Nghiên cứu đặc điểm sinh học một số chủng baccillus thuringiensis sinh protein tinh thể diệt côn trung bộ cánh cứng

ĐạI HọC THáI NGUYÊN TRƯờNG ĐạI HọC KHOA HọC PHùNG HUY TRọNG NGHIÊN CứU ĐặC ĐIểM SINH HọC MộT Số CHủNG Baccillus thuringiensis SINH PROTEIN TINH THể DIệT CÔN TRùNG Bộ CáNH CứNG LUậN VĂN THạC Sĩ CÔNG NGHệ SINH HäC TH¸I NGUY£N - 2013 Tai ngay!!! Ban co the xoa dong chu nay!!! i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu khoa học Các số liệu kết nêu luận văn trung thực chƣa đƣợc cơng bố cơng trình nghiên cứu khác Thái Ngun, ngày 20 tháng 04 năm 2013 Tác giả Phùng Huy Trọng ii LỜI CẢM ƠN Trong trình học tập thực luận văn, nhận đƣợc nhiều giúp đỡ, hỗ trợ thầy cô, bạn bè, đồng nghiệp gia đình Tơi xin trân trọng cảm ơn tất tình cảm q báu Trƣớc tiên, tơi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Ngơ Đình Bính, ngƣời thầy tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ tạo điều kiện để tơi hồn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn KS Đặng Văn Tiến tồn thể cán phịng Di truyền vi sinh, viện Công nghệ sinh học, viện Khoa học Cơng nghệ Việt Nam, nhiệt tình giúp đỡ suốt thời thời gian dài thực tập Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Nguyễn Vũ Thanh Thanh, giảng viên thầy cô giáo trƣờng Đại học Khoa học nhiệt tình giúp đỡ suốt thời thời gian học tập trƣờng hồn thành tốt luận văn Cuối tơi xin cảm ơn bạn bè gia đình, ngƣời ủng hộ suốt thời gian qua! Thái Nguyên, ngày 20 tháng 04 năm 2013 Học viên Phùng Huy Trọng iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii BẢNG NHỮNG TỪ VIẾT TẮT TRONG KHOÁ LUẬN v MỞ ĐẦU PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đại cƣơng vê Bacillus thuringiensis 1.1.1 Lịch sử nghiên cứu ứng dụng Bacillus thuringiensis 1.1.2 Vị trí phân loại, đặc điểm hình thái 1.1.3 Phân biệt Bt với lồi khác nhóm Bacillus cereus 1.1.4 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa 1.1.5 Đặc điểm phân loại 1.1.6 Đặc điểm gen mã hóa protein độc tố diệt côn trùng 13 1.1.7 Phân loại gen mã hóa protein độc tố diệt trùng từ Bacillus thuringiensis 14 1.1.8 Các loại độc tố Bacillus thuringiensis 15 1.1.9 Cơ chế tác động protein tinh thể độc lên côn trùng 17 1.1.10 Các yếu tố ảnh hƣởng đến trình hình thành bào tử tinh thể độc 19 1.2 Tổng quan gen cry3, Protein Cry3 dƣới loài Bacillus thuringiensis tenebrionis 20 1.2.1 Một số đặc điểm gen cry3 20 1.2.2 Đặc điểm sinh hóa huyết học Bacillus thuringiensis subsp tenebrionis 21 1.3 Tổng quan côn trùng cánh cứng (Coleoptera) 22 1.4 Tách dòng gen 26 1.4.1 Khái niệm 26 1.4.2 Vectơ tách dòng 26 iv PHẦN II : VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 28 2.1 Vật liệu 28 2.1.1 Sinh phẩm 28 2.1.2 Hoá chất thiết bị 28 2.1.3 Môi trƣờng 29 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 31 2.2.1 Phƣơng pháp phân lập 31 2.2.2 Phƣơng pháp phân loại Bt phản ứng huyết 31 2.2.3 Phƣơng pháp thử hoạt tính sinh học 32 2.2.4 Phƣơng pháp tách DNA plasmid từ vi khuẩn Bt 33 2.2.5 Phƣơng pháp PCR để khuyếch đại gen cry3A 34 2.2.6 Phƣơng pháp tách dòng gen cry3A 34 PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38 3.1 Phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis mang gen cry3A có hoạt tính diệt côn trùng cánh cứng 38 3.1.1 Kết phân lập vi khuẩn Bacillus thuringiensis 38 3.1.2 Hình dạng tinh thể chủng Bacillus thuringiensis 39 3.2 Kết phân loại dƣới loài phƣơng pháp huyết 40 3.3 Hoạt tính diệt mọt thóc đỏ 41 3.3.1 Xác định nồng độ bào tử 41 3.3.2 Thử hoạt tính sinh học với mọt thóc đỏ trƣởng thành chủng Bt phân lập 41 3.4 Sàng lọc gen cry3A chủng Bt phƣơng pháp PCR 43 3.5 Kết tách dịng gen đọc trình tự gen cry3A 44 3.5.1 Kết tách dòng gen cry3A 44 3.5.2 Xác định trình tự đoạn gen cry3A 47 PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO 51 v BẢNG NHỮNG TỪ VIẾT TẮT TRONG KHOÁ LUẬN STT Viết tắt Viết đầy đủ Amp Ampicillin Bp Base pair Bt Bacillus thuringiensis Bt.t Bacillus thuringiensis subsp tenebrionis DNA Deoxyribonucleotide acid E coli Escherichia coli EDTA Ethylene diamine tetra - acetic acid LB Môi trƣờng Lauria Betani PCR Polymerase chain reaction 10 SDS Sodium dodecyl sulphate 11 Sol Solution 12 TAE Tris - Acetate - EDTA 13 X- gal - Bromo - Cloro - indolyl ß - d galactoside 14 kDa Kilo Dalton 15 dH2O Deion water vi DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Sự phân loại Bacillus thuringiensis dựa vào kháng nguyên tiên mao H Bảng 1.2 Phân loại gen cry mã hóa protein độc tố Cry diệt trùng 14 Bảng 1.3 Các điểm trình tự tham khảo vectơ pGEM - T easy 27 Bảng 3.1 Kết phân lập Bacillus thuringiensis mẫu đất 39 Bảng 3.2 Hình dạng tinh thể chủng Bt phân lập 40 Bảng 3.3 Kết thử hoạt tính diệt âú trùng mọt thóc đỏ trƣởng thành chủng Bt sau ngày thử nghiệm 42 vii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Tế bào vi khuẩn Bacillus thuringiensis Hình 1.2 Tinh thể vi khuẩn Bacillus thuringiensis Hình 1.3 Cơ chế diệt sâu vi khuẩn Bacillus thuringiensis 18 Hình 1.4 Cấu trúc không gian protein Cry3A 21 Hình 1.5 Một số hình ảnh côn trùng cánh cứng 22 Hình 1.6 Ấu trùng mọt thóc đỏ trƣởng thành 23 Hình 1.7 Chu kỳ sống phát triển mọt thóc đỏ (Tribolium castaneum) 25 Hình 1.8 Vectơ tách dịng pGEM - T easy 27 Hình 3.1 Hình dạng khuẩn lạc vi khuẩn Bacillus thuringiensis môi trƣờng MPA phân lập từ đất Nha Trang nuôi cấy 280C sau ngày 38 Hình 3.2 Hình dạng tinh thể chủng Bt phân lập đƣợc nhuộm fushin soi dƣới kính hiển vi điện tử 39 Hình 3.3 Hình ảnh ngƣng kết chủng ĐNT 9.5 phân lập với type huyết dƣới kính hiển vi quang học với độ phóng đại 1000 lần 41 Hình 3.4 Hình ảnh thử hoạt tính diệt ấu trùng mọt thóc đỏ trƣởng thành chủng Bt phân lập…………………………………………………………43 Hình 3.5 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR gel agarose 1% 43 Hình 3.6 Khuẩn lạc xanh, trắng xuất môi trƣờng LBA sau nuôi cấy qua đêm 44 Hình 3.7 Điện di sản phẩm cắt DNA plasmide tách chiết từ dòng khuẩn lạc ĐNT 9.5 agarose 1% 46 Hình 3.8 Kết PCR DNA plasmid dòng khuẩn lạc chủng ĐNT 9.5 biến nạp băng mồi mồi đặc hiệu gen cry3A 47 Hình 3.9: So sánh trình tự đoạn gen cry3A chủng ĐNT9.5 với mã trình tự có mã số M37207.1 EU 332160.1 49 MỞ ĐẦU Côn trùng cánh cứng (Coleoptera) đƣợc biết đến với số lƣợng loài lớn có 250.000 lồi đƣợc mơ tả Trong đó, nhiều lồi thuộc cánh cứng côn trùng gây hại nhƣ: Anomala, Tenebrio molitar… Chúng phá hoại mùa màng, nông sản, làm giảm chất lƣợng nông sản phẩm, đặc biệt lƣơng thực sau thu hoạch Bên cạnh có nhiều lồi trùng thuộc cánh cứng phá hại lâm sản làm thiệt hại lớn cho ngành công nghiệp sản xuất gỗ: Anobiidae (họ mọt gỗ), Cerambycidae (họ xén tóc), Bostrychidae (họ mọt dài)… Theo báo cáo thống kê nhiều nƣớc giới trùng thuộc cánh cứng đƣợc xếp vào loài gây thiệt hại kinh tế nghiêm trọng Có nhiều biện pháp hoá học sinh học đƣợc áp dụng để khắc phục tình trạng Tuy nhiên biện pháp hố học lại thƣờng gây tính kháng thuốc trùng, đồng thời thuốc hố học cịn gây ảnh hƣởng đến sức khỏe cộng đồng, góp phần làm cân sinh thái nhiễm mơi trƣờng Vì vậy, tổ chức Nông lƣơng giới (FAO), tổ chức Y tế giới (WHO) tổ chức Môi trƣờng giới khuyến cáo hạn chế đến mức tối đa việc sử dụng hoá chất tăng cƣờng sử dụng thuốc trừ sâu sinh học Trong số loại thuốc trừ sâu sinh học đƣợc sử dụng loại thuốc có nguồn gốc từ vi khuẩn Bacillus thuringiensis (Bt) có hiệu diệt sâu cao Hiện thuốc trừ sâu sinh học Bt chiếm 90% thị phần thuốc trừ sâu sinh học giới, ngày đƣợc sử dụng cách rộng rãi Thuốc trừ sâu sinh học Bt có nhiều ƣu điểm nhiên nhƣợc điểm chƣa khắc phục đƣợc chế phẩm Bt có phổ tác dụng hẹp - đặc hiệu với vài loài côn trùng Bản chất đặc hiệu gen mã hóa protein tinh thể diệt trùng tế bào vi khuẩn định Trong số 70 nhóm gen cry đƣợc phát gen cry3 số gen mã hóa protein tinh thể diệt trùng cánh cứng, lồi trùng khó tiêu diệt Việc nghiên cứu sâu gen cần thiết Xuất phát từ mục đích tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm sinh học số chủng Bacillus thuringiensis sinh protein tinh thể diệt côn trùng cánh cứng” Mục tiêu đề tài: - Tuyển chọn đƣợc chủng Bacillus thuringiensis subsp tenebrionis có hoạt tính diệt ấu trùng mọt thóc đỏ trƣởng thành (Tribolium castaneum) cao - Xác định đƣợc trình tự gen cry3A từ chủng Bt subsp tenebrionis tuyển chọn Nhiệm vụ đề tài: - Phân lập chủng Bacillus thuringiensis từ mẫu đất, mẫu Nha Trang Quảng Nam - Sàng lọc chủng Bt có hoạt tính diệt ấu trùng mọt thóc đỏ trƣởng thành - Phát gen cry3A phƣơng pháp PCR - Tách dòng gen cry3A mã hố protein tinh thể diệt trùng cánh cứng - Xác định trình tự đoạn gen cry3A so sánh với trình tự ngân hàng gen quốc tế 41 Hình 3.3 Hình ảnh ngƣng kết chủng ĐNT 9.5 phân lập với type huyết dƣới kính hiển vi quang học với độ phóng đại 1000 lần A: trƣớc nhỏ huyết B: sau nhỏ huyết (các tế bào ngƣng kết lại thành đám) Kết phân loại dƣới loài huyết cho thấy, số 11 chủng mang tinh thể hình lập phƣơng có chủng ngƣng kết với type huyết tenebrionis điều chứng tỏ chủng có khả thuộc dƣới lồi Bacillus thuringiensis subsp tenebrionis 3.3 Hoạt tính diệt mọt thóc đỏ 3.3.1 Xác định nồng độ bào tử Trƣớc tiến hành thử hoạt tính diệt mọt thóc đỏ, chúng tơi tiến hành xác định nồng độ bào tử chủng Bt có khả thuộc dƣới loài Bacillus thuringiensis subsp tenebrionis phân lập đƣợc đất Quảng Nam Nha Trang Các bƣớc thực đƣợc trình bày mục 2.2.4.1 phần vật liệu phƣơng pháp Nồng độ bào tử chủng đem thử hoạt tính dao động khoảng 1.1010 – 1,3 1011 bào tử/ml 3.3.2 Thử hoạt tính sinh học với mọt thóc đỏ trƣởng thành chủng Bt phân lập Các chủng Bt đƣợc pha loãng tới nồng độ 1.107 - 1.109 bào tử/ml nƣớc cất vô trùng Tiến hành thử hoạt tính chủng xác định dƣới lồi Bt.tenebrionis Tỷ lệ mọt thóc đỏ chết đƣợc tính sau ngày thử nghiệm Kết thử nghiệm đƣợc trình bày bảng 3.3, hình 3.4 42 Bảng 3.3 Kết thử hoạt tính diệt ấu trùng mọt thóc đỏ trƣởng thành chủng Bt sau ngày thử nghiệm Tên chủng Tỷ lệ mọt chết (%) Nồng độ 107 bào tử/ml Nồng độ 109 bào tử/ml ĐNT 9.5 73,3 80,6 ĐNT 7.2 33,33 56,67 ĐNT 8.4 56,67 72,1 ĐNT 5.3 62,3 72,1 ĐNT 6.2 56,67 71,8 LNT 5.3 33,33 62,3 LNT 14.8 20 47,6 ĐTXTT 1.7 62,3 78,1 ĐTXTT 15 47,6 3.10 Hình 3.4 Hình ảnh thử hoạt tính diệt ấu trùng mọt thóc đỏ trƣởng thành chủng Bt phân lập 43 Từ bảng 3.3 cho thấy hoạt tính diệt mọt thóc đỏ chủng Bt phân lập đƣợc tƣơng đối cao Sau ngày thử nghiệm, kết cho thấy chủng có hoạt tính diệt mọt thóc đỏ, nhiên có chủng ĐNT 9.5 có tỷ lệ chết cao > 80 % nồng độ 109 bào tử/ml Chủng đƣợc chọn để sàng lọc gen cry3A phƣơng pháp PCR 3.4 Sàng lọc gen cry3A chủng Bt phƣơng pháp PCR Để phát sàng lọc gen độc tố cry3A sử dụng phƣơng pháp PCR để khuyếch đại gen với cặp mồi đặc hiệu chúng Theo tính tốn lý thuyết, đoạn gen cry3A sau tổng hợp với cặp mồi đặc hiệu thu đƣợc sản phẩm có kích thƣớc 1060 bp Sản phẩm PCR đƣợc điện di kiểm tra gel agarose 1% Hình 3.5 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen cry3A gel agarose 1% ( Giếng 1: ĐNT 7.2, giếng 2: ĐTXTT 3.10, giếng 3: ĐNT 9.5, giếng 4: Marker, giếng 5: ĐNT 8.4, giếng 6: ĐNT 5.3, giếng 7: LNT 14.8, giếng 8: ĐTXTT 1.7) Kết thí nghiệm (hình 3.5) cho thấy từ chủng nghiên cứu có chủng cho sản phẩm PCR xuất băng có kích thƣớc khoảng 1000 bp nhƣ tính tốn lý thuyết Nhƣ vậy, sơ nhận xét chủng mang gen cry3A thuộc dƣới loài Bacillus thuringiensis subsp tenebrionis có chủng từ Quảng Nam chủng từ Nha Trang Trong chủng mang gen cry3A có chủng ĐNT 9.5 có hoạt lực cao mọt thóc đỏ Để khẳng định đoạn gen có chắn 44 gen cry3A hay không, tiến hành tách dịng đọc trình tự gen cry3A chủng ĐNT 9.5 (Đất Nha Trang) 3.5 Kết tách dòng gen đọc trình tự gen cry3A 3.5.1 Kết tách dòng gen cry3A 3.5.1.1 Gắn sản phẩm PCR vào vectơ tách dòng pGEM – T Easy Vector pGEM - T Easy tồn dạng mạch thẳng với đầu tƣ đầu thừa nucleotide T nên dễ dàng bắp cặp theo nguyên tắc bổ sung với đầu so le A sản phẩm PCR sử dụng Taq polymerase chúng tơi chọn vector pGEM - T Easy làm vector tách dòng Đoạn gen tính tốn theo lý thuyết 1060 bp thu đƣợc từ sản phẩm PCR chủng ĐNT 9.5 đƣợc gắn trực tiếp vào vector pGEM - T Easy đƣợc thực 40C với enzyme T4 ligase Sản phẩm vector tái tổ hợp pGEM - T Easy - cry3A - ĐNT 9.5 3.5.1.2 Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào E.coli DH5α Tiến hành biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α phƣơng pháp sốc nhiệt Sau biến nạp, chủng E.coli DH5α mang vector tái tổ hợp pGEM - T Easy - cry3A đƣợc nuôi cấy môi trƣờng LB + ampicillin + X-gal + IPTG 370C qua đêm thấy xuất khuẩn lạc màu xanh trắng xen kẽ (hình 3.6) Hình 3.6 Hình ảnh khuẩn lạc xanh, trắng xuất môi trƣờng LBA sau nuôi cấy qua đêm 1: khuẩn lạc xanh 2: khuẩn lạc trắng 45 Khuẩn lạc xanh xuất promoter lac - operon vectơ pGEM -T Easy hoạt động bình thƣờng nên Enzyme ß - galactosidase đƣợc tổng hợp (vẫn có khả chuyển hóa X - gal từ khơng màu sang màu xanh chàm) Khuẩn lạc trắng xuất hai nguyên nhân sau: Nguyên nhân thứ tế bào vi khuẩn nhận đƣợc vectơ tái tổ hợp mang đoạn DNA chèn vào vùng lac - operon gen cấu trúc lacz làm hỏng promoter gen lac - operon vectơ pGEM - T Easy nên q trình phát triển khơng tạo Enzyme ß - galactosidase, khơng có khả chuyển hố đƣợc chất x - gal có mơi trƣờng ni cấy vi khuẩn mà khơng có màu xanh Nguyên nhân thứ hai promoter điều khiển hoạt động gen mã hoá cho Enzyme ß - galactosidase bị hỏng, dẫn đến không tạo đƣợc enzym ß - galactosidase mà vi khuẩn E coli khơng chuyển hố đƣợc X gal có môi trƣờng nên tạo thành khuẩn lạc màu trắng Để biết dịng khuẩn lạc trắng có mang gen mong muốn hay không tiến hành kiểm tra phƣơng pháp tách DNA plasmid cắt Enzyme giới hạn Các dòng khuẩn lạc trắng đƣợc cấy vào mơi trƣờng LB có bổ sung ampicillin ni lắc qua đêm để tách plasmid 3.5.1.3 Kiểm tra có mặt gen cry3A dòng Plasmid tái tổ hợp Do vector pGEM - T Easy có chứa vị trí cắt Enzyme EcoRI tiếp giáp với vùng đa cắt nối (vùng cho phép cài gắn đoạn gen cần tách dịng) nên chúng tơi sử dụng Enzyme EcoRI để kiểm tra đảm bảo q trình tách dịng thực thành công với vector tái tổ hợp pGEM - T Easy - cry3A (hình 3.7) 46 Hình 3.7 Hình ảnh điện di sản phẩm cắt DNA plasmide tách chiết từ dòng khuẩn lạc ĐNT 9.5 agarose 1% (Giếng 1,2,3,4: Sản phẩm cắt DNA plasmid dòng khuẩn lạc trắng) giếng 5: Marker) Kết cho thấy plasmid dòng khuẩn lạc trắng sau cắt Enzyme EcoRI tạo băng, băng lớn vector tách dịng pGEM – T Easy có kích thƣớc khoảng 3000 bp, băng nhỏ có kích thƣớc khoảng 1000 bp tƣơng ứng với sản phẩm PCR gen cry3A Điều chứng tỏ plasmid tái tổ hợp pGEM – T Easy - cry3A - ĐNT 9.5 có mang đoạn gen cry3A Để kết luận xác plasmid tái tổ hợp có mang đoạn gen cry3A hay không tiến hành chạy PCR với khuôn DNA plasmid tái tổ hợp sử dụng cặp mồi đặc hiệu gen cry3A Sản phẩm PCR đƣợc kiểm tra điện di gel agarose 1% kết có xuất băng với kích thƣớc 1060 bp giống với sản phẩm PCR tổng số gen cry3A (hình 3.8) 47 1060 bp Hình 3.8 Kết điện di sản phẩm PCR từ DNA plasmid dòng khuẩn lạc chủng ĐNT 9.5 biến nạp mồi đặc hiệu gen cry3A ( giếng 1,2: ĐNT 9.5, giếng 3: Marker) Từ kết thu đƣợc trên, bƣớc đầu chúng tơi kết luận tách dịng thành cơng gen cry3A vector pGEM - T Easy Tuy nhiên, để kiểm tra xác gen tách dịng gen cry3A hay khơng, chúng tơi tiến hành đọc trình tự đoạn gen so sánh với trình tự gen đăng ký Ngân hàng Gen quốc tế phần mềm chuyên dụng 3.5.2 Xác định trình tự đoạn gen cry3A Sau thu nhận đƣợc plasmid có chứa đoạn gen cry3A, chúng tơi tiến hành đọc trình tự gen máy đọc trình tự DNA tự động Trình tự đƣợc so sánh với trình tự có mã số M 37207.1 EU 332160.1 ngân hành gen quốc tế Kết cho thấy trình tự đoạn gen cry3A từ chủng ĐNT 9.5 có chiều dài 1060 bp có độ tƣơng đồng 99% so với trình tự tƣơng ứng chủng cơng bố ngân hàng gen (hình 3.9) với vị trí sai khác nucleotide 396 C → T: ĐNT9.5 M37207.1 EU332160.1 10 20 30 40 50 60 | | | | | | | | | | | | AGGTGCCAAC TAACCATGTT CAATATCCTT TAGCGGAAAC TCCAAATCCA ACACTAGAAG AGGTGCCAAC TAACCATGTT CAATATCCTT TAGCGGAAAC TCCAAATCCA ACACTAGAAG AGGTGCCAAC TAACCATGTT CAATATCCTT TAGCGGAAAC TCCAAATCCA ACACTAGAAG ĐNT9.5 M37207.1 EU332160.1 70 80 90 100 110 120 | | | | | | | | | | | | ATTTAAATTA TAAAGAGTTT TTAAGAATGA CTGCAGATAA TAGTACGGAA GCACTAGATA ATTTAAATTA TAAAGAGTTT TTAAGAATGA CTGCAGATAA TAATACGGAA GCACTAGATA ATTTAAATTA TAAAGAGTTT TTAAGAATGA CTGCAGATAA TAATACGGAA GCACTAGATA ĐNT9.5 M37207.1 EU332160.1 130 140 150 160 170 180 | | | | | | | | | | | | GCTCTACAAC AAAAGATGTC ATTCAAAAAG GCATTTCCGT AGTAGGTGAT CTCCTAGGCG GCTCTACAAC AAAAGATGTC ATTCAAAAAG GCATTTCCGT AGTAGGTGAT CTCCTAGGCG GCTCTACAAC AAAAGATGTC ATTCAAAAAG GCATTTCCGT AGTAGGTGAT CTCCTAGGCG 48 ĐNT9.5 M37207.1 EU332160.1 190 200 210 220 230 240 | | | | | | | | | | | | TAGTAGGTTT CCCGTTTGGT GGAGCGCTTG TTTCGTTTTA TACAAACTTT TTAAATACTA TAGTAGGTTT CCCGTTTGGT GGAGCGCTTG TTTCGTTTTA TACAAACTTT TTAAATACTA TAGTAGGTTT CCCGTTTGGT GGAGCGCTTG TTTCGTTTTA TACAAACTTT TTAAATACTA ĐNT9.5 M37207.1 EU332160.1 250 260 270 280 290 300 | | | | | | | | | | | | TTTGGCCAAG TGAAGACCCG TGGAAGGCTT TTATGGAACA AGTAGAAGCA TTGATGGATC TTTGGCCAAG TGAAGACCCG TGGAAGGCTT TTATGGAACA AGTAGAAGCA TTGATGGATC TTTGGCCAAG TGAAGACCCG TGGAAGGCTT TTATGGAACA AGTAGAAGCA TTGATGGATC ĐNT9.5 M37207.1 EU332160.1 310 320 330 340 350 360 | | | | | | | | | | | | AGAAAATAGC TGATTATGCA AAAAATAAAG CTCTTGCAGA GTTACAGGGC CTTCAAAATA AGAAAATAGC TGATTATGCA AAAAATAAAG CTCTTGCAGA GTTACAGGGC CTTCAAAATA AGAAAATAGC TGATTATGCA AAAAATAAAG CTCTTGCAGA GTTACAGGGC CTTCAAAATA ĐNT9.5 M37207.1 EU332160.1 370 380 390 400 410 420 | | | | | | | | | | | | ATGTCGAAGA TTATGTGAGT GCATTGAGTT CATGGTAAA AAGTCCTGTG AGTTCGCGGA ATGTCGAAGA TTATGTGAGT GCATTGAGTT CATGGCAAAA AAATCCTGTG AGTTCACGAA ATGTCGAAGA TTATGTGAGT GCATTGAGTT CATGGCAAAA AAATCCTGTG AGTTCACGAA ĐNT9.5 M37207.1 EU332160.1 430 440 450 460 470 480 | | | | | | | | | | | | ATCCACATAG CCAGGGGCGG ATAAGAGAGC TGTTTTCTCA AGCAGGAAGT CATTTTCGTA ATCCACATAG CCAGGGGCGG ATAAGAGAGC TGTTTTCTCA AGCAGAAAGT CATTTTCGTA ATCCACATAG CCAGGGGCGG ATAAGAGAGC TGTTTTCTCA AGCAGAAAGT CATTTTCGTA ĐNT9.5 M37207.1 EU332160.1 490 500 510 520 530 540 | | | | | | | | | | | | ATTCGATGCC TTCGTTTGCA ATTTCTGGAT ACGAGGTTCT ATTTCTAACA ACATATGCAC ATTCAATGCC TTCGTTTGCA ATTTCTGGAT ACGAGGTTCT ATTTCTAACA ACATATGCAC ATTCAATGCC TTCGTTTGCA ATTTCTGGAT ACGAGGTTCT ATTTCTAACA ACATATGCAC ĐNT9.5 M37207.1 EU332160.1 550 560 570 580 590 600 | | | | | | | | | | | | AAGCTGCCAA CACACATTTA TTTTTACTAA AAGACGCTCA AATTTATGGA GAAGAATGGG AAGCTGCCAA CACACATTTA TTTTTACTAA AAGACGCTCA AATTTATGGA GAAGAATGGG AAGCTGCCAA CACACATTTA TTTTTACTAA AAGACGCTCA AATTTATGGA GAAGAATGGG ĐNT9.5 M37207.1 EU332160.1 610 620 630 640 650 660 | | | | | | | | | | | | GATACGAAAA AGAAGATATT GCTGAATTTT ATAAAAGACA ACTAAAACTT ACGCAAGAAT GATACGAAAA AGAAGATATT GCTGAATTTT ATAAAAGACA ACTAAAACTT ACGCAAGAAT GATACGAAAA AGAAGATATT GCTGAATTTT ATAAAAGACA ACTAAAACTT ACGCAAGAAT ĐNT9.5 M37207.1 EU332160.1 670 680 690 700 710 720 | | | | | | | | | | | | ATACTGACCA TTGTGTCAAA TGGTATAATG TTGGATTAGA TAAATTAAGA GGTTCATCTT ATACTGACCA TTGTGTCAAA TGGTATAATG TTGGATTAGA TAAATTAAGA GGTTCATCTT ATACTGACCA TTGTGTCAAA TGGTATAATG TTGGATTAGA TAAATTAAGA GGTTCATCTT ĐNT9.5 M37207.1 EU332160.1 730 740 750 760 770 780 | | | | | | | | | | | | ATGAATCTTG GGTAAACTTT AACCGTTATC GCAGAGAGAT GACATTAACA GTATTAGATT ATGAATCTTG GGTAAACTTT AACCGTTATC GCAGAGAGAT GACATTAACA GTATTAGATT ATGAATCTTG GGTAAACTTT AACCGTTATC GCAGAGAGAT GACATTAACA GTATTAGATT ĐNT9.5 M37207.1 EU332160.1 790 800 810 820 830 840 | | | | | | | | | | | | TAATTGCACT ATTTCCATTG TATGATGTTC GGCTATACCC AAAAGAAGTT AAAACCGAAT TAATTGCACT ATTTCCATTG TATGATGTTC GGCTATACCC AAAAGAAGTT AAAACCGAAT TAATTGCACT ATTTCCATTG TATGATGTTC GGCTATACCC AAAAGAAGTT AAAACCGAAT 49 ĐNT9.5 M37207.1 EU332160.1 850 860 870 880 890 900 | | | | | | | | | | | | TAACAAGAGA CGTTTTAACA GATCCAATTG TCGGAGTCAA CAACCTTAGG GGCTATGGAA TAACAAGAGA CGTTTTAACA GATCCAATTG TCGGAGTCAA CAACCTTAGG GGCTATGGAA TAACAAGAGA CGTTTTAACA GATCCAATTG TCGGAGTCAA CAACCTTAGG GGCTATGGAA ĐNT9.5 M37207.1 EU332160.1 910 920 930 940 950 960 | | | | | | | | | | | | CAACCTTCTC TAATATAGAA AATTATATTC GAAAACCACA TCTATTTGAC TATCTGCATA CAACCTTCTC TAATATAGAA AATTATATTC GAAAACCACA TCTATTTGAC TATCTGCATA CAACCTTCTC TAATATAGAA AATTATATTC GAAAACCACA TCTATTTGAC TATCTGCATA ĐNT9.5 M37207.1 EU332160.1 970 980 990 1000 1010 1020 | | | | | | | | | | | | GAATTCAATT TCACACGCGG TTCCAACCAG GATATTATGG AAATGACTCT TTCAATTATT GAATTCAATT TCACACGCGG TTCCAACCAG GATATTATGG AAATGACTCT TTCAATTATT GAATTCAATT TCACACGCGG TTCCAACCAG GATATTATGG AAATGACTCT TTCAATTATT ĐNT9.5 M37207.1 EU332160.1 1030 1040 1050 1060 | | | | | | | | GGTCCGGTAA TTATGTTTCA ACTAGACCAA GCATAGGATC GGTCCGGTAA TTATGTTTCA ACTAGACCAA GCATAGGATC GGTCCGGTAA TTATGTTTCA ACTAGACCAA GCATAGGATC Hình 3.9: So sánh trình tự đoạn gen cry3A chủng ĐNT9.5 với mã trình tự có mã số M37207.1 EU 332160.1 50 PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Đã phân lập tuyển chọn đƣợc 35 chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis từ mẫu đất Nha Trang Quảng Nam với 11 chủng mang tinh thể hình lập phƣơng chiếm 31,4%, chủng mang tinh thể hình cầu chiếm 22,8%, 11chủng mang tinh thể hình lƣỡng tháp chiếm 31.4% chủng lại mang tinh thể có hình khơng xác định chiếm 14,4% Đã phân loại đƣợc chủng dƣới loài Bt subsp tenebrionis phƣơng pháp huyết (ĐNT 9.5; ĐNT 8.4; ĐNT 5.3; ĐNT 7.2; ĐNT 6.2; LNT 5.3; LNT 14.8; ĐTXTT 1.7; ĐTXTT 3.10) Đã tuyển chọn đƣợc chủng có hoạt tính diệt mọt thóc đỏ có chủng ĐNT 9.5 có hoạt tính cao >80%; Bằng phƣơng pháp PCR phát đƣợc chủng mang gen cry3A từ chủng thuộc dƣới loài Bacillus thuringiensis subsp tenebrionis Đoạn gen có kích thƣớc 1060 bp Đã tách dịng giải trình tự gen đoạn gen đặc hiệu cry3A chủng ĐNT9.5 mã hóa protein tinh thể diệt côn trùng cánh cứng so sánh ngân hàng gen quốc tế có độ tƣơng đồng 99% với trình có mã số M37207.1 EU 332160.1 KIẾN NGHỊ Đây đoạn gen quý mã hóa protein có khả diệt mọt thóc đỏ gây hại ngũ cốc kho lƣơng thực Vì kiến nghị cần đƣợc nghiên cứu tiếp để tạo chế phẩm nhằm phục vụ mục đích bảo vệ cho kho lƣơng thực thay cho hóa chất độc hại dùng Là nguyên liệu chuyển gen cry3A vào trồng giúp trồng có khả kháng lại trùng cánh cứng 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Ngô Đình Bính, Lê Thị Minh Thành, Trịnh Thị Thu Hà, Phạm Kiều Thúy, Phạm Minh Hƣơng, Nguyễn Thị Luy, Lê thị Hồng Nhung, Đặng Văn Tiến 2010, 35 năm nghiên cứu phát triển thuốc trừ sâu sinh học Bacillus Thuringiensis Việt Nam Hội nghị khoa học kỷ niệm 35 năm thành lập Viện Khoa học Công nghệ VIệt Nam 1975-2010 Nhà xuất khoa học tự nhiên cơng nghệ 288-300 Ngơ Đình Bính, Nguyễn Quỳnh Châu, Nguyễn Ánh Nguyệt 2002 Thu nhận huyết miễn dịch cho phân loại Bacillus thuringiensis Kỷ yếu Viện Công nghệ Sinh học 200-2001 296-303 Ngơ Đình Bính, Nguyễn Quỳnh Châu, Nguyễn Văn Thƣởng, Nguyễn Ánh Nguyệt, Trịnh Thế Cƣờng, Jasser Mohamad Jamil, Ngơ Đình Anh Trí, Nguyễn Hồi Trâm 2000 Nghiên cứu phân bố đa dạng sinh học Bacillus thuringiensis phân lập từ số tỉnh Việt Nam “Những vấn đề nghiên cứu sinh học” Báo cáo khoa học hội nghị sinh học quốc gia 484-488 Ngơ Đình Bính, Nguyễn Quỳnh Châu, Nguyễn Văn Thƣởng, Trịnh Thị Ngọt, Nguyễn Ánh Nguyệt 2000 Sự phân bố Bacillus thuringiensis mẫu đất Việt Nam Tài nguyên sinh vật đất phát triển bền vững hệ sinh thái đất 1-7 Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Tỵ 2000 Vi sinh vật học Nhà xuất giáo dục Hồng Thị Lợi 2003 Giáo trình trùng học nông nghệp đại cƣơng tập Nhà xuất Nông Nghiệp Hà Nội Trang 122 – 167 Đặng Trọng Lƣơng, R Offringa, Vũ Đức Quang, Nguyễn Hữu Đống, Trần Duy Quý, W Dolf Paul J.J Hooykaas 1999 Thiết kế cấu trúc gen Bt (Bacillus thuringiensis) Ubiquitin promoter-CryIA(c) để chuyển vào hai mầm Báo Cáo khoa học Hội nghị Cơng nghệ sinh học tồn quốc, Hà nội 1999 Tr 1371-1378 Khuất Hữu Thanh 2004 Cơ sở di truyền phân tử kỹ thuật gen Nhà xuất khoa học kỹ thuật 109-147 Tiếng Anh 52 M-M Lecadet, E Frachon, V Cosmao Dumanoir, H Ripouteaus, S Hamon, P Laurent and I Thiery 1999 Updating the H- antigen classification of Bacillus thuringiensis The society for Applied Microbbiology Journal of Applied Microbiology 660:672 10 Carlson, C.R., and A-B Kolsto (1993), “ A complete physical map of a Bacillus thuringiensis chromosome”, J Bacteriol.,175, 1053- 1060 11 Lereclus, D., G Menou, and M.-M Lecadet (1983) “Isolation of a DNA sequence related to several plasmids from Bacillus thuringiensis after a mating involving the Streptococcus faecalis plasmid Pam1”, Mol Gen Genet., 191, 307-313 12 Bielot, H P., J.P Schernthaner, R.E Milne, F.R.Clairmont, R.S Bhella, and H Kaplan (1993), „ Evidence that CryIA crystal protein from Bacillus thuringiensis is associated vith DNA‟ , J Biol Chem, 268, 8240-8245 13 Calson, C R., D.A Caugant, and A.-B Kolsto (1994), “Genotypic diversity among Bacillus cereus and Bacillus thuringiensis strains” 14 Calson, C R., D.A Caugant, and A.-B Kolsto ( 1993) “A complete physical map of a Bacillus thuringiensis chromosome” , J Bacteriol.,175,10531060 15 Crickmore, N., D.R.Zeigler, J Feitelson, E.Schnepf, J Van Rie, D Lereclus, J.Baum, and D.H Dean (1998), “Revision of the nomemclature for Bacillus thuringiensis pesticidal crystal protein”, Microbiol Mol Biol Rev., 62, 807-813 16 J Carroll, J.Li and D.J.Ellar, 1989 Crystal Proteolytic procesing of a Celeoptera- specific δ- endotoxin producted by Bacillus thuringiensis var tenebrionis Biochem J.99 :261 17 Takashi Yamamoto and Gary K Powell 1993 Bacillus thuringiensis crystal protein : Recent Advance in understanding its insecticidal Activity Advanced Engineered Pesticides Printed in the United states of American :34 18 Brigitle Keller and Gustav- Adolf LangenBrush.1993 Control of Coleoptera pest by Bacillus thuringiensis Bacillus thuringiensis, an enviromental biopesticide 172 :187 19 Wijnands L.M, Dufrenne J.B, van Leusden F.M 2002 Characterization of Bacillus cereus RIVM report 250912002/2002 53 20 Altschul, S F., W Gish, W Miller, E W Myers, and D J Lipman 1990 Basic local alignment search tool J Mol Biol 215:403–410 21 Andrup, L., J Damgaard, and K Wassermann 1993 Mobilization of smallplasmids in Bacillus thuringiensis subsp israelensisis accompanied by specific aggregation J Bacteriol 175:6530–6536 22 Andrup, L., G B Jensen, A Wilcks, L Smidt, L Hoflack, and J Mahillon 2003 The patchwork nature of rolling-circle plasmids: comparison of sixplasmids from two distinct Bacillus thuringiensis serotypes Plasmid 49:205–232 23 Balasubramanian, P., R Jayakumar, P Shambharkar, N Unnamalai, S K.Pandian, N S Kumaraswami, R Ilangovan, and V Sekar 2002 Cloning and characterization of the crystal protein-encoding gene of Bacillus thuringiensis subsp yunnanensis Appl Environ Microbiol 68:408–411 24 Beron, C M., L Curatti, and G L Salerno 2005 New strategy for identi-fication of novel Cry-type genes from Bacillus thuringiensis strains Appl.Environ Microbiol 71:761–765 25 Ceron, J., A Ortiz, R Quintero, L Guereca, and A Bravo 1995 Specific PCR primers directed to identify cryI and cryIII genes within a Bacillus thuringiensis strain collection Appl Environ Microbiol 61:3826– 3831 26 Delecluse, A., M L Rosso, and A Ragni 1995 Cloning and expression of a novel toxin gene from Bacillus thuringiensis subsp jegathesan encoding a highly mosquitocidal protein Appl Environ Microbiol 61:4230– 4235 27 Griffitts, J S., J L Whitacre, D E Stevens, and R V Aroian 2001 Bt toxin resistance from loss of a putative carbohydrate-modifying enzyme Science 293:860–864 28 Jain, D., V Udayasuriyan, P I Arulselvi, S S Dev, and P Sangeetha 2006 Cloning, characterization, and expression of a newcry2Ab gene from Bacillus thuringiensis strain 14-1 Appl Biochem Biotechnol 128:185–194 29 Khan, S A 2005 Plasmid rolling-circle replication: highlights of two decades of research Plasmid 53:126–136 54 30 Kongsuwan, K., J Gough, D Kemp, A McDevitt, and R Akhurst 2005 Characterization of a new Bacillus thuringiensis endotoxin, Cry47Aa, from strains that are toxic to the Australian sheep blowfly, Lucilia cuprina FEMS Microbiol Lett 252:127–136 31 Kuo, W S., and K F Chak 1996 Identification of novel cry-type genes from Bacillus thuringiensisstrains on the basis of restriction fragment length polymorphism of the PCR-amplified DNA Appl Environ Microbiol 62:1369–1377 32 Lee, H K., and S S Gill 1997 Molecular cloning and characterization of a novel mosquitocidal protein gene from Bacillus thuringiensis subsp fukuokaensis Appl Environ Microbiol 63:4664–4670 33 Loeza-Lara, P D., G Benintende, J Cozzi, A Ochoa-Zarzosa, V M BaizabalAguirre, J J Valdez-Alarcon, and J E Lopez-Meza 2005 The plasmid pBMBt1 from Bacillus thuringiensis subsp darmstadiensis(INTA Mo14-4) replicates by the rolling-circle mechanism and encodes a novel insecticidal crystal protein-like gene Plasmid 54:229–240 34 Luo, M., and R A Wing 2003 An improved method for plant BAC library construction Methods Mol Biol 236:3–20 35 Masson, L., W J Moar, K van Frankenhuyzen, M Bosse, and R Brousseau 1992 Insecticidal properties of a crystal protein gene product isolated from Bacillus thuringiensis subsp kenyae Appl Environ Microbiol 58:642–646 36 McLinden, J H., J R Sabourin, B D Clark, D R Gensler, W E Workman, and D H Dean 1985 Cloning and expression of an insecticidal k-73 type crystal protein gene from Bacillus thuringiensis var kurstaki into Escherichia coli Appl Environ Microbiol 50:623–628 37 Peng, D., Y Luo, S Guo, H Zeng, S Ju, Z Yu, and M Sun Elaboration of an electroporation protocol for large plasmids and wild-type strains of Bacillus thuringiensis J Appl Microbiol., in press 38 Sambrook, J., and D W Russell 2001 Molecular cloning: a laboratory manual, 3rd ed Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY 55 39 Schnepf, E., N Crickmore, J Van Rie, D Lereclus, J Baum, J Feitelson, D R Zeigler, and D H Dean 1998 Bacillus thuringiensis and its pesticidal crystal proteins Microbiol Mol Biol Rev 62:775–806 40 Schnepf, H E., and H R Whiteley 1981 Cloning and expression of the Bacillus thuringiensis crystal protein gene in Escherichia coli Proc Natl Acad Sci USA 78:2893–2897 41 Shao, Z., Z Liu, and Z Yu 2001 Effects of the 20-kilodalton helper protein on Cry1Ac production and spore formation in Bacillus thuringiensis Appl Environ Microbiol 67:5362–5369 42 Wei, J Z., K Hale, L Carta, E Platzer, C Wong, S C Fang, and R V Aroian 2003 Bacillus thuringiensis crystal proteins that target nematodes Proc Natl Acad Sci USA 100:2760–2765 43 Yu, Z., P Bai, W Ye, F Zhang, L Ruan, Z Yu, and M Sun 2008 A novel negative regulatory factor for nematicidal Cry protein gene expression in Bacillus thuringiensis J Microbiol Biotechnol 18:1033–1039 Nguồn Internet 44 http://www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/toxins2.html 45 www.biocontrol.ca