(Luận văn) xác định một số đặc tính sinh học của parvovirus gây tiêu chảy ở chó nuôi tại thủ đô viêng chăn chdcnd lào

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM SOUKSAVANH SISAMOUTH lu an XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC va n CỦA PARVOVIRUS GÂY TIÊU CHẢY Ở CHĨ NI to p ie gh tn TẠI THỦ ĐÔ VIÊNG CHĂN - CHDCND LÀO d oa nl w lu Thú y Mã số: 8640101 u nf va an Ngành: ll Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Lê Văn Phan oi m z at nh z m co l gm @ an Lu NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP - 2019 n va ac th si LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng thân Các kết nghiên cứu trình bày luận văn trung thực, khách quan chưa dùng bảo vệ để lấy học vị Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực luận văn cám ơn thơng tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày tháng năm 2019 Tác giả luận văn lu an va SoukSaVanh Sisamouth n p ie gh tn to d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th i si LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn tác giả nhận giúp đỡ tạo điều kiện nhiều người, sau lời cảm ơn chân thành tác giả: Trước hết, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Lê Văn Phan người trực tiếp hướng dẫn tơi suốt q trình nghiên cứu hồn thành luận văn Nhờ có hướng dẫn nhiệt tình ý kiến đóng góp q báu thầy mà luận văn hồn thành lu Tơi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám đốc Học viện Nông nghiệp Việt Nam, Ban Quản lý đào tạo, Chủ nhiệm khoa Thú y, Bộ môn Vi sinh vật truyền- nhiễm, Phịng Thí nghiệm trọng điểm cơng nghệ sinh học Thú y, tồn thể thầy, cô giáo cán Khoa Thú y – Học viện Nông nghiệp Việt Nam, trang bị cho kiến thức quý báu giúp đỡ tơi hồn thành cơng trình nghiên cứu luận văn an n va ie gh tn to Cuối cùng, xin chân thành cảm ơn tới bạn bè, đồng nghiệp, người thân gia đình quan cơng tác tạo điều kiện thời gian, động viên, chia sẻ tinh thần, giúp đỡ tơi q trình học tập, nghiên cứu hoàn thành luận văn p Hà Nội, ngày tháng năm 2019 d oa nl w Tác giả luận văn va an lu SoukSaVanh Sisamouth ll u nf oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th ii si MỤC LỤC Lời cam đoan Error! Bookmark not defined Lời cảm ơn Error! Bookmark not defined Mục lục iii Danh mục bảng vi Danh mục hình ảnh vii Danh mục chữ viết tắt viii Trích yếu luận văn ix Thesis abstract xi lu Phần Mở đầu an n va 1.1 Tính cấp thiết đề tài 1.2 Mục tiêu đề tài tn to Phần Tổng quan tài liệu Tình hình nghiên cứu bệnh viêm ruột tiêu chảy Parvovirus ie gh 2.1 p 2.1.1 2.1.2 Tổng quan bệnh viêm ruột tiêu chảy Parvovirus Tình hình nghiên cứu bệnh viêm ruột tiêu chảy Parvovirus gây w oa nl giới Tình hình dịch bệnh viêm ruột tiêu chảy Parvovirus gây Lào 2.2 Đặc điểm sinh học parvovirus 2.2.1 Đặc điểm hình thái, cấu trúc hệ gen Parvovirus 2.2.2 Phân loại phân bố type Parvovirus 2.2.3 Sức đề kháng Parvovirus 2.2.4 Đặc tính ni cấy 2.2.5 Đặc tính kháng nguyên 2.2.6 Khả miễn dịch 2.2.7 Đường xâm nhập cách truyền bệnh 2.2.8 Triệu chứng 10 2.2.9 Các phương pháp chẩn đoán 12 2.3 Phòng bệnh 15 2.4 Tổng quan tế bào 17 2.4.1 Một số đặc điểm tế bào động vật 17 d 2.1.3 ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th iii si 2.4.2 Thành phần dinh dưỡng môi trường nuôi cấy tế bào 17 2.4.3 Điều kiện nuôi cấy 18 2.4.4 Sự tạp nhiễm cách hạn chế 19 2.5 Phân lập VIRUS 19 2.5.1 Khái quát phân lập virus 19 2.5.2 Phân lập Parvovirus phục vụ nghiên cứu sản xuất Vaccine vô hoạt 20 2.6 Giải trình tự gen 21 2.7 Cây phát sinh chửng loại (Phylogenetic Tree) 21 Phần Nội dung phƣơng pháp nghiên cứu 22 lu an n va Đối tượng nghiên cứu 22 3.2 Địa điểm nghiên cứu 23 3.3 Nội dung nghiên cứu 23 3.4 Nghiên vật liệu 23 3.4.1 Hóa chất 23 Trang thiết bị máy móc 23 tn to 3.1 3.4.2 gh Phương pháp nghiên cứu 24 3.5.1 Phường pháp lấy mẫu 24 p ie 3.5 Phương pháp tách DNA tổng số 24 nl w 3.5.2 Phương pháp PCR 25 3.5.4 Phương pháp điện di kiểm tra sản phẩm 26 3.5.5 Phương pháp giải trình tự gen 26 3.5.6 Phương pháp mở giống tế bào CRFK 27 3.5.7 Phương pháp cấy chuyển tế bào CRFK 27 3.5.8 Phương pháp phân lập Parvovirus tế bào CRFK 28 3.5.9 Phương pháp thu virus 29 d oa 3.5.3 ll u nf va an lu oi m z at nh 3.5.10 Phương pháp đếm số lượng tế bào 29 3.5.11 Phương pháp xác định hiệu giá virus 30 z gm @ 3.5.12 Phương pháp phân tích phả hệ 32 Phần Kết thảo luận 33 l Kết chẩn đoán canine parvovirus phương pháp PCR 33 4.2 Kết xây dựng phả hệ (Phylogenetic Tree) 35 4.2.1 Kết phân tích tương đồng Nuclotide chủng m co 4.1 an Lu Parvovirus nghiên cứu 35 n va ac th iv si Kết phân tích tương đồng Amino acid chủng 4.2.2 Parvovirus nghiên cứu 39 lu 4.2.3 Kết xây dựng phả hệ 42 4.3 Kết phân lập chủng Parvovirus môi trường nuôi cấy tế bào CRFK 43 4.3.1 Kết nuôi cấy tế bào CRFK 43 4.3.2 Kết phân lập Parvovirus 44 4.4 Kết xác định hiệu giá Parvovirus môi trường tế bào 45 4.5 Kết xác định đường cong sinh trưởng 46 4.5.1 Kết bệnh tích tế bào thời điểm thu virus 46 4.5.2 Kết chuẩn độ hiệu giá virus thời điểm thu hoạch khác 48 4.5.3 Đường cong sinh trưởng virus 48 an Phần Kết luận kiến nghị 50 Kết luận 50 5.2 Kiến nghị 50 n va 5.1 tn to p ie gh Tài liệu tham khảo 52 d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th v si DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1 Thông tin mẫu phân nghi mắc bệnh parvovirus 22 Bảng 3.2 Thành phần phản ứng PCR 25 Bảng 3.3 Thông tin cặp mồi sử dụng phản ứng PCR (Canio Buonavoglia et al., 2001) 25 Bảng 3.4 Chu trình nhiệt độ phản ứng PCR 25 Bảng 3.5 Sơ đồ thí nghiệm xác định TCID50 31 Bảng 4.1 Thông tin mẫu bệnh phẩm kết chẩn đoán Parvovirus phản ứng PCR 34 lu Bảng 4.2 Kết chẩn đoán Parvovirus phản ứng PCR 35 an Bảng 4.3 Tỷ lệ (%) tương đồng trình tự nt chủng Parvovirus va n nghiên cứu với với chủng Parvovirus tham chiếu to tn khác 38 p ie gh Bảng 4.4 Tỷ lệ (%) tương đồng trình tự aa chủng Parvovirus nghiên cứu với với chủng Parvovirus tham chiếu w khác 41 oa nl Bảng 4.5 Kết xác định hiệu giá Parvovirus đĩa nuôi cấy tế bào 96 giếng sau 96 gây nhiễm 45 d an lu Bảng 4.6 Bệnh tích tế bào thời điểm thu virus 46 va Bảng 4.7 Kết chuẩn độ TCID50 chai gây nhiễm thu hoạch ll u nf thời điểm khác 48 oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th vi si DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 2.1 Cấu tạo Parvovirus Hình 2.2 Sự phân bố CPV-2a\2b\2c giới Hình 2.3 Tỷ lệ phần trăm xuất chủng CPV-2/CPV-2-like, CPV-2a, CPV-2b, CPV2C Hình 2.4 Cơ chế sinh bệnh Parvovirus chó 10 Hình 2.5 Chó bị tiêu chảy cấp, nôn mửa Parvovirus 12 Hình 2.6 Kit thử nhanh Canine Parvovirus (CPV) Ag 14 Hình 4.1 Kết chạy PCR với cặp mồi định tính 555forc/555revc (Canio lu Buonavoglia et al.,2001) Sản phẩm có kích thước theo dự kiến an 583bp 33 va Sự tương đồng nucleotide chủng Parvovirus nghiên cứu n Hinh 4.2 tn to với số chủng virus Parvovirus giới 37 p ie gh Hinh 4.3 Sự tương đồng amino acid chủng Parvovirus nghiên cứu với số chủng virus Parvovirus giới 40 w Hình 4.5 Tế bào CRFK sau ni cấy 24h, 48h, 72h, 96h 43 oa nl Hình 4.6 Hình ảnh đối chứng tế bào CRFK không gây nhiễm virus sau nuôi cấy 24, 48, 72, 96 44 d an lu Hình 4.7 Hình ảnh tế bào CRFK sau gây nhiễm virus 24, 48, 72, 96 44 va Hình 4.8 Hình ảnh bệnh tích tế bào đối chứng âm Parvovirus gây nhiễm u nf tế bào CRFK thời điểm 12, 24, 36, 48, 72, 96 47 Biểu đồ đường cong sinh trưởng Parvovirus tế bào CRFK 49 ll oi m Hình 4.9 z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th vii si DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT lu an n va Nghĩa tiếng Việt PCR Polymerase chain reaction FPV Panleucopenie feline DICT Dose Infectieuse Culture de Tissu MDCK Madin Darby Canine kidney CRFK Crandell Rees Feline Kidney HI Haemagglutination Inhibition ELISA Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay cs cộng CPV2 Canine Parvovirus type HA Haemagglutination tn to Chữ viết tắt IHC Immunohistochemistry gh Melting temperature p ie Tm dNTP Phenol-chlorofrom-isoamyl-alcohol Molecular Evolutionary Genetics Analysis version d lu Microlit va an µl oa MEGA nl P: C: I Phosphate Buffered Saline w PBS Deoxynucleotide Triphosphate Cyto Pathogenic Effect DNA Deoxyribonucleic acid RNA Ribonucleoic acid PBS Phosphate buffered saline TBE Tris/Borate/EDTA RT-PCR Reverse Transcriptase Polymerase Chain React nt Nucleotide aa Amino acid ll u nf CPE oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th viii si TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: SoukSaVanh SISAMOUTH Tên luận văn: ―Xác định số đặc tính sinh học Parvovirus gây tiêu chảy chó ni Thủ Viêng Chăn - CHDCND Lào‖ Mã số: 8640101 Ngành: Thú y Tên sở đào tạo: Học Viện Nơng nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu Nghiên cứu đặc tính sinh học Parvovirus chó ni thủ Viêng ChănCHDCND Lào lu an Phƣơng pháp nghiên cứu đƣợc sử dụng n va - Phương pháp lấy mẫu tn to - Phương pháp tách DNA tổng số - Phương pháp PCR p ie gh - Phương pháp điện di kiểm tra sản phẩm - Phương pháp giải trình tự gen nl w - Phương pháp phân lập parvovirus môi trường tế bào CRFK d oa - Phương pháp xác định hiệu giá virus (TCID50/ml); an lu - Phương pháp xác định đường biểu biễn nhân lên virus; Kết kết luận u nf va - Phương pháp xử lý số liệu ll Kết chẩn đoán phương pháp PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu (555forc/555revc) (Canio Buonavoglia et al.,2001) cho thấy 24 có 22 mẫu dương tính với Parvovirus chiếm tỷ lệ (92%) oi m z at nh z Kết phân tích trình tự gen VP2 cho thấy chủng virus nghiên cứu có mức độ tương đồng nt aa với 99 - 99,6% nt 97,1 - 98,8% aa Trong chủng L04 chủng L12 có mức độ tương đồng cao nt aa với tương ứng 99,6% 98,8% Kết phân tích trình tự nt aa suy diễn đoạn gen VP2 cho thấy chủng L04 có aa sai khác với chủng L05, L12, L14 Các vị trí aa sai m co l gm @ khác gồm vị trí 318 (CH), 320 (GA), 322 (TA), 380 (FS), 414 (RW), 429 an Lu (VG) 430 (LS). Kết phân tích phả hệ dựa trình tự nt gen VP2 chủng n va ac th ix si lu an n va p ie gh tn to d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z gm @ m co l Hinh 4.3 Sự tƣơng đồng amino acid chủng Parvovirus nghiên cứu với số chủng virus Parvovirus giới an Lu Ghi chú: Dấu (.) biểu thị trình tự aa giống với trình tự aa chủng FJ197847/Korea/Vaccine/2017 n va ac th 40 si lu an va n Bảng 4.4 Tỷ lệ (%) tƣơng đồng trình tự aa chủng Parvovirus nghiên cứu với to Tên chủng p ie gh tn với chủng Parvovirus tham chiếu khác FJ197847/Korea/Vaccnine/2007 ID KX601682/Laos/2c/2016 88.5 98.7 ID 96 92.5 92 KX601678/Laos/2c/2016 88 98.7 100 92 ID KT156832/China/2c/2014 96 92.5 92 100 92 ID 92.5 92 100 92 100 ID d oa nl w 88 KR611522/China/2c/2014 a lu 96 10 11 12 13 14 96.5 92 91.4 99.4 91.4 99.4 99.4 ID 94.8 91.4 98.8 90.8 98.8 98.8 98.2 ID FJ222821/Italy/2c/2000 97.1 an 90.8 91.4 90.8 98.8 90.8 98.8 98.8 99.4 97.7 ID AB120727/Vietnam/2b/2004 97.1 91.4 90.8 ll 98.8 90.8 98.8 98.8 99.4 97.7 100 ID FJ005203/Germany/2c/1998 97.1 91.4 90.8 98.8 90.8 98.8 98.8 99.4 97.7 100 100 ID GQ865518/Greece/2c/2008 97.1 91.4 90.8 oi 90.8 98.8 98.8 99.4 97.7 100 100 100 ID LC214970/Vietnam/2a/2013 96.5 90.8 90.2 98.2 98.2 98.8 97.1 98.2 98.2 98.2 98.2 ID fu m 98.8 z at nh 16 17 18 19 90.2 98.2 96 92.5 92 100 92 100 100 99.4 98.8 98.8 98.8 98.8 98.8 98.2 ID MF347723/China/2c/2016 95.4 92 91.4 99.4 91.4 99.4 99.4 98.8 98.2 98.2 98.2 98.2 98.2 97.7 99.4 ID MN119604/China/2c/2019 96 92.5 92 100 92 z 100 99.4 98.8 98.8 98.8 98.8 98.8 98.2 100 99.4 ID MF347725/China/2c/2017 96 92.5 92 100 92 100 100 99.4 98.8 98.8 98.8 98.8 98.8 98.2 100 99.4 100 ID L04/2019 95.4 92 91.4 99.4 91.4 99.4 99.4 98.2 98.2 98.2 98.2 97.7 99.4 98.8 99.4 99.4 ID L05/2019 94.2 90.8 90.2 98.2 90.2 98.2 L12/2019 95.4 92 91.4 99.4 91.4 99.4 99.4 L14/2019 94.8 91.4 90.8 98.8 90.8 98.8 98.8 o l.c LC214969/Vietnam/2c/2013 15 20 21 22 ID KU744254/Taiwan/2c/2015 nv KY937650/China/2c/2016 ID KX601674/Laos/2c/2016 KT162005/China/2c/2014 100 98.2 97.7 97.1 97.1 97.1 97.1 97.1 96.5 98.2 98.8 98.2 98.2 97.7 ID 98.8 98.2 98.2 98.2 98.2 98.2 97.7 99.4 98.8 99.4 99.4 98.8 97.7 ID 98.2 97.7 97.7 97.7 97.7 97.7 97.1 98.8 98.2 98.8 98.8 98.2 97.1 98.2% m gm @ 98.2 98.8 an Lu n va ac th 41 ID si Kết phân tích trình tự gen cho thấy chủng virus nghiên cứu có mức độ tương đồng aa với 97,1 - 98,8% Trong chủng L04 chủng L12 có mức độ tương đồng aa với 98,8% (Bảng 4.4) Kết phân tích trình tự aa suy diễn đoạn gen cho thấy chủng L04 có aa sai khác với chủng L05, L12, L14 Các vị trí aa sai khác gồm vị trí 318 (CH), 320 (GA), 322 (TA), 380 (FS), 414 (RW), 429 (VG) 430 (LS) (Hình 4.3) lu Kết phân tích so sánh trình tự aa chủng Parvovirus cho thấy chủng Parvovirus Lào có mức độ tương đồng từ 94,2 - 95,4% so sánh với chủng vaccine Hàn Quốc Trong chủng L04 L12 có tỷ lệ tương đồng trình tự aa cao so với chủng virus vaccine, tỷ lệ tương đồng 95,4% aa Ngược lại chủng L05 L14 có tỷ lệ tương đồng thấp 94,2 - 94,8% aa (Bảng 4.4) an n va 4.2.3 Kết xây dựng phả hệ p ie gh tn to d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ nucleotide amino acid an Lu Hình 4.4 Cây phả hệ chủng Parvovirus nghiên cứu dựa trình tự n va ac th 42 si Sau so sánh mức độ tương đồng nt aa chủng Parvovirus nghiên cứu, dựa vào phần mềm MEGA7 tiến hành xây dựng sinh học phân tử để xác định phân tích nguồn gốc phát sinh chủng virus nghiên cứu với chủng Parvovirus tham chiếu khác lấy từ ngân hàng GenBank Kết xây dựng phả hệ dựa trình tự nt gen VP2 chủng Parvovirus cho thấy chủng L04, L05, L12, L14 nghiên cứu nằm nhánh phát sinh với chủng Parvovirus gây bệnh chó có mối quan hệ gần gũi với chủng nằm Genotype 2c Trung Quốc (GenBank: MF347723, KT156832, MF347725) chủng Việt Nam (Genbank: LC214969) (Hình 4.4) lu Dựa kết phân tích mức độ tương đồng nt, aa kết phân tích phả hệ cho thấy chủng Parvovirus nghiên cứu L04, L05, L12 L14 thuộc Genotype 2c an n va gh tn to 4.3 KẾT QUẢ PHÂN LẬP CHỦNG PARVOVIRUS TRÊN MÔI TRƢỜNG NUÔI CẤY TẾ BÀO CRFK p ie 4.3.1 Kết nuôi cấy tế bào CRFK d oa nl w Tế bào CRFK phục hồi thực cấy chuyển xác định mật độ tế bào thích hợp để gây nhiễm với mơi trường ni cấy DMEM có bổ sung 5% FBS Một ống giống tế bào CRFK chứa 5x106 tế bào, lấy từ bình Nitơ lỏng ni cấy chai T25 Trong q trình nuôi, mật độ tế bào ghi chép thời điểm khác Kết quan sát cho thấy tế bào sau 12h bắt đầu bám đáy, sau 24h tế bào vươn dài bám vào bề mặt chai Tế bào có hình dạng thn dài, vươn phủ khoảng 80% bề mặt chai sau 48h, sau 72h tế bào phủ kín, bắt đầu có dấu hiệu già, tế bào chết co tròn lên ll u nf va an lu oi m z at nh z c) Tế bào 72h d) Tế bào 96h an Lu b) Tế bào 48h m co l gm @ a) Tế bào 24h Hình 4.5 Tế bào CRFK sau ni cấy 24h, 48h, 72h, 96h n va ac th 43 si 4.3.2 Kết phân lập Parvovirus Kết phân tích phả hệ cho thấy chủng parvovirus nghiên cứu có tương đồng cao (gần 100%) trình tự nt aa, thuộc Genotype 2c Ngoài nghiên cứu dịch tễ học phân tử, nghiên cứu chủng parvovirus phân lập thành công môi trường tế bào CRFK lu an n va gh tn to b) ĐC 48h c) ĐC 72h d) ĐC 96h p ie a) ĐC 24h w Hình 4.6 Hình ảnh đối chứng tế bào CRFK không gây nhiễm virus sau d oa nl nuôi cấy 24, 48, 72, 96 ll u nf va an lu oi m z at nh z b) CPE 48h c) CPE 72h m co l gm @ a) CPE 24h d) CPE 96h an Lu Hình 4.7 Hình ảnh tế bào CRFK sau gây nhiễm virus 24, 48, 72, 96 n va ac th 44 si Kết phân lập virus môi trường tế bào CRFK cho thấy bệnh tích tế bào (CPE) xuất sau 24 h gây nhiễm virus, tế bào bị phá hủy, co tròn, lên Đến 48h đa số tế bào CRFK bị phá hủy lên Sau 72h trở đi, tế bào bị phá hủy gần hồn tồn (Hình 4.5 4.6) Để khẳng định thành công phân lập virus, tế bào gây nhiễm không gây nhiễm virus xác nhận phản ứng PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu phát Parvovirus (555forc/555revc) (Canio Buonavoglia et al.,2001) Kết phản ứng PCR thu sản phẩm PCR có kích thước 583 bp, với kích thước công bố cặp mồi (kết hiện) Chủng virus phân lập thành công đặt tên L12 lu 4.4 KẾT CỦA XÁC ĐỊNH HIỆU GIÁ CỦA PARVOVIRUS TRÊN MÔI TRƢỜNG TẾ BÀO an n va Bảng 4.5 Kết xác định hiệu giá Parvovirus đĩa nuôi cấy tế bào 96 giếng sau 96 gây nhiễm p ie gh tn to Để xác định nồng độ chủng virus phân lập được, tế bào CRFK sử dụng để chuẩn độ virus Kết chuẩn độ để xác định hiệu giá Parvovirus môi trường tế bào thể bảng 4.5 10 11 12 + + + + - - - - - - + B + + + + + + - - - - - - C + + + va + + - - - - - - - D + + + + ll + - - - - - - - E + + + + + + - - - - - - F + + + + + - - - - - - - G + + + + + + - z @ - - - - - H + + + + + + - - gm + - - - - d A lu oa nl w an u nf oi m z at nh m co l Chú thích: – Giếng khơng có bệnh tích tế bào (CPE), tế bào bám đáy phát triển bình thường an Lu + Giếng có bệnh tích tế bào (CPE), tế bào bị phá hủy hoàn toàn n va ac th 45 si Kết chuẩn độ virus cho thấy 10-6 độ pha loãng virus lớn quan sát bệnh tích Ở độ pha lỗng 10-7 đến 10-10 khơng quan sát bệnh tích Theo cơng thức tính Spearman – Karber, chủng L12 xác định có hiệu giá 106.13 TCID50/1 ml Log10TCID50/ml = 6.13 4.5 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH ĐƢỜNG CONG SINH TRƢỞNG Để theo dõi trình phát triển, nhân lên theo thời gian thời điểm đạt hiệu giá cao Parvovirus phân lập được, nghiên cứu thí nghiệm xác định đường cong sinh trưởng chủng virus L12 thiết lập Quá trình xác định đường cong sinh trưởng thực sau: lu an Tiến hành gây nhiễm virus với nồng độ 0,69 × 106.13/ml lên tế bào n va chai T25 với liều 0.5 ml/chai chai làm đối chứng âm không gây Virus thu thời điểm 12, 24, 36, 48, 60 72, 84, 96 sau gây nhiễm gh tn to nhiễm virus Cả chai sau nuôi điều kiện 37ºC 5% CO2 ie Sau 96h, tất chai gây nhiễm tiến hành đông tan lần thu virus p Hàm lượng virus thời điểm khác xác định phương pháp nl w chuẩn độ TCID50 d oa 4.5.1 Kết bệnh tích tế bào thời điểm thu virus lu Sau trình gây nhiễm virus, bệnh tích tế bào CPE quan sát va an thời điểm thu virus Bệnh tích tế bào thời điểm 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84, ll u nf 96 sau gây nhiễm thể bảng 4.6: oi m Bảng 4.6 Bệnh tích tế bào thời điểm thu virus 12h 24h 36h 48h 60h 72h 84h Bệnh tích tế bào - + ++ +++ ++++ ++++ ++++ z at nh Thời điểm 96h z ++++ l gm @ Chú thích: (-) tế bào chưa xuất bệnh tích; (+) tế bào xuất bệnh tích khoảng 10%; (++) m co tế bào có bệnh tích khoảng 50%; (+++) tế bào có bệnh tích khoảng 70%; an Lu (++++) tế bào có bệnh tích khoảng 100% n va ac th 46 si lu an n va p ie gh tn to d oa nl w ĐC tế bào 24h ĐC tế bào 36h ĐC tế bào 48h ĐC tế bào 72h ĐC tế bào 96h CPE 48h CPE 72h CPE 96h ll fu an nv a lu ĐC tế bào 12h oi m z at nh z CPE 36h o l.c gm CPE 24h @ CPE 12h Hình 4.8 Hình ảnh bệnh tích tế bào đối chứng âm Parvovirus gây nhiễm tế bào CRFK m an Lu thời điểm 12, 24, 36, 48, 72, 96 n va ac th 47 si Kết quan sát CPE thời điểm thu virus cho thấy sau 12h bệnh tích tế bào chưa xuất hiện; sau 24h quan sát kính hiển vi soi ngược (khoảng 10%), số lượng tế bào bị phá hủy tăng dần sau 36h gây nhiễm đạt khoảng 50%, đạt xấp xỉ 70% thời điểm 48h sau gây nhiễm CPE đạt 100% ghi nhận thời điểm 60h sau gây nhiễm virus L12 thu virus thời điểm 96h Bảng 4.7 Kết chuẩn độ TCID50 chai gây nhiễm thu hoạch thời điểm khác Thời điểm thu virus Log10TCID50/ml lu an 1.25 24h 2.50 36h 3.50 48h 5.50 60h 5.75 72h 6.00 84h 5.00 96h 4.00 n va 12h p ie gh tn to d oa nl w an lu 4.5.2 Kết chuẩn độ hiệu giá virus thời điểm thu hoạch khác va Để xác định thời điểm thu nồng độ virus cao nhất, thí nghiệm đo ll u nf hiệu giá thời điểm thu virus tiến hành oi bảng sau: m Kết chuẩn độ tính theo công thức Spearman – Kaber tổng hợp z at nh z Sau gây nhiễm Parvovirus lên tế bào CRFK từ 12 đến 72 , hiệu giá virus tăng dần từ 1.25 Log10TCID50 đến 6.00 Log10TCID50 Sau 72 giờ, hiệu giá virus giảm dần thu virus thời điểm 96 hiệu giá 4.5.3 Đƣờng cong sinh trƣởng virus m co l gm @ virus 4.00 Log10TCID50 an Lu Tổng hợp kết chuẩn độ hiệu giá virus, đường cong sinh trưởng xây dựng có biến Log10 TCID50 thời điểm thu virus thể biểu đồ sau: n va ac th 48 si lu an va n Hình 4.9 Biểu đồ đường cong sinh trưởng Parvovirus tế bào CRFK tn to p ie gh Biểu đồ cho thấy chủng L12 có hiệu giá tăng dần theo thời gian, ổn định từ khoảng 48h đến 72h sau gây nhiễm Hiệu giá đạt cực đại (106 TCID50/ml) thời điểm 72h sau gây nhiễm Từ sau 72h trở đi, tế bào bị phá hủy nhiều hơn, nồng độ virus giảm xuống nhanh chóng, tới 96h sau gây nhiễm, hiệu giá virus giảm xuống khoảng 1.5 log so với cực đại Như vậy, thời gian virus phát triển nhanh từ 48h đến 72h, sau 72h nồng độ virus có xu hướng d oa nl w an lu giảm dần ll u nf va Từ đó, xác định thời điểm thu virus thích hợp để virus đạt hiệu giá cao Kết phân tích đường cong sinh trưởng chủng virus L12 oi m cho thấy virus đạt hiệu giá cao giai đoạn 60h đến 72h sau gây nhiễm z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th 49 si PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN Kết chẩn đoán Parvovirus phương pháp PCR cho thấy 22/24 1) (92%) mẫu phân tiêu chảy từ chó nghi mắc Parvovirus cho kết dương tính 2) Kết phân tích trình tự gen VP2 cho thấy chủng virus nghiên cứu có mức độ tương đồng nt aa với 99 - 99,6% (nt) 97,1 98,8% (aa) Trong chủng L04 chủng L12 có mức độ tương đồng cao nt aa với tương ứng 99,6% 98,8% Kết phân tích trình tự nt aa suy diễn đoạn gen VP2 cho thấy chủng L04 có aa sai khác với lu chủng L05, L12, L14 Các vị trí aa sai khác gồm vị trí 318 (CH), 320 (GA), an va 322 (TA), 380 (FS), 414 (RW), 429 (VG) 430 (LS) Kết phân tích so sánh trình tự nt chủng Parvovirus cho thấy n 3) p ie gh tn to chủng Parvovirus Lào có mức độ tương đồng từ 97,3 - 97,7% nt 94,2 95,4% aa so sánh vơi chủng vaccine Hàn Quốc Trong chủng L04 L12 có tỷ lệ tương đồng trình tự nt aa cao so với chủng virus w vaccine, tỷ lệ tương đồng 97,7% nt 95,4% aa Ngược lại chủng L05 oa nl L14 có tỷ lệ tương đồng thấp 97,3 - 97,5% nt 94,2 - 94,8% aa d 4) Kết phân tích phả hệ dựa trình tự nt gen VP2 chủng Parvovirus cho thấy chủng L04, L05, L12, L14 nằm nhánh phát sinh với chủng Parvovirus gây bệnh chó có mối quan hệ gần gữi với chủng nằm Genotype 2c Trung Quốc (GenBank: MF347723, u nf va an lu ll KT156832, MF347725) chủng Việt Nam (Genbank: LC214969) m Đã phân lập thành công parvovirus môi trường tế bào CRFK 6) Chủng virus phân lập có hiệu giá 106.13 TCID50/ml oi 5) z at nh 5.2 KIẾN NGHỊ z l gm @ Tiếp tục thu thập chó mắc Parvovirus giống chó khác để phân lập nhiều mẫu Parvovirus phục vụ cho việc sàng lọc lựa chọn chủng virus từ thực địa m co an Lu Tiếp tục nghiên cứu đánh giá ổn định đặc tính sinh học chủng Parvovirus phân lập môi trường nuôi cấy qua nhiều đời đánh giá độc lực chó thí nghiệm n va ac th 50 si Tiếp tục nghiên cứu giải trình tự tồn genome chủng Parvovirus phân lập nhằm xác định khác liệu di truyền chủng virus nghiên cứu Nghiên cứu lựa chọn chủng vaccine Parvovirus thích hợp cho việc sản xuất kháng thể đơn dòng phục vụ chẩn đoán chế tạo Kit chẩn đoán nhanh chó mắc Parvovirus lu an n va p ie gh tn to d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th 51 si TÀI LIỆU THAM KHẢO I Tài liệu tiếng Việt: Bích, T N., Thảo, T T., Việt, N Q., Mai, N T Y (2013) KHẢO SÁT TỶ LỆ BỆNH DO PARVOVIRUS TRÊN CHÓ TỪ ĐẾN THÁNG TUỔI Ở THÀNH PHỐ CẦN THƠ Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ tr 15-20 Du, T., Giao, X (2006) Kỹ thuật ni chó, mèo phòng trị bệnh thường gặp NXB lao động xã hội, Hà Nội Tr 69 -72 Nguyễn Như Pho (2003) Bệnh Parvovirus Care chó." NXB Nơng Nghiệp, Hà Nội Nguyễn Văn Thanh, Vũ Như Quán, Sử Thanh Long Nguyễn Đức Trường (2016) lu Bệnh chó Việt Nam biện pháp phịng trị NXB Nông nghiệp, Hà Nội an Phạm Sỹ Lăng cs (2006) Kỹ thuật ni chó phịng chống bệnh cho chó." va n NXB Lao động xã hội, Hà Nội tn to Phan, T K N., Trần, T N T (2002) Thực tiêu sinh sản tế bào thực vật: Ủy ban nhân dân tỉnh an Giang Trường đại học An Giang Trần Thanh Phong Nguyễn Thị Thơ (1996) Một số bệnh truyền nhiễm ie gh p chó Vương Đức Chất Lê Thị Tài (2004) Bệnh thường gặp chó mèo cách w oa nl phịng trị NXB Nơng nghiệp Hà Nội ( ed.) d II Tài liệu tiếng Anh: Allen, R., Pereira, L., Raes, D., and Smith, M (1998) Guidelines for computing an lu va crop water requirements-FAO Irrigation and drainage paper 56; FAO-Food and u nf Agriculture Organization of the United Nations, Rome (http://www fao org/docrep) ll ARPAV (2000), La caratterizzazione climatica della Regione Veneto, Quaderni per oi Buonavoglia, C., Martella, V., Pratelli, A., Tempesta, M., Cavalli, A., Buonavoglia z at nh 10 m Geophysics pp 156, 178 and Carmichael, L (2001) Evidence for evolution of canine parvovirus type in z Italy Journal of General Virology 82(12) pp 3021-3025 Buonavoglia, D., Cavalli, A., Pratelli, A., Martella, V., Greco, G., Tempesta, M., gm @ 11 and Buonavoglia, C (2000) Antigenic analysis of canine parvovirus strains l isolated in Italy The new microbiologica 23(1) pp 93-96 m co 12 Burtonboy, G., Coignoul, F., Delferriere, N and Pastoret, P.-P (1979) Canine Archives of virology 61(1-2) pp 1-11 an Lu hemorrhagic enteritis: detection of viral particles by electron microscopy n va ac th 52 si 13 Butler, J (2004) Undoing gender: routledge 14 Carmichael, L., and Binn, L (1981) New enteric viruses in the dog Advances in Veterinary Science and Comparative Medicine (USA) 15 Carmichael, L., Joubert, J., and Pollock, R (1980) Hemagglutination by canine parvovirus: serologic studies and diagnostic applications American journal of veterinary research 41(5) pp 784-791 16 Decaro, N., Desario, C., Addie, D D., Martella, V., Vieira, M J., Elia and G Thiry, E (2007) Molecular epidemiology of canine parvovirus, Europe Emerging infectious diseases 13(8) pp 1222 17 Decaro, N., Elia, G., Martella, V., Campolo, M., Desario, C., Camero and Narcisi, D (2006) Characterisation of the canine parvovirus type variants using minor groove lu binder probe technology Journal of virological methods 133(1) pp 92-99 an 18 Hong, C., Decaro, N., Desario, C., Tanner, P., Pardo, M C., Sanchez and Saliki, J n va T (2007) Occurrence of canine parvovirus type 2c in the United States Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, 19(5) pp 535-539 Johnson, R and Spradbrow, P (1979) Isolation from dogs with severe enteritis gh of a parvovirus related to feline panleucopaenia virus Australian Veterinary tn to 19 ie p Journal 55 (3) pp 151-152 Kelly, W (1978) An enteric disease of dogs resembling feline panleucopaenia w 20 Lin, C.-N., Chien, C.-H., Chiou, M.-T., Chueh, L.-L., Hung, M.-Y and Hsu, H.-S d oa 21 nl Australian Veterinary Journal 54 (12).pp 593-593 (2014) Genetic characterization of type 2a canine parvoviruses from Taiwan reveals lu Martella, V., Cavalli, A., Pratelli, A., Bozzo, G., Camero, M., Buonavoglia and u nf va 22 an the emergence of an Ile324 mutation in VP2 Virology journal 11(1).pp 39 Buonavoglia, C (2004) A canine parvovirus mutant is spreading in Italy Journal ll Martella, V., Decaro and Buonavoglia, C (2006) Evolution of CPV-2 and oi 23 m of Clinical Microbiology 42 (3) pp 1333-1336 z at nh implicance for antigenic/genetic characterization Virus genes 33(1) pp 11-13 24 Mochizuki, M., Harasawa, R., and Nakatani, H (1993) Antigenic and genomic z variabilities among recently prevalent parvoviruses of canine and feline origin in @ 25 gm Japan Veterinary microbiology 38(1-2) pp 1-10 Moraillon, R (1993) Les vomissements des carnivores Orientaton diagnostique l 26 m co et conduite a tenir Recueil de Medecine Veterinaire 169 pp 963-967 Nakamura, M., Tohya, Y., Miyazawa and Mochizuki (2004) A novel antigenic an Lu variant of canine parvovirus from a Vietnamese dog Archives of virology 149(11).pp 2261-2269 n va ac th 53 si 27 Ohshima, T., Hisaka, M., Kawakami, K., Kishi, M., Tohya and Mochizuki, M (2008) Chronological analysis of canine parvovirus type isolates in Japan Journal of Veterinary Medical Science 70(8) pp 769-775 28 Parrish, C R (1991) Mapping specific functions in the capsid structure of canine parvovirus and feline panleukopenia virus using infectious plasmid clones Virology.183(1).pp 195-205 29 Pérez, R., Francia, L., Romero, V., Maya, L., López and Hernández, M (2007) First detection of canine parvovirus type 2c in South America Veterinary microbiology 124(1-2) pp.147-152 30 Reed, A P., Jones, E V and Miller, T J (1988) Nucleotide sequence and genome organization of canine parvovirus Journal of virology 62(1) pp 266-276 lu 31 Steinel, A., Munson, L., Van Vuuren and Truyen, U (2000) Genetic characterization an of feline parvovirus sequences from various carnivores Journal of General Virology va 81(2).pp 345-350 n Truyen, U (2006) Evolution of canine parvovirus—a need for new vaccines? Veterinary microbiology 117(1) pp 9-13 gh tn to 32 33 Truyen, U., Steinel, A., Bruckner, L., Lutz and Möstl, K (2000) Distribution of ie p antigen types of canine parvovirus in Switzerland, Austria and Germany Schweizer Archiv Fur Tierheilkunde 142(3) pp 115-119 w Vannamahaxay, S., Vongkhamchanh, S., Intanon, M., Tangtrongsup, S., oa nl 34 Tiwananthagorn, S., Pringproa and Chuammitri, P (2017) Molecular characterization d 35 an lu of canine parvovirus in Vientiane, Laos Archives of virology 162(5).pp 1355-1361 Woods, C (1980) Canine parvoviral enteritis Journal of the American Animal va Zhou, P., Zeng, W., Zhang, X and Li, S (2017) The genetic evolution of canine ll 36 u nf Hospital Association 16(2) pp 171-179 oi m parvovirus–A new perspective PLoS One, 12(3), e0175035 z at nh III Tài liệu website: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5376324/ https://www.unitedvetclinic.com/canine-parvovirus/ https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4777807/ https://vietnamese.alibaba.com/product-detail/anigen-rapid-cpv-ag-test-kit-canine- z m co l gm @ parvovirus-virus-rapid-tests-60642373717.html an Lu n va ac th 54 si