Xác định tỷ lệ nhiễm vi khuẩn salmonella và một số đặc điểm của salmonella trong thịt lợn tươi tại khu vực thành phố thái nguyên

đại học thái nguyên Tr-ờng đại học khoa học đào thị thủy Xác định tỷ lệ nhiễm vi khuẩn salmonella số đặc điểm salmonella thịt lợn t-ơi khu vực thành phố thái nguyên luận văn thạc sĩ công nghệ sinh học thái nguyên 2012 1Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Tai ngay!!! Ban co the xoa dong chu nay!!! http://www.lrc-tnu.edu.vn đại học thái nguyên Tr-ờng đại học khoa học đào thị thủy Xác định tỷ lệ nhiễm vi khuẩn salmonella số đặc điểm salmonella thịt lợn t-ơi khu vực thành phố thái nguyên Chuyên ngành: Công nghệ sinh học MÃ số: 60 42 02 01 luận văn thạc sĩ công nghệ sinh häc Ng-êi h-íng dÉn khoa häc: pgs.ts nghiªm ngäc minh thái nguyên 2012 2S húa bi Trung tõm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Trong năm gần vấn đề “Bảo đảm chất lƣợng an toàn thực phẩm” mối quan tâm đặc biệt nƣớc ta nhiều nơi giới Sự phát triển kinh tế mạnh mẽ, với trình thị hố ngày nhanh nhƣ mở rộng giao lƣu quốc tế địi hỏi nƣớc khơng phải tăng số lƣợng sản phẩm mà phải đảm bảo chất lƣợng vệ sinh an toàn giá trị dinh dƣỡng thực phẩm Hiện ngộ độc thực phẩm vấn đề nghiêm trọng sức khỏe ngƣời Theo báo cáo Bộ Y tế cho biết năm gần vấn đề ngộ độc thực phẩm xảy phổ biến địa bàn nƣớc, năm 2006 có 165 vụ ngộ độc thực phẩm với 7.000 ngƣời mắc có 57 ngƣời tử vong Thực tế nay, thực phẩm có nguồn gốc từ động vật đặc biệt thịt lợn bán số chợ, cửa hàng lại không đảm bảo chất lƣợng (thịt bị nhiễm bụi bẩn, vi khuẩn trình giết mổ, vận chuyển bày bán chợ) Điều lý giải mà hàng năm có nhiều vụ ngộ độc thực phẩm xảy Một nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm vi sinh vật độc tố chúng nhiễm thịt, có vi khuẩn Salmonella độc tố đƣờng ruột Enterotoxin nguyên nhân hàng đầu gây ngộ độc thực phẩm Khi đời sống nhân dân ngày đƣợc nâng cao, vấn đề an toàn thực phẩm có lợn thịt lợn bệnh, không bị nhiễm Salmonella yêu cầu cấp thiết Có nhiều tác giả cơng bố nhiễm Salmonella vào thân thịt lợn trình giết mổ chủ yếu liên quan đến nhiễm trùng Salmonella ruột [30], [32] 3Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Theo Bryan (1988); Nielsen Wegener (1997); Berends B.R., Van Knapen F., Mossel D.A.A., Burt S.A and Snij J.M.A (1998); Schwartz (1999): Các đàn lợn bị nhiễm Salmonella gây thiệt hại kinh tế cho ngƣời chăn ni mà cịn nguồn tàng trữ mầm bệnh gây hại ngƣời Bởi mà biện pháp ngăn chặn có hiệu gia súc cần thiết điều kiện tiên góp phần giảm thiểu dịch bệnh, tăng thu nhập cho ngƣời chăn nuôi, chống ô nhiễm môi trƣờng bảo vệ sức khoẻ cộng đồng [31], [33], [35], [37] Xuất phát từ lí từ thực tế đời sống, tiến hành thực đề tài: “ Xác định tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Salmonella số đặc điểm Salmonella thịt lợn tƣơi khu vực thành phố Thái Nguyên ” Mục tiêu nghiên cứu - Xác định tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Salmonella thịt lợn tƣơi - Tìm hiểu số đặc tính sinh hố, đặc tính gây bệnh serotype chủng Salmonella phân lập đƣợc Nội dung nghiên cứu 3.1 Khảo sát tình hình giết mổ tiêu thụ thịt lợn địa bàn thành phố Thái Nguyên 3.2 Đánh giá tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Salmonella thịt lợn tƣơi: - Lấy mẫu, phân lập vi khuẩn Salmonella - Xác định tiêu tổng số vi khuẩn Salmonella thịt lợn tƣơi - Biện pháp khống chế tình trạng thải trừ Salmonella thịt lợn, góp phần bảo vệ sức khoẻ ngƣời tiêu dùng 4Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 