ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http //www lrc tnu edu vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM LÊ THỊ NGỌC THƢƠNG TUYỂN CHỌN, TÁCH DÒNG VÀ XÁC ĐỊNH TRÌ[.]
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM LÊ THỊ NGỌC THƢƠNG TUYỂN CHỌN, TÁCH DÒNG VÀ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ GEN cry1C MÃ HÓA PROTEIN TINH THỂ DIỆT CÔN TRÙNG BỘ CÁNH VẢY TỪ VI KHUẨN Bacillus thuringiensis subsp aizawai PHÂN LẬP TỪ MỘT SỐ MẪU ĐẤT TỈNH THÁI NGUYÊN LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thái Nguyên - 2012 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Tai ngay!!! Ban co the xoa dong chu nay!!! http://www.lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM LÊ THỊ NGỌC THƢƠNG TUYỂN CHỌN, TÁCH DÒNG VÀ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ GEN cry1C MÃ HÓA PROTEIN TINH THỂ DIỆT CÔN TRÙNG BỘ CÁNH VẢY TỪ VI KHUẨN Bacillus thuringiensis subsp aizawai PHÂN LẬP TỪ MỘT SỐ MẪU ĐẤT TỈNH THÁI NGUYÊN Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60.42.30 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS NGƠ ĐÌNH BÍNH Thái Nguyên - 2012 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu khoa học Các số liệu kết luận văn trung thực chưa cơng bố cơng trình nghiên cứu khác Tác giả luận văn Lê Thị Ngọc Thương Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN Trong trình học tập thực luận văn, nhận nhiều giúp đỡ, hỗ trợ thầy cô, bạn bè, đồng nghiệp gia đình Tơi xin trân trọng cảm ơn tất tình cảm q báu Trước tiên, xin gửi lời cảm ơn tới PGS TS Ngô Đình Bính, người thầy tận tình hướng dẫn tơi hồn thành luận văn Tơi xin bày tỏ lịng cảm ơn tới CN Đặng Văn Tiến tồn thể cán phịng Di truyền Vi sinh, Viện cơng nghệ Sinh học, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam, nhiệt tình giúp đỡ tơi suốt thời thời gian dài thực tập Bên cạnh đó, tạo điều kiện hỗ trợ Khoa Sau đại học, BCN Khoa đồng nghiệp Khoa Sinh – KTNN, Trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên động lực lớn giúp tơi hồn thành tốt luận văn Cuối tơi xin cảm ơn bạn bè gia đình, người ln ủng hộ suốt thời gian qua! Tác giả luận văn Lê Thị Ngọc Thương Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn i MỤC LỤC Trang Trang bìa phụ Lời cam đoan Lời cảm ơn Mục lục i Danh mục chữ viết tắt iii Danh mục bảng iv Danh mục hình v MỞ ĐẦU Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Lịch sử nghiên cứu, ứng dụng vi khuẩn Bacillus thuringiensis .3 1.1.1 Lịch sử nghiên cứu vi khuẩn Bacillus thuringiensis giới 1.1.2 Những nghiên cứu Bacillus thuringiensis Việt Nam 1.2 Những đặc điểm vi khuẩn Bacillus thuringiensis 1.2.1 Vị trí phân loại 1.2.2 Phân loại vi khuẩn Bacillus thuringiensis 1.2.3 Đặc điểm hình thái, sinh lý, hóa sinh vi khuẩn Bacillus thuringiensis 1.3 Độc tố vi khuẩn Bacillus thuringiensis 10 1.3.1 Độc tố Cry 11 1.3.2 Độc tố Cyt 11 1.3.3 Độc tố Vip 12 1.3.4 Cấu trúc nhóm độc tố tinh thể 12 1.3.5 Cơ chế tác động protein độc tố tinh thể 14 1.4 Gen mã hóa protein độc tố tinh thể 16 1.4.1 Vị trí gen mã hóa độc tố vi khuẩn Bacillus thuringiensis 17 1.4.2 Phân nhóm gen mã hóa độc tố 17 1.5 Tổng quan loài Bacillus thuringiensis subsp aizawai gen cry1C 19 1.5.1 Một số đặc điểm loài Bta 19 1.5.2 Gen cry1C 20 1.6 Tổng quan côn trùng thử nghiệm 22 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ii 1.6.1 Sâu tơ (Plutella xylostella) 22 1.6.2 Sâu xanh da láng (Spodoptera exigua) 23 Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP .26 2.1 Vật liệu 26 2.2 Hóa chất thiết bị 26 2.3 Phương pháp nghiên cứu 28 2.3.1 Phương pháp phân loại hình dạng tinh thể chủng Bt 28 2.3.2 Phương pháp phân loại Bacillus thuringiensis phản ứng huyết 28 2.3.3 Phương pháp định lượng mật độ bào tử 29 2.3.4 Phương pháp thử hoạt tính đối tượng sâu xanh sâu tơ 29 2.3.5 Phương pháp tách DNA plasmid 30 2.3.6 Phương pháp PCR để khuếch đại gen cry1C 31 2.3.7 Phương pháp tách dòng gen cry1C 31 2.3.8 Phương pháp xác định trình tự nucleotid đoạn gen tách dòng 34 2.4 Địa điểm nghiên cứu 35 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .36 3.1 Tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis subsp aizawai mang gen cry1C có hoạt tính diệt sâu tơ (Plutella xylostella) sâu xanh da láng (Spodoptera exigua) 36 3.1.1 Phân loại hình dạng tinh thể chủng Bacillus thuringiensis nghiên cứu 36 3.1.2 Phân loại Bacillus thuringiensis phương pháp huyết 38 3.1.3 Thử hoạt tính chủng Bacillus thuringiensis subsp aizawai sâu tơ (Plutella xylostella) sâu xanh da láng (Spodoptera exigua) 40 3.1.4 Kết khuếch đại gen cry1C chủng Bacillus thuringiensis subsp aizawai phương pháp PCR 43 3.2 Tách dịng đọc trình tự gen cry1C .44 3.2.1 Tách dòng gen cry1C 44 3.2.2 Xác định trình tự đoạn gen cry1C 49 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .49 TÀI LIỆU THAM KHẢO 51 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn iii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, TỪ VIẾT TẮT Viết tắt STT Viết đầy đủ Amp Ampicillin bp Base pair Bt Bacillus thuringiensis Bta Bacillus thuringiensis subspecies aizawai DNA Deoxyribonucleotide acid E coli Escherichia coli EDTA Ethylene diamine tetra- acetic acid OD Optical density- mật độ quang học PCR Polymerase chain reaction- phản ứng chuỗi 10 SDS Sodium dodecyl sulphate 11 Sol Solution 12 TE Tris EDTA 13 X- gal 5- Bromo- Cloro- indolyl ß- d galactoside 14 kDa Kilo Dalton 15 dH2O Nước deion 16 cs cộng Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn iv DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 3.1 Hình dạng tinh thể chủng Bacillus thuringiensis nghiên cứu 37 Bảng 3.2 Kết phân loại loài chủng Bt sinh tinh thể .39 Bảng 3.3: Kết thử hoạt tính diệt sâu tơ chủng Bta sau ngày thử nghiệm 41 Bảng 3.4 Kết thử hoạt tính diệt sâu xanh da láng chủng Bta .42 sau ngày thử nghiệm 42 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn v DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1 Hình thái khuẩn lạc nhóm B.cereus (nguồn: Phịng DTVS) Hình 1.2 Phản ứng ngưng kết vi khuẩn Bacillus thuringiensis với kháng nguyên lông roi H [6] Hình 1.3 Bào tử tinh thể Bacillus thuringiensis [24] .9 Hình 1.4 Bào tử tinh thể Bacillus thuringiensis kính hiển vi quang học nhuộm với fuchsin base (nguồn: Phòng DTVS) .10 Hình 1.8 Cây phân loại hai họ độc tố Cyt Vip [42] .12 Hình 1.6 Các block bảo thủ có mặt loại độc tố Cry [26] 14 Hình 1.7 Mơ hình cấu trúc chung độc tố Cry [26] .14 Hình 1.5 Cơ chế tác động protein tinh thể độc tố tới trùng đích [24] 16 Hình 1.9 Hình ảnh sâu tơ (Plutella xylostella) thiệt hại sâu tơ gây [10] .23 Hình 1.10 Vịng đời sâu xanh da láng (Spodoptera exigua) [10] .25 Hình 3.1 Hình dạng khuẩn lạc vi khuẩn Bacillus thuringiensis môi trường MPA sau 72 nuôi cấy 280C .36 Hình 3.2 Hình dạng bào tử tinh thể chủng TN1.12 TN 36.3 37 Hình 3.3 Hình ảnh ngưng kết chủng 4J4 (A) TN 6.12 (B) với typ huyết H7 kính hiển vi quang học .39 Hình 3.4 Thử hoạt tính diệt sâu tơ chủng Bta nghiên cứu 41 Hình 3.5 Hình ảnh thử hoạt tính diệt sâu xanh da láng chủng Bta nghiên cứu 42 Hình 3.6 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR chủng Bta nghiên cứu .44 Hình 3.7 Khuẩn lạc xanh trắng đĩa thạch LBA sau 14 ni cấy 45 Hình 3.8 Hình ảnh điện di sản phẩm colony - PCR với mồi M13 46 Hình 3.9 Hình ảnh điện di sản phẩm cắt DNA plasmid tách chiết từ số dòng khuẩn lạc trắng 47 Hình 3.10 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR gen cry1C từ DNA plasmid tái tổ hợp pGEM-T Easy – cry1C – TN28.6 - p3, pGEM-T Easy – cry1C – TN 36.3 - p1 pGEM-T Easy – cry1C – TN 6.12 – p7 48 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Thái Nguyên tỉnh trung du miền núi phía Bắc, nơng nghiệp chiếm tỷ trọng lớn cấu kinh tế Cũng nhiều vùng nông nghiệp khác, sâu hại trồng, đặc biệt loài thuộc Cánh vảy sâu tơ (Plutella xylostella), sâu xanh da láng (Spodoptera exigua)…là nhân tố gây thiệt hại lớn tới suất phẩm chất nông sản Việc sử dụng thuốc trừ sâu hóa học để diệt côn trùng Cánh vảy (Lepidoptera) biện pháp có hiệu tức thời lại gây tác hại lâu dài cho môi trường sinh thái, đồng thời việc tồn dư thuốc trừ sâu nông sản gây ngộ độc cho người động vật, nguyên nhân khiến thuốc trừ sâu sinh học coi giải pháp hiệu để dần thay thuốc trừ sâu hóa học nơng nghiệp Trên thị trường thuốc trừ sâu sinh học nay, chế phẩm có nguồn gốc từ vi khuẩn Bacillus thuringiensis chiếm thị phần gần tuyệt đối [8], [39] Bacillus thuringiensis vi khuẩn Gram dương, giai đoạn sinh bào tử có khả tạo protein tinh thể gây độc cách đặc hiệu với côn trùng thuộc Cánh vảy (Lepidoptera), Hai cánh (Diptera), Cánh cứng (Coleoptera) … Các tinh thể hỗn hợp hay nhiều loại protein thuộc nhóm độc tố Cry độc tố Cyt Các độc tố có tính đặc hiệu với trùng đích khơng gây độc cho người, động vật có xương sống, thực vật Các độc tố tinh thể mã hóa gen cry nằm plasmid [39] Bacillus thuringiensis subsp aizawai (Bta) 82 loài vi khuẩn Bacillus thuringiensis, có khả sinh nhiều loại protein tinh thể có tác dụng diệt trùng thuộc nhiều khác Protein tinh thể độc Cry1C loại protein Bta sinh trình hình thành bào tử, có hoạt tính chống lại trùng Cánh vảy mạnh Việc sàng lọc tuyển chọn lồi Bacillus thuringiensis có khả tiêu diệt nhiều loại trùng đích tiếp tục nghiên cứu trình tự gen cry 42 Kết bảng 3.3 cho thấy chủng Bta đem thử nghiệm có hoạt tính diệt sâu tơ tương đối cao Sau ngày thử hoạt tính đa số chủng cho tỷ lệ sâu chết lớn 50%, hai nồng độ pha loãng Một số chủng chủng TN28.6, TN36.3 TN3.4., thử nồng độ 10 bào tử/ml có tỷ lệ sâu chết cao hơn 80% * Kết thử hoạt tính sâu xanh da láng (Spodoptera exigua) Chúng tơi tiếp tục tiến hành thử hoạt tính chủng Bta nghiên cứu đối tượng sâu xanh da láng, loại sâu lớn, gây nhiều thiệt hại nông nghiệp Phương pháp tiến hành tương tự với đối tượng sâu tơ Hình 3.5 Hình ảnh thử hoạt tính diệt sâu xanh da láng chủng Bta nghiên cứu Bảng 3.4 Kết thử hoạt tính diệt sâu xanh da láng chủng Bta sau ngày thử nghiệm STT Tên chủng ĐC âm ĐC dương (4J4) TN 1.12 TN 3.4 TN 4.4 TN 5.3 TN 6.12 TN 28.6 TN 36.3 Tỷ lệ sâu chết (%) Nồng độ 107 Nồng độ 109 bào tử/ml bào tử/ml 33,33 22,22 22,22 11,11 11,11 22,22 22,22 22,22 77,78 55,56 44,44 33,33 44,44 55,56 66,67 55,56 43 Số liệu bảng 3.4 cho thấy chủng Bta có hoạt tính diệt sâu xanh da láng Sau ngày thử hoạt tính có 4/7 chủng cho tỷ lệ sâu chết lớn 50% nồng độ 109 bào tử/ml Trong đó, TN1.12, TN6.12, TN28.6 TN36.3 chủng có hoạt tính diệt sâu cao Sâu xanh da láng loại sâu lớn, ăn tạp khó diệt thuốc trừ sâu hóa học, kết thử nghiệm hoạt tính diệt sâu chủng Bta tương đối khả quan Qua kết thử hoạt tính chủng Bta với loại trùng thử nghiệm nhận xét sau: - chủng Bta nghiên cứu có hoạt tính với loại côn trùng thử nghiệm - Các chủng TN1.12, TN6.12, TN28.6 TN36.3 có hoạt tính diệt cao loại côn trùng thử nghiệm Các kết thử hoạt tính diệt sâu nói sở để tiến hành nghiên cứu gen mã hóa độc tố tinh thể 3.1.4 Kết khuếch đại gen cry1C chủng Bacillus thuringiensis subsp aizawai phương pháp PCR Gen mã hóa protein Cry1C gen nhiều nhà khoa học quan tâm Do protein tinh thể Cry1C có tác dụng diệt hiệu nhiều loài thuộc Cánh vảy, có lồi có dấu hiệu kháng thuốc trừ sâu hóa học sâu sâu xanh da láng (Spodoptera exigua), sâu tơ (Plutella xylostella), sâu khoang (Spodoptera litura) Chúng sử dụng phương pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại gen cry1C chủng Bta có hoạt tính diệt sâu Theo tính tốn lý thuyết, đoạn gen cry1C sau tổng hợp với cặp mồi đặc hiệu thu sản phẩm có kích thước 288 bp Sản phẩm PCR điện di kiểm tra gel agarose 1% (Hình 3.6) 44 11 22 33 44 55 66 7 8 M M 300 bp Hình 3.6 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR chủng Bta nghiên cứu Giếng 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8: TN1.12, TN3.4, TN4.4, TN5.3, TN6.12, TN28.6, TN36.3, ĐC dương M: DNA Marker Hình ảnh điện di cho thấy, sản phẩm PCR chủng Bta cho băng rõ nét, có kích thước gần 300 bp tính tốn Như chúng tơi bước đầu kết luận chủng Bacillus thuringiensis subsp aizawai nghiên cứu có mang gen cry1C Để khẳng định xác có mặt gen cry1C chủng Bta nói trên, chọn chủng TN28.6, TN36.3 TN6.12 chủng có hoạt tính diệt sâu cao để tách dịng xác định trình tự gen chúng 3.2 Tách dòng đọc trình tự gen cry1C 3.2.1 Tách dòng gen cry1C 3.2.1.1 Gắn sản phẩm PCR vào vector tách dòng pGEM-T Easy Vector pGEM-T Easy tồn dạng mạch thẳng với đầu tự đầu thừa nucleotid T nên dễ dàng bắt cặp theo nguyên tắc bổ sung với đầu so le A sản phẩm PCR sử dụng Taq polymerase, lựa chọn vector pGEM-T Easy làm vector tách dịng 45 Đoạn gen tính tốn theo lý thuyết có kích thước 288 bp thu từ phản ứng PCR chủng gắn trực tiếp vào vector pGEM-T Easy enzyme T4ligase 40C Sản phẩm vector tái tổ hợp pGEM-T Easy – cry1C – TN28.6, pGEM-T Easy – cry1C – TN 36.3 pGEM-T Easy – cry1C – TN 6.12 3.2.1.2 Biến nạp vector tái tổ hợp vào vi khuẩn E coli DH5α Tiến hành biến nạp vector tái tổ hợp nói vào tế bào vi khuẩn E coliDH5α theo phương pháp trình bày phần 2.3.6.2 Các chủng vi khuẩn sau biến nạp nuôi cấy môi trường LBA bổ sung kháng sinh Ampicillin X - gal 370C Hình 3.7 Khuẩn lạc xanh trắng đĩa thạch LBA sau 14 nuôi cấy Sau 14 ni cấy, đĩa thạch thấy có xuất khuẩn lạc màu xanh màu trắng (hình 3.7) Các khuẩn lạc mọc mơi trường chứa kháng sinh Ampicillin dòng vi khuẩn nhận vector pGEM – T Easy có gen kháng kháng sinh Ampicillin Các khuẩn lạc xanh xuất vector pGEM – T Easy không chứa đoạn gen cry1C, nên gen tổng hợp enzyme ß- galactosidase hoạt động, chất X – gal chuyển hóa từ khơng màu sang màu xanh tràm 46 Các khuẩn lạc trắng xuất hai nguyên nhân sau: nguyên nhân thứ tế bào vi khuẩn nhận vector tái tổ hợp mang đoạn gen cry1C chèn vào làm bất hoạt gen tổng hợp enzyme ß- galactosidase Khi chất X - gal có mơi trường ni cấy khơng chuyển hóa nên khuẩn lạc khơng có màu xanh Ngun nhân thứ hai promoter điều khiển hoạt động gen mã hố cho enzyme ß - galactosidase bị hỏng ngẫu nhiên, khơng tạo enzyme ß- galactosidase, tạo khuẩn lạc màu trắng Để xác định xác khuẩn lạc trắng mang vector tái tổ hợp có gen cry1C, chúng tơi tiến hành sàng lọc kỹ thuật colony – PCR với cặp mồi M13 Sản phẩm colony – PCR kiểm tra điện di gel agarose 1% 500 bp 300 bp Hình 3.8 Hình ảnh điện di sản phẩm colony - PCR với mồi M13 1,2,4: Sản phẩm colony - PCR dòng khuẩn trắng TN 28.6 - p3, TN36.3 p3, TN6.12 - p7 3: Sản phẩm colony – PCR từ dòng khuẩn lạc trắng TN 6.12 – p5 5: Thang DNA chuẩn Vector pGEM – T Easy không chứa gen ngoại lai sau phản ứng PCR với mồi M13 thu sản phẩm có kích thước xấp xỉ 300 bp Khi vector có đoạn gen cry1C chèn vào sản phẩm PCR có kích thước trội lên kích thước đoạn gen này, tức khoảng 288bp Hình ảnh điện di cho thấy, sản phẩm colony - 47 PCR dòng khuẩn lạc trắng TN 28.6 – p3, TN 36.3 – p1 TN 6.12 – p7 có kích thước khoảng xấp xỉ 600 bp, phù hợp với tính tốn lý thuyết (bằng kích thước đoạn gen cry1C 288bp cộng với kích thước sản phẩm mồi M13 300bp) Trong khuẩn trắng TN 6.12 – p5 thu đoạn gen có kích thước xấp xỉ 300bp Điều chứng tỏ dịng khuẩn lạc trắng TN 28.6 – p3, TN 36.3 – p1 TN 6.12 – p7 biến nạp vector có mang gen cry1C 3.2.1.3 Kiểm tra có mặt gen cry1C plasmid tái tổ hợp Các dòng khuẩn lạc trắng sàng lọc kỹ thuật colony - PCR chọn để tách plasmid kiểm tra enzyme giới hạn Do vùng MSC vector pGEM – T Easey có chứa vị trí cắt enzyme EcoRI, sử dụng enzyme để tiến hành cắt kiểm tra plasmid các khuẩn lạc trắng lựa chọn, qua xác nhận có mặt đoạn gen cry1C Sản phẩm cắt điện di gel agarose 1% (hình 3.9) 3000 bp 300 bp Hình 3.9 Hình ảnh điện di sản phẩm cắt DNA plasmid tách chiết từ số dòng khuẩn lạc trắng Giếng 1,2,4 Sản phẩm cắt DNA plasmid dòng khuẩn lạc trắng plasmid hợp pGEM-T Easy – cry1C – TN28.6 - p3, pGEM-T Easy –cry1C – TN 36.3 - p1 pGEM-T Easy – cry1C – TN 6.12 – p7 Giếng DNA plasmid dòng khuẩn lạc xanh (ĐC) Giếng 5.Thang DNA chuẩn 48 Kết điện di cho thấy, DNA plasmid dòng khuẩn lạc trắng sau cắt enzyme EcoRI tạo hai băng, băng lớn vector tách dòng pGEM-T Easy có kích thước khoảng 3000 bp, băng nhỏ có kích thước gần 300 bp tương ứng với sản phẩm PCR gen cry1C Qua kết bước đầu khẳng định dòng khuẩn lạc TN28.6 - p3, TN 36.3 - p1, TN 6.12 – p7 biến nạp vector tái tổ hợp mang gen cry1C Mặt khác, q trình tách dịng khơng làm ảnh hưởng tới vị trí cắt enzyme EcoRI vùng MCS vector tách dòng Để khẳng định chắn có mặt gen cry1C plasmid dịng vi khuẩn nói trên, chúng tơi tiến hành phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu TYIC TYIUNI từ DNA plasmid tái tổ hợp khuẩn lạc trắng kiểm tra EcoRI Kết thể hình 3.10 M 300 bp Hình 3.10 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR gen cry1C từ DNA plasmid tái tổ hợp pGEM-T Easy – cry1C – TN28.6 - p3, pGEM-T Easy – cry1C – TN 36.3 p1 pGEM-T Easy – cry1C – TN 6.12 – p7 Từ kết thu được, chúng tơi bước đầu kết luận tách dịng thành cơng gen cry1C vector tách dịng pGEM – T Easy vi khuẩn E coli Tuy nhiên, để kết luận xác đoạn gen tách dịng có phải gen cry1C hay khơng chúng tơi tiến hành đọc trình tự đoạn gen so sánh với trình tự gen đăng ký Ngân hàng Gen quốc tế 49 3.2.2 Xác định trình tự đoạn gen cry1C Plasmid tái tổ hợp pGEM-T Easy – cry1C – TN28.6 - p3, pGEM-T Easy – cry1C – TN 36.3 - p1 pGEM-T Easy – cry1C – TN 6.12 – p7 chọn để đọc trình tự so sánh với trình tự có mã số AF362020.1 ngân hàng gen quốc tế Đoạn gen 288 bp chủng TN6.12 TN36.3 có độ tương đồng 100% so với trình tự gen cry1C chủng Bta C002 (AF362020.1) công bố ngân hàng gen quốc tế Trong đó, trình tự đoạn gen cry1C chủng TN28.6 bị nucleotide ở vị trí 282 so với trình tự lựa chọn để so sánh 10 20 30 | | TTGGTGCAGG TTGGTGCAGG TTGGTGCAGG TTGGTGCAGG 40 | | TTCTATTAGT TTCTATTAGT TTCTATTAGT TTCTATTAGT 50 60 AF362020.1 6.12 – p7 28.6 – p3 36.3 – p1 | | CAACCTCTAT CAACCTCTAT CAACCTCTAT CAACCTCTAT | | AGCGGTGAAC AGCGGTGAAC AGCGGTGAAC AGCGGTGAAC | | TTTATATAGA TTTATATAGA TTTATATAGA TTTATATAGA | | TAAAATTGAA TAAAATTGAA TAAAATTGAA TAAAATTGAA AF362020.1 6.12 – p7 28.6 – p3 36.3 – p1 70 80 90 100 110 120 | | | | | | | | | | | | ATTATTCTAG CAGATGCAAC ATTTGAAGCA GAATCTGATT TAGAAAGAGC ACAAAAGGCG ATTATTCTAG CAGATGCAAC ATTTGAAGCA GAATCTGATT TAGAAAGAGC ACAAAAGGCG ATTATTCTAG CAGATGCAAC ATTTGAAGCA GAATCTGATT TAGAAAGAGC ACAAAAGGCG ATTATTCTAG CAGATGCAAC ATTTGAAGCA GAATCTGATT TAGAAAGAGC ACAAAAGGCG AF362020.1 6.12 – p7 28.6 – p3 36.3 – p1 130 140 150 160 170 180 | | | | | | | | | | | | GTGAATGCCC TGTTTACTTC TTCCAATCAA ATCGGGTTAA AAACCGATGT GACGGATTAT GTGAATGCCC TGTTTACTTC TTCCAATCAA ATCGGGTTAA AAACCGATGT GACGGATTAT GTGAATGCCC TGTTTACTTC TTCCAATCAA ATCGGGTTAA AAACCGATGT GACGGATTAT GTGAATGCCC TGTTTACTTC TTCCAATCAA ATCGGGTTAA AAACCGATGT GACGGATTAT AF362020.1 6.12 – p7 28.6 – p3 36.3 – p1 190 200 210 220 230 240 | | | | | | | | | | | | CATATTGATC AAGTATCCAA TTTAGTGGAT TGTTTATCAG ATGAATTTTG TCTGGATGAA CATATTGATC AAGTATCCAA TTTAGTGGAT TGTTTATCAG ATGAATTTTG TCTGGATGAA CATATTGATC AAGTATCCAA TTTAGTGGAT TGTTTATCAG ATGAATTTTG TCTGGATGAA CATATTGATC AAGTATCCAA TTTAGTGGAT TGTTTATCAG ATGAATTTTG TCTGGATGAA AF362020.1 6.12 – p7 28.6 – p3 36.3 – p1 250 260 270 280 | | | | | | | | | AAGCGAGAAT TGTCCGAGAA AGTCAAACAT GCGAAGCGAC TCAGTGA AAGCGAGAAT TGTCCGAGAA AGTCAAACAT GCGAAGCGAC TCAGTGA AAGCGAGAAT TGTCCGAGAA AGTCAAACAT GCGAAGCGAC T-AGTGA AAGCGAGAAT TGTCCGAGAA AGTCAAACAT GCGAAGCGAC TCAGTGA Trình tự AF362020.1 trình tự gen cry1Ca mã hóa protein Cry1Ca Như vậy, chúng tơi kết luận trình tự gen cry1C chủng Bta chúng tơi tách dịng thuộc phân nhóm gen cry1Ca 50 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ KẾT LUẬN Từ 150 chủng vi khuẩn thuộc nhóm Bacillus cereus chưa qua phân loại, xác định 54 chủng Bt sinh tinh thể, 26/54 chủng sinh loại tinh thể dạng lưỡng tháp cầu Đã phân loại 26 chủng Bt sinh tinh thể lưỡng tháp cầu 56 typ huyết chuẩn 26 chủng Bt thuộc lồi khác nhau, phổ biến lồi aizawai, thuringiensis, có 10 chủng thuộc loài aizawai, chiếm tỷ lệ 38,46% Đã sàng lọc chủng Bta có hoạt tính diệt sâu tơ (Plutella xylostella) sâu xanh da láng (Spodoptera exigua), chủng TN 1.12, TN6.12, TN28.6 TN 36.3 có hoạt tính diệt sâu cao Đã khuếch đại gen cry1C từ chủng Bta có hoạt tính diệt sâu cặp mồi đặc hiệu Sản phẩm PCR thu có kích thước 288 bp Đã tách dịng xác định trình tự gen cry1C chủng Bta so sánh với trình tự có mã số AF362020.1 cơng bố Gene Bank Trình tự so sánh có độ tương đồng 100% với đoạn gen cry1C chủng TN6.12 TN36.3 99, 65% đoạn gen cry1C chủng TN28.6 Các gen tách dịng thuộc phân nhóm gen cry1Ca ĐỀ NGHỊ Đã xác định trình tự đoạn gen cry1C chủng TN 36.3, TN 6.12 TN 28.6 có hoạt tính diệt sâu cao Trên sở thiết kế cặp mồi khuếch đại toàn gene cry1C để tiến hành biểu vi khuẩn E coli Thiết kế vector biểu gen cry1C chủng đột biến Bacillus thuringiensis (Bt51) không sinh tinh thể 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Đái Duy Ban ( 2006), Công nghệ gen, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, tr 153 Ngơ Đình Bính, Nguyễn Quỳnh Châu, Nguyễn Văn Thưởng, Nguyễn Ánh Nguyệt, Trịnh Thế Cường, Jasser Mohamad Jamil, Ngơ Đình Anh Trí, Nguyễn Hồi Trâm (2000), “Nghiên cứu phân bố đa dạng sinh học Bacillus thuringiensis phân lập từ số tỉnh Việt Nam”, Những vấn đề nghiên cứu sinh học, Báo cáo khoa học hội nghị sinh học quốc gia, tr 484-488 Ngơ Đình Bính, Nguyễn Quỳnh Châu, Nguyễn Văn Thưởng, Trịnh Thị Ngọt, Nguyễn Ánh Nguyệt (2000), “Sự phân bố Bacillus thuringiensis mẫu đất Việt Nam”, Tài nguyên sinh vật đất phát triển bền vững hệ sinh thái đất, tr 1-7 Ngơ Đình Bính, Nguyễn Quỳnh Châu, Nguyễn Ánh Nguyệt, Nguyễn Xuân Cảnh, Vi Thị Đoan Chính, Nguyễn Hồi Trâm, Nguyễn Văn Tuất (2003), “Tách dịng biểu gen mã hóa protein Cry1C diệt sâu khoang từ Bacillus thuringiensis subsp aizawai” , Những vấn đề nghiên cứu Khoa học Sự sống, Báo cáo khoa học hội nghị toàn quốc lần thứ hai, tr 830 – 832 Ngơ Đình Bính, Lê Thị Minh Thành, Trịnh Thị Thu Hà, Phạm Kiều Thúy, Phạm Minh Hương, Nguyễn Thị Luy, Lê Thị Hồng Nhung, Đặng Văn Tiến (2010), “35 năm nghiên cứu phát triển thuốc trừ sâu sinh học Bacillus thuringiensis Việt Nam”, Hội nghị khoa học kỷ niệm 35 năm Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam, tr 288 – 300 Ngô Đình Bính, Nguyễn Quỳnh Châu, Nguyễn Ánh Nguyệt (2002), “Thu nhận huyết miễn dịch cho phân loại Bacillus thuringiensis”, Kỷ yếu Viện Công nghệ Sinh học 200-2001, tr 296-303 Nguyễn Xuân Cảnh, Nguyễn Ánh Nguyệt, Nguyễn Thanh Hạnh, Nguyễn Quỳnh Châu, Ngơ Đình Bính (2004), “ Nghiên cứu đa dạng sinh học vi khuẩn Bacillus thuringiensis Việt Nam”, Báo cáo khoa học, nghiên cứu Khoa học sống định hướng Nông lâm nghệp miền núi, Thái Nguyên 2004, NXB KHKT, tr 59 – 62 52 http://www.thainguyen.gov.vn/sites/home/news/GioiThieuChung 22/03/2012 Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2005), Vi sinh vật học, Nhà xuất Giáo dục 10 Hoàng Thị Lợi (2003), Giáo trình trùng học nơng nghiệp tập 2, NXB Nông nghiệp Hà Nội, tr 122 – 167 11 La Thị Nga, Nguyễn Minh Dương, Trần Duy Minh, Trương Ba Hùng, Võ Thị Thứ (2003), “Đa dạng phân tử Bacillus thuringiensis tỉnh Bắc Bộ Bắc Trung Bộ”, Tạp chí Di truyền học Ứng dụng,1 12 Khuất Hữu Thanh (2004), Cơ sở di truyền phân tử kỹ thuật gen, Nhà xuất khoa học kỹ thuật 13 Lê Thị Minh Thành, Nguyễn Thị Thanh Hạnh, Nguyễn Xuân Cảnh, Nguyễn Ánh Nguyệt, Nguyễn Đình Tuấn, Phạm Kiều Thúy, Ngơ Đình Bính (2005), Nghiên cứu phân bố đa dạng gen vi khuẩn Bacillus thuringiensis phân lập số tỉnh thuộc vùng Bắc Bộ, Tạp chí Di truyền ứng dụng, số 4, tr 29 – 34 14 Mai Trường, Nguyễn Hữu Hổ, Lê Đức Tấn, Nguyễn Thị Thanh, Nguyễn Văn Uyển (1998), “Bước đầu chuyển gen bar, gen gusA gen cry1Ac vào đậu xanh (Vigana radia L.) nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens”, Hội nghị toàn quốc lần thứ công nghệ sinh học lúa, Huế, tr 86-87 Tài liệu tiếng Anh 15 Abad AR, Duck NB, Feng X, Flannagan RD, Kahn TW, Sims LE (2002) Genes encoding novel protein with pesticidal activity against coleopterans, United States Patent Appication Publication 16 Barjac D H (1981), “Identification of H- serotypes of Bacillus thuringiensis”, pp 36 – 42 17 Barjac D H and Bonnefoi A (1962), “Essai de classification biochimique et serologique de 24 souches de Bacillus du type B Bacillus thuringiensis.” Entomophaga 7, pp – 31 53 18 Bietlot, H P., J P Shernthaner, R E Milne, F R Clairmont, R> S Behella, and Kaplan (1993), "Envidence that the CryIA Crystal protein from Bt is associated with DNA", J Biol Chem 268, pp 8240-8245 19 Bravo, A (1997), "Phylogenetic relationship of Bacilluc thuringiensis δ endotoxin family proteins and their funtional domains", J Bateriol 179, pp 2793 - 2801 20 Burges H D (2001), "Bacillus thuringiensis in Pest control", Pesticide Outlook, pp 90 - 98 21 Cao, J., Tang, J D., Strizhov, N., Shelton, A M., Earle, E D (1999) “Transgenic broccoli with high levels of Bacillus thuringiensis Cry1C protein control diamondback moth larvae resistant to Cry1A or Cry1C” Mol Breed, 5, pp 131 - 141 22 Chen, M, Zhao, J - Z; Collins, H L; Earle, E D; Cao, J.; Shelton, A M ( 2008) “A critical assessment of the effects of Bt transgenic plants on parasitoids” PLoS ONE , 3(5), pp 2284 23 Chen Yuehua, Li Hongxiu, Wang Jinhong, Cai Jun, Ren Gaixin (2004), “Cloning of full Cry1C gene from B.t.c and expression in crops beneficial bacteria Bacillus cereus” , Wei Sheng wu xue Tong bao, 31(1), pp 65-68 24 Deacon, J " The microbial world: Bacillus thuringiensis", www.helios.bto.ed.ac.uk/bto/microbes/Bacillus thuringiensis.htm 20/06/2012 25 Dwu, XL Cao, Y.Y Bai, and AI Aronson (1991), “Sequensing of an operon containing a novel δ-endotoxin gene from Bacillus thuringiensis”, FEMS microbial Lett, pp 81-31 26 E Shnepf, N Crickmore, J Van Rie, D Lereclus, J Baum, J Feitelson, D r Zeigler, and D H Dean (1998), “Bacillus thuringiensisand Its Pesticidal Crystal Proteins”, Microbiology and Molecular Biology Review, 63 (3), pp 775 – 806 27 Ereclus D, Deléclese A and Lecadet M (1993), “Diversity of Bacillus thuringiensis toxin and genes” , Bacillus thuringiensis an environmental pesticide Theory and Practice , pp 37 – 60 28 Estruch, J J., G W Warren, M A Mullins, G J Nye, J A Craig and M G Koziel (1996), "Vip 3A, a novel Bacillus thuringiensis vegetative insecticidal 54 protein with wide spedtrum of activities against lepidotera insiects", Proc Nat Acad Sci USA 93, pp 5389 - 5394 29 Eugene W Nester, Linda S Thomashow, Matthew Metz and Milton Gordon (2002), 100 years of Bacillus thuringiensis: A Critical Scientific Assessment, American Academy of Microbiology,Washington, USA 30 Grochulski, P., L Masson, S Borisova, M Pusztai-Carey, J.-L Schwartz, R Brousseau, and M Cygler (1995), "Bacillus thuringiensis CryIA(a) insecticidal toxin: Crystal structure and channel formation", J Mol Biol., 254, pp 447- 464 31 Herman HÖfte and H R Whiteley, 1989, “Insecticidal Crystal proteins of Bacillus thuringiensis”, Microbiology Review, 53 (2), pp 242-25 32 Jen-Chieh Cheng, Feng-Chia Hsieh, Bing-Lan Liu, and Suey-Sheng Kao (2005), “Cloning and Expression of Cry1Aa, Cry1Ab, Cry1C, and Cry1Da Genes from Bacillus thuringiensis var aizawai” The 6th Pacific Rim Conference on the Biotechnology of Bacillus thuringiensis and its Environmental Impact, Victoria BC 33 Joseph Sambrook and David W Russell (2001), Molecular Cloning - A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press 34 Klier A (1985), Biopesticide opportunities and challegene for menegement insect, Parteun International Symposia 35 Kronstad, J W., and H R Whiteley (1986), "Three classes of homologous Bacillus thuringiensis Crystal protein genes", Genes 43, pp 29-40 36 Lee, M K., Walters, F S., Hart, H., Palekar, N., Chen, J.-S Shotkoski, F (2005), "Vip 3A: A novel insecticidal protein with the broad spectrum lepidoptera aictivity", Biotechnology of Bacillus thuringiensis, 5, pp 231-245 37 Lee, M K., Walters, F S., Hart, H., Palekar, N., Chen, J.-S (2003), "The mode of action of the Bacillus thuringiensis Vegetative insecticidal protein Vip2A differs from that of Cry1Ab", Appl Environ Microbiol, 69, pp 4648-4657 38 Li, J., J Caroll, and D J Ellar (1991), "Crystal structure of insecticidal δ endotoxin from Bacillus thuringiensis at 2.5 A resolution", Nature 353, pp 815-821 55 39 Mario Soberon, Isabel Gomez, Carolina Rausell, Carlos Munoz Garray, Joan Conde, Meibao Zhuang,, Sarjeet S Gill and Alejandra Bravo (2003), "Analysis of the Sequential Role of Cadherin and APN in Toxicity of CryAb from Bt", Proceeding of the 5th Pacific Rim conference on the Biotechnology of Bacillus thuringiensis and its Environment Impact, Hanoi, Vietnam 40 Metahelix Life Sciences Private Limited, Bio - Safety Evaluation of Cry1C Protein Expressed in Bt cotton carrying Cry1C genes, Review Committee on Genetic Modifications Department of Biotechnology MST, GOI New Delhi 110003 event MLS9124 41 N Crickmore, D R Zeigler, J Feitelson, E Schnepf, , J Van Rie, D Lereclus, J Baum, D H Dean (1998), "Revision of the Nomenclature for the Bacillus thuringiensis Pesticidal Crystal Proteins", Microbiology and Molecular Biology Reviews, pp 807- 813 42 N Crickmore (2011), Bacillus thuringiensis Toxin Gene Nomenclature http://www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/, 27/07/2012 43 Proceedings of the 2nd Canberra B thuringiensis meeting Sertember, Lanberra, 1993 44 Promega (2010), Technical Manual: pGEM®-T and pGEM®-T Easy Vector Systems, Instructions for use of products A1360, A1380, A3600, A3610, USA 45 Shin-ichiro Asano, Chikage Yamashita, Toshihiko Iizuka, Katsuyoshi Takeuchi, Satoshi Yamanaka, David Cerf, and Takashi Yamamoto (2003), "A strain of Bacillus thurigiensis supsp galleriae contaning a novel Cry8 gene highly toxic to Anomala cuprea", Biological Control 28, pp 191-196 46 Strizhov, N., Keller, M., Mathur, J., Koncz - Kalman, Z., Bosch, D., Prudovsky, E., Schell, J., Sneh, B., Koncz, C., Zil berstein, A (1996), "A synthetic cryIC gene, encoding a Bacillus thuringiensis endotoxin, confers Spodopteraresistance in alfalfa and tobacco", L5Proc Natl Acad Sci., USA, 93, pp 15012-15017 47 Suey-Shang Kao, Feng-Chia Hsieh, Ching-Chou Tzeng, Yeong Sheng Tsai (2003), "Screening, Cloning, Transformation and Expression of cry1-type Genes" Proceeding of the 5th Pacific Rim conference on the Biotechnology of Bacillus thuringiensis and its Environment Impact, Hanoi, Vietnam 56 48 Tang, W., Chen, H., Xu, C., Li, X., Lin, Y., Zhang X (2007), "Development of insect-resistant transgenic indica rice with a synthetic cry1C gene" Mol.Breed., 18, pp -10 49 Theiry and E Franchon (1997), “Identification, isolation, culture and preservation entomopathogenic bateria”, Biotechniques Manual of Technology in insect Pathology, Edited by Lawrence A Lacey, Academic Press, pp 55 – 57 50 Wijnands L.M, Dufrene J.B, Van Leusden F.M (2002), Characterization of Bacillus Cereus RIVM report 250912002/2002, The National Institue for Public Health and the Environment, Bilthoven, The Netherlands