Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng lên quá trình nuôi cấy cây thanh hao hoa vàng

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN KHOA KHOA HỌC T ự NHIÊN VÀ XÃ HỘI - ĐINH VĂN THIỆU NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT s ố CHÂT KÍCH THÍCH SINH TRƯỞNG LÊN Q TRÌNH NI CÂY CÂY THANH HAO HOA VÀNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC C huyên ngành: D i truyền học Giáo viên hướng dẫn: ThẽS Nguyễn Thị Hải Yến THÁI NGUYÊN ■ 2007 Tai ngay!!! Ban co the xoa dong chu nay!!! £ u â tv •lănVlẩ t naKiêO' S)ạv &Ọ& M i o i i ỉ tì t t Lời cho tơi b y tỏ lò n g b iết ơn tcti Ths N gu yễn Thị Hải Yến m ôn Sinh h ọc - K h oa K h oa h ọc Tự Iửủẽn Se X ã h ội - Đại học Thải N gu yên người đ ã tậ n tìn h hư ớng dẫn v g iú p đ ỡ tro n g s u ố t trìn h m luận văn Đ ồng thời cũ n g x in gửi lời b iết ơn tới tấ t th ầ y cô, cán tro n g m ôn Sinh h ọc - K h oa K h o a h ọc Tự n h iên &> X ả hội - Đ ại h ọc Thải N gu yên v bạn bè đ ó n g góp nh ữ n g ý k iến v ô cù n g q u ý báu g iú p tơi h ồn th àn h đ ề tài n y Tôi x in b y tỏ lò n g b iết ơn tới n h ữ n g người th ẫ n tro n g gia, đình v bạn bè đ ộn g viên , k h u y ê n bảo v tạo điều k iện tố t n h ấ t cho h ọc tậ p v h oàn thêưih luận v ă n n ậ y Cuối cù n g x in chẩn th n h cảm ơn cản p h ò n g th i n gh iệm K h o a Sinh h ọc - KTN N - Đẹù h ọc Sư ph jn Thải N gu yên đả tạo điều k iện th u ận đ ể tơi h ồn th àn h đề tài n y Tôi v ô cù n g cảm ơn n h ữ n g tìn h cảm tố t đ ẹp Thái Nguyên, ngày 20 tháng 05 năm 2007 Sinh viên Đinh Vân Thiệu \T H III ■Họ LỚPc CNSH - KHOA NHIÊN & XÃ HỘI Số hóaHINH bởi \Trung tâm liệu –KIĐH TN KHOA HỌC T ự http://www.lrc-tnu.edu.vn Jluuh 3.3 NHÂN CHỒI CÂY THANH HAO 3.3.1 Ảnh hưởng BAP lên hệ số nhân chồi BAP thuộc nhóm cytokinin có tác dụng kích thích phân chia tế bào, hình thành sinh trưởng chồi in vitro [6]ắ BAP có biểu ức chế tạo rễ sinh trưởng mô sẹo có ảnh hưởng rõ rệt đến phát sinh phơi vơ tính mẫu ni cấy Hàm lượng BAP thường dao động từ 0,1- mg/1 Ớ ngưỡng nồng độ cao hơn, BAP có tác dụng kích thích rõ rệt đến hình thành chồi bất định, đồng thời ức chế mạnh đến tạo rễ chổi nuôi cấy Trong thí nghiệm chúng tơi sử dụng đoạn thân bánh tẻ thu từ hạt nảy mầm có kích thước (2cm) cấy lên mơi trường MS có bổ sung: sucrose 3%, nước dừa 15%, aga 0,6- 0,8%, than hoạt tính 0,15% BAP với nồng độ thay đổi từ 0; 0,2; 0,5; 1; 1,5; 2,5 mg/1 Sau 40 ngày nuôi cấy thấy nồng độ BAP tãng hệ số nhân chồi tăng lên theo cao 3,2 lần mơi trường có BAP nồng độ mg/1 (bảng 4), nồng độ BAP tăng lên 2,5mg/l hệ số nhân chồi giảm 2,73 lần Như kết luận môi trường MS bổ sung 2mg/l BAP thích hợp cho q trình nhân chồi Bảng 4: Ảnh hưởng BAP tới hệ số nhân chồi Hàm stt lượng BAP Sau 30 ngày Sô mẫu (mg/l) Sau 40 ngày Sô lượng Hệ sô Số lượng Hệ sô chồi nhản chồi chổi nhàn chồi 30 39 1.30 42 1.40 0.2 30 62 2.07 66 2.20 0.5 30 63 2.10 69 2.30 30 68 2.27 72 2.40 1.5 30 75 2.50 80 2.67 30 93 3.10 96 3.20 2.5 30 79 2.63 82 2.73 THIỆU - LỚP - KHOA & XÃ HỘI 38 Số hóĐINH a bởVÃN i Trung tâm HọcCNSH liệuKI – ĐH TNKHOA HỌC T ự NHIÊN http://www.lrc-tnu.edu.vn .-í Uíltl Jăỉl ílíịKièỹ Kưc □ Hệ số nhân chồi (lần) □ Hàm lượng BAP (mg/l) Biểu đồ 4: Ảnh hưởng BAP lên số nhân chồi f\ ụrt' ẽu Hình 4: Thanh hao hoa vàng mơi trường nhân chồi có BAP 39 ĐINH VÃN THIỆU - LÓP CNSH K I - KHOA KHOA HỌC T ự NHIÊN & XÃ HỘI Số hó a bởi Trung tâm Học liệu – ĐH TN http://www.lrc-tnu.edu.vn 3.3.2 Ảnh hưởng kinetin lên hệ số nhân chồi Kinetin sản phẩm phát thuộc nhóm cytokinin có cấu trúc phân tử là: 6-2-furfuryl-aminopurin Sản phẩm kích thích phát sinh chồi, phối hợp xử lý auxin tỷ lệ nồng độ thích hợp kích thích q trình phân chia tế bào Trong thí nghiệm kinetin sử dụng với nồng độ: 1, 2, mg/1 Kết thu bảng cho thấy, nồng độ kinetin thích hợp cho việc tạo chồi lmg/1 với hệ số nhân chồi (2,47 lần) Bảng 5: Ảnh hưởng kinetin tới hệ sô'nhân chồi Nồng độ stt kinetin Số chồi thu Sô mầu (mg/l) Sau 30 Hệ sô Sau 40 Hệ sò' nhân ngày nhân chồi ngày chồi 1 30 58 1.93 74 2.47 2 30 50 1.67 60 2.00 3 30 45 1.50 60 2.00 30 49 1.63 58 1.93 □ Nồng độ kinetin (mg/l) □ Hệ số nhân chồi (lần) Biểu đồ 5: Ảnh hưởng kinetỉn lên hệ sô nhân chồi Thanh hao hoa vàng ĐINH VĂN THIỆU - LỚP CNSH KI - KHOA KHOA HỌC T ự NHIÊN & XẢ HỘI Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐH TN 40 http://www.lrc-tnu.edu.vn V^ĩ/I ỉtìì Kư< i t - 1í Hình 5A: Ảnh chồi Thanh hao hoa vàng sau sử dụng kinetin với nồng độ mg/1 1' ệ \ Hình 5B: Anh chồi Thanh hao hoa vàng sau sử dụng kinetin với nồng độ mg/1 ĐINH VÃN THIỆU - LỚP CNSH KI - KHOA KHOA HỌC T ự NHIÊN & XÃ HỘI Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐH TN 41 http://www.lrc-tnu.edu.vn £ u ậ t v t ó n - t ấ t nqíỈLèn* ẩ i Ẩạc- 3.3.3 Ảnh hưởng phối hợp BAP với NAA lên hệ sô nhân chồi Tác động phối hợp auxin (NAA) cytokinin (BAP) có tác dụng đến phát triển phát sinh hình thái tế bào mô Những nghiên cứu Skoog cho thấy tỷ lệ auxin/cytokinin cao thích hợp cho việc hình thành rễ thấp kích thích q trình phát sinh chồi Nếu tỷ lệ mức độ cân thuận lợi cho phát sinh mơ sẹo [10] Trong thí nghiệm chúng tơi giữ nồng độ BAP mg/1 (nồng độ thích hợp cho phát sinh chồi Thanh hao hoa vàng) kết hợp với NAA với dải nồng độ: 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 mg/1 Kết trình bày bảng biểu đồ cho ta thấy 2mg/l BAP + 0,2 mg/1 NAA cho hệ sô' nhàn chồi cao (1,652 lần) Bảng 6: Ả nh hưởng phối hợp BAP NAA nên hệ sô' nhàn chồi Stt Số mẫu đưa Sô chồi thu Hệ sô nhân vào chồi Hàm lượng BAP+NAA (mg/l) BAP+ 0,2NAA 25 41.3 1.652 2 BAP+ 0,4NAA 25 31.4 1.256 BAP+ 0.6NAA 25 23.5 0.94 BAP+ 0.8NAA 25 30.8 1.232 2BA P+ 1.0NAA 25 0.36 ĐINH VÃN THIỆUtâm - LỚP CNSH KHOA HỌC T ự NHIÊN & XÃ HỘI 42 Số hó a bở i Trung Họ c liệKI u –- KHOA ĐH TN http://www.lrc-tnu.edu.vn Biểu đồ 6: Ảnh hưởng phối hợp BAP NAA lên hệ số nhân chồi Thanh hao hoa vàng Hình 6: Ảnh Thanh hao hoa vàng sau sử dụng phối hợp NAA với BAP để nhân chồi 43 THIỆU - LỚP CNSH KI - KHOA KHOA HỌC T ự NHIÊN & XÃ HỘI Số hóĐINH a bởVÃN i Trung tâm Học liệu – ĐH TN http://www.lrc-tnu.edu.vn £ u ậ t y \>ăn i ấ t n u K iệ a - $ i ẩ c 3.4 GIAI ĐOẠN RA RỄ NAA (Naphthalence acetic acid) đưa vào môi trường nuôi cấy nhằm thúc đẩy sinh trưởng giãn nở tế bào, tăng cường trình sinh tổng hợp trao đổi chất, kích thích hình thành rễ tham gia vào q trình phát sinh phơi vơ tính Nồng độ khuyến cáo 0,1 đến lmg/1, nồng độ cao kích thích hình thành mơ sẹo Trong thí nghiệm NAA sử dụng với dải nồng độ: 0,1, 0,3, 0,6, 0,8 mg/1 Qua bảng biểu đồ cho ta thấy nồng độ lmg/1 NAA có số lượng rễ lớn (14,8) rẽ ngắn (0,72cm) Ở nồng độ 0,3 mg/1 sô' lượng rễ lớn thứ (12,6) chiều dài rễ lớn (3,03 cm) Như nồng độ thích hợp cho việc sinh trưởng rễ Thanh hao hoa vàng 0,3 mg/1 NAA Bảng 7.ẻẢ nh hưởng NAA lên số lượng chiêu rễ Thanh hao hoa vàng stt Hàm lượng NAA (mg/1) Chiều dài rễ (cm) Sô lượng rễ 0.1 1.97 2.4 0.3 3.03 12.6 0.6 2.42 7.8 0.8 0.71 0.72 14.8 VĂN THIỆU - LỚP CNSH KI - KHOA KHOA HỌC T ự NHIÊN & XẢ HỘI 44 Số ĐINH hóa bở i Trung tâm Học liệu – ĐH TN http://www.lrc-tnu.edu.vn Jã4l t ú ĩ Họ i □ Hàm krợng NAA (mg'!) □ Chiều dải rễ (cm) o Số lượng rễ Biểu đồ 7: Ảnh hưởng NAA tới chiều dài số lượng rễ Thanh hao hoa vàng Hình 7: Anh rễ Thanh hao hoa vàng sử dụng NAA để tạo rễ ĐINH VAN THIẸU - LƠP CNSH KI - KHOA KHOA HỌC TựN H IE N & XA HỢI Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐH TN 45 http://www.lrc-tnu.edu.vn £uận, tỉăn, tưl tiíệKiêp' ftọc 3.5 KẾT QUẢ RA CÂY Tạo sau giai đoạn ni cấy in vitro phát triển bình thường ngồi điều kiện tự nhiên có ý nghĩa quan trọng Trong thực tiễn giai đoạn định thành hay bại trình nhân giống Trong đề tài này, thời kỳ sung sức (cây xanh, tốt, rẽ phát triển) định đưa ngồi tự nhiên Chúng tơi tiến hành đưa 50 ống nghiệm tự nhiên, sau 20 ngày tiến hành lấy số liệu thu 38 sống 76%, số chết 12 chiếm 24% Các sống phát triển tốt (có xanh, thân mập rẻ dài) ¿5 ỆV > s i Hình 8: Ảnh Thanh hao hoa vàng đưa tự nhiên ĐINH VÃN THIỆU - LỚP CNSH KI - KHOA KHOA HỌC T ự NHIÊN & XÀ HỎI Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐH TN 46 http://www.lrc-tnu.edu.vn ^■ u ậ « 'ỉă n t t Hỹ t H p ỉP i R ọ c KẾT LUẬN VÀ ĐỂ NGHỊ Kết luận Dựa kết phân tích chúng tơi đưa kết luận sau: Khử trùng mẫu hạt Thanh hao HgCl, 0,1 % với thời gian đến phút cho kết tốt ti lệ nhiễm thấp (4,67 - 11,33%) ti lệ nảy mầm cao đạt (88,11 %- 92,48%) Với dung dịch javen 60% khử trùng thời gian 20 phút tốt (ti lệ nhiễm 55%, ti lệ nảy mầm cao đạt 91,667%) Nồng độ NAA thích hợp cho việc tạo mô sẹo mg/1, tỷ lệ tạo mơ ỉẹo (100%) Nồng độ BAP thích hợp cho việc nhân chồi 2mg/l (hệ số nhân chồi 3,2 lần) Nồng độ kinetin thích hợp cho việc nhân chồi lmg/1 (hệ số nhân chồi 2,45 lần) BAP kinetin có ảnh hường khác lên hệ số nhân chồi Thanh hao hoa vàng Mơi trường MS bổ sung 2mg/l BAP thích hợp (hệ số nhân chồi 3,2 lần) Phối hợp cytokinin (BAP) với auxin (NAA) để tạo chồi Thanh hao hoa vàng có nồng độ thích hợp 2mg/l BAP+ 0.2 mg/1 NAA với hệ sô' nhân chồi (1.652 lần) Nồng độ NAA thích hợp cho việc sinh trường rễ Thanh hao hoa vànơ 0.3 mg/1 (số lượng rễ 12,6 chiều dài trung binh cùa rễ 3,03cm) Đề nghị Tiên hành nghiên cứu tìm quy trình chiết xuất artemisinin từ mỏ sẹo Nghiên cứu công nghệ chuyển gen tổng hợp artemisinin cùa Thanh hao hoa vàng vào vi sinh vật, làm giảm giá thành artemisinin ĐINH VÃN THIỆU - LỚP CNSH K I - KHOA KHOA HỌC T Ị M ĐÊN & XẢ HỘI Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐH TN 47 http://www.lrc-tnu.edu.vn X u ậ n - ¿ ă n lấ t tu d U ê a * ă ) i ílạ < s PHỤ LỤC: MÔI TRƯỜNG MURASHING-SKOOG (MS) Nồng độ Dung dịch mẹ Hoa chất MSI K N03 Muối đa lượng n h 4n o MgS04.7H20 k 2p o MS II CaCl2 2H20 Muối đa lượng MS III H B O Muối vi lượng MgS04 ZnS04 KI Na2M0ơ CuS04 C„C12 (mg/1 mòi trường) 1900 1650 370 170 440 6,2 22,3 8,6 0,83 0,25 0,025 0,025 MS IV Na2EDTA 37,3 Sắt FeS04.7 H20 27,8 Glycine MS V Inosit (pha NaOH) 100 Vitamin Nicotinic axit 0,5 Vitamin B, 0,5 Vitamin B6 0,5 VÀN THIỆU - LỚP CNSH KI - KHOA KHOA HỌC T ự NHIÊN & XÃ HỘI 48 Số ĐINH hóa bở i Trung tâm Học liệu – ĐH TN http://www.lrc-tnu.edu.vn b uậtv t ấ t l iiifiiéa Ổ ^ọí Ẩ ọ t TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt [1] Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, Lê Thị Muội Công nghệ sinh học cải tiến giống trồng Nhà Xuất Bản Nông Nghiệp 1997 [2] Lê Trần Bình cs Tài liệu thực hành Công Nghệ Tế Bào Thực Vật Viện Công Nghệ Sinh Học Phịng Cơng nghệ Tế bào thực vật 2003 [3] Trần Việt Hưng Từ điển thảo mộc dược học - tập l ẵ 2006 [4] Vũ Thị Lan Luận văn Thạc sĩ Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy để thu nhận sinh khối định tính số chất có hoạt tính sinh học mơ ni cấy từ Trinh nữ hoàng cung (Crinum Latifolium L.) 2005 [5] Nguyễn Đức Thành Nuôi cấy mô tế bào thực vật Nghiên cứu ứng dụng Nhà xuất Nông nghiệp Hà Nội 2000 [6] Thông tin khoa học, công nghệ Lâm Đồng, số 1.1993 [7] Trần Xuân Thuyết Thanh hao hoa vàng Tạp chí sức khoẻ & đời sống [8] Nguyễn Vãn Uyển Nuôi cấy Mô thực Vật Phục Vụ công tác Giống cày trồng Nhà Xuất Bản Nông Nghiệp 1993 [9] Vũ Văn Vụ- Nguyễn Mộng Hùng- Lê Hồng Điệp Công nghệ Sinh học, Tập 1,2 Nhà Xuất Bản Giáo Dục 2005 [10] Vũ Văn Vụ, Vũ Thanh Tâm, Hoàng Minh Tấn Sinh lý học thực vật Nhà Xuất Bản Giáo Dục 2005 Tài liệu tiếng Anh [11] Ann Trop.Med Parasitol Số 79-1985 [12] Biochem.Pharmacol Số 32-1983 [13] International Journal of Immunology Số 385-1990 [14] International Journal of Oncology So 18 April,2001 [15] Journal of Natural Products So 47-1984 số 54-1991 [16] Parasitology Số 7-1993 [17] Tropical Disease Bulletin So-1980 [18] Planta Medica Số 68-Dec 2002 [ 19] Trans Royal Soc Trop Med Hygiene So 88-1994 ĐINH VÀN THIỆU - LỚP CNSH KI - KHOA KHOA HỌC T ự NHIÊN & XÃ HỎI Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐH TN 49 http://www.lrc-tnu.edu.vn