Thiết kế vector chuyển gen gshi nhằm nâng cao khả năng tích lũy asen trong thực vật

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC NGUYỄN THU TRANG THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN GSH1 NHẰM NÂNG CAO KHẢ NĂNG TÍCH LŨY ASEN TRONG THỰC VẬT LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thái Nguyên – 2013 Số hóa trung tâm học liệu Tai ngay!!! Ban co the xoa dong chu nay!!! http://lrc.tnu.edu.vn/ ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC NGUYỄN THU TRANG THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN GSH1 NHẰM NÂNG CAO KHẢ NĂNG TÍCH LŨY ASEN TRONG THỰC VẬT Chun ngành: Cơng nghệ Sinh học Mã số: 60 42 0201 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS LÊ VĂN SƠN Thái Nguyên – 2013 Số hóa trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/ i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, lời tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới TS Lê Văn Sơn, Phòng Kỹ thuật Di truyền, Viện Công nghệ sinh học , Viện Hàn lâm Khoa học Cơng nghệ Việt Nam tận tình hướng dẫn, bảo, dìu dắt, giúp đỡ tơi thời gian học tập hồn thành khóa luận Tơi xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành tới PGS TS Chu Hoàng Hà, ThS Bùi Phương Thảo, tập thể cán Phịng Cơng nghệ Tế bào Thực vật, Viện Cơng nghệ sinh học nhiệt tình giúp đỡ, truyền đạt nhiều kinh nghiệm quý báu cho suốt thời gian làm khố luận Tơi xin cảm ơn Phịng Đào tạo thầy cô giáo Cơ sở đào tạo sau đại học, Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên quan tâm, tạo điều kiện thuận lợi cho tơi q trình học tập Cuối cùng, xin dành cho người thân gia đình bạn bè lịng biết ơn sâu sắc, người thân yêu bên tôi, động viên góp ý cho tơi suốt q trình học tập hồn thành khố luận Tơi chân thành cảm ơn tất giúp đỡ q báu đó./ Thái Nguyên, ngày 25 tháng 10 năm 2013 Tác giả luận văn Nguyễn Thu Trang Số hóa trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/ ii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT A.tumefaciens Agrobacterium tumefaciens As Asen BAP 6- benzenladenine Bp base pair (cặp bazơ) DNA Deoxyribonucleic Acid dNTPs Deoxy Nucleoside Triphosphate EDTA Ethylene Diamine tetra- acetate Acid Gus Gen mã hóa enzyme β-glucuronidase GSH Glutathione GSH1 Enzyme γ-glutamylcysteine synthetase IBA Indole-3-butyric acid kb Kilo base LB Môi trƣờng theo Luria Bertani MS Môi trƣờng theo Murashige Skoog (1962) OD Optical density (mật độ quang học) PCR Polymerase Chain Reaction RNase ARN polimerase Taq Thermus aquaticus Ti-plasmid Tumor inducing plasmid (plasmid gây khối u) T-DNA Transferred-DNA TP Transit peptide iii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Trang 2.1 Trình tự mồi nhân gen GSH1……………………………… 25 2.2 XbaI SacI 26 2.3 Thành phần phản ứng ghép nối GSHI vào vector PBI121…… 26 2.4 Thành phần phản ứng colony-PCR 28 2.5 Sol 29 2.6 Thành phần dung dịch tách chiết DNA……………………… 32 2.7 Thành phần phản ứng PCR nhân gen GSHI………………… 33 3.1 Kết chuyển gen chọn lọc in vitro thuốc K326 42 3.2 Kết phân tích dịng thuốc chuyển gen phƣơng pháp PCR………………… 44 Kết đánh giá khả chống chịu As dòng thuốc chuyển gen GSH1………………………………………… 44 3.3 iv DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Tên hình Trang 1.1 Mơ hình hấp thụ chất thực vật 1.2 Sơ đồ hấp thụ As trao đổi chất thực vật …… 12 1.3 Cơ chế lây nhiễm A tumefaciens vào tế bào thực vật 21 2.1 Sơ đồ vector pBluesript II SK-GSH1…………………………… 25 3.1 Kết xử lý vector pBluescript II SK-GSH1 cặp enzyme giới hạn XbaI SacI …………………………………………… 36 3.2 Kết xử lý vector pBI121 cặp enzyme giới hạn 36 3.3 Kết điện di sản phẩm tinh 37 3.4 E.coli DH5α 38 3.5 Kết điện di sản phẩm colony-PCR cặp mồi GSH1F1/GSH1-M1 39 Kết điện di sản phẩm cắt vector tái tổ hợp XbaI SacI 39 Kết điện di sản phẩm cắt vector tái tổ hợp XbaI SacI 40 Mảnh thuốc K326 môi trƣờng đồng nuôi cấy (A) bắt đầu cảm ứng tạo cụm chồi môi trƣờng GM +Km50 (B) 41 Sự phát triển mảnh môi trƣờng chọn lọc GM + Km50 sau khoảng tuần theo dõi 42 3.10 Cây tuần môi trƣờng rễ (A) in vivo tháng (B)………………………………………………………… 42 3.11 Kết điện di DNA tổng số dòng thuốc …………… 43 3.12 Kết điện di sản phẩm PCR dòng thuốc với cặp mồi GSH1-F/GSH1-R………………………………………………… 43 3.6 3.7 3.8 3.9 Số hóa trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/ v MỤC LỤC Lời cảm ơn i Danh mục ký hiệu, chữ viết tắt ii Danh mục bảng iii Danh mục hình iv Mục lục v MỞ ĐẦU CHƢƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình ô nhiễm As biện pháp xử lý 1.1.1.Tình hình nhiễm As 1.1.2 Tác hại As đến môi trƣờng sức khỏe ngƣời 1.1.3 Các phƣơng pháp xử lý truyền thống 1.1.4 Xử lý ô nhiễm As đất thực vật (Phytoextraction) 1.1.4.1 Xử lý ô nhiễm As đất thực vật “siêu tích tụ” 1.1.4.2 Thực vật biến đổi gen cho mục đích xử lý nhiễm kim loại nặng 10 1.2 Cơ sở khoa học chuyển gen thực vật 14 1.2.1 Khái niệm chuyển gen 14 1.2.2 Các phƣơng pháp chuyển gen thực vật 14 1.2.2.1 Các phƣơng pháp chuyển gen trực tiếp 14 1.2.2.2 Phƣơng pháp chuyển gen gián tiếp 17 1.2.3 Các hệ thống vector dùng để chuyển gen 20 1.2.3.1 Hệ vector xâm nhập (CXN) 20 1.2.3.2 Hệ vector nhị thể (Binary vector) 21 Số hóa trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/ vi 1.3 Glutathione gen GSH1 Số hóa trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/ 21 vi CHƢƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.1 Vật liệu 24 2.1.1 Nguyên liệu thực vật 24 2.1.2 Chủng vi khuẩn nguyên liệu DNA 24 2.1.3 Hóa chất 25 2.1.4 Thiết bị 25 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 25 2.2.1 Phƣơng pháp thiết kế vector chuyển gen 25 2.2.2 Phƣơng pháp chuyển gen vào thuốc 30 2.2.3 Các phƣơng pháp phân tích chuyển gen 32 CHƢƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35 3.1 Kết thiết kế cấu trúc vector chuyển gen 35 3.1.1 Kết thiết kế cấu trúc vector chuyển gen pBI121/GSH1 35 3.1.2 Tạo chủng vi khuẩn A tumefaciens mang vector tái tổ hợp pBI121/GSH1 39 3.2 Kết chuyển gen chọn lọc in vitro giống thuốc K326 40 3.3 Kết phân tích chuyển gen 42 3.3.1 Kết phân tích dịng chuyển gen PCR 42 3.3.2 Kết đánh giá khả chống chịu As dòng chuyển gen 44 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ… 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO……………………………………………… 48 PHỤ LỤC………………………………………………… …………… 54 Số hóa trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/ MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Asen (As) nguyên tố phổ biến thiên nhiên, chiếm 1,1 – % tổng số nguyên tử vỏ trái đất As đất tồn pha rắn chiếm tới 94% lại 6% tổng As tồn dung dịch đất, dễ dàng di chuyển khỏi Nguồn phát thải As trƣớc hết từ ngành cơng nghi , chì (Pb), thủy ngân (Hg) cadmium (Cd) Để xử lý đất ô nhiễm As ngƣời ta thƣờng sử dụng phƣơng pháp truyền thống nhƣ: rửa đất; cố định chất nhiễm hố học vật lý; xử lý nhiệt; trao đổi ion, ơxi hố khử chất ô nhiễm; đào đất bị ô nhiễm để chuyển đến nơi chơn lấp thích hợp, Các phƣơng pháp thƣờng tốn kinh phí, giới hạn kỹ thuật hạn chế diện tích Gần đây, nhờ hiểu biết chế hấp thụ, chuyển hoá, chống chịu loại bỏ kim loại nặng số loài thực vật, ngƣời ta bắt đầu ý đến khả sử dụng thực vật để xử lý môi trƣờng nhƣ công nghệ mơi trƣờng đặc biệt Tuy nhiên lồi thực vật thƣờng đƣợc dùng lại có sinh khối thấp, yêu cầu đặt phải tạo giống có khả sinh trƣởng nhanh, sinh khối lớn có khả hấp thụ kim loại nặng Cây trồng chuyển gen giải pháp cho vấn đề Trong đề tài lựa chọn gen GSH1 mã hóa enzyme γglutamyl cysteine synthetase tham gia q trình sinh tổng hợp glutathione (GSH) - trung gian giải độc quan trọng kim loại nặng thực vật gen mục tiêu Khi để thực vật tiếp xúc với kim loại nặng nhiều tạo phản ứng oxy hóa (ROS) tích lũy ion kim loại (M +) GSH khử độc Số hóa trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/ 43 Bảng 3.1 Kết chuyển gen chọn lọc in vitro thuốc K326 Lần biến nạp Tổng số mẫu biến nạp Số mẫu tạo cụm chồi Số chồi sống sót môi trƣờng GM chọn lọc Số chồi tạo rễ môi trƣờng RM chọn lọc 30 15 60 56 30 18 62 58 Tổng cộng 60 33 122 114 Dựa vào bảng số liệu trên, ta thấy có 50-60% tổng số mẫu tạo chồi Thuốc đối tƣợng có khả đáp ứng cao chuyển gen Tuy nhiên, tỷ lệ chuyển gen khả tái sinh phụ thuộc vào cấu trúc vector chuyển Trong nghiên cứu này, giả định chuyển gen có khả tái sinh rễ mơi trƣờng chọn lọc ngƣỡng tỷ lệ chuyển gen đạt đƣợc tới xấp xỉ 1,9 cây/mảnh Đây tỷ lệ tƣơng đối cao so với công bố trƣớc Các kết nghiên cứu cho thấy cấu trúc kích thƣớc gen chuyển có ảnh hƣởng tới khả tiếp nhận Trong thí nghiệm này, cấu trúc vector chuyển có kích thƣớc trung bình Vì giải thích phần đáp ứng chuyển nạp cấu trúc gen tƣơng đối tốt 3.3 Kết phân tích chuyển gen 3.3.1 Kết phân tích dịng chuyển gen PCR Với tổng số 60 mảnh sử dụng cho biến nạp, chúng tơi thu đƣợc 114 dịng thuốc T0 sống sót rễ mơi trƣờng có bổ sung kháng sinh chọn lọc Lựa chọn ngẫu nhiên 18 dòng thuốc T0 trồng giá thể TN1 chăm sóc điều kiện nhà lƣới Tỷ lệ sống sót thu đƣợc đạt 100% Để kiểm tra có mặt gen chuyển chuyển gen, tiến hành tách DNA tổng số từ mẫu dòng thuốc chuyển gen rễ phát triển tốt giá thể sau tuần kiểm tra phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu GSH1-F/GSH1-R Kết tách chiết DNA tổng số dòng thuốc chuyển gen dòng đối chứng (không chuyển gen) đƣợc điện di kiểm tra gel agarose 0,8% cho thấy tất mẫu có băng (Hình 3.11) Số hóa trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/ 44 Băng xuất rõ đậm nét chứng tỏ DNA tổng số tách chiết đƣợc nguyên vẹn, tỉ lệ DNA đứt gãy thấp sử dụng cho phản ứng PCR Hình 3.11 Kết điện di DNA tổng số dịng thuốc wt: thuốc khơng chuyển gen; 1-9: dòng thuốc chuyển gen Kết phân tích kiểm tra sản phẩm PCR dịng thuốc chuyển gen đƣợc thể Hình 3.12 Bảng 3.2 kb Hình 3.12 Kết điện di sản phẩm PCR dòng thuốc với cặp mồi GSH1-F/GSH-R (+): đối chứng dƣơng; (-): đối chứng âm; M: Marker DNA 1Kb; wt: Cây thuốc không chuyển gen; 1- 19 : dòng thuốc chuyển gen Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm PCR dòng thuốc biến nạp cấu trúc pBI121/GSH1 cho thấy có mẫu dƣơng tính với phản ứng nhân cặp mồi đặc hiệu Tất mẫu xuất băng kích thƣớc khoảng 2,2 kb, tƣơng ứng với kích thƣớc chủa cấu trúc GSH1 thiết kế Số hóa trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/ 45 ban đầu (đối chứng +, hình 3.14), chứng tỏ cấu trúc GSH1 đƣợc chuyển thành công vào dịng thuốc (Hình 3.14) Bảng 3.2: Kết phân tích dịng thuốc chuyển gen phƣơng pháp PCR Cấu trúc chuyển Tổng số mẫu phân tích Số mẫu dƣơng tính với PCR Tỷ lệ dịng dƣơng tính với PCR (%) GSH1 18 44,4 Kết Bảng 3.2 cho thấy tỷ lệ dƣơng tính qua sàng lọc PCR đạt 44,4% (8/18 cây) 55,6% tổng số vƣợt qua chọn lọc nhƣng âm tính với kết PCR 3.3.2 Kết đánh giá khả phát triển dòng chuyển gen môi trường chứa As Lấy thuốc dƣơng tính có ngày tuổi ni cấy, chiều dài khoảng cm đặt vào môi trƣờng rễ RMTL có bổ sung As (V) (Na2HAsO4) với nồng độ khác nhau: M, 50 M, 100 M, 150 M Sau 10 ngày ta thu đƣợc kết thể bảng 3.3 Bảng 3.3 Kết đánh giá phát triển dòng thuốc môi trƣờng chứa As nồng độ khác Nồng độ As ( M) Cây WT Cây chuyển gen Số hóa trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/ 46 50 100 150 Ở mơi trƣờng rễ khơng chứa As đối chứng (ĐC) chuyển gen (CG) phát triển tƣơng đƣơng Tuy nhiên bổ sung As vào mơi trƣờng rễ mức độ phát triển có khác biệt Ở nồng độ As 50 M ĐC phát triển không CG, xanh nhƣng không mọc rễ, khơng tạo Trong nồng độ As CG cho rễ phát triển dài, mảnh xanh đậm, mọc thêm Số hóa trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/ 47 mới, có sức sống cao Đây đƣợc coi nồng độ cho CG tích lũy đƣợc As phát triển tốt môi trƣờng Khi tăng nồng độ As lên 100 M, CG phát triển đƣợc nhiên rễ không dài, không xanh, bắt đầu chuyển màu không đƣợc xanh tốt nhƣ nồng độ 50 M Trong đó, ĐC có tƣợng thối rễ,các mảnh úa vàng, dấu hiệu cho ngừng phát triển dần chết Biều thấy rõ ĐC CG cấy môi trƣờng rễ có bổ sung 150 M As Dù đƣợc chuyển gen nhƣng ngƣỡng As cao nên không phát triển đƣợc Qua bảng 3.3 ta nhận thấy CG ĐC có sƣ khác rõ ràng cấy môi trƣờng rễ có bổ sung As Những CG sống đƣợc mơi trƣờng có bổ sung As có nồng độ từ 50-100 M Cịn ĐC khơng phát triển dần chết môi trƣờng chứa As Điều chứng tỏ dòng thuốc mang gen GSH1 có khả khả sinh trƣởng phát triển mơi trƣờng có As tốt không chuyể gen Kết tiếp tục đƣợc phân tích khả hấp phụ tích lũy As cây, từ biết đƣợc mức biểu hoạt tính gen GSH1 tái tổ hợp, đƣa đƣợc hƣớng úng dụng trồng khác Số hóa trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/ 48 V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận Đã thiết kế đƣợc vector chuyển gen pBI121 mang gen GSH1 đổi mã biểu phù hợp thực vật biến nạp thành công vào chủng vi khuẩn A tumefaciens EHA105 Đã chuyển thành công gen GSH1 vào giống thuốc K326 thu đƣợc 114 dòng rễ môi trƣờng chứa kháng sinh chọn lọc Kết kiểm tra có mặt gen GSH1 18 chuyển gen phản ứng PCR cho thấy 8/18 dịng cho kết dƣơng tính (chiếm tỷ lệ 44,4%) Các dòng chuyển gen bƣớc đầu thể khả phát triển tốt đối chứng môi trƣờng chứa As, đặc biệt ngƣỡng nồng độ As 50µM Đề nghị Để phát triển kết nghiên cứu đề tài, đề xuất số ý kiến nhƣ sau: - Tiếp tục phân tích dịng chuyển gen, đánh giá mức độ biểu gen chuyển - Đánh giá khả tích lũy As dịng chuyển gen mơi trƣờng nhiễm Số hóa trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/ 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Đặng Thị An, Chu Thị Thu Hà (2005) Ảnh hƣởng kim loại nặng đất thời gian phơi nhiễm lên tích tụ kim loại số rau Những vấn đề nghiên cứu khoa học sống NXB KH&KT: 361-364 Lê Trần Bình, Cao Huyền Trang (2005) Nghiên cứu phát triển vaccine ăn đƣợc thực vật Tạp chí cơng nghệ sinh học 3: 133-142 Hồng Văn Bính (2007) Độc chất học cơng nghiệp dự phòng nhiễm độc, NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Đặng Đình Kim (2010) Báo cáo tổng kết đề tài: Nghiên cứu ứng dụng thực vật để cải tạo đất bị ô nhiễm KLN vùng khai thác khoáng sản Đề tài cấp nhà nƣớc KC08.04/06-10 Võ Văn Minh (2007) Khả hấp thụ Cadimi đất cỏ Vetiver Thông báo khoa học, ĐHSP Đà Nẵng Nguyễn Quốc Thơng, Đặng Đình Kim, Lê Lan Anh, Trần Văn Tựa (1999) khả tích lũy KLN Cr, Ni, Zn bèo tây xử lý nƣớc thải cơng nghiệp Báo cáo Hội nghị CNSH tồn quốc, Hà Nội Nguyễn Quốc Thơng, Đặng Đình Kim, Vũ Đức Lợi, Lê Lan Anh, Trần Dụ Chi, Vũ Văn Vụ (2003) Hấp thụ KLN Cr Ni từ nƣớc thải mạ điện cải soong Hội nghị CNSH toàn quốc, Hà Nội Lê Thế Thự, Vũ Trọng Thiện, Đặng Ngọc Chánh cs (2006) Điều tra ô nhiễm arsen nƣớc ngầm tỉnh miền Tây Nam Bộ (Long An, Tiền Giang, Bến Tre) Tạp chí Y học thành phố Hồ Chí Minh 10(4): 116-121 Trần Văn Tựa (2007) Nghiên cứu sử dụng lồi thực vật thủy sinh điển hình cho xử lý nƣớc thải công nghiệp chế biến thực phẩm Đề tài cấp viện KH&CN Việt Nam 2005-2006 Số hóa trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/ 50 Tài liệu tiếng Anh 10 Abernathy CO, Thomas DJ (2003) Health effects and risk assessment of arsenic Journal of Nutrition 133: 1536-1539 11 Andrew Meharg (2005) Venomous Earth - How Arsenic Caused The World's Worst Mass Poisoning, Macmillan Science Macmillan Science 192 12 Aposhian HV, Zakharyan RA, Petrick JS, Sampayo A, Radabaugh TR, Wildfang EK, Healy SM and Aposhian MM (1999) Methylarsonous acid [MMA(III)], the most toxic and neglected biotransformant of inorganic arsenic Chapman and Hall, New York 43 13 Baker AJM, McGrath SP, Reeves RD, Smith JAC (2000) Metal hyperac cumulator plants: A review of the ecoloy and physiology of a biochemical resource for phytoreme diation of metal-polluted soils Phytoremediation of Contaminated Soil and Water Florida: 85-107 14 Bako L, Umeda M, Tiburcio AF, Schell J, Koncz C (2003) The VirD2 pilot protein of Agrobacterium-transferred DNA interacts with the TATA box - binding protein and a nuclear protein kinase in plants Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 100: 1010810113 15 Citovsky V, Wong ML, Zambryski P (1989) Cooperative interaction of Agro bacterium ViE2 protein with single-stranded DNA: implications for the T-DNA transfer process Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 86: 1193-1197 16 Chen T, Liao XY, Huang Z, Lei M, Li WX, Mo Ly, An ZZ, Wei CY, Xiao XY and Xie H (2006) Phytoremendiation of arsenic contaminated soil in china Method Biotech 23: 391-400 17 Cobbett CS (2000) Phytochelatins and their roles in heavy metal detoxification Plant Physiol 123: 825-832 18 Cole DJ (1983) Oxidation of xenobiotics in plants Prog Pest Biochem Technol 3: 199-253 Số hóa trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/ 51 19 Coleman JOD, Blake - Kalff MMA, Davies TGE (1997) Detoxification of xenobiotics by plants: Chemicalmodification and vacuolar compartimentation Trends Plant Sci 2: 144-151 20 Dhankher OP, Li Y, Rosen BP, Shi J, Salt D, Senecoff JF, Sashti NA, Meagher RB (2002) Engineering tolerance and hyperaccumulation of arsenic in plants by combining arsenate reductase and gamma-glutamylcysteine synthetase expression Nat Biotechnol 20: 1140-1145 21 Ding ZS, Zhao M, Jing YX, Li LB and Kuang TY (2006) Efficient agro bacterium mediated transformation of rice by phosphomannose isomerase mannose selection Plant Molecular Biology Reporter 24: 295-303 22 Douglas KT (1987) Mechanisms of action of gluta-thione-dependent enzymes Advances in Enzymology and Related Areas of Molecular Biology 59: 103-167 23 Foyer CH, Souriau N, Perret S, Lelandais M, Kunert KJ, PruvostC, Jouanin L (1995) Overexpression of glutathione reductase but not glutathione synthetase leads to increases in antioxidant capacity and resistance to photoinhibition in poplar trees Plant Physiol 109: 1047-1057 24 Gallego SM, Benavides MP, Tomaro ML (1996) Effect of heavymetal ion excess on sunflower leaves: evidence for involvementof oxidative stress Plant Sci 121: 151-159 25 Gasic K, Korban SS (2007) Transgenic Indian mustard (Brassica juncea) plants expressing an Arabidopsis phytochelatin synthase (AtPCS1) exhibit enhanced As and Cd tolerance Plant Mol Biol 64: 361-369 26 Gelvin SB (2003) Agrobacterium and plant transformation: the biology behind the “gene - jockeying” tool Microbiology and Molecular Biology 67: 16-37 27 Guo JB, Dai XJ, Xu WZ, Ma M (2008) Overexpression of GSH1 and AsPCS1 simultaneously increase the tolerance and accumulation of cadmium ad arsenic in Arabidopsis thaliana Chemosphere 72: 1020-1026 Số hóa trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/ 52 28 Gushima H, Yasuda S, Soeda E, Yokota M, Kondo M and Kimura A (1984) Complete nucleotide se-quence of the E.coli glutathione synthetase gsh-11 Nucleic Acids Res 12: 9299-9307 29 Hooykaas VS, Hooykass PJJ, Schilperoot RA (1984) Expression of Ti plasmid genes in monocotyledonous plants infected with Agrobacterium tumefaciens Nature 311: 763-764 30 Huang CS, Moore WR, Meister A (1988) On the active site thiol of γglutamylcysteine synthetase: relationships to catalysis, inhibition, and regulation Proc natl Acad sci USA 8: 2464-2468 31 Kotrba P, Najmanova J, Macek T, Ruml T, Mackova M (2009) Genetically modified plants in phytoremediation of heavy metal and metalloid soil and sediment pollution Biotech Adv 27: 799-810 32 Larsson A, Orrenius S, Holmgren A and Mannervik B (1983) Functions of Glutathione: Biochemical, Physiological, Toxicological and Clinical Aspects Raven Press, New York 33 Ma JF, Tamai K, Ichii M, Wu GF (2002) A rice mutant defective in Si uptake Plant Physiol 130: 2111-2117 34 Ma JF, Tamai K, Yamaji N, Mitani N, Konishi K, Katsuhara M, Ishiguro M, Murata Y, Yano M (2006) A silicon transporter in rice Nature 440: 688691 35 Ma LQ, Komar KM, Tu C, Zhang W, Cai Y (2001) A fern that hyperacumulate arsenic Nature 223: 409-579 36 Mc Grath SP, Zhao FJ (2003) Phytoextraction of metals and metalloids from contaminated soils Curr Opin Biotechnol 14: 277-282 37 Meister A (1988) Glutathione metabolism and its selective modification J Biol Chem 263: 17205-17208 38 Meister A and Anderson ME (1983) Glutathione in: Ann rev biochem (Snell EE, Boyer PD, Meister A and Richardson CC) Annual Reviews 52: 711-760 Số hóa trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/ 53 39 Meng YL, Liu Z, Rosen BP (2004) As(III) and Sb(III) uptake by GlpF and efflux by ArsB in Escherichia coli J Biol Chem 279: 18334-18341 40 Murata K and Kimura A (1982) Cloning of a gene responsible for the biosynthesis of glutathione in Escherichia coli B Appl Environ Microbiol 44(6): 1444-1448 41 Pilon-Smits E (2005) Phytoremediation annu rev Plant biol 56: 15-39 42 Prasad MNV and H Freitas (2003) Metal hyperaccumulation in plants – Biodiversity prospecting for phytoremediation technology Electr J Biotech 6(3): 275-321 43 Sandermann H (1994) Higher plantmetabolismof xenobiotics: The „green liver‟ concept Pharmacogenetics 4: 225-241 44 Shelmerdine PA, Colin RB, McGrath SP and Young SD (2009) Modelling phytoremediation by the hyperaccumulating fern, Pteris vittata, of soils historically contaminated with arsenic Env Pollution 157(5): 1589-1596 45 Song WY, Park J, Mendoza-Cozatl DG, Sute-Grotemeyer M, Shim D, Hoertensteiner S, Geisler M, Weder B, Rea PA, Rentsch D, Schroeder JI, Lee Y, Martinoia E (2010) Arsenic tolerance in Arabidopsis is mediated by two ABCC-type phytochelatin transporters Proc Natl Acad Sci USA 107(49): 21187-21192 46 Watanabe K, Yamano Y, Murata K and Kimura A (1986) The nucleotide sequence of the gene for y- glutamylcysteine synthetase of Escherichia coli Nucleic Acids Res 14: 4393-4000 47 Weckx JEJ, Clijsters HMM (1996) Oxidative damage and defenseme chanisms in primary leaves ofPhaseolus vulgarisas a result ofroot assimilation of toxic amounts of copper Physiol Plant 96: 506–512 48 Weckx JEJ, Clijsters HMM (1997) Zn phytotoxicity induces oxidative stress in primary leaves of Phaseolus vulgaris PlantPhysiol Biochem 35: 405410 Số hóa trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/ 54 49 Wei SH, Zhou QX, Kovl PV (2006) Flowering stage characteristics of cadmium hyperaccumulator Solanum nigrum L and their significance to phytoremediation Sci of the Total Env 369: 441-446 50 WHO (World health organization) Genneva, “Inorganic lead environment health criteria 165” IPCS (International program on chemical safely) 51 Williams PN, Price AH, Raab A, Hossain SA, Feldmann J, Meharg AA (2005) Variation in arsenic speciation and concentration in paddy rice related to dietary exposure Environ Environ sci Technol 39(15): 5531-5540 52 Winski SL and Carter DE (1995) Interactions of rat red blood cell sulfhydryls with arsenate and arsenite Journal of Toxicological Environment and Health 46: 379-397 53 Xu XY, McGrath SP, Zhao FJ (2007) Rapid reduction of arsenate in the medium mediated by plant roots New Phytol 176: 590-599 54 Zhao FJ, Ma JF, Meharg AA, McGrath SP (2009) Arsenic uptake and metabolism in plants New Phytol 181(4): 777-794 55 Zhu YG, Rosen BP, (2009) Perspectives for genetic engineering for the phytoremediation of arsenic-contaminated environments: from imagination to reality? Curr Opin Biotech 20: 220-224 56 Pilon-Smits EAH, Hwang S, Lytle CM, Zhu Y, Tai JC, Bravo RC, Chen Y, Leustek T, Terry N (1999) Overexpression of ATP sulfurylase in Indian mustard leads to increased selenate uptake, reduction and tolerance Plant Physiol 119: 123-132 57 Sies H (Ed) (1985) Oxidative Stress Academic Press, London 58 Steffens JC (1990) The heavy metal-binding peptides of plants Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Bio l41: 553-575 Số hóa trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/ 55 PHỤ LỤC Phụ lục Sơ đồ vector pBI121/GUS Phụ lục Trình tự gen GSH1 tổng hợp nhân tạo Trình tự nucleotide gen GSH1 gồm 2037 bp nhƣ sau: ATGGGACTCTTAGCTTTGGGCACGCCTTTGCAGTGGTTTGAGTCTAGGACGTACAATGAACACATA AGGGATGAAGGTATCGAGCAGTTGTTGTATATTTTCCAAGCTGCTGGTAAAAGAGACAATGACCCT CTTTTTTGGGGAGACGAGCTTGAGTACATGGTTGTAGATTTTGATGATAAGGAGAGAAATTCTATG CTCGACGTTTGCCATGACAAGATACTCACTGAGCTTAATATGGAGGATTCGTCCCTTTGTGAGGCT AACGATGTGAGTTTTCACCCTGAGTATGGCCGGTATATGTTAGAGGCAACACCAGCTTCTCCATAT TTGAATTACGTGGGTAGTTACGTTGAGGTTAACATGCAAAAAAGACGTGCCATTGCAGAATATAAG CTATCTGAATATGCGAGACAAGATAGTAAAAATAACTTGCATGTGGGCTCCAGGTCTGTCCCTTTG ACGCTGACTGTCTTCCCGAGGATGGGATGCCCCGACTTTATTAACATTAAGGATCCGTGGAATCAT AAAAATGCCGCTTCCAGGTCTCTGTTTTTACCCGATGAAGTCATTAACAGACATGTCAGGTTTCCT AACTTGACAGCATCCATCAGGACCAGGCGTGGTGAAAAAGTTTGCATGAATGTTCCCATGTATAAA GATATAGCTACTCCAGAAACGGATGACTCCATCTACGATCGAGATTGGTTTTTACCAGAAGACAAA GAGGCGAAACTGGCTTCCAAACCGGGTTTCATTTATATGGATTCCATGGGTTTTGGCATGGGCTGT TCGTGCTTACAAGTGACCTTTCAGGCACCCAATATCAACAAGGCACGTTACCTGTACGATGCATTA GTGAATTTTGCACCTATAATGCTAGCCTTCTCTGCCGCTGCGCCTGCTTTTAAAGGTTGGCTAGCC GACCAAGATGTTCGTTGGAATGTGATATCTGGTGCGGTGGACGACCGTACTCCGAAGGAAAGAGGT GTTGCGCCATTACTACCCAAATACAACAAGAACGGATTTGGAGGCATTGCCAAAGACGTACAAGAT AAAGTCCTTGAAATACCAAAGTCAAGATATAGTTCGGTTGATCTTTTCTTGGGTGGGTCGAAATTT TTCAATAGGACTTATAACGACACAAATGTACCTATTAATGAAAAAGTATTAGGACGACTACTAGAG AATGATAAGGCGCCACTGGACTATGATCTTGCTAAACATTTTGCGCATCTCTACATAAGAGATCCA GTATCTACATTCGAAGAACTGTTGAATCAGGACAACAAAACGTCTTCAAATCACTTTGAAAACATC CAAAGTACAAATTGGCAGACATTACGTTTTAAACCCCCCACACAACAAGCAACCCCGGACAAAAAG Số hóa trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/ 56 GATTCTCCTGGTTGGAGAGTGGAATTCAGACCATTTGAAGTGCAACTATTAGATTTTGAGAACGCT GCGTATTCCGTGCTCATATACTTGATTGTCGATAGCATTTTGACCTTTTCCGATAATATTAACGCA TATATTCATATGTCCAAAGTATGGGAAAATATGAAGATAGCCCATCACAGAGATGCTATCCTATTT GAAAAATTTCATTGGAAAAAATCATTTCGCAACGACACCGATGTGGAAACTGAAGATTATTCTATA AGCGAGATTTTCCATAATCCAGAGAATGGTATATTTCCTCAATTTGTTACGCCAATCCTATGCCAA AAAGGGTTTGTAACCAAAGATTGGAAAGAATTAAAGCATTCTTCCAAACACGAGAGACTATACTAT TATTTAAAGCTAATTTCTGATAGAGCAAGCGGTGAATTGCCAACAACAGCAAAATTCTTTAGAAAT TTTGTACTACAACATCCAGATTACAAACATGATTCAAAAATTTCAAAGTCGATCAATTATGATTTG CTTTCTACGTGTGATAGACTTACCCATTTAGACGATTCAAAAGGTGAATTGACATCCTTTTTAGGA GCTGAAATTGCAGAATATGTAAAAAAAAATAAGCCTTCAATAGAAAGCAAATGTTAA Gen mã hóa cho protein bao gồm 678 aa với trình tự nhƣ sau: MGLLALGTPLQWFESRTYNEHIRDEGIEQLLYIFQAAGKRDNDPLFWGDELEYMVVDFDDKER NSMLDVCHDKILTELNMEDSSLCEANDVSFHPEYGRYMLEATPASPYLNYVGSYVEVNMQKRR AIAEYKLSEYARQDSKNNLHVGSRSVPLTLTVFPRMGCPDFINIKDPWNHKNAASRSLFLPDE VINRHVRFPNLTASIRTRRGEKVCMNVPMYKDIATPETDDSIYDRDWFLPEDKEAKLASKPGF IYMDSMGFGMGCSCLQVTFQAPNINKARYLYDALVNFAPIMLAFSAAAPAFKGWLADQDVRWN VISGAVDDRTPKERGVAPLLPKYNKNGFGGIAKDVQDKVLEIPKSRYSSVDLFLGGSKFFNRT YNDTNVPINEKVLGRLLENDKAPLDYDLAKHFAHLYIRDPVSTFEELLNQDNKTSSNHFENIQ STNWQTLRFKPPTQQATPDKKDSPGWRVEFRPFEVQLLDFENAAYSVLIYLIVDSILTFSDNI NAYIHMSKVWENMKIAHHRDAILFEKFHWKKSFRNDTDVETEDYSISEIFHNPENGIFPQFVT PILCQKGFVTKDWKELKHSSKHERLYYYLKLISDRASGELPTTAKFFRNFVLQHPDYKHDSKI SKSINYDLLSTCDRLTHLDDSKGELTSFLGAEIAEYVKKNKPSIESKC Phụ lục Thành phần môi trường nuôi cấy dùng cho tái sinh Loại môi trƣờng Môi trƣờng cảm ứng Kí hiệu GM Thành phần MS + mg/l BAP + 30 g/l sucrose + 8g/l agar, pH=5,8 MS + mg/l BAP + 30 g/l sucrose + Môi trƣờng chọn lọc tạo chồi Môi trƣờng kéo dài chồi GM Km50 8g/l agar, pH = 5,8 + cefotaxime 500mg/l + kanamycine 50mg/l MS + 30 g/l sucrose + 8g/l agar, pH MS Km50 = 5,8 + cefotaxime 500mg/l + kanamycine 50mg/l MS + 0,1 mg/l IBA + 15 g/l sucrose Môi trƣờng rễ RMTL + 8g/l agar, pH = 5,8 + cefotaxime 500mg/l + kanamycine 50mg/l Số hóa trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/ 57 Phụ lục Thành phần môi trường nuôi tạo dịch huyền phù vi khuẩn Môi trƣờng LB đặc LB lỏng Thành phần g/l yeast extract + 10 g/l NaCl + 10 g/l tryptone + 15 g/l agar, pH = 7,0 g/l yeast extract + 10 g/l NaCl + 10 g/l tryptone, pH = 7,0 Số hóa trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/