3.3 Nghiên cứu đặc tính sinh học, hóa học: - Nghiên cứu đặc tính sinh học, hóa học vi khuẩn Salmonella phân lập đƣợc - Định type kháng huyết 3.4 Xác định độc tố đƣờng ruột Enterotoxin: - Xác định độc lực chủng vi khuẩn Salmonella phân lập đƣợc - Phân lập gen độc tố đƣờng ruột Enterotoxin 3.5 Xác định tính mẫn cảm với số loại kháng sinh hóa dƣợc chủng vi khuẩn khuẩn Salmonella phân lập đƣợc 5Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM DO VI KHUẨN SALMONELLA 1.1.1 Ngộ độc thực phẩm Ngộ độc thực phẩm (Intoxincation) hay gọi trúng độc thức ăn ăn phải thức ăn có chứa chất độc, thƣờng xảy cách đột ngột hàng loạt (nhƣng bệnh dịch nhiễm khuẩn), có triệu chứng bệnh cấp tính, biểu nôn mửa, ỉa chảy (trừ nhiễm độc tố vi khuẩn độc thịt lại bị táo bón) triệu chứng khác đặc hiệu cho loại ngộ độc Trong đó có ngộ độc thực phẩm nhiễm vi khuẩn Salmonella 1.1.2 Ngộ độc thực phẩm vi khuẩn Salmonella Vi khuẩn Salmonella sống phủ tạng gia cầm, gia súc vấy nhiễm vào thịt giết mổ Chúng có mặt phân dễ dàng xâm nhập vào trứng gia cầm qua lỗ nhỏ li ti vỏ Salmonella thủ phạm gây ngộ độc thực phẩm vào mùa hè Những thức ăn giàu chất dinh dƣỡng nhƣ thịt, cá, trứng, sữa dễ bị nhiễm Salmonella trình chế biến, bảo quản, vận chuyển không bảo đảm vệ sinh Các thống kê dịch tễ học cho thấy, ca ngộ độc thức ăn nhiễm khuẩn Salmonella xảy lẻ tẻ quanh năm tăng mạnh từ tháng đến tháng năm Đây lúc tiết trời nóng bức, vi khuẩn sinh sôi nảy nở nhanh, ruồi nhặng, gián hoạt động mạnh; sức đề kháng thể lại giảm sút, dễ nhiễm bệnh Thông thƣờng, 12-24 sau ăn phải thực phẩm nhiễm khuẩn (có nhanh chậm hơn), bệnh nhân thấy đau bụng, buồn nơn, nơn mửa, 6Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn phân lỏng, nhức đầu, nơn nao, khó chịu, mồ hơi, mặt tái nhợt, sốt 38 -400 C 2- ngày (có trƣờng hợp sốt lâu hơn) Những trƣờng hợp nhẹ tự khỏi sau nơn hết thức ăn sau vài ba lần tiêu chảy, cần bù nƣớc chất điện giải Đối với trƣờng hợp nặng (nhất với em nhỏ, cụ già), cần dùng thêm kháng sinh theo dẫn thầy thuốc Do nôn nhiều, tiêu chảy nhiều, bệnh nhân bị nƣớc, muối nghiêm trọng nên thấy mệt, mắt trũng, chân tay lạnh, vật vã, li bì, mê sảng Khi đó, cần nhanh chóng chuyển đến bệnh viện để điều trị 1.1.3 Tình hình ngộ độc thực phẩm Salmonella giới Năm 2003 Bỉ có tới 12.849 trƣờng hợp ngộ độc vi khuẩn Salmonella 6.556 trƣờng hợp nhiễm vi khuẩn Campylobacter số vi khuẩn khác mà nguyên nhân chủ yếu chế biến thực phẩm chƣa kỹ thịt nhiễm bẩn chiếm tới 20% (Bộ Y tế, 2005) Ngày 1/1/2006 Allanta xảy đợt truyền nhiễm, vi khuẩn Salmonella có liên quan tới thực phẩm làm ngã bệnh 172 ngƣời 18 tiểu bang, 11 ngƣời phải vào bệnh viện khơng có chết Đối tƣợng bị tình nghi nhiễm Salmonella gồm: rau diếp cà chua tiệm ăn siêu thị [13] Ngày 26/12/2007 Ban kiểm dịch an tồn thực phẩm Bộ Nơng nghiệp Mỹ (FSIS) phát vi khuẩn Salmonella thịt bò tƣơi cửa hàng kho chứa siêu thị Arinoza, California, Hawaii, Nevada New Mexico Đã làm 38 trƣờng hợp bị mắc bệnh [15] Ngày 9/7/2008 Mỹ có 1.000 ngƣời bị ngã bệnh vi khuẩn Salmonella, đƣợc xem số lớn từ 10 năm qua Hoa Kỳ ngộ độc thực phẩm Thủ phạm bị nghi ngờ cà chua, ớt đỏ ngị tƣơi 7Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Tốc độ nhiễm trung bình 25-40 ca ngày, lan tràn 41 tiểu bang Tại Canada có trƣờng hợp [13] 1.1.4 Tình hình ngộ độc thực phẩm Salmonella Việt Nam Ở Việt Nam vấn đề vệ sinh an toàn thực phẩm vấn đề đƣợc Đảng Nhà nƣớc quan tâm Tuy nhiên, vấn đề thực tế lại khơng hồn tồn dễ dàng q trình thực Tình trạng ngộ độc xảy hầu hết địa phƣơng, nguyên nhân ngộ độc đa dạng: ngộ độc thức ăn bị nhiễm vi khuẩn, hoa phun thuốc trừ sâu, bánh phở có hàn the Nhƣng nguyên nhân vi sinh vật chiếm tỷ lệ cao từ 32,8-55,8 %, đặc biệt vi khuẩn Salmonella gây nhiều vụ ngộ độc thực phẩm Ngộ độc thức ăn Việt Nam từ năm 1983 -1989, tổng số 269 vụ ngộ độc theo dõi, có 5756 ngƣời mắc, tử vong 156 (2,7%) mà nguyên nhân chủ yếu Salmonella (Cục quản lý chất lƣợng vệ sinh an toàn thực phẩm, 2002) Vụ ngộ độc thực phẩm ăn nem thính có nhiễm Salmonella Thái Bình Vụ ngộ độc thực phẩm ăn hủ tiếu nhiễm Salmonella enteritidis Ngày 16/5/2005 vụ ngộ độc kem Tràng Tiền làm 13 ngƣời gia đình chị Ngô Mai Lan phải vào viện Bạch Mai Nguyên nhân kem nhiễm vi khuẩn Salmonella [15] Ngày 9/5/2008 theo ông Trần Đáng - Cục trƣởng Cục an toàn vệ sinh thực phẩm (Bộ Y tế) vừa thông báo qua kiểm tra 100 nhà hàng, quán ăn, quan chức đóng cửa, tạm đình hoạt động 60 sở vi phạm vệ sinh an tồn thực phẩm, có 23 qn thịt chó Qua xét nghiệm mẫu thớt mẫu dồi chó chín phát vi khuẩn thƣơng hàn (Salmonella) Có vi khuẩn tả mẫu rau diếp cá thớt số nhà hàng phố Cầu Giấy, Trƣờng Chinh Đã gây dịch tiêu chảy cấp địa bàn thành phố Hà Nội 8Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 1.2 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VI KHUẨN SALMONELLA TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM 1.2.1 Tình hình nghiên cứu giới: Năm 1885, Daniel E Salmon nhà bác học thú y Mỹ lần phát Salmonella từ ruột lợn đặt tên Salmonella cholerae suis Vi khuẩn Salmonella sau đƣợc biết nguyên nhân gây bệnh ngƣời [38] Năm 1933, Hội nghị các nhà vi sinh vật học quốc tế chí nh thƣ́c đặt tên cho vi khuẩn là Salmonella Vào năm 1934, hai nhà khoa học đã thiết lập bảng cấu trúc kháng nguyên đặt tên bảng phân loại Kauffmann - White Tƣ̀ đó đến bảng cấu trúc kháng nguyên của Salmonella đƣợc bổ su ng Ngày nay, nhà khoa học xác định đƣợc khoảng 2.500 serotype Salmonella chia làm 67 nhóm huyết dựa vào cấu trúc kháng nguyên O [25] Những năm gần đây, hai serotype Salmonella typhimurium Salmonella enteritidis đƣợc quan tâm Mỹ, Salmonella kháng lại thuốc kháng sinh thông thƣờng điều trị bệnh cho ngƣời gia súc Ngày nay, để định danh vi khuẩn Salmonella, ngƣời ta sử dụng sơ đồ Kauffmann - White White thiết lập, sau đƣợc Kauffmann bổ sung phát triển Trên hệ thống phân loại Ewing, dựa vào khả gây bệnh thích nghi với vật chủ ngƣời hay động vật mà Salmonella chia làm nhóm chính: Nhóm 1: Salmonella gây bệnh cho ngƣời gồm Salmonella typhi Salmonella paratyphi A, B C Chúng lây nhiễm trực tiếp gián tiếp qua thức ăn, nƣớc uống, từ ngƣời sang ngƣời khác [25] 9Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Nhóm 2: Gây bệnh động vật, nhƣ Salmonella dublin trâu bò, Salmonella cholerae suis lợn Nhóm 3: Gây bệnh cho nhiều loài động vật, nguyên nhân gây nên vụ ngộ độc nghiêm trọng ngƣời động vật, điển hình Salmonella enteritidis, Salmonella typhimurium, Salmonella spp là tác nhân gây ngộ độc thƣ̣c phẩm phạm vi toàn thế giới , bệnh chúng gây đe dọa sƣ́c kh ỏe cộng đồng hầu hết quốc gia phát triể n và phát triển Theo Laval (2000) nguy bệnh Salmonella lợn đe dọa thời kỳ vỗ béo đến giết mở Lị mổ nơi tàng trữ lây lan mầm bệnh quan trọng cho các trang trại chăn nuôi cũng nhƣ ngƣời tiêu dùng Salmonella typhimurium gây bệnh viêm ruộ t ỉ a chảy mạn tí nh ở lợn , cần lợn đàn lợn 100 bị ỉ a chảy Salmonella, 24 giờ sau cả đàn bị lây nhiễm Điều đáng chú ý là phƣơng thƣ́c lây truyền ngang của loài vi khuẩn này tƣ̀ lợn này sang lợn khác đàn sau chúng đƣợc bà i thải ngồi mơi trƣờng [1] 1.2.2 Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam Đây nghiên cứu có liên quan đến đề tài gần nhất: Lê văn Tạo cộng (1994) tiến hành phân lập, xác định serotype vi khuẩn Salmonella gây bệnh lợn cho biết: 50% Salmonella cholerae suis; 12,5% Salmonella enteritidis; 6,5% Salmonella typhimurium lại serotype khác[18] Trần Xuân Hạnh (1995) nghiên cứu lợn 2-4 tháng tuổi xác định đƣợc serotype Salmonella với tỷ lệ nhiễm nhƣ sau: Salmonella cholerae suis 35,9%, S derby 17,9, Salmonella typhimurium Salmonella london 10,2 thấp Salmonella newport 7,6% [5] 10Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 56  M: Marker 100bp, Fermentas, Mỹ  Giếng số 1: Sản phẩm PCR chủng S1  Giếng số 2: Sản phẩm PCR chủng S3  Giếng số 3: Sản phẩm PCR chủng S4  Giếng số 4: Sản phẩm PCR chủng S5  Giếng số 5: Sản phẩm PCR chủng S6  Giếng số 6: Sản phẩm PCR chủng S8  Giếng số 7: Đối chứng âm Kết hình 3.8 cho thấy tất sản phẩm PCR chủng vi khuẩn Salmonella đặc hiệu, vạch phụ kèm theo, có kích thƣớc khoảng 259 bp theo tính tốn lý thuyết Hiện chúng tơi tiến hành đọc trình tự sản phẩm để so sánh với trình tự gen ngân hàng NCBI để khẳng định chắn có mặt gen độc tố từ chủng Salmonella phân lập đƣợc xác 3.5 Xác định tính mẫn cảm với số loại kháng sinh chủng Salmonella phân lập đƣợc Với mục đích cung cấp dẫn liệu khoa học tính kháng kháng sinh chủng Salmonella phân lập đƣợc, góp phần phục vụ nghiên cứu ứng dụng điều trị, chúng tơi tiến hành thử tính mẫn cảm vi khuẩn Salmonella phân lập 10 loại kháng sinh Kết đƣợc trình bày bảng 3.11 58Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 57 Bảng 3.11 Kết tính mẫn cảm với số loại kháng sinh chủng Salmonella phân lập đƣợc Số Tên kháng sinh STT chủng hoá dƣợc thử Đánh giá mức độ mẫn cảm Rất mẫn cảm Mẫn cảm Mẫn cảm trung bình yếu Kháng thuốc + % + % + % + % Cefalexin 16,7 50,0 33,3 0 Clindamycin 0 33,3 50,0 16,7 Gentamycin 50,0 33,3 16,7 0 Erythromycin 0 50,0 33,3 16,7 Norfloxacin 83,3 16,7 0 0 Kanamycin 0 16,7 50,0 33,3 Difloxacin 50,0 33,3 16,7 0 Spectinomycin 16,7 33,3 33,3 16,7 Enrofloxacin 66,7 16,7 16,7 0 10 Lincomycin 0 33,3 50,0 16,7 (Chú thích: +: Dƣơng tính; %: Tỷ lệ) Các kết thu đƣợc từ bảng 3.11 cho thấy: Salmonella mẫn cảm với Norfloxacin, Enrofloxacin, Gentamycin, Difloxacin tỷ lệ từ 50 - 83,33% chủng mà phân lập thử nghiệm với loại thuốc Các loại kháng sinh Cefalexin, Erythromycin, Clindamycin, Spectinomycin, Lincomycin, Kanamycin mẫn cảm trung bình với Salmonella tỷ lệ từ 16,7 - 50,0% Điều chứng tỏ, vi khuẩn gây bệnh nguy hiểm song bệnh vi khuẩn gây điều trị hiệu tận gốc bệnh sử dụng thuốc, liều đủ liệu trình Salmonella kháng thuốc Qua bảng kết thử nghiệm nhận thấy, tỷ lệ Salmonella kháng thuốc thấp từ 16,7 - 33,3% tùy loại kháng sinh Kết 59Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 58 chúng tơi hồn tồn phù hợp với tác giả nƣớc khả mẫn cảm với kháng sinh vi khuẩn Theo Phùng Quốc Chƣớng (2005) vi khuẩn Salmonella mẫn cảm với Norfloxacin (100%) [3]; theo Tô Liên Thu (2004) vi khuẩn Salmonella phân lập đƣợc từ thịt lợn mẫn cảm cao với Norfloxacin (90%) Gentamycin (90%) [14]; cịn theo Dƣơng Thùy Dung (2010) Salmonella phân lập đƣợc từ thịt lợn mẫn cảm với Nofloxacin Enrofloxacin [4] Mức độ kháng thuốc vi khuẩn có xu hƣớng tăng theo phần trăm sử dụng Do tiến hành điều trị cần phải kết hợp nhiều loại kháng sinh có phác đồ điều trị phù hợp 60Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 59 Chƣơng KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Đã xác định đƣợc mức độ nhiễm Salmonella thịt lợn tƣơi khu chợ địa bàn thành phố Thái Nguyên: Mức độ nhiễm thịt theo buổi chiều (18,0 %) cao buổi sáng (12,1%) Đã xác định số đặc tính sinh hố 16 chủng định type đƣợc 10 chủng Salmonella phân lập đƣợc, định loại đƣợc serovar khác chủng Salmonella typhimurium chiếm tỷ lệ 90% Kết thử độc lực chủng vi khuẩn Salmonella cho thấy độc lực gây chết chuột Phân lập lại tìm thấy có Salmonella Đã nhân dịng thành cơng đoạn gen độc tố Enterotoxin chủng vi khuẩn Salmonella, có kích thƣớc khoảng 259 bp Xác định đƣợc tính mẫn cảm với số loại kháng sinh chủng Salmonella phân lập đƣợc với tỷ lệ từ 50-83,3% tỷ lệ Salmonella kháng thuốc thấp từ 16,7-33,3% 5.2 Kiến nghị Tiến hành thử nghiệm với số lƣợng mẫu lớn Thử nghiệm kiểm tra tiêu Samonella loại thực phẩm khác nhƣ thịt đông lạnh, thịt xoay nhỏ, thịt nghiền, thịt chế biến, trứng tƣơi, cá thủy sản tƣơi sống… 61Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 60 TÀI LIỆU THAM KHẢO I TIẾNG VIỆT Laval A (2000), Bệnh phó thương hàn, Bài giảng giáo sƣ đại học Thú y Pháp cho lớp Dịch tễ học Thú y Hà Nội thành phố Hồ Chí Minh, Hội Thú y Việt Nam, tr 13-16 Ngô Văn Bắc (2007), Đánh giá ô nhiễm vi khuẩn thịt lợn sữa, lợn choai xuất khẩu, thịt gia súc tiêu thụ nội địa số sở giết mổ Hải Phòng - giải pháp khắc phục, Luận văn thạc sĩ Nông nghiệp, Đại học Nông nghiệp I - Hà Nội, tr 22 - 39 Phùng Quốc Chƣớng (2005), “Kết kiểm tra tính mẫn cảm số thuốc kháng sinh vi khuẩn Salmonella phân lập từ vật nuôi ĐăkLăk”, Tạp chí KHKT Thú y, (1), tr 53 Dƣơng Thùy Dung (2010), Nghiên cứu ô nhiễm thịt lợn tươi số tiêu vi khuẩn địa bàn thành phố Thái Nguyên, Luận văn thạc sĩ sinh học, tr 33 - 39 Trần Xuân Hạnh (1995), “Phân lập giám định vi khuẩn Salmonella lợn -4 tháng tuổi”, Tạp chí khoa học công nghệ quản lý kinh tế, Hà Nội, (6), tr 240 Đỗ Văn Hiệp (2007), Khảo sát thực trạng hoạt động giết mổ lợn trâu bò huyện Quốc Oai – Hà Tây, Luận văn thạc sĩ khoa học Nông nghiệp, Đại học Nông nghiệp – Hà Nội, tr 51 - 56 Lƣơng Đức Phẩm (2000), Vi sinh vật học an toàn vệ sinh thực phẩm, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội tr 89 - 106 Nguyễn Vĩnh Phƣớc (1970), Vi sinh vật thú y tập 2, Nxb ĐH THCN, Hà Nội tr 21 - 30 62Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 61 Lê Minh Sơn (2003), Nghiên cứu số vi khuẩn gây ô nhiễm thịt lợn vùng hữu ngạn Sông Hồng, Luận án tiến sĩ Nông nghiệp, trƣờng Đại học Nông nghiệp I, Hà Nội, tr 58- 65 10 Nguyễn Quang Tuyên (2008), Giáo trình vi sinh vật thú y, Nxb Nơng Nghiệp, tr 72-81 11 Nguyễn Nhƣ Thanh (1997), Vi sinh vật thú y, Nxb Nông nghiệp, tr - 10 12 Nguyễn Nhƣ Thanh (2001), Vi sinh vật Thú y, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội, tr 37 - 56 13 Tô Liên Thu (1999), Nghiên cứu ô nhiễm vi sinh vật thực phẩm có nguồn gốc từ động vật thị trường Hà Nội, Luận án thạc sĩ Nông nghiệp, tr 50 - 58 14 Tơ Liên Thu (2004), “Tình trạng kháng kháng sinh vi khuẩn Salmonella E coli phân lập đƣợc từ thịt lợn thịt gà vùng đồng Bắc bộ”, Tạp chí KHKT Thú y, (4), tr 29 - 35 15 Tô Liên Thu (2005), Nghiên cứu tình trạng nhiễm số vi khuẩn vào thịt lợn, thịt gà sau giết mổ Hà Nội số phương pháp làm giảm nhiễm khuẩn thịt, Luận án Tiến sỹ Nông nghiệp, Viện Thú y Quốc gia Hà Nội, tr 45 - 57 16 Nguyễn Thị Thanh Thủy, Khảo sát thực trạng hoạt động giết mổ ô nhiễm vi sinh vật thịt lợn số sở giết mổ địa bàn huyện Gia Lâm, thành phố Hà Nội, Luận văn thạc sĩ Nông nghiệp, Đại học Nông nghiệp – Hà Nội, tr 26 - 33 17 Nguyễn Thị Nguyệt Quế (2006), Khảo sát thực trạng hoạt động giết mổ, số tiêu vi sinh vật ô nhiễm thịt lợn nơi giết mổ bày 63Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 62 bán chợ địa bàn quận Long Biên- thành phố Hà Nội, Luận văn thạc sĩ Nông nghiệp, Đại học Nông nghiệp – Hà Nội, tr 25 - 38 18 Lê Văn Tạo, Nguyễn Thị Vui (1994), “Phân lập định type vi khuẩn Salmonella gây bệnh cho lợn”, Tạp chí Nơng nghiệp, cơng nghiệp thực phẩm,(11), Hà Nội, tr 430 -431 19 Vũ Bình Minh, Cù Hữu Phú (1999), “Kết phân lập vi khuẩn E coli Salmonella lợn mắc bệnh tiêu chảy, xác định số đặc tính sinh vật hố học chủng vi khuẩn phân lập đƣợc”, Tạp chí KHKT thú y, Hội thú y Việt Nam, Hà Nội, tr 32 - 36 20 Võ Thị Trà An, Nguyễn Ngọc Tuân Lê Hữu Ngọc (2006), “Tình hình nhiễm Salmonella phân thân thịt (bò, heo, gà) số tỉnh phía Nam”, Tạp chí KHKT Thú Y , 13(2), tr 11 - 16 21 Trần Thị Hạnh, Nguyễn Tiến Thành, Ngô Văn Bắc, Trƣơng Thị Hƣơng Giang, Trƣơng Thị Quý Dƣơng (2009), “Tỷ lệ nhiễm Salmonella spp sở giết mổ lợn công nghiệp thủ công”, Tạp chí KHKT Thú y, 16 (2), tr 51 - 56 22 Chu Văn Mẫn, Đào Hữu Hồ (2002), Thống kê sinh học, Nxb Đại học Quốc gia Hà Nội, tr 171 - 176 23 Nguyễn Vĩnh Phƣớc (1976), Vi sinh vật thú y tập 3, Nxb ĐH THCN, Hà Nội, tr 21 - 37 24 Trung tâm kiểm tra vi sinh thú y Trung ƣơng I – Cục thú y (1998), Tài liệu tập huấn kiểm tra vệ sinh thú y thịt sản phẩm thực phẩm có nguồn gốc từ thịt, Hà Nội 25 Ủy ban tƣ pháp Ủy ban Quốc tế Hệ thống học prokaryotes Các loại loài chi Salmonella Lignieres 1900 Salmonella enterica (Kauffmann -White) Le Minor Popoff 1987, với LT2T chủng loại, 64Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 63 bảo tồn enterica danh hiệu Salmonella enterica tất epithets trƣớc đƣợc áp dụng cho loài Ý kiến 80 Int J Syst evol Microbiol năm 2005; 55:519-520 26 Ủy ban khoa học nhà nƣớc , Phương pháp xác định tiêu vi khuẩn Salmonella thịt tươi TCVN 5153:1990, Hà Nội 27 Ủy ban khoa học nhà nƣớc, Phương pháp xác định tiêu tổng số VKHK thịt tươi TCVN 5667:1992, Hà Nội 28 Ủy ban khoa học nhà nƣớc, Phương pháp lấy mẫu thịt lợn tươi theo TCVN 4833-1:2002; TCVN 4833-2:2002, Hà Nội 29 Ủy ban khoa học nhà nƣớc, Quy định kỹ thuật áp dụng tiêu vi sinh vật thịt lợn tươi TCVN 7046:2002, Hà Nội II TIẾNG ANH 30 Berends B.R., Van Kanpen F., Snijders J.M.A and Mossel D.A.A (1997), “Identification and quantification of risk factors regarding Salmonella spp on fork carcasses”, Int J Food Microbiol, 36, pp 199206 31 Berends B.R., Van Knapen F., Mossel D.A.A., Burt S.A and Snij J.M.A (1998), “Impact on human health of Salmonella spp on pork in the Netherlands and the anticipated effects of some currently proposed control strategies”, Int J Food Mcrobiol, 44, pp 219-229 32 Borch E., Nesbakken T and Christensen H., (1996), “Hazard identification in swine slaughter with respect to foodborne”, Bacteria Int J Food Microbiol, 30, pp 9-25 33 Bryan F (1988), “Risks associated with vehicles of foodborne pathogens and toxins”, J Food Prot, 51, pp 498-508 65Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 64 34 Mervat A.M., Abostate, Dalia A., Zahran and Halan, El, Hifnawi (2006), Incidence of Bacillus cereus in some meat products and the effect of Gamma radiation on its toxin, International Journal of Agriculture and Biology, pp 539-557 35 Nielsen B and Wegener H.C (1997), Public health and pork and fork products: regional perspectives of Denmark, Rev Sci Tech, 16, pp 513-524 36 Quinn P.J., Carter M.E., Markey B.K., Carter G.R (1994) Clinical Veterinary Microbiology, Wolfe publishing Mosby-Year Book Europe Limited, pp 199-202 37 Schwartz K.J (1999), Salmonellosis In: Straw B E., S D Allaire., W L Mengeling and D J Taylo (eds), Disease of Swine, Iowa State University Press, Ames, pp 535-551 38 Zhao Cuiwei, Beilei Ge, Juan De Villena, Robert Sudler, Emily Yeh, Shaohua Zhao, David G White, David Wagner (2001), Prevalence of Campylobacter spp, E.coli and Salmonella serovars in retail chicken, turkey, pork and beef from the Greater Washington, D.C, Area, Environmental Microbiology, pp 5431 – 5436 66Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn i DANH MỤC CHƢ̃ VIẾT TẮT B cereus Bacillus cereus Bp Base pairs (cặp base) BPW Buffered pepton water Cl perfringens Clostridium perfringens CNSH Công nghệ sinh học cs Cộng CSGM Cơ sở giết mổ DNA Deoxyribonucleic acid E.coli Escherichia coli KHKT Khoa học kỹ thuật MRSV Modified Semisolid Rappaport Vassiliadis NĐTP Ngộ độc thực phẩm Nxb Nhà xuất PCR Polymerase Chain Reaction (phản ứng chuỗi Polymerase ) S Salmonella Staph aureus Staphylococus aureu Taq-DNA polymerase Thermus aquaticus DNA polymerase TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam TSI Triple Sugar Iron VKHK Vi khuẩn hiếu khí VSATTP Vệ sinh an toàn thực phẩm XLD Lysine Deoxycholate agar XLT4 Xylose Lysine Tetrathionat 67Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Đánh giá kết cảm quan thịt (Nguyễn Vĩnh Phƣớc (1976), Trung tâm kiểm tra vệ sinh thú y Trung ƣơng I-Cục thú y (1998) 11 Bảng 1.2 Tiêu chuẩn đánh giá thịt tƣơi phản ứng sinh hóa học 12 Bảng 1.3 Đặc tính sinh hóa số lồi Salmonella 17 Bảng 2.1 Cặp mồi sử dụng nghiên cứu 21 Bảng 3.1 Tỷ lệ chợ quầy bán thịt đƣợc kiểm soát giết mổ địa bàn thành phố Thái Nguyên 32 Bảng 3.2 Kết khảo sát tình hình giết mổ tiêu thụ thịt lợn khu chợ: Quan Triều, Đồng Quang, Chợ Thái Gang Thép 33 Bảng 3.3 Kết xác định tiêu tổng số VKHK nhiễm thịt tƣơi 35 Bảng 3.4 Kết xác định mức độ nhiễm vi khuẩn Salmonella thịt lợn tƣơi 37 Bảng 3.5 Kết xác định mức độ nhiễm Salmonella thịt lợn theo thời gian lấy mẫu bán khu chợ địa bàn thành phố Thái Nguyên 40 Bảng 3.6 Kết xác định mức độ nhiễm Salmonella thịt lợn theo mùa vụ lấy mẫu bán khu chợ địa bàn thành phố Thái Nguyên 43 Bảng 3.7 So sánh kết thực tế tiêu cho phép số lƣợng vi khuẩn Salmonella 25g thịt 47 Bảng 3.8 Kết xác định số đặc tính sinh vật, hoá học 49 vi khuẩn Salmonella phân lập đƣợc 49 Bảng 3.9 Kết xác định serovar chủng Salmonella phân lập đƣợc kháng huyết 51 Bảng 3.10 Kết thử độc lực chủng vi khuẩn Salmonella phân lập đƣợc 52 Bảng 3.11 Kết tính mẫn cảm với số loại kháng sinh chủng Salmonella phân lập đƣợc 57 68Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn iii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Vi khuẩn Salmlonella spp 14 Hình 2.1 Chu trình phản ứng PCR 26 Hình 3.1 Biểu đồ mức độ biến đổi tỷ lệ nhiễm Salmonella 40 thịt lợn theo thời gian lấy mẫu 40 Hình 3.2 Biểu đồ mức độ biến đổi tỷ lệ nhiễm Salmonella 44 thịt lợn theo mùa vụ lấy mẫu 44 Hình 3.4 Hình ảnh Salmonella môi trƣờng Mannitol 50 Hình 3.3 Hình ảnh Salmonella mơi trƣờng TSI 50 Hình 3.5 Hình ảnh định type chủng Salmonella phân lập đƣợc 51 Hình 3.6 Hình ảnh mổ khám chuột sau thử độc lực 54 Hình 3.7 Hình ảnh điện di sản phẩm DNA tổng số 54 mẫu nghiên cứu 54 Hình 3.8: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen độc tố Enterotoxin 55 mẫu nghiên cứu 55 69Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn iv MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Lý chọn đề tài Mục tiêu nghiên cứu Nội dung nghiên cứu 1.1 NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM DO VI KHUẨN SALMONELLA 1.1.1 Ngộ độc thực phẩm 1.1.2 Ngộ độc thực phẩm vi khuẩn Salmonella 1.1.3 Tình hình ngộ độc thực phẩm Salmonella giới 1.1.4 Tình hình ngộ độc thực phẩm Salmonella Việt Nam 1.2 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VI KHUẨN SALMONELLA TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM 1.2.1 Tình hình nghiên cứu giới: 1.2.2 Tình hình nghiên cứu Việt Nam 1.2.3 Nguyên nhân nhiễm khuẩn thịt 10 1.3 VI KHUẨN SALMONELLA 13 1.3.1.Lịch sử phát 13 1.3.2 Đặc điểm hình thái 14 1.3.3 Cấu trúc kháng nguyên 15 1.3.4 Đặc tính sinh hóa 16 1.3.5 Triệu chứng gây bệnh 18 1.3.6 Độc tố chế gây bệnh 18 1.3.7 Đặc điểm nuôi cấy 18 Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 20 2.2 Vật liệu, hóa chất dụng cụ nghiên cứu 20 2.2.1 Mơi trƣờng cần thiết q trình nghiên cứu 20 70Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn v 2.2.2 Thiết bị, máy móc, dụng cụ hố chất dùng thí nghiệm 21 2.3 Cặp mồi sử dụng 21 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 21 2.4.1 Phƣơng pháp điều tra 21 2.4.2 Phƣơng pháp lấy mẫu 22 2.4.3 Phƣơng pháp xác định tiêu Salmonella 22 2.4.4 Phƣơng pháp xác định gen độc tố đƣờng ruột Enterotoxincủa chủng salmonella phân lập đƣợc: 24 2.4.5 Phƣơng pháp định type huyết học chủng Salmonella phân lập đƣợc phản ứng ngƣng kết nhanh phiến kính 27 2.4.6 Phƣơng pháp xác định đặc tính sinh hố vi khuẩn Salmonella 28 2.4.7 Phƣơng pháp thử độc lực chuột nhắt trắng 29 2.4.8 Phƣơng pháp kháng sinh đồ 29 2.4.9 Phƣơng pháp xử lý số liệu 29 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31 3.1 Khảo sát tình hình giết mổ tiêu thụ thịt lợn địa bàn thành phố Thái Nguyên 31 3.1.1 Khảo sát tỷ lệ chợ quầy bán thịt đƣợc kiểm soát giết mổ địa bàn thành phố Thái Nguyên 32 3.1.2 Khảo sát tình hình giết mổ tiêu thụ thịt lợn khu chợ: Quan Triều, Đồng Quang, Chợ Thái Gang Thép 33 3.2 Đánh giá tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Salmonella thịt lợn tƣơi 35 3.2.1 Xác định tiêu tổng số vi khuẩn hiếu khí nhiễm thịt lợn tƣơi 35 3.2.2 Xác định mức độ nhiễm vi khuẩn Salmonella thịt lợn tƣơi 36 71Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn vi 3.2.3 Xác định mức độ nhiễm vi khuẩn Salmonella thịt lợn theo thời gian lấy mẫu bán khu chợ: Quan Triều, Đồng Quang, chợ Thái Gang Thép 39 3.2.4 Xác định mức độ nhiễm vi khuẩn Salmonella thịt lợn theo mùa vụ lấy mẫu bán khu chợ: Quan Triều, Đồng Quang, chợ Thái Gang Thép 42 3.2.5 So sánh thực tế với tiêu cho phép số lƣợng vi khuẩn Salmonella 25g thịt lợn tƣơi 46 3.3 Kết nghiên cứu đặc tính sinh học, hóa học vi khuẩn Salmonella phân lập đƣợc 48 3.3.1 Giám định đặc tính sinh học, hoá học chủng vi khuẩn Salmonella phân lập đƣợc 48 3.3.2 Kết xác định serovar chủng Salmonella phân lập đƣợc bằng phƣơng pháp ngƣng kết nha nh phiến kí nh theo sơ đồ của Kauffmann White 51 3.4 Xác định độc tố đƣờng ruột Enterotoxin 52 3.4.1 Xác định độc lực chủng vi khuẩn Salmonella phân lập đƣợc 52 3.4.2 Kết PCR nhân đoạn gen độc tố đƣờng ruột Enterotoxin 54 3.5 Xác định tính mẫn cảm với số loại kháng sinh chủng Salmonella phân lập đƣợc 56 Chƣơng KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 59 5.1 Kết luận 59 5.2 Kiến nghị 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO 60 72Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn