Phát triển hệ thống tái sinh từ mô sẹo phục vụ chọn dòng chịu hạn ở cây đậu tương glycine max (l ) merrill

MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Đậu tương loại trồng chiến lược nhiều quốc gia giới Hạt đậu tương có hàm lượng chất dinh dưỡng cao, chứa 40% - 50% protein, 18% -25% lipit, chứa nhiều loại axit amin cần thiết (lizin, triptophan, metionin, xystein, lozin ) nhiều loại vitamin (B1, B2, C, D, E, K ), nguồn lượng cần thiết cho sống người Cây đậu tương có thời gian sinh trưởng ngắn, hệ rễ có nốt sần mang vi khuẩn cố định đạm nên đậu tương thường trồng luân canh với lúa ngô để tăng vụ cải tạo đất bạc màu Với giá trị to lớn mà đậu tương trồng phổ biến nhiều nơi từ vùng ôn đới đến vùng nhiệt đới, từ 550 vĩ Bắc đến 550 vĩ Nam, từ vùng thấp mực nước biển vùng cao 2000m so với mực nước biển với diện tích khoảng 74,4 triệu [4], [9] Trong đó, chúng trồng nhiều Mỹ, Braxin, Argentina, Trung Quốc, Ấn Độ Ở Việt Nam đậu tương gieo trồng vùng nông nghiệp nước Các giống đậu tương nước ta phong phú gồm giống đậu tương nhập nội, giống lai tạo, giống đậu tương đột biến tập đoàn giống đậu tương địa phương Các giống đậu tương địa phương đa dạng phong phú kiểu hình kiểu gen, nguồn nguyên liệu để chọn tạo giống đậu tương cho suất chất lượng phù hợp với mục tiêu chọn giống [9] Tạo giống đậu tương có suất cao, kháng bệnh, chống chịu với điều kiện bất lợi biến đổi khí hậu ln nhà tạo giống quan tâm Bên cạch phương pháp truyền thống, phương pháp tạo giống công nghệ sinh học phương pháp mang lại hiệu cao công tác chọn giống đậu tương với tính trạng mong muốn Ở Việt Số hóa Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên Tai ngay!!! Ban co the xoa dong chu nay!!! http://www.lrc-tnu.edu.vn Nam, tạo giống đậu tương công nghệ sinh học bắt đầu quan tâm nghiên cứu Một công cụ quan trọng tạo giống cơng nghệ sinh học kĩ thuật chọn dịng tế bào soma, với tần suất tạo biến di truyền ngẫu nhiên khoảng 10 -5- 10-8, nuôi cấy mô sẹo xem nguồn vật liệu phong phú cho việc chọn dịng tế bào có tính chống chịu trồng (Lê Trần Bình cs, 1997) [1] Vì vậy, phát triển hệ thống tái sinh khâu quan trọng việc ứng dụng công nghệ sinh học để cải tạo giống theo hướng tăng cường khả chống chịu với điều kiện ngoại cảnh bất lợi đậu tương Xuất phát từ lí chúng tơi lựa chọn đề tài cho luận văn thạc sĩ là: Phát triển hệ thống tái sinh từ mơ sẹo phục vụ chọn dịng chịu hạn đậu tương [Glycine max (L.) Merrill] Mục tiêu nghiên cứu Tạo dịng đậu tương từ mơ sẹo chịu nước kỹ thuật nuôi cấy in vitro Nội dung nghiên cứu - Nghiên cứu điều kiện tối ưu khử trùng hạt sử dụng nuôi cấy in vitro - Khảo sát môi trường tạo mô sẹo phôi hạt đậu tương - Đánh giá khả chịu hạn đậu tương kỹ thuật thổi khô mô sẹo ngưỡng thổi khô khác nhau: 3, 5, (giờ) - Khảo sát môi trường tái sinh tạo hoàn chỉnh - Sử dụng kỹ thuật RAPD để đánh giá thay đổi hệ gen dịng đậu tương tái sinh từ mơ sẹo chịu nước - Thiết lập sơ đồ hình xác định khoảng cách di truyền dòng đậu tương nghiên cứu - Tuyển chọn dòng đậu tương ưu tú để tiếp tục theo dõi, đánh giá hệ tiếp sau Số hóa Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 CÂY ĐẬU TƢƠNG 1.1.1 Tình hình sản xuất đậu tƣơng Đậu tương có tên khoa học (Glycine Max (L.) Merrill) thuộc họ đậu (Fabaceae), họ phụ cánh bướm (Papilionoidace) có NST 2n = 40, có nguồn gốc từ Trung Quốc loại trồng hàng năm không thấy xuất loài hoang dại Các giống đậu tương địa phương nước ta du nhập từ Trung Quốc từ lâu [4] Cây đậu tương trồng cạn ngắn ngày, khó tìm thấy loại có tác dụng nhiều mặt hiệu kinh tế cao đậu tương Về thực phẩm hạt đậu tương có thành phần dinh dưỡng cao 40% - 50% protein, 18% - 25 % lipit 20% gluxit [9] Protein đậu tương có phẩm chất tốt loại protein thực vật, có đầy đủ cân đối loại axit amin cần thiết Lipit đậu tương chúa tỷ lệ lớn axit béo chưa no, có hệ số đồng hóa lớn (98%), số iot cao (120- 137) có tác dụng phịng chống bệnh biếu cổ cho người, đặc biệt vùng trung du miền núi Hạt đậu tương nhiều khống có khả cung cấp lượng lớn (4.710kcal), người ta chế biến hạt đậu tương thành 600 sản phẩm khác [9] Đậu tương trồng lấy hạt, cung cấp dầu quan trọng lấy