Đánh giá một số đặc điểm nông sinh học và phân lập gen cystatin của một số dòng lạc (arachis hypogaea l ) có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mất nước và xử lý chiếu xạ

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM PHẠM TUẤN OANH ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM NÔNG SINH HỌC VÀ PHÂN LẬP GEN CYSTATIN CỦA MỘT SỐ DÕNG LẠC (Arachis hypogaea L.) CĨ NGUỒN GỐC TỪ MƠ SẸO CHỊU MẤT NƢỚC VÀ XỬ LÝ CHIẾU XẠ LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thái Nguyên - 2011 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Tai ngay!!! Ban co the xoa dong chu nay!!! http://www.lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM PHẠM TUẤN OANH ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM NÔNG SINH HỌC VÀ PHÂN LẬP GEN CYSTATIN CỦA MỘT SỐ DÕNG LẠC (Arachis hypogaea L.) CĨ NGUỒN GỐC TỪ MƠ SẸO CHỊU MẤT NƢỚC VÀ XỬ LÝ CHIẾU XẠ Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60.42.70 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS Chu Hoàng Mậu Thái Nguyên - 2011 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Chu Hồng Mậu tận tình hƣớng dẫn, bảo, động viên tạo điều kiện giúp đỡ tơi hồn thành luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn TS Vũ Thị Thu Thủy (Khoa Sinh - KTNN) nhiệt tình giúp đỡ, truyền đạt kinh nghiệm hỗ trợ tơi suốt q trình thực nghiệm hồn thành luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn kỹ thuật viên phịng Hóa sinh; Phịng Cơng nghệ tế bào; Phịng Di truyền Cơng nghệ gen (Khoa Sinh - KTNN - Trƣờng Đại học Sƣ Phạm Thái Nguyên); Bộ môn Sinh học phân tử Công nghệ gen (Viện Khoa học Sự sống - ĐH Thái Nguyên) cán thuộc Viện Công nghệ Sinh học giúp đỡ tơi q trình thực luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu Trƣờng Đại học Sƣ phạm Thái Nguyên, Khoa Sau đại học, Ban chủ nhiệm Khoa Sinh - KTNN thầy cô giáo, cán khoa tạo điều kiện giúp đỡ trình học tập hồn thành luận văn Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình bạn bè ln động viên ủng hộ tơi suốt q trình học tập, nghiên cứu Tác giả Phạm Tuấn Oanh Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn i MỤC LỤC Trang Trang bìa phụ Mục lục i Danh mục chữ viết tắt iv Danh mục bảng v Danh mục hình vi MỞ ĐẦU Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 CÂY LẠC 1.1.1 Nguồn gốc, phân loại, đặc điểm sinh học giá trị kinh tế lạc 1.1.2 Đặc điểm hóa sinh hạt lạc 1.1.3 Tình hình sản xuất lạc giới Việt Nam 1.2 TÍNH CHỊU HẠN Ở THỰC VẬT 1.2.1 Hạn tác động hạn đến thực vật 1.2.2 Cơ sở sinh lý, hóa sinh sinh học phân tử tính chịu hạn 1.3 ỨNG DỤNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ VÀ TẾ BÀO THỰC VẬT TRONG CHỌN DÒNG CHỊU HẠN Ở THỰC VẬT 10 1.4 MỘT SỐ GEN LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN CỦA CÂY TRỒNG VÀ CÂY LẠC 12 1.5 CYSTATIN VÀ GEN CYSTATIN Ở THỰC VẬT 14 1.5.1 Cysteine proteinase 14 1.5.2 Cystatin chất ức chế cysteine proteinase 15 1.5.3 Gen mã hóa cystatin thực vật lạc 19 Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 21 2.1.1 Vật liệu thực vật 21 2.1.2 Hóa chất thiết bị 21 2.1.3 Địa điểm nghiên cứu 22 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Ngun http://www.lrc-tnu.edu.vn ii 2.2.1 Mơ hình nghiên cứu tổng quát 22 2.2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu đồng ruộng 23 2.2.3 Phƣơng pháp đánh giá chất lƣợng hạt 23 2.2.4 Khả chịu hạn dòng lạc đƣợc đánh giá giai đoạn hạt nảy mầm phƣơng pháp gây hạn sinh lý 24 2.2.5 Phƣơng pháp sinh học phân tử 25 2.2.6 Phƣơng pháp xử lý số liệu 27 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .28 3.1 KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ ĐẶC ĐIỂM NÔNG HỌC VÀ CHẤT LƢỢNG HẠT CỦA MỘT SỐ DÒNG LẠC NGHIÊN CỨU 28 3.1.1 Đặc điểm nơng học số dịng lạc nghiên cứu hệ thứ Năm 28 3.1.2 Chất lƣợng hạt dòng lạc nghiên cứu hệ thứ Năm 31 3.1.3 Đặc điểm nơng học số dịng lạc nghiên cứu hệ thứ Sáu 35 3.1.4 Nhận xét đặc điểm nơng học, chất lƣợng hạt dịng lạc nghiên cứu 37 3.2 KHẢ NĂNG CHỊU HẠN Ở GIAI ĐOẠN NẢY MẦM CỦA MỘT SỐ DÒNG LẠC NGHIÊN CỨU Ở THẾ HỆ THỨ NĂM TRONG ĐIỀU KIỆN GÂY HẠN SINH LÝ 40 3.2.1 Hoạt độ α - amylase điều kiện gây hạn sinh lý 40 3.2.2 Hàm lƣợng đƣờng điều kiện gây hạn sinh lý 42 3.2.3 Mối tƣơng quan hoạt độ α - amylase hàm lƣợng đƣờng dòng lạc nghiên cứu giai đoạn hạt nảy mầm 43 3.2.4 Hoạt độ protease điều kiện gây hạn sinh lý 44 3.2.5 Hàm lƣợng protein điều kiện gây hạn sinh lý 46 3.2.6 Mối tƣơng quan hoạt độ protease hàm lƣợng protein giai đoạn hạt nảy mầm 48 3.2.7 Nhận xét khả chịu hạn dòng lạc nghiên cứu điều kiện hạn sinh lý giai đoạn hạt nảy mầm 48 3.3 KẾT QUẢ PHÂN LẬP VÀ GIẢI TRÌNH TỰ GEN CYSTATIN Ở LẠC 49 3.3.1 Tách chiết tinh DNA tổng số 49 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn iii 3.3.2 Kết PCR nhân gen cystatin 50 3.3.3 Kết tách dòng gen cystatin 51 3.3.4 Kết xác định trình tự nucleotide 52 3.3.5 Kết so sánh trình tự amino acid 57 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .59 CÔNG TRÌNH CƠNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN 60 TÀI LIỆU THAM KHẢO 61 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn iv NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT ABA Abscisic acid bp Base pair CTAB N- Cetyl- N,N,N- trimethyl amonium bromide Cv Hệ số biến động cDNA Complementary DNA ĐC Đối chứng DNA Deoxyribose Nucleic Acid ĐVHĐ Đơn vị hoạt độ đtg Đồng tác giả EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid HSP Heat shock protein IPTG Isopropyl β – D –1 thiogalactopyranoside Hecta Krad Kilorad Kb Kilo base kDa Kilo dalton LB Luria – Bertani LEA Late embryogenesis abundant LTP Lipid transfer protein MGPT Môi giới phân tử mRNA Messenger Ribonucleic acid Nxb Nhà xuất OD Optical density PCR Polymerase chain reaction TAE Tris acetate EDTA TN Thí nghiệm Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn v DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1 Diện tích, suất, sản lƣợng lạc giới từ năm 2005 – 2009 Bảng 1.2: Diện tích, suất sản lƣợng lạc Việt Nam từ 2005 – 2009 Bảng 3.1 Một số đặc điểm nơng học dịng lạc hệ thứ Năm 28 Bảng 3.2 Một số tiêu cấu thành suất chất lƣợng hạt dòng lạc nghiên cứu hệ thứ Năm 32 Bảng 3.3 Đặc điểm nơng học dịng lạc nghiên cứu hệ thứ Sáu 35 Bảng 3.4 Một số tiêu cấu thành suất dòng lạc hệ thứ Sáu 37 Bảng 3.5 Hoạt độ α - amylase điều kiện gây hạn sinh lý 41 Bảng 3.6 Hàm lƣợng đƣờng tan điều kiện gây hạn sinh lý 43 Bảng 3.7 Mối tƣơng quan hoạt độ α - amylase hàm lƣợng đƣờng tan giai đoạn hạt nảy mầm 44 Bảng 3.8 Hoạt độ protease điều kiện gây hạn sinh lý 45 Bảng 3.9 Hàm lƣợng protein điều kiện gây hạn sinh lý 47 Bảng 3.10 Mối tƣơng quan hoạt độ protease hàm lƣợng protein giai đoạn hạt nảy mầm 48 Bảng 3.11 Sự sai khác trình tự nucleotide dịng R5.44, RM5.46 ba trình tự gen cystatin lạc công bố GenBank 55 Bảng 3.12 Độ tƣơng đồng độ sai khác trình tự gen cystatin dịng lạc RM5.46 R5.44 với ba trình tự gen cystatin lạc công bố Genbank 56 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Ngun http://www.lrc-tnu.edu.vn vi DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 2.1 Mơ hình nghiên cứu tổng qt 22 Hình 2.2 Vector pTZ57R/T 26 Hình 3.1 Khu vực thí nghiệm số dịng nghiên cứu ngồi đồng ruộng 33 Hình 3.2 Một số dòng lạc nghiên cứu giống lạc L18 hệ thứ Năm .34 Hình 3.3 Hình ảnh hạt dịng lạc nghiên cứu giống L18 hệ thứ Sáu 39 Hình 3.4 Hoạt độ α - amylase giai đoạn hạt nảy mầm phƣơng pháp định tính 42 Hình 3.5 Hoạt độ protease giai đoạn hạt nảy mầm phƣơng pháp định tính .46 Hình 3.6 Kết tách chiết DNA tổng số dòng lạc nghiên cứu hệ thứ Năm giống gốc L18 49 Hình 3.7 Kết nhân gen cystatin dòng lạc R5.44 RM5.46 .50 Hình 3.8 Kết biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E coli DH5α 51 Hình 3.9 Kết colony – PCR dòng lạc R5.44 RM5.46 52 Hình 3.10 Kết cắt plasmid tái tổ hợp EcoRI BamHI 52 Hình 3.11 So sánh trình tự nucleotide gen cystatin dịng R5.44, RM5.46 ba trình tự gen cystatin lạc cơng bố GenBank 54 Hình 3.12 Mối quan hệ di truyền gen cystatin dòng lạc R5.44 RM5.46 với ba trình tự gen cystatin lạc công bố Genbank 56 Hình 3.13 So sánh trình tự amino acid gen cystatin dịng lạc R5.44 RM5.46 với ba trình tự gen cystatin lạc công bố Genbank 57 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Lạc (Arachis hypogaea L.) công nghiệp ngắn ngày, có lịch sử canh tác lâu đời, có giá trị dinh dƣỡng giá trị kinh tế cao Lạc cịn trồng có khả thâm canh, cải tạo đất tốt, chống xói mịn phù hợp với cấu chuyển đổi kinh tế nông nghiệp [4] Ở Việt Nam, lạc đƣợc trồng hầu hết tỉnh từ Bắc vào Nam, nhiên diện tích trồng phân tán, suất chất lƣợng chƣa ổn định Một nguyên nhân ảnh hƣởng đến suất chất lƣợng lạc biến đổi khí hậu tồn cầu theo xu hƣớng sa mạc hóa, gây hạn hán kéo dài nhiều nơi Vì vậy, vấn đề đặt cần nghiên cứu tuyển chọn đƣợc giống lạc có suất, chất lƣợng tốt có khả chịu hạn, thích hợp với điều kiện khí hậu thổ nhƣỡng nƣớc ta [4], [18], [19] Kỹ thuật chọn dòng biến dị soma đƣợc ứng dụng rộng rãi chọn tạo giống trồng có khả chống chịu cao với điều kiện bất lợi môi trƣờng Với nguồn biến dị cao (10-5 – 10-8), đa đạng kiểu gen kiểu hình, kỹ thuật cho phép tiến hành chọn lọc dòng tế bào nhanh hiệu so với phƣơng pháp truyền thống Ngồi ra, nghiên cứu ảnh hƣởng tác nhân bất lợi lên thực vật mức độ khác (gen, tế bào, mô, quan nuôi cấy, phân lập hồn chỉnh) Tính ƣu việt kỹ thuật đƣợc khẳng định lúa [2] Đối với lạc, Vũ Thị Thu Thủy đtg (2009), kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật, kết hợp gây nƣớc xử lý mô sẹo chiếu xạ chọn lọc đƣợc số dịng xanh từ mơ sẹo giống lạc L18 Các dòng lạc chọn lọc đƣợc trồng đánh giá qua hệ tuyển chọn phân loại dịng theo nhóm có triển vọng suất, chất lƣợng hạt có khả chống chịu hạn [20] Để góp phần nghiên cứu chất tính chống chịu thực vật, việc nghiên cứu phân lập gen liên quan đến tính chống chịu cần thiết Qua đó, giúp nhà chọn giống phân tích đánh giá hệ gen thực vật cách nhanh chóng, Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 52 tính DNA plasmid tái tổ hợp đƣợc tách kit hãng BIONEER Kiểm tra kết tách plasmid phản ứng cắt với loại enzyme EcoRI BamHI Kết thể hình 3.10 M M 2  2886 bp 500 bp 500 bp 250 bp 250bp Hình 3.9 Kết colony – PCR dịng lạc R5.44 RM5.46 Hình 3.10 Kết cắt plasmid tái tổ hợp EcoRI BamHI (M: Thang DNA: Kb, 1: R5.44, 2: RM5.46) Hình 3.10 cho thấy, sản phẩm phân cắt thành băng DNA tƣơng ứng với phần vector dài 2886 bp đoạn DNA có kích thƣớc khoảng 500 bp Nhƣ vậy, kết luận tách chiết đƣợc plasmid tái tổ hợp có mang gen cystatin 3.3.4 Kết xác định trình tự nucleotide Trình tự gen cystatin đƣợc xác định từ plasmid máy đọc trình tự nucleotide tự động Xử lý kết thu đƣợc phần mềm Laser gene nhận đƣợc gen cystatin hai dịng lạc có kích thƣớc 461 bp Gen cystatin lạc gồm exon intron, đoạn exon gồm 102 nucleotide vị trí đến 102 đoạn exon có 195 nucleotide, từ vị trí 267 đến 461; đoạn intron có 164 nucleotide, từ vị trí 103 đến 266 chứa exon intron So sánh trình tự nucleotide gen cystatin phân lập đƣợc với trình tự nucleotide gen cystatin lạc công bố GenBank Trong đó, mã số FN811133 trình tự gen cystatin giống lạc L18 [61], FR691053 giống lạc L23 [62] FR745399 dịng lạc RM48 có nguồn gốc từ mô sẹo chịu chiếu xạ thổi khô giống lạc L18 [63] Kết thể hình 3.11 bảng 3.11 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 53 RM46 R44 FN811133 FR691053 FR745399 RM46 R44 FN811133 FR691053 FR745399 RM46 R44 FN811133 FR691053 FR745399 RM46 R44 FN811133 FR691053 FR745399 RM46 R44 FN811133 FR691053 FR745399 RM46 R44 FN811133 FR691053 FR745399 RM46 R44 FN811133 FR691053 FR745399 RM46 R44 FN811133 FR691053 FR745399 RM46 R44 FN811133 FR691053 FR745399 10 20 30 + -+ -+A T G G C A G C A G T G G G T G C A C C T C G C G A A G T A A T G G C A G C A G T G G G T G C A C C T C G C G A A G T A A T G G C A G C A G T G G G T G C A C C T C G C G A A G T A A T G G C A G C A G T G G G T G C A C C T C G C G A A G T A A T G G C A G C A G T G G G T G C A C C T C G C G A A G T A 40 50 60 + -+ -+G C T G G A A A C G A G A A C A G C C T C G A G A T C G A T G C C G G A A A C G A G A A C A G C C T C G A G A T C G A T G C C G G A A A C G A G A A C A G C C T C G A G A T C G A T G C T G G A A A C G A G A A C A G C C T C G A G A T C G A T G C C G G A A A C G A G A A C A G C C T C G A G A T C G A T 70 80 90 + -+ -+A G T C T T G C T C G C T T T G C T G T T G A T G A A C A C A G T C T T G C T C G C T T T G C T G T C G A T G A A C A C A G T C T T G C T C G C T T T G C T G T C G A T G A A C A C A G T C T T G C T C G C T T T G C T G T T G A T G A A C A C A G T C T T G C T C G C T T T G C T G T T G A T G A C A C A 100 110 120 + -+ -+A A C A A G A A A C A G G T T T C T T T C T C T C T C T T G A A C A A G A A A C A G G T T T C T T T C T C T C T C T A C A A C A A G A A A C A G G T T T C T T T C T C T C T C T A C A A C A A G A A A C A G G T T T C T T T C T C T C T C T T G A C A A G A A A C A G G G T T T C T T T C T C T C T C T A G 130 140 150 + -+ -+C G A A G A T C G C T T T C G C T T T G G T T T T G G T T C C G A T C A T C G C T T T G G C T C T G G T T T T G G T T C C G A T C A T C G C T T T G G C T C T G G T T T T G G T T C C G A A G A T C G C T T T C G C T T T G G T T T T G G T T C C G A A G A T C G C T T T G G C T C T G G T T T T G G T T C 160 170 180 + -+ -+G T T T T G T G T G A T T G A T C A T G A T T A G T G T T C G T T T T G T A T G A T T G A T C A T G A T T A G T G T T C G T T T T G T A T G A T T G A T C A T G A T T A G T G T T C G T T T T G T G T G A T T G A T C A T G A T T A G T G T T C G T T T T G T A T G A T T G A T C A T G A T T A G T G T T C 190 200 210 + -+ -+G A T T T T G A T T T A A T T T T A A A A T A A T T T G G G G A T T T T G A T T T A A T C T T A A A A T A A T T T G G G G A T T T T G A T T T A A T T T T A A A A T A A T T T G G G G A T T T T G A T T T A A T T T T A A A A T A A T T T G G G G A T T T T G A T T T A A T T T T A A A A T A A T T T G G G 220 230 240 + -+ -+T G G T T G T T T T G G A T T T T T A T C T A A T G T G A C T G G T T G T T T T G G A T T T T T A T C T A A T G T G A C T G G T T G T T T T G G A T T T T T A T C T A A T G T G A C T G G T T G T T T T G G A T T T T T A T C T A A T G T G A C T T G T T G T C T T G G A T T T T T A T C T A A T G T A A C 250 260 270 + -+ -+G A A T T A A A T T G G G A A T G A T G A T G C A G A A T G G A A T T A A A T T G G G A A T G A T G A T G C A G A A T G G A A T T A A A T T G G G A A T G A T G A T G C A G A A T G G A A T T A A A T T G G G A A T G A T C A T G C A G A A T G G A A T T A A A T T G G G A A T G A T C A T G C A G A A T G 280 290 300 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 54 RM46 R44 FN811133 FR691053 FR745399 RM46 R44 FN811133 FR691053 FR745399 RM46 R44 FN811133 FR691053 FR745399 RM46 R44 FN811133 FR691053 FR745399 RM46 R44 FN811133 FR691053 FR745399 RM46 R44 FN811133 FR691053 FR745399 RM46 R44 FN811133 FR691053 FR745399 + -+ -+G C C T T C T C G A G T T T A A G A G G G T T A T A A G T G G C C T T C T C G A G T T T A A G A G G G T T A T A A G T G G C C T T C T C G A G T T T A A G A G G G T T A T A A G T G C C C T T C T T G A G T T T A A G A G G G T T A T A A G T G C C C T T C T C G A G T T T A A G A G G G T T A T A A G T G 310 320 330 + -+ -+C T A A G C A G C A A G T T G T T G C T G G G A C T T T G C C T A A G C A G C A A G T T G T T G C T G G G A C T T T G C C T A A G C A G C A A G T T G T T G C T G G G A C T T T G C C T A A G C A G C A A G T T G T T G C T G G G A C C T T G C C T A A G C A G C A A G T T G T T G C T G G G A C T T T G C 340 350 360 + -+ -+A C C A C A T C A C T T T G G A G G C A G C A A G T G G T G A C C A C A T C A C T T T G G A G G C A G C A A G A G G T G A C C A C A T C A C T T T G G A G G C A G C A A G T G G T G A C C A C A T C A C T T T G G A G G C A G C A A G T G G T G A C C A C A T C A C T T T G G A G G C A G C A A G T G G T G 370 380 390 + -+ -+A T A G T A A G A A T G T T T A T G A A G C C A A G G T G T A T A G T A A G A A T G T T T A T G A A G C C A A G G T G T A T A G T A A G A A T G T T T A T G A A G C C A A G G T G T A T A G T A A G A A T G T T T A T G A A G C C A A G G T T T A T A G T A A G A A T G T T T A T G A A G C C A A G G T G T 400 410 420 + -+ -+G G G A A A A G C C A T G G A T G A A C T T C A A G G A G G G G G A A A A G C C A T G G A T G A A C T T C A A G G A G G G G G A A A A G C C A T G G A T G A A C T T C A A G G A G G G G G A A A A G C C A T G G A T G A A C T T C A A G G A G G G G G A A A A G C C A T G G A T G A A C T T C A A G G A G G 430 440 450 + -+ -+T T C A G G A G T T C A A G C T T G C T G G T G A T G G C T T T C A G G A G T T C A A G C T T G C T G G T G A T G G C T T T C A G G A G T T C A A G C T T G C T G G T G A T G G C T T T C A G G A G T T C A A G C T T G C T G G T G A T G G C T T T C A G G A G T T C A A G C T T G C T G G T G A T G G C T 460 + C C A A T G C T T A A C C A A T G C T T A A C C A A T G C T T A A C C A A T G C T T A A C C A A T G C T T A A Hình 3.11 So sánh trình tự nucleotide gen cystatin dịng R5.44, RM5.46 ba trình tự gen cystatin lạc cơng bố GenBank Các vị trí sai khác hai dịng lạc RM5.46 R5.44 với ba trình tự gen cystatin đƣợc công bố GenBank đƣợc thể bảng 3.11 Tổng số vị trí sai khác trình tự nucleotide hai dịng RM5.46 R5.44 so với giống gốc L18 11, vị trí nằm exon vị trí nằm intron Dịng RM5.46 có vị trí sai khác, vị trí nằm exon vị trí nằm Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Ngun http://www.lrc-tnu.edu.vn 55 intron Dịng R5.44 có vị trí sai khác, thuộc vùng intron có vị trí vị trí nằm exon Khi tiến hành so sánh trình tự gen cystatin dịng lạc RM5.46 R5.44 với nhau, nhận thấy, hai dịng nghiên cứu có 11 vị trí nucleotide khác vị trí: 33, 81, 119, 120, 124, 125, 134, 138, 158, 195, 356 Bảng 3.11 Sự sai khác trình tự nucleotide dịng R5.44, RM5.46 ba trình tự gen cystatin lạc cơng bố GenBank STT 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 Vị trí 33 81 87 88 89 90 92 93 95 96 99 100 101 119 120 124 125 134 138 158 195 212 218 238 260 271 278 326 356 389 RM5.46 R5.44 T T A C A C A C A G A C A T G A G C T G T G T G G G C T T G C C A C A C A C A G A C A A C T C G C A C G T G G G C T A G FN811133 C C A C A C A C A G A C A A C T C G C A T G T G G G C T T G FR691053 T T A C A C A C A G A C A T G A G C T G T G T G C C T C T T FR745399 C T C A C A C A G A C A G A G A G G C A T T C A C C C T T G Trình tự gen cystatin hai giống đậu xanh khác khả chịu hạn có kích thƣớc 1115 nucleotide, kết so sánh nhận đƣợc sai khác vị trí nằm intron, khơng có sai khác exon [12] Sự sai khác trình tự nucleotide gen cystatin xuất nhiều dịng lạc có nguồn gốc từ mơ Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 56 sẹo chịu xử lý so với giống gốc, mức độ xử lý khác làm xuất số lƣợng đột biến khác Sự sai khác nằm intron exon [21] Kết nghiên cứu chứng tỏ mơ sẹo chịu xử lý có gia tăng tần số đột biến so với giống gốc Trên sở sai khác nucleotide gen cystatin thiết lập mối quan hệ di truyền gen cystatin lạc Kết nghiên cứu trình bày bảng 3.12 hình 3.12 Độ tƣơng đồng (%) HE575221 (RM5.46) HE575222 (R5.44) FN811133 FR691053 FR745399 Độ sai khác (%) Bảng 3.12 Độ tƣơng đồng độ sai khác trình tự gen cystatin dịng lạc RM5.46 R5.44 với ba trình tự gen cystatin lạc công bố Genbank Bảng 3.12 cho thấy, độ tƣơng đồng gen cystatin hai dòng lạc với trình tự cơng bố dao động từ 95,2% đến 99,6%, độ sai khác từ 0,4% đến 4,9% Gen cystatin dịng RM5.46 có độ sai khác so với giống gốc L18 2,0% Gen cystatin dòng R5.44 sai khác so với giống L18 0,4% HE575221 (RM5.46) FR691053 HE575222 (R5.44) FN811133 FR745399 2.4 Nucleotide Substitutions (x100) Hình 3.12 Mối quan hệ di truyền gen cystatin dòng lạc R5.44 RM5.46 với ba trình tự gen cystatin lạc cơng bố Genbank Sơ đồ hình hình 3.12 thể mối quan hệ di truyền giống, dòng lạc sở phân tích trình tự gen cystatin Kết sơ đồ cho thấy sơ đồ hình 3.12 cho thấy gen cystatin lạc phân thành nhóm Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 57 Nhóm I gồm nhóm phụ Nhóm phụ gồm dịng RM5.46 (có nguồn gốc từ mô sẹo chịu chiếu xạ kết hợp xử lý nƣớc) giống FR691053 (giống L23 giống có khả chịu hạn cao) Nhóm phụ dịng R5.44 giống FN811133 (giống lạc L18) Nhóm II có dịng RM48 (mã số FR745399) Dịng RM5.46 biến đổi tạo quan hệ gần với giống có khả chịu hạn cao (L23) gợi ý để nghiên cứu mối quan hệ gen cystatin với khả chịu hạn lạc 3.3.5 Kết so sánh trình tự amino acid Gen cystatin phân lập đƣợc có thay đổi vị trí nucleotide exon lý để chúng tơi tiến hành so sánh trình tự amino acid protein cystatin dòng RM5.46 R5.44 với trình tự amino acid cơng bố GenBank, kết thể hình 3.13 RM46 R44 AY722693 FR745399 FN811133 FR691053 10 20 30 + -+ -+M A A V G A P R E V A G N E N S L E I D S L A R F A V D E H M A A V G A P R E V A G N E N S L E I D S L A R F A V D E H M A A V G A P R E V A G N E N S L E I D S L A R F A V D E H M A A V G A P R E V A G N E N S L E I D S L A R F A V D D T M A A V G A P R E V A G N E N S L E I D S L A R F A V D E H M A A V G A P R E V A G N E N S L E I D S L A R F A V D E H RM46 R44 AY722693 FR745399 FN811133 FR691053 40 50 60 + -+ -+N K K Q N G L L E F K R V I S A K Q Q V V A G T L H H I T L N K K Q N G L L E F K R V I S A K Q Q V V A G T L H H I T L N K K Q N G L L E F K R V I S A K Q Q V V A G T L H H I T L T R N R N A L L E F K R V I S A K Q Q V V A G T L H H I T L N K K Q N G L L E F K R V I S A K Q Q V V A G T L H H I T L N K K Q N A L L E F K R V I S A K Q Q V V A G T L H H I T L 70 80 90 + -+ -+E A A S G D S K N V Y E A K V W E K P W M N F K E V Q E F K E A A R G D S K N V Y E A K V W E K P W M N F K E V Q E F K E A A S G D S K N V Y E A K V W E K P W M N F K E V Q E F K E A A S G D S K N V Y E A K V W E K P W M N F K E V Q E F K E A A S G D S K N V Y E A K V W E K P W M N F K E V Q E F K E A A S G D S K N V Y E A K V W E K P W M N F K E V Q E F K RM46 R44 AY722693 FR745399 FN811133 FR691053 -L A G D G S N A L A G D G S N A L A G D G S N A L A G D G S N A L A G D G S N A L A G D G S N A RM46 R44 AY722693 FR745399 FN811133 FR691053 Hình 3.13 So sánh trình tự amino acid gen cystatin dịng lạc R5.44 RM5.46 với ba trình tự gen cystatin lạc cơng bố Genbank Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 58 Vùng mã hóa cho protein gen cystatin lạc dài 297 nucleotide, mã hóa phân tử protein tƣơng ứng gồm 98 amino acid, có vùng bảo thủ L22A23R24F25A26V27 Q49V50V51A52G53 Đoạn intron gồm 164 nucleotide gen nằm vùng bảo thủ đoạn nối trình tự amino acid glutamine34 (Gln34) asparagin35 (Asn35) Dịng RM5.46 có hai vị trí nucleotide sai khác nằm exon nhƣng khơng làm sai khác trình tự amino acid Dịng R5.44 có sai khác amino acid vị trí 64 (Serine64 đƣợc thay Arginine64), nhiên chƣa tìm thấy mối liên hệ sai khác amino acid với khả chịu hạn Đối chiếu với kết công bố tác giả Marcia đtg (2008) [38], Martinez đtg (2008) [39], xác định gen cystatin phân lập đƣợc từ dịng RM5.46 R5.44 thuộc nhóm I phân họ cystatin thực vật (hay phytocystatin) Tuy có sai khác trình tự nucleotide mã hóa chuỗi amino acid, nhƣng trình tự amino acid dịng lạc RM5.46 khơng có sai khác so với giống lạc L18 AY722693 Hai dịng lạc RM5.46 R5.44 có vị trí amino acid sai khác với dịng RM48 (ở vị trí 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36) vị trí sai khác với giống L23 (vị trí 36) Trình tự amino acid gen cystatin dịng lạc R5.44 mã hóa có amino acid sai khác so với trình tự cịn lại vị trí 64 Đây kết thay nucleotide (T thay C vị trí 195) dẫn đến thay đổi amino acid (serine64 đƣợc thay arginine64) Sự thay đổi amino acid thay T thay C trình tự nucleotide gen mã hóa cystatin dịng R5.44 có nguồn gốc từ mơ sẹo chịu thổi khơ q trình ni cấy mơ sẹo xảy đột biến điểm, làm thay nucleotide Dòng lạc R5.44 đƣợc đánh giá dịng lạc có khả chịu hạn so với dòng RM5.46 RM48, phải có liên quan đến thay amino acid dịng lạc Tuy nhiên, tính chịu hạn tính trạng liên quan đến nhiều gen có gen cystatin cần có nghiên cứu sâu để làm sáng tỏ vấn đề Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 59 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ KẾT LUẬN 1.1 Các dòng lạc nghiên cứu hệ thứ Năm thứ Sáu có hệ số biến động di truyền tiêu nghiên cứu thấp ổn định so với giống gốc Kết nghiên cứu thu đƣợc số dịng có triển vọng: Dịng RM5.46 có khối lƣợng 100 quả, 100 hạt lớn Dịng R5.44 R5.46 có tỷ lệ nhân cao 1.2 Hàm lƣợng lipid dao động từ 34,95% đến 39,10% Dòng lạc có hàm lƣợng lipid cao RM5.48 (39,10%) Hàm lƣợng protein dao động từ 26,25% đến 38,11% Dòng RM5.47 có hàm lƣợng protein cao (38,11%) 1.3 Hàm lƣợng đƣờng tan hoạt độ α - amylase, hàm lƣợng protein hoạt độ protease dịng lạc giai đoạn nảy mầm có mối tƣơng quan thuận chặt chẽ, liên quan đến khả chịu hạn dòng 1.4 Đánh giá số đặc điểm nông sinh học, chất lƣợng hạt suất khả chịu hạn, kết tuyển chọn đƣợc số dịng lạc ƣu việt: Dịng RM46 có khối lƣợng 100 quả, 100 hạt cao Dịng RM5.48 có hàm lƣợng lipid cao Dịng RM5.47 có hàm lƣợng protein cao Dịng có khả chịu hạn cao RM5.48 1.5.Tách dịng xác định trình tự gen cystatin hai dòng lạc RM5.46 R5.44 Gen cystatin hai dòng lạc có kích thƣớc 461 nucleotide, chứa exon intron Đoạn mã hóa gen cystatin lạc dài 297 nucleotide, mã hóa cho chuỗi polypeptide dài 98 amino acid Dịng R5.44 có thay amino acid cystatin so với giống gốc vị trí 64 (Serine64 đƣợc thay Arginine64) ĐỀ NGHỊ 1.1 Tiếp tục đánh giá khả chịu hạn dòng lạc giai đoạn phát triển khác để khẳng định hiệu kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào chọn dòng lạc lạc 1.2 Thiết kế vector chứa gen cystatin để chuyển vào lạc trồng khác để nghiên cứu ảnh hƣởng gen đến khả chống chịu lạc Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Ngun http://www.lrc-tnu.edu.vn 60 CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN Phạm Tuấn Oanh, Vũ Thị Thu Thuỷ, Nguyễn Thị Tâm, Chu Hoàng Mậu (2011), Sự sai khác trình tự nucleotide gen cystatin số dịng lạc có nguồn gốc từ mơ sẹo giống lạc L18, Tạp chí Khoa học&Cơng nghệ - Đại học Thái Nguyên, 85(09)/1: 133-141 Chu M H., Vu T T T., Pham O T., Hoang M V., (2011), Arachis hypogaea cst gene for cystatin, cultivar L18, isolated from irradiated and dehydrated peanut line.GenBank, Accession : HE575221.1 Chu M H., Vu T T T., Pham O T., Hoang M V., (2011), Arachis hypogaea cst gene for cystatin, cultivar L18, isolated from dehydrated peanut line, GenBank, Accession : HE575222.1 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 61 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Trần Thị Ân (2006), "Tuyển chọn giống lạc có suất, phẩm chất cao thích hợp cho vùng đất cát biển Thanh Hóa", Tạp chí Nông nghiệp Phát triển nông thôn, kỳ 1, tháng 1/2006: 61-68 Lê Trần Bình, Lê Thị Muội (1998), Phân lập gen chọn dòng chống chịu ngoại cảnh bất lợi lúa, Nxb Đại học Quốc Gia Hà Nội: – 57, 154-165 Phạm Thị Trân Châu, Nguyễn Thị Hiền, Phùng Gia Tƣờng (1998), Thực hành hóa sinh học, Nxb Giáo Dục: 54-55 Đƣờng Hồng Dật (2007), Cây lạc biện pháp thâm canh nâng cao hiệu sản xuất, Nxb Thanh Hóa: 5-80 Nguyễn Lân Dũng, Phạm Thị Trân Châu, Nguyễn Thanh Hiền, Lê Đình Lƣơng, Đồn Xn Mƣợu, Phạm Văn Ty (1978), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, Nxb Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội, tập 3: 134-139 Đinh Thị Vĩnh Hà, Nguyễn Văn Mã (2008), ''Sự biến đổi hoạt độ enzim protease, lipase, amylase hạt đậu tƣơng nảy mầm điều kiện thiếu nƣớc'', Tạp chí Khoa học Cơng nghệ, 46(6): 51-58 Vũ Công Hậu, Ngô Thế Dân, Trần Thị Dung (1994), Cây lạc, Nxb Nông nghiệp Hà Nội: 7- 76 Trần Thị Phƣơng Liên (1999), Nghiên cứu đặc tính hóa sinh sinh học phân tử số giống đậu tương có khả chịu nóng, chịu hạn Việt Nam, Luận án tiến sỹ sinh học, Viện Công nghệ Sinh học, Hà Nội Trần Thị Phƣơng Liên, Huỳnh Thị Thu Huệ, Nông Văn Hải, Lê Thị Muội (2005), ''Amylaza hạt số giống đậu tƣơng chịu nóng số giống đậu tƣơng chịu hạn'', Tạp chí Sinh học, 27(1): 58-63 10 Nguyễn Thiên Lƣơng, Phan Quốc Gia, Nguyễn Thị Chinh, Nguyễn Văn Thắng, Nguyễn Xuân Thu, Phạm Thị Thủy, Vũ Thị Ngọc Phƣợng (2009), "Đánh giá khả chịu hạn số giống lạc 2008", Tạp chí Nơng nghiệp Phát triển nơng thơn, 7: 67-72 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 62 11 Chu Hoàng Mậu (2008), Phương pháp phân tích di truyền đại chọn giống trồng, Nxb Đại học Thái Nguyên 12 Chu Hoàng Mậu, Nguyễn Vũ Thanh Thanh, Nguyễn Thị Thu Trang, (2008), So sánh trình tự gien cystatin đậu xanh (Vigna radiata (L,) Wilczek), Tạp chí Sinh học, 30(3): 121-128 13 Nguyễn Văn Mùi (2002), Xác định hoạt độ enzyme, NXB Khoa học Kỹ Thuật 14 Đinh Thị Phịng, Lê Thị Muội, Lê Trần Bình (2004), "Kết tạo giống lúa DR3 kỹ thuật chọn dòng biến dị soma", Tạp chí Khoa học Cơng nghệ, 42(5): 27-33 15 Nguyễn Thị Tâm, Võ Văn Ngọc (2009), "Đặc điểm hóa sinh số dịng lúa chọn lọc hệ R4 có nguồn gốc từ mơ sẹo chịu nƣớc, Báo cáo Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc: 340-343 16 Nguyễn Thị Tâm, Nguyễn Thị Thu Ngà (2007) " Ảnh hƣởng hạn sinh lý đến số tiêu sinh hóa giai đoạn hạt nảy mầm số giống lạc", Tạp chí Nông Nghiệp Phát triển Nông thôn, (6): 34-39 17 Trần Minh Tâm (2006), Bảo quản chế biến nông sản sau thu hoạch, Nxb Nông Nghiệp, Hà Nội: 289 - 291 18 Chu Thị Thơm, Phan Thị Lài, Nguyễn Văn Tó (2006), Kỹ thuật trồng chăm sóc lạc, Nxb Lao Động, Hà Nội: 7-43, 105-112 19 Tạ Quốc Tuấn, Trần Văn Lợt ( 2006), Cây đậu phộng, kỹ thuật trồng thâm canh, Nxb Nông Nghiệp, TP, Hồ Chí Minh: 7-53 20 Vũ Thị Thu Thủy, Nguyễn Thị Tâm, Chu Hoàng Mậu, Nguyễn Vũ Thanh Thanh (2011), "Chọn lọc dòng biến dị chịu nƣớc chiếu xạ lạc", Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 93: 349-356 21 Vũ Thị Thu Thủy, Nguyễn Thị Tâm, Chu Hoàng Mậu, Nguyễn Vũ Thanh Thanh (2011), "Nghiên cứu đặc điểm trình tự gien cystatin số dịng lạc có nguồn gốc từ mơ sẹo chịu chiếu xạ xử lý nƣớc", Tạp chí Sinh học, 33(1): 86-95 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 63 TÀI LIỆU TIẾNG ANH 22 Abe K., Emori Y., Kondo H., Suzuki K., Arai K., (1987), "Molecular cloning of a cysteine proteinase inhibitor of rice (oryzacystatin), Homology with animal cystatin and transient expression in ripening process of rice seeds", J Biol Chem, 262,35: 16793-16797, 23 Adkins S M., Shiraishi T., Kunavuvatchaidach R., Godwin I D (1995), "Somaclonal variation in rice drought – tolerance and other agronomic characters", Aust J Bot, 4: 201-209 24 Barrett A J (1987), "The Cystatins; a new class of peptidase inhibitors", Trend Biochem Sci, 12: 318-326 25 Barett A J., Rawlings N D., Davies M E., Machleidt W., Salvesen G., Turk V (1986), Cystein proteinnase inhibitor of the cystatin superfamily, in: AJ Barett, G, Salvesen (Eds), Proteinase inhibitor Elsevier, Amsterdam, The Netherlands: 519-569 26 Bond J S, Butlern P E, (1987), "Intracellular proteases", Ann Rev Biochem., 56: 333-364 27 Colella R., Sakaguchi Y., Nagase H., Bird J W C (1989), "Chicken egg white cystatin", J Biol Chem, 264: 17164 – 17169 28 Douliez J P., Michon T., Elmorjani K., Marion D (2000), "Structure, biological and technological functions of lipid transfer proteins and indolines, the major lipid binding proteins from Cereal Kernels", J Cereal Sci, 32(1): 1-20 29 Dramé K N., Clavel D., Repellin A., Passaquet C., Zuily-Fodil Y (2007), "Water deficit induces variation in expression of stress-responsive genes in two peanut (Arachis hypogaea L.) cultivars with different tolerance to drought", Plant Physiol Biochem, 45(3-4):236-243 30 Gawel N J, Jarret R L (1991), Genomic DNA isolation, http: //www.weihenstephan.de/pbpz/bambra/html/dna.htmn 31 Grudkowska M., Zagdanska B (2004), "Multifunctional role of plant cysteine proteinases", Acta Biochim Pol, 51(3): 609-624 32 Guerbette F., Grosbois M., Jolliot C A , Kader J C., Zachowski A (1999), "Lipid-transfer proteins from plants: Structure and binding properties", Mol Cell Biochem, 192: 157-161 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 64 33 Hwang J E., Hong J K., Je J H., Lee K O., Kim D Y., Lee S Y., Lim C O (2009), "Regulation of seed germination and seedling growth by an Arabidopsis phytocystatin isoform, AtCYS6", Plant Cell Rep, 28: 1623–1632 34 Hundertmark M., Hincha D K (2008), "LEA ( Late Embryogenesis Abundant) protein and their encoding genes in Arabidopsis thaliana", BMC Genomics, 9(118) 35 Ismail C (2005), "The role of potassium in alleviating detrimental effects of abiotic stresses in plants", J Plant Nutr Soil Sci, 168: 521-530 36 Lindhal M., Yang D H., Andersson B (1995), "Regulatory proteolysis of the major light-harvesting chlorophyll a/b protein of photosystem II by a lightinduced membrane-associated enzymatic system", Eur J Biochem, 231: 503–509 37 Liu K H., Lin T Y (2003), "Cloning and characterization of two novel lipid transfer protein I genes in Vigna radiate", DNA seq, 14(6): 420-426 38 Marcia M P., Andreia C T Z., Quilherme L., Giancarlo P., Rogerio M (2008), "Molecular evolution and diversification of plant cysteine proteinase inhibitors: New insights after the poplar genome", Mol Phylogenet Evol, 49(1): 349-355 39 Martinez M., Diaz-Mendoza M., Carrillo L., Diaz I (2007), "Cacboxyl terminal extended phytocystatins are bifunctional inhibitors of papain and legumain cystein proteinase", FEBS Lett, 581: 2914-2918 40 Massonneau A., Condamine P., Wisniewski J P., Zivy M., Rogowsky P M (2005) "Maize cystatins respond to developmental cues, cold stress and drought", Biochim Biophys Acta, 1729: 186-199 41 Oliveira A, S., Xarvier – Fihlo J., Sales M P (2003),"Cysteine proteinases and cystatins", Braz Arch Biol Technol , 46 (1): 91 – 104 42 Pernas M., R, Sanchez-Mong G., Salcedo (2000), "Biotic and abiotic stress can induce cystatin expression in chestnut", FEBS Lett, 467: 206– 210 43 Raesh S., Manickam A., (2006), "Predictiion of functions of two LEA proteins from mungbean", Bioinformation, 1(4): 133-138 44 Rodriguez V S., Rangel G A., Villagomez M C., Lopez C A., Vargas D F., Martinez G N., Hernandez C., Delano-Frier J (2007), "Cloning of a cDNA encoding a cystatin from grain amaranth (Amaranthus hypochondriacus) Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 65 showing a tissue-specific expression that is modified by germination and abiotic stress", Plant Physiol, Biochem, 45(10-11): 790-798 45 Turk B., Turk V., Turk D, (1997), "Structural and functional aspects of papain like cysteine proteinases and their protein inhibitors", Biol Chem, 378(3-4): 141-150 46 Turk V., Bode W., (1991), "The cystatins: protein inhibitors of cysteine proteinases", FEBS Lett, 285(2): 213-219 47 Turner N., C., (1979), Drought resistance and adaptation to water deficits in crop plants, In: Stress Physiology in crop plants, Musell H., Staples R C (eds.), Wiley-InterScience, NewYork: 343-372 48 Wang K M., Kumar S., Cheng Y S., Venkatagiri S., Yang A H., Yeh K W (2008), "Characterization of inhibitory mechanism and antifungal activity between group-1 and group-2 phytocystatins from taro (Colocasia esculenta)", FEBS Journal, 275: 4980–4989 49 Wangxia W., Basia V., Oded S., Arie A (2004), "Role of plant heat shock proteins and molecular chaperones in the abiotic stress response", Trends Plant Sci, 9(5): 244-252 50 Xiong L., Karen S S., Zhu J K (2002), "Abiotic stress signal transduction in plants: Molecular and genetic perspetives", Physiol Plant, 112: 152-166 51 Yang A H., Yeh K W (2005), "Molecular cloning, recombinant gene expression, and antifungal activity of cystatin from taro (Colocasia esculenta cv, Kaosiung no, 1)", Planta, 221: 493–501 52 Zhang X., Liu S., Takano T (2008), "Two cysteine proteinase inhibitors from Arabidopsis thaliana, AtCYSa and AtCYSb, increasing the salt, drought, oxidation and cold tolerance", Plant Mol Biol, 68: 131–143 53 http://www.gso.gov.vn/default.aspx?tabid=390&idmid=3&ItemID=10000 Sản lƣợng lạc phân theo địa phƣơng, Tổng cục Thống kê, tháng 5/2011 http://www.gso.gov.vn/default.aspx?tabid=390&idmid=3&ItemID=10002 Diện tích lạc phân theo địa phƣơng, Tổng cục Thống kê, tháng 5/2011 54 http://faostat.fao.org/site/567/DesktopDefault.aspx?PageID=567#ancor Faostat, 2009 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 66 55 http://agriviet.com/nd/724-cach-trong-lac-dau-phong-thu-dong-dat-nang-suat-cao Agriviet.com (2007), Cách trồng lạc-đậu phộng thu đông đạt suất cao 56 http://www.thaibinhseed.com.vn/news.asp?LGID=0&NewsID=952 Nguyễn Thị Mai Chi, Bệnh hại lạc vụ thu-đông biện pháp phòng trừ 57 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AY722693 Yan Y., Wang L., Huang S., (2004), Arachis hypogaea cysteine proteinase inhibitor mRNA, complete cds, GenBank: AY722693.1 58 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/DQ294615.1 Senthil-Kumar M., Govind G., Kang L., Mysore K.S., Udayakumar M (2007), Arachis hypogaea 17.3 kDa class I heat shock protein mRNA, partial cds, GenBank: DQ294615.1 59 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/DQ889543.1 Bi Y.P., Wan S.B., Shan L., Zhang H.T., Su L., Quan X.Q., Xia M (2006), Arachis hypogaea clone 1E65 heat shock protein mRNA, partial cds, GenBank: DQ889543.1 60 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/FM955398.1 Liu W (2008), Arachis hypogaea mRNA for putative DREB transcription factor (DRE-binding domain gene), isolated from leaf, GenBank: FM955398.1 61 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/FN811133.1 Vu T.T.T., Nguyen T.V.T., Chu M.H., Nguyen T.T (2010), Arachis hypogaea cystatin gene 1, exons 1-2, GenBank: FN811133.1 62 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/FR691053.1 Vu T.T.T., Chu M.H., Nguyen T.T.V., Nguyen T.T (2010), Arachis hypogaea cystatin gene for cystein proteinase inhibitor, cultivar L23, GenBank: FR691053.1 63 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/FR745399.1 Vu T.T.T., Nguyen T.T., Chu M.H., Nguyen T.T.V (2010), Arachis hypogaea cystatin gene for cystein proteinase inhibitor, cultivar L18, GenBank: FR745399.1 64 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/BAA19608.1 Misaka T., Kuroda M., Iwabuchi K., Abe K., Arai S (1996), Cysteine proteinase inhibitor [Glycine max], GenBank: BAA19608.1 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn