Nghiên cứu thu nhận và xác định một số tác dụng sinh học của phân đoạn peptide từ lá cây thuốc hoàn ngọc đỏ (strobilanthes schomburgkii) (craib) j r i wood

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC -  - VIÊN THỊ SÁNG NGHIÊN CỨU THU NHẬN VÀ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA PHÂN ĐOẠN PEPTIDE TỪ LÁ CÂY THUỐC HỒN NGỌC ĐỎ (STROBILANTHES SCHOMBURGKII) (CRAIB) J.R.I.WOOD KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC HÀ NỘI – 2023 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC -  - VIÊN THỊ SÁNG NGHIÊN CỨU THU NHẬN VÀ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA PHÂN ĐOẠN PEPTIDE TỪ LÁ CÂY THUỐC HỒN NGỌC ĐỎ (STROBILANTHES SCHOMBURGKII) (CRAIB) J.R.I.WOOD KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC KHÓA : QH.2018.Y NGƯỜI HƯỚNG DẪN : TS VÕ HOÀI BẮC NGƯỜI HƯỚNG DẪN : PGS.TS VŨ THỊ THƠM HÀ NỘI – 2023 LỜI CẢM ƠN Lời xin chân thành cảm ơn Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm – Khoa học Công nghệ Việt Nam tạo điều kiện, môi trường tốt giúp thực tốt khóa luận Tơi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc tới TS.Võ Hoài Bắc PGS.TS.Vũ Thị Thơm tận tình bảo, hướng dẫn giúp đỡ tơi suốt q trình nghiên cứu hồn thành khóa luận tốt nghiệp Tơi xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu trường Đại Học Y Dược – Đại Học Quốc Gia Hà Nội, phòng ban liên quan, Trưởng Bộ Môn Y Dược học sở, tồn thể thầy giáo giảng dạy, hướng dẫn để tơi có kiến thức ngày hơm Cuối cùng, tơi xin bày tỏ tình cảm lịng biết ơn chân thành tới gia đình, bạn bè tận tình giúp đỡ, động viên tơi suốt thời gian qua Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 25 tháng 05 năm 2023 Sinh viên Viên Thị Sáng DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT STT Chữ viết tắt Ý nghĩa A660 Bước sóng 660nm BMDM Tế bào đại thực bào BSA Albumin huyết bò DMSO Dimethyl sulfoxide HNĐ Hoàn Ngọc Đỏ LPS Lipopolysaccharides MTT 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tentrazolium bromide IL-6 Interleukin-6 IL-10 Interleukin-10 10 TNF-α Yếu tố hoại tử khối u 11 OD Optical density DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng Xây dựng đồ thị chuẩn protein theo phương pháp Lowry .16 Bảng Xác định hoạt tính kháng khuẩn peptide HNĐ .29 DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Cây Hồn Ngọc Đỏ (Strobilanthes schomburgkii) (Craib) J.R.I.Wood 13 Hình 2.1 Hình ảnh mẫu Hồn Ngọc Đỏ Strobilanthes schomburgkii (Craib) J.R.I.Wood thu nhận Hà Nội 14 Hình 3.1 Điện di Gel Tricine-SDS-PAGE 16% peptide tự nhiên từ Hoàn ngọc đỏ Gel nhuộm bạc sau điện di 21 Hình 3.2 Sơ đồ tách chiết peptide HNĐ 22 Hình 3.3 Điện di Gel Tricine-SDS-PAGE 16% peptide thủy phân từ Hoàn ngọc đỏ Gel nhuộm bạc sau điện di .23 Hình 3.4 Sơ đồ thủy phân peptide HNĐ 24 Hình 3.5 Ảnh hưởng peptide HNĐ lên khả sống tế bào RAW264.7 25 Hình 3.6 Ảnh hưởng peptide tự nhiên giải phóng TNF-α 26 Hình 3.7 Ảnh hưởng peptide tự nhiên giải phóng IL-6 27 Hình 3.8 Ảnh hưởng peptide tự nhiên giải phóng IL-10 28 Hình 3.9 Xác định hoạt tính kháng khuẩn peptide HNĐ 30 MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƯƠNG – TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu peptide .3 1.2 Các hoạt tính sinh học peptide 1.2.1 Các peptide kháng viêm .4 1.2.2 Các peptide kháng khuẩn 1.2.3 Các peptide chống oxy hóa 1.2.4 Các peptide chống stress tăng sức đề kháng 1.2.5 Các peptide có hoạt tính chống ung thư .8 1.2.6 Các hoạt tính sinh học khác peptid 1.3 Nghiên cứu thuốc thuộc họ Ơrơ (Acanthaceae) 1.4 Nghiên cứu Thế Giới Việt Nam Hoàn Ngọc Đỏ Strobilanthes schomburgkii (Craib) J.R.I.Wood 12 CHƯƠNG – ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1 Đối tượng nghiên cứu .14 2.1.1 Nguyên liệu thực vật 14 2.1.2 Hóa chất thiết bị 14 2.2 Phương pháp nghiên cứu 15 2.2.1 Xử lý nguyên liệu .15 2.2.2 Tách phân đoạn peptide tự nhiên .15 2.2.3 Thu nhận tách peptide thủy phân từ protein thuốc 15 2.2.4 Phương pháp điện di Gel Tricine-SDS-PAGE xác định Peptide15 2.2.5 Xác định hàm lượng Protein theo phương pháp Lowry 16 2.2.6 Đánh giá khả kháng khuẩn phân đoạn peptide phương pháp khuếch tán đĩa thạch 17 2.2.7 Phương pháp nuôi tế bào Macrophage từ tủy xương chuột 18 2.2.8 Đánh giá hoạt tính độc tố phân đoạn peptide tới khả sống tế bào macrophage kít đếm tế bào sống sót 18 2.2.9 Đánh giá khả kháng viêm theo phương pháp Trịnh Tất Cường cộng 19 2.2.10 Phần mềm ANOVA thống kê Excel phân tích vẽ đồ thị 19 CHƯƠNG – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .20 3.1 Tách chiết thu nhận phân đoạn peptide tự nhiên thủy phân từ thuốc Hoàn Ngọc Đỏ .20 3.1.1 Tách chiết thu nhận phân đoạn peptide tự nhiên từ thuốc Hoàn Ngọc Đỏ 20 3.1.2 Tách chiết thu nhận phân đoạn peptide thủy phân từ thuốc Hoàn Ngọc Đỏ 22 3.3 Đánh giá ảnh hưởng phân đoạn peptide đến giải phóng cytokine tiền viêm in vitro 26 3.4 Xác định hoạt tính kháng khuẩn phân đoạn peptide thu nhận 29 CHƯƠNG – KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .32 Khóa Luận Tốt Nghiệp MỞ ĐẦU Tính cần thiết đề tài Trong năm gần đây, peptide hoạt tính sinh học có nguồn gốc từ thực vật peptide thủy phân từ protein thực phẩm chứng minh có nhiều lợi ích cho sức khỏe chống lại nhiều bệnh tật, bao gồm bệnh tim mạch, viêm nhiễm ung thư [1] Các peptide kháng khuẩn (AMPs) thu hút quan tâm nghiên cứu nhà khoa học giới Nhiều loại thực vật giàu peptide kháng viêm (AIPs) peptide kháng khuẩn (AMPs), nguồn dược liệu tiềm để điều trị viêm nhiễm trùng [2,3] Các peptide kháng viêm điều hịa biệt hóa tế bào miễn dịch ngăn ngừa phản ứng viêm mức [4-6] dị ứng [7] Một số peptide có nguồn gốc từ protein chứng minh khả giảm viêm trực tiếp khơng bị biến tính qua q trình thủy phân tiêu hóa in vitro q trình lên men làm chín thực phẩm [8] Do xuất vi khuẩn kháng thuốc kháng số loại kháng sinh truyền thống, việc tìm kiếm chất kháng khuẩn mới, đặc biệt từ peptide kháng khuẩn thực cần thiết [9] Thực vật dồi AMPs [10] Các AMPs phân lập từ thực vật phận thân, rễ, hạt, hoa nhiều lồi khác có hoạt tính chống lại số mầm bệnh thực vật chống lại vi khuẩn gây bệnh cho người [11] Các peptide kháng khuẩn như: vancomycin, polymyxin, daptomycin sử dụng để điều trị chủng vi khuẩn kháng kháng sinh Trong năm gần đây, nghiên cứu cho thấy thuộc họ Ơrơ (Acanthaceae) có nhiều tác dụng sinh học khác Các loài thực vật thuộc họ Acanthaceae chứa chất quan trọng như: alkaloid, phenol, terpenoid, tanin, quinon, glycoside tim, saponin, carbohydrate, flavonoid protein đóng vai trị việc điều trị số bệnh Một số loài như: Adathoda beddomie, Neelagirianthasis Sp, Justeceae gendurusa, Neelagirianthasis hemitomie, Berleria priority, Adathoda zylanica Hemigraphis corolata có khả tiêu diệt làm chậm phát triển nhiều vi khuẩn truyền nhiễm bao gồm loài Pseudomonas nguy hiểm [12] Loài Clinacanthus nutans chứa hợp chất hoạt tính sinh học quan trọng có tác dụng việc chống viêm, kháng virus, chống oxy hóa chống tiểu đường [13] Cây Hoàn Ngọc Đỏ, tên khoa học Strobilanthes schomburgkii (Craib) J.R.I.Wood, thuộc họ Ơrơ (Acanthaceae) Theo kinh nghiệm dân gian Việt Nam, SVTH: Viên Thị Sáng MSV: 18100207 Khóa Luận Tốt Nghiệp loại có cơng dụng hiệu việc chữa trị bệnh đường tiêu hóa, bệnh dày có tác dụng kháng viêm, kháng khuẩn, cầm máu Cho đến nay, chưa có nghiên cứu hoạt chất kháng viêm, kháng khuẩn, nghiên cứu hoạt tính sinh học peptide từ thuốc Hồn Ngọc Đỏ Trong luận văn này, chúng tơi thu nhận phân đoạn peptide tự nhiên, peptide thủy phân từ thuốc Hoàn Ngọc đỏ (Strobilanthes schomburgkii) (Craib) J.R.I.Wood đánh giá số tác dụng sinh học phân đoạn peptide Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài Đây nghiên cứu việc thu nhận xác định tác dụng sinh học phân đoạn peptide từ thuốc Hoàn Ngọc đỏ (Strobilanthes schomburgkii) (Craib) J.R.I.Wood in vitro Kết luận văn chứng khoa học chứng minh tác dụng sinh học sử dụng dân gian góp phần bổ sung thơng tin khoa học thuốc quý Việt Nam Mục tiêu nghiên cứu đề tài Tách chiết thu nhận 1-2 phân đoạn peptide tự nhiên peptide thủy phân từ protein từ thuốc Hoàn Ngọc Đỏ (Strobilanthes schomburgkii) (Craib) J.R.I.Wood Đánh giá số tác dụng sinh học phân đoạn peptide phân lập từ thuốc SVTH: Viên Thị Sáng MSV: 18100207 Khóa Luận Tốt Nghiệp Ảnh hưởng peptide từ Hoàn Ngọc Đỏ Strobilanthes schomburgkii (Craib) J.R.I.Wood lên khả sống sót đại thực bào RAW264.7 xác định thí nghiệm MTT Ảnh hưởng tế bào macrophage 1.6 1.4 1.2 (A) 0.8 0.6 0.4 0.2 ĐC 20 10 30 40 Peptide HNĐ µg/ml Ảnh hưởng tế bào macrophage 1.6 1.4 1.2 (B) 0.8 0.6 0.4 0.2 ĐC 10 40 30 Peptide HNĐ thủy phân µg/ml 20 Hình 3.5 Ảnh hưởng peptide HNĐ lên khả sống tế bào RAW264.7 (A): Peptide HNĐ tự nhiên; (B): Peptide HNĐ sau thủy phân Khả sống sót tế bào giếng tra thuốc peptide nồng độ 10, 20, 30, 40 µg/ml khơng có khác biệt đáng kể so với khả sống sót tế bào giếng đối chứng sinh học (giếng tế bào ni mơi trường ni cấy) (Hình 3.5) Kết cho thấy peptide khơng có khả gây độc với đại thực bào Nồng độ sử dụng cho thí nghiệm SVTH: Viên Thị Sáng 25 MSV: 18100207 Khóa Luận Tốt Nghiệp 3.3 Đánh giá ảnh hưởng phân đoạn peptide đến giải phóng cytokine tiền viêm in vitro Peptide nhóm hợp chất nhà khoa học giới quan tâm có nhiều tác dụng quan trọng kháng viêm, kháng khuẩn chống oxy hóa Mẫu Peptide nồng độ 10, 20, 30, 40 (µg/ml) tra vào giếng tế bào RAW 264.7 Cảm ứng đại thực bào RAW 264.7 LPS với nồng độ µg/ml 24 theo mơ tả chi tiết phần phương pháp Lần lượt thu dịch nồng độ để phân tích cytokine TNF-α (A) Peptide HNĐ tự nhiên TNF-α 600 500 400 * 300 (B) * * 200 * 100 * Đc LPS LPS + 10 LPS+ 20 LPS +30 LPS+40 Dexan Peptide HNĐ thủy phân Hình 3.6 Ảnh hưởng peptide HNĐ giải phóng TNF-α (A): Peptide HNĐ tự nhiên; (B): Peptide HNĐ thủy phân (*p