dầu Hiện qua thống kê FAO cho thấy từ năm 1980 trở lại sản lượng đậu tương giới tăng lên lần chủ yếu nhờ vào tăng suất diện tích Trong vịng 20 năm qua diện tích gieo trồng tăng nhanh, suất bình quân tăng cao 23 tạ/ha Các nước sản xuất đậu Số hóa Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn tương đứng đầu giới: Mỹ, Brazin, Argentina Trung Quốc chiếm khoảng 90-95% tổng sản lượng đậu tương giới [9] Ở Việt Nam, đậu tương trồng vùng nơng nghiệp, vùng núi phía Bắc có diện tích gieo trồng lớn 46,6%, đồng Sơng Hồng 19,3%, vùng Tây Nguyên 11%, miền Đông Nam Bộ 10,2%, đồng Sông Cửu Long 8,9%, khu Bốn 2,3% vùng Duyên hải miền Trung 1,6% [9] Cây đậu tương chiếm vị trí quan trọng nông nghiệp nước ta, đặc biệt vùng nông thôn nghèo, kinh tế chưa phát triển Tuy nhiên, việc sản xuất đậu tương nước chưa đầu tư cao, suất thấp, nghiên cứu cải tiến đặc điểm nông học giống địa phương tạo giống có suất cao, thích nghi với điều kiện sinh thái vùng khác phương pháp truyền thống kết hợp với đại đáp ứng yêu cầu thực tiễn đặt chiến lược quan trọng phát triển đậu đỗ nước ta 1.1.2 Đặc điểm sinh học sinh thái học đậu tƣơng Cây đậu tương trồng cạn thu hạt, gồm phận chính: rễ, thân, lá, hoa, hạt Rễ đậu tương rễ cọc, gồm rễ rễ phụ, rễ có nhiều nốt sần chứa vi khuẩn Rhizobium japonicum, có khả cố định đạm khơng khí tạo thành đạm dễ tiêu [4] Các cơng trình nghiên cứu cho thấy giống có khả cộng sinh có đủ nốt sần thường làm cho hàm lượng protein cao, trồng đậu tương có tác dụng cải tạo đất Thân đậu tương thân thảo, phân cành dạng bụi, đậu tương kép với chét, có 4-5 chét Đậu tương tự thụ phấn, hoa đậu tương nhỏ, khơng hương vị, có màu tím, tím nhạt trắng, hoa mọc từ nách ngọn, đậu tương thuộc loại ráp, thẳng cong, có nhiều lơng chín có màu vàng xám Hạt đậu tương khơng có nội nhũ Số hóa Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn mà có lớp vỏ bao quanh phơi lớn Hạt có hình trịn bầu dục, tròn dài, tròn dẹt, ovan vỏ hạt thường nhẵn có màu vàng nhạt, vàng đậm, xanh, nâu, đen đa số hạt màu vàng Khối lượng hạt đa dạng dao động từ 20-400 mg/ hạt Màu sắc rốn hạt giống khác nhau, biểu đặc trưng giống Cây đậu tương có loại hình sinh trưởng: sinh trưởng hữu hạn sinh trưởng vô hạn, thời gian sinh trưởng thường chia nhóm chín sớm, trung bình muộn Theo thời gian sinh trưởng, nhà chọn giống đậu tương cho giống chín sớm (75-90 ngày), giống chín sớm (90-100 ngày), giống chín trung bình (100-110 ngày), loại chín muộn trung bình (110-120 ngày), giống chín muộn (130-140 ngày), giống chín muộn (140150 ngày) thời gian sinh trưởng yếu tố quan trọng để lựa chọn trồng luân canh xen vụ Đậu tương tương đối mẫn cảm với điều kiện ngoại cảnh Trong tập đồn giống đậu tương có giống trồng vào vụ hè, có giống trồng vào vụ đơng, có giống trồng vụ xuân hè có giống trồng thích hợp với vụ thu đơng [9] Các họ đậu nói chung, đậu tương nói riêng có nhu cầu nước cao loại khác thuộc nhóm chịu hạn Đó hạt đậu tương có hàm lượng protein lipit cao, để tổng hợp 1kg chất khô cần 500 – 530 kg nước, trình nảy mầm nhu cầu nước đậu tương cao 50%, ngơ 30%, lúa 20% [9] Hạn tượng thường xuyên xảy tự nhiên dẫn đến tình trạng thiếu nước đặc biệt thực vật Khái niệm hạn dùng để thiếu nước môi trường gây nên suốt trình hay giai đoạn làm ảnh hưởng đến sinh trưởng phát triển Những trồng có khả trì phát triển cho suất tương đối ổn định Số hóa Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn điều kiện khô hạn gọi chịu hạn Khi nghiên cứu đặc tính chịu hạn đậu tương phương diện sinh lý di truyền cho thấy đặc tính liên quan chặt chẽ đến đặc điểm hóa keo chất nguyên sinh, đặc điểm trình trao đổi chất Tính chịu hạn đậu tương tính trạng đa gen Chúng thể nhiều khía cạnh khác nhau: phát triển nhanh rễ, tính chín sớm tương đối, chất di truyền giống có khả sử dụng nước tiết kiệm trình sinh trưởng phát triển Căn vào đặc điểm này, đậu tương chia thành hai nhóm: - Nhóm chịu nước giai đoạn phát triển - Nhóm chịu thiếu nước tất giai đoạn phát triển 1.2 ỨNG DỤNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ VÀ TẾ BÀO THỰC VẬT TRONG CẢI TIẾN GIỐNG CÂY TRỒNG 1.2.1 Cơ sở khoa học chọn dòng tế bào soma Cơ sở khoa học chọn dòng tế bào thực vật tính tồn tế bào thực vật Mỗi tế bào lấy từ thể thực vật khả tiềm tàng để phát triển thành cá thể hoàn chỉnh Điều nhà khoa học chứng minh qua nhiều thí nghiệm nuôi cấy mô tế bào thực vật Cơ sở thứ hai mô quần thể tế bào nuôi cấy bao gồm số lượng lớn tế bào khơng đồng Vì quần thể tế bào ni cấy xem quần thể thực vật mà diễn thay đổi kiểu gen, kiểu hình tuổi Khi tế bào tái sinh thành thể thay đổi mức độ thể Những biến đổi di truyền tự phát xảy q trình ni cấy mơ tế bào Larkin Scowcroft (1982) gọi ―biến di sinh dưỡng‖ hay ―biến dị soma‖ Giải thích xuất biến dị soma Số hóa Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn điều kiện in vitro có nhiều ý kiến khác Theo Skirvin CS (1994), xuất biến dị soma rối loạn phân bào nguyên nhiễm gây chất kích thích sinh trưởng có mặt số chất mơi trường ni cấy Sự hình thành biến dị soma đột biến số lượng cấu trúc nhiễm sắc thể, tái tổ hợp phân bào nguyên nhiễm[13], phát huy tác dụng yếu tố di truyền vận động, methyl hóa ADN…[1] Các loại mơ phân hóa tách từ thể thực vật có khả tái sinh trực tiếp thành cây, ngồi chúng có khả phát triển trực tiếp từ tế bào mô sẹo (callus) Trong phương thức nuôi cấy phổ biến ni cấy mơ sẹo nghiên cứu nhiều đối tượng Mô sẹo loại tế bào chưa phân hóa, phân chia liên tục, có khả phân hóa thành phơi, chồi hồn chỉnh Mơ sẹo hình thành qua ni cấy in vitro từ quan sinh dưỡng thực vật Trong mơi trường chứa chất điều hịa sinh trưởng nhóm auxin, điều kiện ni cấy thích hợp mơ sẹo hình thành trì thơng qua cấy chuyển tái sinh Các mô sẹo sau xử lý điều kiện cực đoan khả sinh trưởng tái sinh tăng lên rõ rệt [35] Nhiều nghiên cứu cho thấy, tái sinh từ mơ sẹo có biến đổi di truyền phong phú [16] Tuy nhiên, với loại thiết phải nghiên cứu kỹ thuật ni cấy tối ưu thích hợp cho việc đánh giá tái sinh Có nhiều yếu tố ảnh hưởng tới khả tái sinh nguồn gốc mô sẹo [23], mức bội thể mô sẹo, thành phần nồng độ chất kích thích sinh trưởng thực vật bổ sung vào môi trường nuôi cấy Theo Lê Trần Bình CS (1995) tách động điều kiện cực đoan mức độ thời gian định mô hay tế bào thường chết, tế bào có sức sống sống sót cho hiệu tái sinh cao [3] Để đạt hiệu chọn dịng ni cấy mô sẹo người ta phải sử dụng khối mô có kích thước nhỏ nhằm Số hóa Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn hạn chế chọn lọc không triệt để kích thước lớn khơng đồng khối mô sẹo ban đầu 1.2.2 Ảnh hƣởng chất điều hịa sinh trƣởng đến q trình ni cấy mơ tế bào thực vật Hiện người ta phát thấy nhóm chất kích thích sinh trưởng thực vật là: auxin, cytokinin, ethylen, giberelin, absixic acid Những chất phân thành nhóm dựa vào tính tương đồng cấu trúc chức sinh lý, nhiên chức nhiều chúng có tác động chồng chéo lẫn Còn số nhóm khác điều khiển giai đoạn sinh trưởng định Trong nuôi cấy mô người ta thường sử dụng ba nhóm chất điều hịa sinh trưởng dẫn xuất auxin, cytokinin giberelin Nhóm auxin nhóm kích thích sinh trưởng nhà sinh lý học thực vật phát quan tâm sớm Auxin hoocmon thực vật có tác dụng kích thích sinh trưởng, kéo dài tế bào phân hóa quan, kiểu tác động liên quan đến làm chuyển đổi mềm hóa màng tế bào Chính chức người ta sử dụng đánh giá hoạt tính nó, ví dụ cách đo phần kéo dài mầm yến mạch trồng điều kiện tối biết hoạt tính auxin Nhóm auxin bao gồm chất sau: 2,4 Diclorophenoxyacetic acid (2,4-D), α - Naphtylacetic acid (α-NAA), Indolacetic acid (IAA), 2,4- D dễ gây độc có tác dụng kích thích q trình phân chia tế bào nên thường sử dụng nhiều [16] α NAA có tác dụng làm tăng hô hấp tế bào mô ni cấy, tăng hoạt tính enzym ảnh hưởng mạnh đến trình trao đổi nitơ, tăng khả tiếp nhận sử dụng chất môi trường, α-NAA có tác dụng tạo rễ cho non mạnh auxin khác [16] Nhóm giberelin nhóm phát qua nghiên cứu bệnh lúa von, tác động làm tế bào dãn phân chia, làm lùn cao Số hóa Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ngô lùn thành ngô cao, đậu dạng bụi thành dạng đứng Đại diện cho nhóm giberilic acid (GA3), chất sử dụng rộng rãi nông nghiệp Nhóm cytokinin nhóm chất kích thích sinh trưởng có tác dụng làm tăng phân chia tế bào Các cytokinin dùng ni cấy mơ kinetin 6- benzyl aminopurin (BAP) phát nghiên cứu liên quan đến ni cấy mơ Ethylen nhóm có ảnh hưởng lớn đến sinh trưởng phát triển gần chúng coi hoocmon thực vật Ethylen thường sử dụng để làm chín đồng loạt chuối, hoa đồng loạt dứa, ảnh hưởng đến trình phân bào [16] Abscisis acid (ABA) thuộc nhóm chất ức chế sinh trưởng, có tác dụng làm tăng cường khả chống chịu tế bào thực vật điều kiện ngoại cảnh bất lợi [16], ABA đưa vào môi trường tái sinh mang lại hiệu định 1.2.3 Hệ thống ni cấy để chọn dịng tế bào có khả chống chịu Nguyên lý kỹ thuật chọn dòng tế bào thực vật tượng tế bào thực vật nuôi cấy tế bào mô sẹo điều kiện in vitro chúng thường có biến đổi di truyền tự phát, gọi chúng biến dị tế bào soma (biến dị soma) Xử lý mô sẹo tác nhân phi sinh học điều kiện phòng thí nghiệm cho phép chọn dịng tế bào thích hợp theo định hướng chọn lọc Tuy vậy, loài thực vật người ta phải nghiên cứu trạng thái ni cấy thích hợp cho việc chọn dịng Đến chọn dòng tế bào chịu stress số loài thực vật lúa, lạc, đậu, ngô người ta sử dụng số hệ thống nuôi cấy sau đây: Nuôi cấy mô sẹo: Mơ sẹo khối tế bào mơ mền có cấu trúc thấp, chưa phân hóa, phân chia cách hỗn loạn có tính biến động di Số hóa Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn truyền cao Mô sẹo thu nuôi cấy in vitro quan phận khác thực vật thân, lá, rễ, hoa .trong mơi trường chứa chất điều hịa sinh trưởng nhóm auxin điều kiện ni cấy thích hợp Mơ sẹo trì mơi trường ni cấy cách cấy chuyển có định kỳ, nhiên thực nghiệm thấy rằng: i) mô sẹo qua cấy chuyển nhiều lần có ảnh hưởng khơng tốt đến khả tái sinh cây; ii) tăng tính biến động di truyền mơ Các tế bào di truyền có tính ổn định di truyền thấp Nhiều tác giả công bố nhận tái sinh từ mô sẹo thông qua nhiều lần cấy chuyển có thay đổi nhiễm sắc thể (dị bội, đa bội) biến đổi di truyền khác Vì việc nhân nhanh trì tính đồng di truyền thơng qua ni cấy mơ sẹo cần thận trọng nhiều loại thực vật sử dụng mô sẹo sơ cấp để tái sinh hồn chỉnh thơng qua đường tạo phơi vơ tính Mặt khác tái sinh từ mô sẹo với biến đổi di truyền phong phú lại có ý nghĩa việc chọn giống vật liệu di truyền trở lên phong phú (Lê Trần Bình CS) [1] [2] [3], (Bùi Bảo Hồn) [6] Ni cấy tế bào huyền phù: Nuôi cấy tế bào huyền phù nuôi cấy tế bào đơn (single cell) cụm nhỏ tế bào (cell agregate) môi trường lỏng Các tế bào tạo từ mơ sẹo có nguồn gốc thân, lá, rễ, hoa, phôi…Muốn thu tế bào huyền phù nhỏ, cần sàng lọc liên tục qua loại sàng có mắt lọc nhỏ (< 0,5 mm) Để đạt nuôi cấy huyền phù tương đối cần phải sàng lọc hàng chục lần, thời gian cần thiết để thiết lập môi trường ni cấy huyền phù 2-3 tháng Đây điều trở ngại nghiên cứu với thực vật thời gian ni cấy dài tế bào huyền phù khả tái sinh Lúc việc chọn dịng gặp khó khăn để ứng dụng cho thực tiễn tạo giống Vì trường Số hóa Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Ngun 10 http://www.lrc-tnu.edu.vn CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN Chu Hoàng Mậu, Nguyễn Thị Tú Lan, Nguyễn Thị Tâm, ― Kết chọn lọc dịng mơ sẹo chịu nước đậu tương ( Glycine max (L.) Merill)‖, Tạp chí Khoa học & Công nghệ, Đại học Thái Nguyên, số 67, tr.113-117 TÀI LIỆU THAM KHẢO Số hóa Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên 59 http://www.lrc-tnu.edu.vn Tài liệu tiếng Việt Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhĩ, Lê Thi Muội (1997), Công nghệ sinh học thực vật cải tiến giống trồng, Giáo trình cao học Nơng nghiệp, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội, 188 trang Lê Trần Bình, Lê Thị Muội (1998), Phân lập gen chọn dòng chống chịu ngoại cảnh bất lợi lúa, Nxb Đại học Quốc Gia, Hà Nội, 250 trang Lê Trần Bình, Võ Thị Ngọc Diệp, Lê Thị Muội (1995), ―Nghiên cứu khả chịu lạnh chịu khô mơ sẹo lúa giống lúa có nguồn gốc sinh thái khác nhau‖, Tạp chí sinh học, 17(1), tr 25-29 Ngô Thế Dân cộng (1999), Cây đậu tương, Nxb Nông Nghiệp Lê Xuân Đắc, Đinh Thị Phịng, Lê Thị Muội, Lê Trần Bình (1999), ―Sử dụng kỹ thuật RAPD để đánh giá tính đa hình ADN số dịng chọn lọc từ mơ sẹo giống lúa C71‖ Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, Nxb Khoa học kỹ thuật Hà Nội, tr 1341-1347 Bùi Bảo Hoàn (1993), Ứng dụng nuôi cấy mô