Luận văn thạc sĩ VNUA xác định một số đặc tính sinh học của parvovirus gây tiêu chảy ở chó nuôi tại thủ đô viêng chăn CHDCND lào

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM SOUKSAVANH SISAMOUTH XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA PARVOVIRUS GÂY TIÊU CHẢY Ở CHĨ NI TẠI THỦ ĐƠ VIÊNG CHĂN - CHDCND LÀO Ngành: Thú y Mã số: 8640101 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Lê Văn Phan NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP - 2019 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng thân Các kết nghiên cứu trình bày luận văn trung thực, khách quan chưa dùng bảo vệ để lấy học vị Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực luận văn cám ơn thơng tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày tháng năm 2019 Tác giả luận văn SoukSaVanh Sisamouth i LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn tác giả nhận giúp đỡ tạo điều kiện nhiều người, sau lời cảm ơn chân thành tác giả: Trước hết, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Lê Văn Phan người trực tiếp hướng dẫn tơi suốt q trình nghiên cứu hồn thành luận văn Nhờ có hướng dẫn nhiệt tình ý kiến đóng góp q báu thầy mà luận văn tơi hồn thành Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám đốc Học viện Nông nghiệp Việt Nam, Ban Quản lý đào tạo, Chủ nhiệm khoa Thú y, Bộ môn Vi sinh vật truyền- nhiễm, Phịng Thí nghiệm trọng điểm cơng nghệ sinh học Thú y, tồn thể thầy, giáo cán Khoa Thú y – Học viện Nông nghiệp Việt Nam, trang bị cho kiến thức q báu giúp đỡ tơi hồn thành cơng trình nghiên cứu luận văn Cuối cùng, tơi xin chân thành cảm ơn tới bạn bè, đồng nghiệp, người thân gia đình quan cơng tác tạo điều kiện thời gian, động viên, chia sẻ tinh thần, giúp đỡ tơi q trình học tập, nghiên cứu hoàn thành luận văn Hà Nội, ngày tháng năm 2019 Tác giả luận văn SoukSaVanh Sisamouth ii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com MỤC LỤC Lời cam đoan Error! Bookmark not defined Lời cảm ơn Error! Bookmark not defined Mục lục iii Danh mục bảng vi Danh mục hình ảnh vii Danh mục chữ viết tắt viii Trích yếu luận văn ix Thesis abstract xi Phần Mở đầu 1.1 Tính cấp thiết đề tài 1.2 Mục tiêu đề tài Phần Tổng quan tài liệu 2.1 Tình hình nghiên cứu bệnh viêm ruột tiêu chảy Parvovirus 2.1.1 Tổng quan bệnh viêm ruột tiêu chảy Parvovirus 2.1.2 Tình hình nghiên cứu bệnh viêm ruột tiêu chảy Parvovirus gây giới 2.1.3 Tình hình dịch bệnh viêm ruột tiêu chảy Parvovirus gây Lào 2.2 Đặc điểm sinh học parvovirus 2.2.1 Đặc điểm hình thái, cấu trúc hệ gen Parvovirus 2.2.2 Phân loại phân bố type Parvovirus 2.2.3 Sức đề kháng Parvovirus 2.2.4 Đặc tính ni cấy 2.2.5 Đặc tính kháng nguyên 2.2.6 Khả miễn dịch 2.2.7 Đường xâm nhập cách truyền bệnh 2.2.8 Triệu chứng 10 2.2.9 Các phương pháp chẩn đoán 12 2.3 Phòng bệnh 15 2.4 Tổng quan tế bào 17 2.4.1 Một số đặc điểm tế bào động vật 17 iii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 2.4.2 Thành phần dinh dưỡng môi trường nuôi cấy tế bào 17 2.4.3 Điều kiện nuôi cấy 18 2.4.4 Sự tạp nhiễm cách hạn chế 19 2.5 Phân lập VIRUS 19 2.5.1 Khái quát phân lập virus 19 2.5.2 Phân lập Parvovirus phục vụ nghiên cứu sản xuất Vaccine vô hoạt 20 2.6 Giải trình tự gen 21 2.7 Cây phát sinh chửng loại (Phylogenetic Tree) 21 Phần Nội dung phƣơng pháp nghiên cứu 22 3.1 Đối tượng nghiên cứu 22 3.2 Địa điểm nghiên cứu 23 3.3 Nội dung nghiên cứu 23 3.4 Nghiên vật liệu 23 3.4.1 Hóa chất 23 3.4.2 Trang thiết bị máy móc 23 3.5 Phương pháp nghiên cứu 24 3.5.1 Phường pháp lấy mẫu 24 3.5.2 Phương pháp tách DNA tổng số 24 3.5.3 Phương pháp PCR 25 3.5.4 Phương pháp điện di kiểm tra sản phẩm 26 3.5.5 Phương pháp giải trình tự gen 26 3.5.6 Phương pháp mở giống tế bào CRFK 27 3.5.7 Phương pháp cấy chuyển tế bào CRFK 27 3.5.8 Phương pháp phân lập Parvovirus tế bào CRFK 28 3.5.9 Phương pháp thu virus 29 3.5.10 Phương pháp đếm số lượng tế bào 29 3.5.11 Phương pháp xác định hiệu giá virus 30 3.5.12 Phương pháp phân tích phả hệ 32 Phần Kết thảo luận 33 4.1 Kết chẩn đoán canine parvovirus phương pháp PCR 33 4.2 Kết xây dựng phả hệ (Phylogenetic Tree) 35 4.2.1 Kết phân tích tương đồng Nuclotide chủng Parvovirus nghiên cứu 35 iv LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 4.2.2 Kết phân tích tương đồng Amino acid chủng Parvovirus nghiên cứu 39 4.2.3 Kết xây dựng phả hệ 42 4.3 Kết phân lập chủng Parvovirus môi trường nuôi cấy tế bào CRFK 43 4.3.1 Kết nuôi cấy tế bào CRFK 43 4.3.2 Kết phân lập Parvovirus 44 4.4 Kết xác định hiệu giá Parvovirus môi trường tế bào 45 4.5 Kết xác định đường cong sinh trưởng 46 4.5.1 Kết bệnh tích tế bào thời điểm thu virus 46 4.5.2 Kết chuẩn độ hiệu giá virus thời điểm thu hoạch khác 48 4.5.3 Đường cong sinh trưởng virus 48 Phần Kết luận kiến nghị 50 5.1 Kết luận 50 5.2 Kiến nghị 50 Tài liệu tham khảo 52 v LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1 Thông tin mẫu phân nghi mắc bệnh parvovirus 22 Bảng 3.2 Thành phần phản ứng PCR 25 Bảng 3.3 Thông tin cặp mồi sử dụng phản ứng PCR (Canio Buonavoglia et al., 2001) 25 Bảng 3.4 Chu trình nhiệt độ phản ứng PCR 25 Bảng 3.5 Sơ đồ thí nghiệm xác định TCID50 31 Bảng 4.1 Thông tin mẫu bệnh phẩm kết chẩn đoán Parvovirus phản ứng PCR 34 Bảng 4.2 Kết chẩn đoán Parvovirus phản ứng PCR 35 Bảng 4.3 Tỷ lệ (%) tương đồng trình tự nt chủng Parvovirus nghiên cứu với với chủng Parvovirus tham chiếu khác 38 Bảng 4.4 Tỷ lệ (%) tương đồng trình tự aa chủng Parvovirus nghiên cứu với với chủng Parvovirus tham chiếu khác 41 Bảng 4.5 Kết xác định hiệu giá Parvovirus đĩa nuôi cấy tế bào 96 giếng sau 96 gây nhiễm 45 Bảng 4.6 Bệnh tích tế bào thời điểm thu virus 46 Bảng 4.7 Kết chuẩn độ TCID50 chai gây nhiễm thu hoạch thời điểm khác 48 vi LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 2.1 Cấu tạo Parvovirus Hình 2.2 Sự phân bố CPV-2a\2b\2c giới Hình 2.3 Tỷ lệ phần trăm xuất chủng CPV-2/CPV-2-like, CPV-2a, CPV-2b, CPV2C Hình 2.4 Cơ chế sinh bệnh Parvovirus chó 10 Hình 2.5 Chó bị tiêu chảy cấp, nơn mửa Parvovirus 12 Hình 2.6 Kit thử nhanh Canine Parvovirus (CPV) Ag 14 Hình 4.1 Kết chạy PCR với cặp mồi định tính 555forc/555revc (Canio Buonavoglia et al.,2001) Sản phẩm có kích thước theo dự kiến 583bp 33 Hinh 4.2 Sự tương đồng nucleotide chủng Parvovirus nghiên cứu với số chủng virus Parvovirus giới 37 Hinh 4.3 Sự tương đồng amino acid chủng Parvovirus nghiên cứu với số chủng virus Parvovirus giới 40 Hình 4.5 Tế bào CRFK sau ni cấy 24h, 48h, 72h, 96h 43 Hình 4.6 Hình ảnh đối chứng tế bào CRFK không gây nhiễm virus sau nuôi cấy 24, 48, 72, 96 44 Hình 4.7 Hình ảnh tế bào CRFK sau gây nhiễm virus 24, 48, 72, 96 44 Hình 4.8 Hình ảnh bệnh tích tế bào đối chứng âm Parvovirus gây nhiễm tế bào CRFK thời điểm 12, 24, 36, 48, 72, 96 47 Hình 4.9 Biểu đồ đường cong sinh trưởng Parvovirus tế bào CRFK 49 vii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Việt PCR Polymerase chain reaction FPV Panleucopenie feline DICT Dose Infectieuse Culture de Tissu MDCK Madin Darby Canine kidney CRFK Crandell Rees Feline Kidney HI Haemagglutination Inhibition ELISA Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay cs cộng CPV2 Canine Parvovirus type HA Haemagglutination IHC Immunohistochemistry Tm Melting temperature dNTP Deoxynucleotide Triphosphate PBS Phosphate Buffered Saline P: C: I Phenol-chlorofrom-isoamyl-alcohol MEGA Molecular Evolutionary Genetics Analysis version µl Microlit CPE Cyto Pathogenic Effect DNA Deoxyribonucleic acid RNA Ribonucleoic acid PBS Phosphate buffered saline TBE Tris/Borate/EDTA RT-PCR Reverse Transcriptase Polymerase Chain React nt Nucleotide aa Amino acid viii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: SoukSaVanh SISAMOUTH Tên luận văn: ―Xác định số đặc tính sinh học Parvovirus gây tiêu chảy chó ni Thủ Viêng Chăn - CHDCND Lào‖ Mã số: 8640101 Ngành: Thú y Tên sở đào tạo: Học Viện Nông nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu Nghiên cứu đặc tính sinh học Parvovirus chó ni thủ Viêng ChănCHDCND Lào Phƣơng pháp nghiên cứu đƣợc sử dụng - Phương pháp lấy mẫu - Phương pháp tách DNA tổng số - Phương pháp PCR - Phương pháp điện di kiểm tra sản phẩm - Phương pháp giải trình tự gen - Phương pháp phân lập parvovirus môi trường tế bào CRFK - Phương pháp xác định hiệu giá virus (TCID50/ml); - Phương pháp xác định đường biểu biễn nhân lên virus; - Phương pháp xử lý số liệu Kết kết luận Kết chẩn đốn phương pháp PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu (555forc/555revc) (Canio Buonavoglia et al.,2001) cho thấy 24 có 22 mẫu dương tính với Parvovirus chiếm tỷ lệ (92%) Kết phân tích trình tự gen VP2 cho thấy chủng virus nghiên cứu có mức độ tương đồng nt aa với 99 - 99,6% nt 97,1 - 98,8% aa Trong chủng L04 chủng L12 có mức độ tương đồng cao nt aa với tương ứng 99,6% 98,8% Kết phân tích trình tự nt aa suy diễn đoạn gen VP2 cho thấy chủng L04 có aa sai khác với chủng L05, L12, L14 Các vị trí aa sai khác gồm vị trí 318 (CH), 320 (GA), 322 (TA), 380 (FS), 414 (RW), 429 (VG) 430 (LS). Kết phân tích phả hệ dựa trình tự nt gen VP2 chủng ix LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Hinh 4.3 Sự tƣơng đồng amino acid chủng Parvovirus nghiên cứu với số chủng virus Parvovirus giới Ghi chú: Dấu (.) biểu thị trình tự aa giống với trình tự aa chủng FJ197847/Korea/Vaccine/2017 40 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Bảng 4.4 Tỷ lệ (%) tƣơng đồng trình tự aa chủng Parvovirus nghiên cứu với với chủng Parvovirus tham chiếu khác Tên chủng FJ197847/Korea/Vaccnine/2007 10 11 12 13 14 16 17 18 19 20 21 22 ID KX601674/Laos/2c/2016 88.5 ID KX601682/Laos/2c/2016 88 98.7 ID KR611522/China/2c/2014 96 92.5 92 KX601678/Laos/2c/2016 88 98.7 100 92 ID KT156832/China/2c/2014 96 92.5 92 100 92 ID KT162005/China/2c/2014 96 92.5 92 100 92 100 ID KY937650/China/2c/2016 96.5 92 91.4 99.4 91.4 99.4 99.4 ID KU744254/Taiwan/2c/2015 94.8 91.4 90.8 98.8 90.8 98.8 98.8 98.2 ID FJ222821/Italy/2c/2000 97.1 91.4 90.8 98.8 90.8 98.8 98.8 99.4 97.7 ID AB120727/Vietnam/2b/2004 97.1 91.4 90.8 98.8 90.8 98.8 98.8 99.4 97.7 100 ID FJ005203/Germany/2c/1998 97.1 91.4 90.8 98.8 90.8 98.8 98.8 99.4 97.7 100 100 ID GQ865518/Greece/2c/2008 97.1 91.4 90.8 98.8 90.8 98.8 98.8 99.4 97.7 100 100 100 ID LC214970/Vietnam/2a/2013 96.5 90.8 90.2 98.2 90.2 98.2 98.2 98.8 97.1 98.2 98.2 98.2 98.2 ID LC214969/Vietnam/2c/2013 15 ID 96 92.5 92 100 92 100 100 99.4 98.8 98.8 98.8 98.8 98.8 98.2 ID MF347723/China/2c/2016 95.4 92 91.4 99.4 91.4 99.4 99.4 98.8 98.2 98.2 98.2 98.2 98.2 97.7 99.4 ID MN119604/China/2c/2019 96 92.5 92 100 92 100 100 99.4 98.8 98.8 98.8 98.8 98.8 98.2 100 99.4 ID MF347725/China/2c/2017 96 92.5 92 100 92 100 100 99.4 98.8 98.8 98.8 98.8 98.8 98.2 100 99.4 100 ID L04/2019 95.4 92 91.4 99.4 91.4 99.4 99.4 98.8 98.2 98.2 98.2 98.2 98.2 97.7 99.4 98.8 99.4 99.4 ID L05/2019 94.2 90.8 90.2 98.2 90.2 98.2 98.2 97.7 97.1 97.1 97.1 97.1 97.1 96.5 98.2 98.8 98.2 98.2 97.7 ID L12/2019 95.4 92 91.4 99.4 91.4 99.4 99.4 98.8 98.2 98.2 98.2 98.2 98.2 97.7 99.4 98.8 99.4 99.4 98.8 97.7 ID L14/2019 94.8 91.4 90.8 98.8 90.8 98.8 98.8 98.2 97.7 97.7 97.7 97.7 97.7 97.1 98.8 98.2 98.8 98.8 98.2 97.1 98.2% 41 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com ID Kết phân tích trình tự gen cho thấy chủng virus nghiên cứu có mức độ tương đồng aa với 97,1 - 98,8% Trong chủng L04 chủng L12 có mức độ tương đồng aa với 98,8% (Bảng 4.4) Kết phân tích trình tự aa suy diễn đoạn gen cho thấy chủng L04 có aa sai khác với chủng L05, L12, L14 Các vị trí aa sai khác gồm vị trí 318 (CH), 320 (GA), 322 (TA), 380 (FS), 414 (RW), 429 (VG) 430 (LS) (Hình 4.3) Kết phân tích so sánh trình tự aa chủng Parvovirus cho thấy chủng Parvovirus Lào có mức độ tương đồng từ 94,2 - 95,4% so sánh với chủng vaccine Hàn Quốc Trong chủng L04 L12 có tỷ lệ tương đồng trình tự aa cao so với chủng virus vaccine, tỷ lệ tương đồng 95,4% aa Ngược lại chủng L05 L14 có tỷ lệ tương đồng thấp 94,2 - 94,8% aa (Bảng 4.4) 4.2.3 Kết xây dựng phả hệ Hình 4.4 Cây phả hệ chủng Parvovirus nghiên cứu dựa trình tự nucleotide amino acid 42 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Sau so sánh mức độ tương đồng nt aa chủng Parvovirus nghiên cứu, dựa vào phần mềm MEGA7 tiến hành xây dựng sinh học phân tử để xác định phân tích nguồn gốc phát sinh chủng virus nghiên cứu với chủng Parvovirus tham chiếu khác lấy từ ngân hàng GenBank Kết xây dựng phả hệ dựa trình tự nt gen VP2 chủng Parvovirus cho thấy chủng L04, L05, L12, L14 nghiên cứu nằm nhánh phát sinh với chủng Parvovirus gây bệnh chó có mối quan hệ gần gũi với chủng nằm Genotype 2c Trung Quốc (GenBank: MF347723, KT156832, MF347725) chủng Việt Nam (Genbank: LC214969) (Hình 4.4) Dựa kết phân tích mức độ tương đồng nt, aa kết phân tích phả hệ cho thấy chủng Parvovirus nghiên cứu L04, L05, L12 L14 thuộc Genotype 2c 4.3 KẾT QUẢ PHÂN LẬP CHỦNG PARVOVIRUS TRÊN MÔI TRƢỜNG NI CẤY TẾ BÀO CRFK 4.3.1 Kết ni cấy tế bào CRFK Tế bào CRFK phục hồi thực cấy chuyển xác định mật độ tế bào thích hợp để gây nhiễm với mơi trường ni cấy DMEM có bổ sung 5% FBS Một ống giống tế bào CRFK chứa 5x106 tế bào, lấy từ bình Nitơ lỏng ni cấy chai T25 Trong q trình ni, mật độ tế bào ghi chép thời điểm khác Kết quan sát cho thấy tế bào sau 12h bắt đầu bám đáy, sau 24h tế bào vươn dài bám vào bề mặt chai Tế bào có hình dạng thn dài, vươn phủ khoảng 80% bề mặt chai sau 48h, sau 72h tế bào phủ kín, bắt đầu có dấu hiệu già, tế bào chết co tròn lên a) Tế bào 24h b) Tế bào 48h c) Tế bào 72h d) Tế bào 96h Hình 4.5 Tế bào CRFK sau nuôi cấy 24h, 48h, 72h, 96h 43 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 4.3.2 Kết phân lập Parvovirus Kết phân tích phả hệ cho thấy chủng parvovirus nghiên cứu có tương đồng cao (gần 100%) trình tự nt aa, thuộc Genotype 2c Ngoài nghiên cứu dịch tễ học phân tử, nghiên cứu chủng parvovirus phân lập thành công môi trường tế bào CRFK a) ĐC 24h b) ĐC 48h c) ĐC 72h d) ĐC 96h Hình 4.6 Hình ảnh đối chứng tế bào CRFK khơng gây nhiễm virus sau nuôi cấy 24, 48, 72, 96 a) CPE 24h b) CPE 48h c) CPE 72h d) CPE 96h Hình 4.7 Hình ảnh tế bào CRFK sau gây nhiễm virus 24, 48, 72, 96 44 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Kết phân lập virus môi trường tế bào CRFK cho thấy bệnh tích tế bào (CPE) xuất sau 24 h gây nhiễm virus, tế bào bị phá hủy, co tròn, lên Đến 48h đa số tế bào CRFK bị phá hủy lên Sau 72h trở đi, tế bào bị phá hủy gần hoàn toàn (Hình 4.5 4.6) Để khẳng định thành cơng phân lập virus, tế bào gây nhiễm không gây nhiễm virus xác nhận phản ứng PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu phát Parvovirus (555forc/555revc) (Canio Buonavoglia et al.,2001) Kết phản ứng PCR thu sản phẩm PCR có kích thước 583 bp, với kích thước cơng bố cặp mồi (kết hiện) Chủng virus phân lập thành công đặt tên L12 4.4 KẾT CỦA XÁC ĐỊNH HIỆU GIÁ CỦA PARVOVIRUS TRÊN MÔI TRƢỜNG TẾ BÀO Để xác định nồng độ chủng virus phân lập được, tế bào CRFK sử dụng để chuẩn độ virus Kết chuẩn độ để xác định hiệu giá Parvovirus môi trường tế bào thể bảng 4.5 Bảng 4.5 Kết xác định hiệu giá Parvovirus đĩa nuôi cấy tế bào 96 giếng sau 96 gây nhiễm 10 11 12 A + + + + + + - - - - - - B + + + + + + - - - - - - C + + + + + - - - - - - - D + + + + + - - - - - - - E + + + + + + - - - - - - F + + + + + - - - - - - - G + + + + + + - - - - - - H + + + + + + - - - - - - Chú thích: – Giếng khơng có bệnh tích tế bào (CPE), tế bào bám đáy phát triển bình thường + Giếng có bệnh tích tế bào (CPE), tế bào bị phá hủy hoàn toàn 45 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Kết chuẩn độ virus cho thấy 10-6 độ pha loãng virus lớn quan sát bệnh tích Ở độ pha lỗng 10-7 đến 10-10 khơng quan sát bệnh tích Theo cơng thức tính Spearman – Karber, chủng L12 xác định có hiệu giá 106.13 TCID50/1 ml Log10TCID50/ml = 6.13 4.5 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH ĐƢỜNG CONG SINH TRƢỞNG Để theo dõi trình phát triển, nhân lên theo thời gian thời điểm đạt hiệu giá cao Parvovirus phân lập được, nghiên cứu thí nghiệm xác định đường cong sinh trưởng chủng virus L12 thiết lập Quá trình xác định đường cong sinh trưởng thực sau: Tiến hành gây nhiễm virus với nồng độ 0,69 × 106.13/ml lên tế bào chai T25 với liều 0.5 ml/chai chai làm đối chứng âm không gây nhiễm virus Cả chai sau ni điều kiện 37ºC 5% CO2 Virus thu thời điểm 12, 24, 36, 48, 60 72, 84, 96 sau gây nhiễm Sau 96h, tất chai gây nhiễm tiến hành đông tan lần thu virus Hàm lượng virus thời điểm khác xác định phương pháp chuẩn độ TCID50 4.5.1 Kết bệnh tích tế bào thời điểm thu virus Sau trình gây nhiễm virus, bệnh tích tế bào CPE quan sát thời điểm thu virus Bệnh tích tế bào thời điểm 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84, 96 sau gây nhiễm thể bảng 4.6: Bảng 4.6 Bệnh tích tế bào thời điểm thu virus Thời điểm 12h 24h 36h 48h 60h 72h 84h Bệnh tích tế bào - + ++ +++ ++++ ++++ ++++ Chú thích: 96h ++++ (-) tế bào chưa xuất bệnh tích; (+) tế bào xuất bệnh tích khoảng 10%; (++) tế bào có bệnh tích khoảng 50%; (+++) tế bào có bệnh tích khoảng 70%; (++++) tế bào có bệnh tích khoảng 100% 46 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com ĐC tế bào 12h ĐC tế bào 24h ĐC tế bào 36h ĐC tế bào 48h ĐC tế bào 72h ĐC tế bào 96h CPE 12h CPE 24h CPE 36h CPE 48h CPE 72h CPE 96h Hình 4.8 Hình ảnh bệnh tích tế bào đối chứng âm Parvovirus gây nhiễm tế bào CRFK thời điểm 12, 24, 36, 48, 72, 96 47 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Kết quan sát CPE thời điểm thu virus cho thấy sau 12h bệnh tích tế bào chưa xuất hiện; sau 24h quan sát kính hiển vi soi ngược (khoảng 10%), số lượng tế bào bị phá hủy tăng dần sau 36h gây nhiễm đạt khoảng 50%, đạt xấp xỉ 70% thời điểm 48h sau gây nhiễm CPE đạt 100% ghi nhận thời điểm 60h sau gây nhiễm virus L12 thu virus thời điểm 96h Bảng 4.7 Kết chuẩn độ TCID50 chai gây nhiễm thu hoạch thời điểm khác Thời điểm thu virus Log10TCID50/ml 12h 1.25 24h 2.50 36h 3.50 48h 5.50 60h 5.75 72h 6.00 84h 5.00 96h 4.00 4.5.2 Kết chuẩn độ hiệu giá virus thời điểm thu hoạch khác Để xác định thời điểm thu nồng độ virus cao nhất, thí nghiệm đo hiệu giá thời điểm thu virus tiến hành Kết chuẩn độ tính theo cơng thức Spearman – Kaber tổng hợp bảng sau: Sau gây nhiễm Parvovirus lên tế bào CRFK từ 12 đến 72 , hiệu giá virus tăng dần từ 1.25 Log10TCID50 đến 6.00 Log10TCID50 Sau 72 giờ, hiệu giá virus giảm dần thu virus thời điểm 96 hiệu giá virus 4.00 Log10TCID50 4.5.3 Đƣờng cong sinh trƣởng virus Tổng hợp kết chuẩn độ hiệu giá virus, đường cong sinh trưởng xây dựng có biến Log10 TCID50 thời điểm thu virus thể biểu đồ sau: 48 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Hình 4.9 Biểu đồ đường cong sinh trưởng Parvovirus tế bào CRFK Biểu đồ cho thấy chủng L12 có hiệu giá tăng dần theo thời gian, ổn định từ khoảng 48h đến 72h sau gây nhiễm Hiệu giá đạt cực đại (106 TCID50/ml) thời điểm 72h sau gây nhiễm Từ sau 72h trở đi, tế bào bị phá hủy nhiều hơn, nồng độ virus giảm xuống nhanh chóng, tới 96h sau gây nhiễm, hiệu giá virus giảm xuống khoảng 1.5 log so với cực đại Như vậy, thời gian virus phát triển nhanh từ 48h đến 72h, sau 72h nồng độ virus có xu hướng giảm dần Từ đó, xác định thời điểm thu virus thích hợp để virus đạt hiệu giá cao Kết phân tích đường cong sinh trưởng chủng virus L12 cho thấy virus đạt hiệu giá cao giai đoạn 60h đến 72h sau gây nhiễm 49 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN 1) Kết chẩn đoán Parvovirus phương pháp PCR cho thấy 22/24 (92%) mẫu phân tiêu chảy từ chó nghi mắc Parvovirus cho kết dương tính 2) Kết phân tích trình tự gen VP2 cho thấy chủng virus nghiên cứu có mức độ tương đồng nt aa với 99 - 99,6% (nt) 97,1 98,8% (aa) Trong chủng L04 chủng L12 có mức độ tương đồng cao nt aa với tương ứng 99,6% 98,8% Kết phân tích trình tự nt aa suy diễn đoạn gen VP2 cho thấy chủng L04 có aa sai khác với chủng L05, L12, L14 Các vị trí aa sai khác gồm vị trí 318 (CH), 320 (GA), 322 (TA), 380 (FS), 414 (RW), 429 (VG) 430 (LS) 3) Kết phân tích so sánh trình tự nt chủng Parvovirus cho thấy chủng Parvovirus Lào có mức độ tương đồng từ 97,3 - 97,7% nt 94,2 95,4% aa so sánh vơi chủng vaccine Hàn Quốc Trong chủng L04 L12 có tỷ lệ tương đồng trình tự nt aa cao so với chủng virus vaccine, tỷ lệ tương đồng 97,7% nt 95,4% aa Ngược lại chủng L05 L14 có tỷ lệ tương đồng thấp 97,3 - 97,5% nt 94,2 - 94,8% aa 4) Kết phân tích phả hệ dựa trình tự nt gen VP2 chủng Parvovirus cho thấy chủng L04, L05, L12, L14 nằm nhánh phát sinh với chủng Parvovirus gây bệnh chó có mối quan hệ gần gữi với chủng nằm Genotype 2c Trung Quốc (GenBank: MF347723, KT156832, MF347725) chủng Việt Nam (Genbank: LC214969) 5) Đã phân lập thành công parvovirus môi trường tế bào CRFK 6) Chủng virus phân lập có hiệu giá 106.13 TCID50/ml 5.2 KIẾN NGHỊ Tiếp tục thu thập chó mắc Parvovirus giống chó khác để phân lập nhiều mẫu Parvovirus phục vụ cho việc sàng lọc lựa chọn chủng virus từ thực địa Tiếp tục nghiên cứu đánh giá ổn định đặc tính sinh học chủng Parvovirus phân lập môi trường nuôi cấy qua nhiều đời đánh giá độc lực chó thí nghiệm 50 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Tiếp tục nghiên cứu giải trình tự tồn genome chủng Parvovirus phân lập nhằm xác định khác liệu di truyền chủng virus nghiên cứu Nghiên cứu lựa chọn chủng vaccine Parvovirus thích hợp cho việc sản xuất kháng thể đơn dòng phục vụ chẩn đoán chế tạo Kit chẩn đoán nhanh chó mắc Parvovirus 51 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com TÀI LIỆU THAM KHẢO I Tài liệu tiếng Việt: Bích, T N., Thảo, T T., Việt, N Q., Mai, N T Y (2013) KHẢO SÁT TỶ LỆ BỆNH DO PARVOVIRUS TRÊN CHÓ TỪ ĐẾN THÁNG TUỔI Ở THÀNH PHỐ CẦN THƠ Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ tr 15-20 Du, T., Giao, X (2006) Kỹ thuật ni chó, mèo phòng trị bệnh thường gặp NXB lao động xã hội, Hà Nội Tr 69 -72 Nguyễn Như Pho (2003) Bệnh Parvovirus Care chó." NXB Nơng Nghiệp, Hà Nội Nguyễn Văn Thanh, Vũ Như Quán, Sử Thanh Long Nguyễn Đức Trường (2016) Bệnh chó Việt Nam biện pháp phịng trị NXB Nơng nghiệp, Hà Nội Phạm Sỹ Lăng cs (2006) Kỹ thuật ni chó phịng chống bệnh cho chó." NXB Lao động xã hội, Hà Nội Phan, T K N., Trần, T N T (2002) Thực tiêu sinh sản tế bào thực vật: Ủy ban nhân dân tỉnh an Giang Trường đại học An Giang Trần Thanh Phong Nguyễn Thị Thơ (1996) Một số bệnh truyền nhiễm chó Vương Đức Chất Lê Thị Tài (2004) Bệnh thường gặp chó mèo cách phịng trị NXB Nông nghiệp Hà Nội ( ed.) II Tài liệu tiếng Anh: Allen, R., Pereira, L., Raes, D., and Smith, M (1998) Guidelines for computing crop water requirements-FAO Irrigation and drainage paper 56; FAO-Food and Agriculture Organization of the United Nations, Rome (http://www fao org/docrep) ARPAV (2000), La caratterizzazione climatica della Regione Veneto, Quaderni per Geophysics pp 156, 178 10 Buonavoglia, C., Martella, V., Pratelli, A., Tempesta, M., Cavalli, A., Buonavoglia and Carmichael, L (2001) Evidence for evolution of canine parvovirus type in Italy Journal of General Virology 82(12) pp 3021-3025 11 Buonavoglia, D., Cavalli, A., Pratelli, A., Martella, V., Greco, G., Tempesta, M., and Buonavoglia, C (2000) Antigenic analysis of canine parvovirus strains isolated in Italy The new microbiologica 23(1) pp 93-96 12 Burtonboy, G., Coignoul, F., Delferriere, N and Pastoret, P.-P (1979) Canine hemorrhagic enteritis: detection of viral particles by electron microscopy Archives of virology 61(1-2) pp 1-11 52 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 13 Butler, J (2004) Undoing gender: routledge 14 Carmichael, L., and Binn, L (1981) New enteric viruses in the dog Advances in Veterinary Science and Comparative Medicine (USA) 15 Carmichael, L., Joubert, J., and Pollock, R (1980) Hemagglutination by canine parvovirus: serologic studies and diagnostic applications American journal of veterinary research 41(5) pp 784-791 16 Decaro, N., Desario, C., Addie, D D., Martella, V., Vieira, M J., Elia and G Thiry, E (2007) Molecular epidemiology of canine parvovirus, Europe Emerging infectious diseases 13(8) pp 1222 17 Decaro, N., Elia, G., Martella, V., Campolo, M., Desario, C., Camero and Narcisi, D (2006) Characterisation of the canine parvovirus type variants using minor groove binder probe technology Journal of virological methods 133(1) pp 92-99 18 Hong, C., Decaro, N., Desario, C., Tanner, P., Pardo, M C., Sanchez and Saliki, J T (2007) Occurrence of canine parvovirus type 2c in the United States Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, 19(5) pp 535-539 19 Johnson, R and Spradbrow, P (1979) Isolation from dogs with severe enteritis of a parvovirus related to feline panleucopaenia virus Australian Veterinary Journal 55 (3) pp 151-152 20 Kelly, W (1978) An enteric disease of dogs resembling feline panleucopaenia Australian Veterinary Journal 54 (12).pp 593-593 21 Lin, C.-N., Chien, C.-H., Chiou, M.-T., Chueh, L.-L., Hung, M.-Y and Hsu, H.-S (2014) Genetic characterization of type 2a canine parvoviruses from Taiwan reveals the emergence of an Ile324 mutation in VP2 Virology journal 11(1).pp 39 22 Martella, V., Cavalli, A., Pratelli, A., Bozzo, G., Camero, M., Buonavoglia and Buonavoglia, C (2004) A canine parvovirus mutant is spreading in Italy Journal of Clinical Microbiology 42 (3) pp 1333-1336 23 Martella, V., Decaro and Buonavoglia, C (2006) Evolution of CPV-2 and implicance for antigenic/genetic characterization Virus genes 33(1) pp 11-13 24 Mochizuki, M., Harasawa, R., and Nakatani, H (1993) Antigenic and genomic variabilities among recently prevalent parvoviruses of canine and feline origin in Japan Veterinary microbiology 38(1-2) pp 1-10 25 Moraillon, R (1993) Les vomissements des carnivores Orientaton diagnostique et conduite a tenir Recueil de Medecine Veterinaire 169 pp 963-967 26 Nakamura, M., Tohya, Y., Miyazawa and Mochizuki (2004) A novel antigenic variant of canine parvovirus from a Vietnamese dog Archives of virology 149(11).pp 2261-2269 53 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 27 Ohshima, T., Hisaka, M., Kawakami, K., Kishi, M., Tohya and Mochizuki, M (2008) Chronological analysis of canine parvovirus type isolates in Japan Journal of Veterinary Medical Science 70(8) pp 769-775 28 Parrish, C R (1991) Mapping specific functions in the capsid structure of canine parvovirus and feline panleukopenia virus using infectious plasmid clones Virology.183(1).pp 195-205 29 Pérez, R., Francia, L., Romero, V., Maya, L., López and Hernández, M (2007) First detection of canine parvovirus type 2c in South America Veterinary microbiology 124(1-2) pp.147-152 30 Reed, A P., Jones, E V and Miller, T J (1988) Nucleotide sequence and genome organization of canine parvovirus Journal of virology 62(1) pp 266-276 31 Steinel, A., Munson, L., Van Vuuren and Truyen, U (2000) Genetic characterization of feline parvovirus sequences from various carnivores Journal of General Virology 81(2).pp 345-350 32 Truyen, U (2006) Evolution of canine parvovirus—a need for new vaccines? Veterinary microbiology 117(1) pp 9-13 33 Truyen, U., Steinel, A., Bruckner, L., Lutz and Möstl, K (2000) Distribution of antigen types of canine parvovirus in Switzerland, Austria and Germany Schweizer Archiv Fur Tierheilkunde 142(3) pp 115-119 34 Vannamahaxay, S., Vongkhamchanh, S., Intanon, M., Tangtrongsup, S., Tiwananthagorn, S., Pringproa and Chuammitri, P (2017) Molecular characterization of canine parvovirus in Vientiane, Laos Archives of virology 162(5).pp 1355-1361 35 Woods, C (1980) Canine parvoviral enteritis Journal of the American Animal Hospital Association 16(2) pp 171-179 36 Zhou, P., Zeng, W., Zhang, X and Li, S (2017) The genetic evolution of canine parvovirus–A new perspective PLoS One, 12(3), e0175035 III Tài liệu website: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5376324/ https://www.unitedvetclinic.com/canine-parvovirus/ https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4777807/ https://vietnamese.alibaba.com/product-detail/anigen-rapid-cpv-ag-test-kit-canineparvovirus-virus-rapid-tests-60642373717.html 54 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com ... YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: SoukSaVanh SISAMOUTH Tên luận văn: ? ?Xác định số đặc tính sinh học Parvovirus gây tiêu chảy chó ni Thủ đô Viêng Chăn - CHDCND Lào? ?? Mã số: 8640101 Ngành: Thú y Tên sở đào... ruột tiêu chảy Parvovirus chó từ chủng virus thực địa Xuất phát từ vấn đề thực tế thực đề tài: ―XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA PARVOVIRUS GÂY TIÊU CHẢY Ở CHĨ NI TẠI THỦ ĐƠ VIÊNG CHĂN -CHDCND. .. ĐƠ VIÊNG CHĂN -CHDCND LÀO.‖ 1.2 MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI  Xác định số đặc tính sinh học chủng Parvovirus phân lập ngồi thực địa  Xác định số đặc tính sinh học phân tử chủng Parvovirus LUAN VAN CHAT