tế bào bảo quản, nhân giống chọn lọc dòng chịu lạnh khoai lang (Ipomoea batatas L.), Luận văn thạc sỹ sinh học, Viện Công Nghệ Sinh học, Hà Nội Nguyễn Thị Thúy Hường, Trần Thị Ngọc Diệp, Nguyễn Thu Hiền, Chu Hoàng Mậu, Lê Văn Sơn, Chu Hoàng Hà (2009), ― Phát triển hệ thống tái sinh in vitro đậu tương (Glycine max (L.) Merill) phục vụ chuyển gen„, Tạp chí Khoa học &Công nghệ- ĐH Thái Nguyên, 52 (4): 82-88 Dương Trọng Hiền (2000), Nghiên cứu tiêu sinh lý, hóa sinh tảo spirulina plantensis tác động NaCl, Luận văn Tiến sĩ Sinh học, Hà Nội Trần Đình Long (2000), Cây đậu tương, Nxb Nơng nghiệp Hà Nội 10 Nguyễn Hồng Lộc (1992), Chọn dịng chịu muối NaCl chịu nước thuốc (Nicotiana tabacum L.), Luận án phó tiến sĩ sinh học, Viện Công nghệ Sinh học, Hà Nội, 107 trang Số hóa Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên 60 http://www.lrc-tnu.edu.vn 11 Nguyễn Thị Luyện, Chu Hoàng Mậu (2009), Hoàn thiện hệ thống tái sinh in vitro đậu xanh (Vigna Wilczek) phục vụ cho chuyển gen, Tạp chí Khoa học &Cơng nghệ- ĐH Thái Ngun 12 Chu Hoàng Mậu (2001), Sử dụng phương pháp đột biến thực nghiệm để tạo dòng đậu tương đậu xanh thích hợp cho miền núi Đơng Bắc Việt Nam, Luận án tiến sĩ sinh học, Viện Công nghệ sinh học Hà Nội 13 Chu Hoàng Mậu (2008), Phương pháp phân tích di truyền đại chọn giống trồng, Nxb Đại học Thái Nguyên 14 Đinh Thị Phòng, Lê Trần Bình, Lê Thị Muội (1995), ―Sử dụng cơng nghệ tế bào thực vật để chọn dòng chịu nước lúa„ Kỷ yếu viện Công nghệ sinh học, Nxb Khoa học&kỹ thuật, Hà Nội, tr 27- 38 15 Đinh Thị Phòng (2001), Nghiên cứu khả chịu hạn chọn dòng tế bào chịu hạn lúa công nghệ tế bào thực vật, Luận án tiến sĩ Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học Hà Nội, 134 trang 16 Hoàng Minh Tấn, Nguyễn Quang Thạch, Trần Văn Phẩm (1994), Giáo trình sinh lí thực vật, Nxb Nơng nghiệp, Hà Nội, tr 1-228 17 Nguyễn Thị Tâm (2004), Nghiên cứu khả chịu nóng chọn dịng chịu nóng lúa cơng nghệ tế bào thực vật, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Viện Công nghệ sinh học Hà Nội 18 Nguyễn Vũ Thanh Thanh (2003), Nghiên cứu thành phần hóa sinh hạt tính đa dạng di truyền số giống đậu xanh có khả chịu hạn khác nhau, Luận văn thạc sĩ Sinh học, Trường Đại học Sư Phạm - Đại học Thái Nguyên 19 Bùi Văn Thắng, Đinh Thị Phòng, Lê Thị Muội, Lê Trần Bình, Nguyễn Văn Thắng, Trần Văn Dương (2003),―Đánh giá tính đa dạng số giống lạc tập đoàn giống chống chịu bệnh gỉ sắt kỹ thuật RAPD‖ Hội nghị công nghệ sinh học toàn quốc, tr 805-809 20 Vũ Thanh Trà, Trần Thị Phương Liên (2006), ―Nghiên cứu đa dạng di truyền số giống đậu tương địa phương có phản ứng khác với bệnh gỉ sắt thị SSR‖, Tạp chí Nơng nghiệp Phát triển nơng thơn, 21, 30-32 Số hóa Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên 61 http://www.lrc-tnu.edu.vn 21 Nguyễn Thị Thư, Đỗ Tiến Phát, Lê Thị Muội, Đinh Thị Phòng (2007),‖ Tái sinh in vitro qua phôi soma từ mầm hạt chưa chín đậu tương (Glycine max (L.) Merrill )‖, Tạp trí Cơng nghệ Sinh học 5(2): 247-253, 2007 Tài liệu tiếng Anh 22 Abdul B., Frinch R P., Cocking E C (1999), ― Plant regeneration from protoplast of wild rice (Oryza rufipogon Griff)„, Plant cell Rep, 10, pp 200203 23 Abe T., Kudo M., Oka Y., Yamaguchi J., Sasahara T (1996), ― Changes in αamylase activity during plant regeneration from rice calli„, J Plant Physiol, 149, pp 592- 598 24 Amirato P., Evans D., Sharp W R., Yamada Y (1984), Handbook of plant Cell Culture, Crop Species, New York, Macmilan, pp 25 Baker J., Steele C., Dure L (1988), ―Sequence and characterization of Lea proteins and n from cotton„ Plant Mol Biol, 11, pp 277- 291 26 Ben-Hayyim G., Kochba J (1982), ―Growth characteristics and stability of tolerance of Citrus callus cell subjectet to NaCl stress„, Plant Sci Lett, 27, pp.8794 27 Bertin P., Kinet J M., Bouharmont J (1995), ―Heritable chilling tolerance improvenment in rice throungh somachonal variation anh cell line selection„, Auts J Bot, 44, pp 91- 105 28 Bray E.A (1997), Plant responses to water deficit, Trends Plant Sci, 2, pp 47- 54 29 Brown-Guedira, J.A Thompsonb, R.L Nelsonc and M.L Warburton (2000), ―Evaluation of Genetic Diversity of Soybean Introductions and North American Ancestors Using RAPD and SSR Markers‖, Crop Science 40:815-823 30 Chao Yang, Tuanjie Zhao, Deyue Yu and Junyi Gai (2009), ―somatic embryogesis and plant regeneration in Chinese soybean (Glycine max (L.) Merill) – impacts of mannitol, abscisic acid, and explant age‖, In vitro Cellular& Developmental Biology- Plant, 45 (2): 180- 188 Số hóa Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên 62 http://www.lrc-tnu.edu.vn 31 Chandler S F., Vasil I K (1984), ― Selection and charaterrization of NaCl tolerance cell from embryogenesis cultures of Pennisetum purpureum Schum‖, Plant Sci Lett, 37, pp 157-164 32 Dix P.J (1986), Plant cell culture technology, Yeoman M M (els), Oxford, Blackwell Scietific Publications, pp 143- 201 33 Dix P.J (1990), Plant cell line selection (Procedures and Applications), VCH Verlagsgellschaft MBH 34 Evan D A (1989), ―Somaclonal variation: Genetic basis and breeding application‖, Trends Genet 5, pp 46-50 35 Gawel, Jarret ―Genomic (1991) DNA isolation‖ www.weihenstephan.de/pbpz/bambara/htm/dna.htm 36 Gyu-Taek Cho, Jeongran Lee, Jung-Kyung Moon, Mun-Sup Yoon, Hyung-Jin Baek, Jung-Hoon Kang, Tae-San Kim, Nam-Chon Paek (2008), ―Genetic Diversity and Population Structure of Korean Soybean Landrace [Glycine max (L.) Merr.]‖, J Crop Sci Biotech 2008 (June) 11 (2) : 83 – 90 37 Herman E B (1991), Recent advances in plant tissue culture: Regeneretion, Micropropagation and Media (1988- 1991), J Agritech, Consutant, Inc Shrub Oak New York, USA 38 Lanham PG, Fennell S, Moss JP, Powell W (1992), ―Detection of polymorphic loci in Arachis germplasm using radom amplified polymorphic DNAs”, Genome, 35 (5) :885-9 39 Li Z., Nelson R.L., (2002), ―RAPD Marker Diversity among Cultivated and Wild Soybean Accessions from Four Chinese Provinces‖, Crop Science, 42:1737-1744 40 Mansfield M A., Lingle W L., Key J L (1988), ―The effects of lethal heat shock on non- adapted and thermotolerant root cells of Glycine max‖, Jounal of Ultrastructure Research 99, pp 96- 105 Số hóa Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên 63 http://www.lrc-tnu.edu.vn 41 Moretzsohn MC, Hopkins MS, Mitchell SE, Kresovich S, Valls JF, Ferreira ME (2004), ―Genetic diversity of peanut (Arachis hypogaea L ) and its wild relatives based on the analysis of hypervariable regions of the genome”, Plant Mol Biol, 4(1) :11 42 Muler A J (1983), ―Genetic analysis of nitrate reductase deficient tobaco plants regenerated from mutant cells Evidence for duplicate structural genes‖, Mol Gen Genet 192, pp 275- 281 43 Muruga Loganathan, Subbiyan Marthaasalam, Ling Yin Shin, Wei ching Lien, Wen Hwei Hsu, Pei Fang Lee, Chih Wen Yu and Chin Ho Lin (2010), Regenration of soybean (Glycine max L Merill) through direct somatic embryogenesis from the immature embryonic shoot tip In vitro Cellular & Developmental Biology – Plant (online) 44 Muruganatham M., Amutha S., Selvaraj N., Vengadesan G., Ganapathi A ( 2007), ― Efficient Agrobacterium- ediated transformation of Vigna mungo using immature cotyledonary-node explant and phosphinothricin as the selection egent‖, In vitro Cell Dev Biol.-Plant, 43: 550- 557 45 Ranch J P., Oglesby L., Zielinski A C and Horsch R B (1985), Plant regeneration from embyo-derived tissue cultures of soybeans In vitro cellular & Developmental Biology – Plant, 21 (11): 653- 658 46 Raghava R N V., Nobors M V (1985), ― Plant from regeneration from tissue culture of Pokali rice is promoted by optizing callus to medium volume ratio and by amedium conditioning facto produced by embryogeneic callus‖, Cell Tiss Org Cult 4, pp 241- 248 47 Seitova A.M., Ignatov A.N., Suprunova T.P., Tsvetkov I.L., Deĭneko E.V., Dorokhov D.B., Shumnyĭ V.K., Skriabin K.G., (2004), ―Assessment of genetic diversity of wild soybean (Glycine soja Siebold et Zucc.) in the far eastern region of Russia”, Genetika, 40(2):224-231 Số hóa Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên 64 http://www.lrc-tnu.edu.vn 48 Subramanion V, Gurtu S, Nageswara Rao RC, Nigam SN (2000), ―Identification of DNA polymoraphism in cultivated groundnut using random amplified polymoraphic DNA (RAPD) assay‖, Genome, 43 (4): 656-60 49 Vierling R., Nguyen H J (1992), ―Use of RAPD marker to determine the genetic relationships of diploid wheat genotype”, Theor Appl Genet, 84: 835-838 50 Welsh J., McClelland M (1990), ―Fingeprinting genomes using PCR with arbitrary primer‖, Nucleic Acids Res, 18, pp 7213-7218 51 Wennuan Liu, Patricia J Moore and Glenn B Collins (1992), Somatic embryogenesis in soybean via somatic embryo cycling In vitro cellular & Developmental Biology – Plant, 28 (3): 153- 160 52 (71) William J G K., Kubelik A E., Levak K J., Rafalski J A., Tingey S V, (1990), ―DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic merers‖, Nucleic Acids Res, 18, pp 6531-6535 53 Wong C., Ko S., Woo S (1983), ―Regenration of rice plantlets on NaCl- stress medium by anther culture‖, Bot Bull Acad Sin 24, pp.59- 64 54 Xiaohui Song, Yingpeng Han, Weili Teng, Genlou Sun and Wenbin Li (2010), Identification of QTL underlying somatic embryogenesis capacity of immature embryo in soybean (Glycine max (L.) Merr.), Plant Cell Reports, 29 (2): 125-131 55 Xingliang Zhou, Thomas E Carter Jr, Zhanglin Cui, Shoji Miyazaki, Joseph W Burto (2002), ―Genetic diversity patterns in Japanese soybean cultivars based on coefficient of Parentage‖ Crop Science; 42, 4; ProQuest Central 56 Yiwu Chen, Dechun Wang, Prakash Arelli, Mohsen Ebrahimi, Randall L Nelson (2006), ―Molecular marker diversity of SCN-resistant sources in soybean”, Genome; 49, 8; ProQuest Central 57 Yong-Bi Fu, Gregory W Peterson, Malcolm J Morrison (2007), ―Genetic Diversity of Canadian Soybean Cultivars and Exotic Germplasm Revealed by Simple Sequence Repeat Marker”, Crop Science; 47, 5; ProQuest Central Số hóa Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên 65 http://www.lrc-tnu.edu.vn MỤC LỤC Trang cc MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Mục tiêu nghiên cứu Nội dung nghiên cứu………………………………………… Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU………………… ……… 1.1 Cây đậu tương……………………………………………… 1.1.1 Tình hình sản xuất đậu tương 1.1.2 Đặc điểm sinh học sinh thái học đậu tương……………………… 1.2 Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật cải tiến 1.2.1 Cơ sở khoa học chọn dòng tế bào soma 1.2.2 Ảnh hưởng chất điều hịa sinh trưởng đến q trình ni cấy mơ tế bào thực vật 1.2.3 Hệ thống nuôi cấy để chọn dịng tế bào có khả chống chịu 1.2.4 Các phương thức chọn dòng tế bào 12 1.2.5 Tái sinh từ tế bào nuôi cấy in vitro 13 1.2.6 Một số nghiên cưú đánh giá khả chống chịu chọn 14 dịng tế bào soma kỹ thuật ni cấy in vitro 1.3 Ứng dụng kỹ thuật RAPD để đánh giá dòng chọn lọc 16 1.3.1 RAPD…………………………………………………… 16 Số hóa Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 1.3.2 Ứng dụng kỹ thuật RAPD để phân tích dịng chọn lọc 18 Chương 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN 21 CỨU 2.1 Nguyên liệu………………………………………………… 21 2.1.1 Nguyên liệu thực vật……………………………………… 21 2.1.2 Hóa chất thiết bị……………………………………… 22 2.1.2.1 Hóa chất………………………………………………… 22 2.1.2.2 Thiết bị………………………………………………… 22 2.2 Phương pháp nghiên cứu………………………………… 22 2.2.1 Sơ đồ thí nghiệm tổng quát 22 2.2.2 Phương pháp nuôi cấy in vitro chọn dịng chịu hạn 23 2.2.2.1 Tạo mơ sẹo từ hạt đậu tương 23 2.2.2.2 Xử lý mô sẹo thổi khô 23 2.2.2.3 Chọn lọc mơ sẹo sống sót sau xử lý thổi khô tái sinh 24 2.2.2.4 Tạo hoàn chỉnh…………………………………… 25 2.2.2.5 Ra chế độ chăm sóc 25 2.2.3 Phương pháp xử lý kết tính tốn số liệu 26 2.2.4 Phương pháp nghiên cứu sinh học phân tử 26 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29 3.1 Kết nghiên cứu khả chịu hạn chọn dòng tế bào chịu 29 hạn đậu tương kỹ thuật in vitro 3.1.1 Ảnh hưởng nồng độ 2,4 D đến khả tạo mô 29 sẹo 3.1.2 Khả chịu hạn giống đậu tương mức độ mô sẹo Số hóa Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên 30 30 http://www.lrc-tnu.edu.vn 3.1.2.1 Độ nước mô sẹo 3.1.2.3 Tỷ lệ tái sinh chồi mơ sẹo sống sót 31 3.1.3 Ảnh hưởng nồng độ BAP đến khả tái sinh 33 3.1.4 Ảnh hưởng nồng độ α-NAA tới khả hình thành phát 35 triển hệ rễ 3.1.5 Nhận xét khả chịu hạn chọn dòng chịu hạn hệ 36 thống tái sinh in vitro 3.2 Đánh giá đa hình dịng chọn lọc R kỹ thuật 38 RAPD 3.2.1 Kết tách chiết tinh ADN từ dòng chọn 39 lọc 3.2.2 Kết phân tích đa hình số dịng chọn lọc hệ R0 có 40 nguồn gốc từ mô sẹo chịu nước hai giống ĐVN5 ĐVN6 kỹ thuật RAPD 3.2.3 So sánh sư khác dòng chọn lọc với giống gốc 51 mức độ phân tử 3.2.4 Nhận xết kết phân tích tính đa hình ADN hệ gen 53 dòng chọn lọc giống gốc 3.3 Đặc điểm nơng học số dịng ưu việt chọn lọc từ hệ R 54 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 57 CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO 59 Tài liệu tiếng Việt 59 Tài liệu tiếng Anh 61 Số hóa Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Ngun http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn tới PGS TS Chu Hoàng Mậu tận tình hướng dẫn tạo điều kiện giúp đỡ tơi hồn thành luận văn Tơi xin cảm ơn thầy giáo, kỹ thuật viên phịng thí nghiệm thuộc Khoa Sinh – KTNN, Trường Đại học Sư phạm – Đại học Thái Nguyên tận tình giúp đỡ tơi q trình học tập thực luận văn Tơi xin cảm ơn Ban Lãnh đạo, cán bộ, kỹ thuật viên môn Sinh học Phân tử Công nghệ gen Viện Khoa học Sự sống – Đại học Thái Nguyên tạo điều kiện giúp đỡ tơi tiến hành số thí nghiệm luận văn Tác giả luận văn Nguyễn Thị Tú Lan Số hóa Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT 2,4-D 2.4- Diclorophenoxyacetic acid ABA Abscisis acid DNA Deoxiribonucleic acid BAP 6- Benzyl amino purin CS Cộng D7 Dòng thứ D13 Dòng thứ 13 D21 Dòng thứ 21 D23 Dòng thứ 23 D34 Dòng thứ 34 ĐVN5 Giống đậu tương Việt Nam ĐVN6 Giống đậu tương Việt Nam EDTA Ethylen diamintetra acetic acid IAA β- Indol acetic acid M Thang DNA chuẩn (Maker) MS Murashige – Skoog NAA α - Naphtylacetic acid R0 Cây tái sinh từ mô sẹo RAPD Random Amplified Polymorphic DNA TAE Tris axetat EDTA TBE Tris borat EDTA Số hóa Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Trình tự nucleotit 10 mồi ngẫu nhiên sử dụng phân 28 tích RAPD Bảng 3.1 Ảnh hưởng nồng độ 2,4 D đến khả tạo mô 29 sẹo Bảng 3.2 Tỷ lệ sống sót mơ sẹo ngưỡng thời gian thổi khô 31 khác Bảng 3.3 Ảnh hưởng nồng độ BAP đến khả tái sinh 34 Bảng 3.4 Ảnh hưởng nồng độ α-NAA đến khả hình 36 thành rễ Bảng 3.5 Độ tinh hàm lượng ADN mẫu đậu tương 40 Bảng 3.6 Tổng số phân đoạn ADN nhân dịng 41 đậu tương phân tích với 10 mồi ngẫu nhiên Bảng 3.7 Tính đa hình phân đoạn ADN nhân 42 dòng đậu tương với 10 mồi ngẫu nhiên Bảng 3.8 Hệ số đồng dạng di truyền dòng chọn lọc hai 52 giống gốc Bảng 3.9 Một số đặc điểm nông học giống gốc ĐVN5 55 ĐVN6 Bảng 3.10 Một số đặc điểm số dòng chọn lọc từ hệ R 55 Số hóa Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 2.1 Sơ đồ thí nghiệm tổng qt………………………………… 22 Hình 3.1 Tốc độ nước mô sẹo giống đậu tương sau 30 xử lý thổi khô……………………………………………………… Hình 3.2 Tỷ lệ tái sinh từ mơ sẹo sống sót sau xử lý thối khơ 33 Hình 3.3 Một số hình ảnh chọn dịng tế bào soma có khả 37 chịu hạn đậu tương…………………………………… Hình 3.4 Một số hình ảnh đậu tương dịng chịu hạn trồng 38 ngồi đồng ruộng……………………………………………………… Hình 3.5 Kết điện di ADN tổng số tách từ mẫu đậu tương…… 40 Hình 3.6 Kết điện di sản phẩm RAPD gel agarose 1,5% với 44 mồi M16……………………………………………………………… Hình 3.7 Kết điện di sản phảm RAPD gel agarose 1,5% với 45 mồi M11……………………………………………………………… Hình 3.8 Kết điện di sản phẩm RAPD gel agarose 1,5% với 46 mồi M18……………………………………………………………… Hình 3.9 Kết điện di sản phẩm RAPD gel agarose 1,5% với 47 mồi M8……………………………………………………………… Hình 3.10 Kết điện di sản phẩm RAPD gel agarose 1,5% với 48 mồi M15……………………………………………………………… Hình 3.11 Kết điện di sản phẩm RAPD gel agrose 1,5% với 49 mồi M5……………………………………………………………… Hình 3.12 Kết điện di sản phẩm RAPD gel agarose 1,5% với 49 mồi M7……………………………………………………………… Hình 3.13 Kết điện di sản phẩm RAPD trren gel agarose 1,5% 50 mồi M9…………………………………………………………… Số hóa Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Hình 3.14 Kết điện di sản phẩm RAPD gel agarose 1,5% với 51 mồi M10 Hình 3.15 Biểu đồ so sánh dòng chọn lọc giống gốc 53 mức độ phân tử sử dụng mồi M4, M5, M7, M8, M9, M10, M11, M15, M16, M18………………………………………………… Số hóa Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn