Đánh giá khả năng chịu hạn và phân lập gen cystatin ở một số giống ngô chịu hạn khác nhau

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC - NGUYỄN PHƯƠNG THẢO ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHỊU HẠN VÀ PHÂN LẬP GEN CYSTATIN Ở MỘT SỐ GIỐNG NGÔ CHỊU HẠN KHÁC NHAU LUẬN VĂN THẠC SĨ CƠNG NGHỆ SINH HỌC Thái Ngun, năm 2012 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Tai ngay!!! Ban co the xoa dong chu nay!!! http://www.lrc-tnu.edu.vn MỞ ĐẦU ĐẶT VẤN ĐỀ Ở Việt Nam, ngô lƣơng thực quan trọng đƣợc trồng nhiều vùng sinh thái khác nhau, đa dạng mùa vụ gieo trồng hệ thống canh tác [4] Cây ngô không cung cấp lƣơng thực cho ngƣời, vật nuôi mà cịn trồng xóa đói giảm nghèo tỉnh có điều kiện kinh tế khó khăn Tuy nhiên năm qua, hạn chế điều kiện tƣới tiêu, tập quán canh tác đặc biệt việc chọn giống chịu hạn đƣa vào sản xuất chƣa đƣợc trọng, thêm vào diễn biến thời tiết phức tạp, hạn hán thƣờng xuyên xảy nên suất ngơ nƣớc ta cịn thấp Nƣớc ta có 75% diện tích đồi núi, lƣợng mƣa hàng năm không đồng vùng, tình trạng hạn hán thƣờng xuyên diễn dẫn đến suất trồng nói chung ngơ nói riêng bị giảm Năm 2004, tỉnh Đắc Lắc có 28000 ngơ bị hạn, trắng 60% giảm suất 40% Để hạn chế ảnh hƣởng hạn tới suất ngô, năm gần nƣớc ta tuyển chọn mở rộng trồng giống ngơ lai có khả chịu hạn tốt, cho suất cao Ngồi ra, có nhiều cơng trình nghiên cứu đến khả chịu hạn ngơ Đó kết đánh giá khả chịu hạn ngô đồng ruộng [17], đánh giá khả chịu hạn ngô non điều kiện hạn nhân tạo [11], [18]), nghiên cứu ảnh hƣởng môi trƣờng đến khả tạo mô sẹo ngơ [14] Có số cơng trình nghiên cứu ngơ tiếp cận phân tích đại phân tử DNA nhƣ: phân lập gen dehydrin dhn1/rab17 từ DNA genome [6]), phân lập gen dehydrin từ cDNA [25]) Những nghiên cứu mức độ phân tử nhằm mục đích tìm kiếm phân tích gen liên quan đến đặc tính chịu hạn ngơ Các nghiên cứu thống đặc tính chịu hạn ngơ nói riêng trồng nói chung nhiều gen định, có gen cystatin Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn việc chọn tạo giống ngô theo hƣớng nâng cao khả chịu hạn, tiến hành đề tài nghiên cứu “Đánh giá khả chịu hạn phân lập gen cystatin số giống ngô chịu hạn khác nhau” MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU - Xác định đƣợc mức độ chịu hạn số giống ngô giai đoạn non -Xác định đƣợc mối liên quan hoạt tính enzyme α – amylase, protease, chiều dài rễ với khả chịu hạn số giống ngơ - Phân lập xác định đƣợc trình tự gen cystatin số giống ngơ có khả chịu hạn khác NỘI DUNG NGHIÊN CỨU - Đánh giá khả chịu hạn phƣơng pháp gây hạn nhân tạo giai đoạn 3, 5, 7, ngày gây hạn - Xác định hoạt tính α – amylase, protease hạt 10 giống ngô nghiên cứu - Xác định chiều dài rễ ngày tuổi giai đoạn non - Tách chiết DNA tổng số 10 giống ngô nghiên cứu - Sử dụng kỹ thuật PCR để nhân gen cystatin số giống ngơ - Tách dịng gen cystatin giống ngô: giống chịu hạn tốt giống chịu hạn - Xác định trình tự gen cystatin giống ngơ có khả chịu hạn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 CÂY NGƠ 1.1.1 Nguồn gốc phân loại Cây ngơ có tên khoa học Zea mays L., loại lƣơng thực thuộc chi Maydeae, họ hòa thảo (Gramineae), hòa thảo (Graminales) Căn vào kết nghiên cứu khảo cổ học, tế bào học, di truyền học…cho thấy ngơ có nguồn gốc từ Châu Mỹ, ngơ lan truyền sang Châu Âu phần cịn lại giới sau có tiếp xúc ngƣời Châu Âu với Châu Mỹ Ở Việt Nam ngô đƣợc trồng vào kỷ thứ XVII Dựa vào hạt có mày hay khơng có mày, hình thái bên ngồi cấu trúc nội nhũ hạt, ngô đƣợc phân thành lồi phụ: ngơ bọc, ngơ đá, ngơ ngựa, ngô đƣờng, ngô nổ, ngô bột, ngô nếp, ngô đƣờng bột, ngơ bán ngựa Từ lồi phụ vào màu sắc hạt màu sắc lõi ngô để phân thành thứ Đây cách phân loại theo đặc điểm thực vật học, ngồi ngơ cịn đƣợc phân loại theo sinh thái học, nơng học, thời gian sinh trƣởng thƣơng phẩm [8] 1.1.2 Đặc điểm sinh học Ngô lƣơng thực thấy dạng trồng bao gồm phận: rễ, thân, lá, hoa (bông cờ, bắp ngô) hạt Ngô có hệ rễ tiêu biểu cho rễ hịa thảo Tuy nhiên ngơ có rễ phát triển mạnh, nên có khả hút nƣớc khỏe, nhiều lồi trồng khác Hệ rễ ngơ hồn chỉnh chia thành nhóm: rễ mầm, rễ đốt, rễ chân kiềng Rễ mầm mọc từ trụ mầm, chức rễ hút nƣớc, thức ăn non Rễ đốt mọc vòng quanh đốt thấp thân Đây loại rễ định q trình sinh trƣởng phát triển ngơ, giúp hút nƣớc chất dinh dƣỡng suốt đời sống Rễ chân kiềng Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn mọc quanh đốt thấp sát mặt đất Rễ giúp chống đỡ bám chặt vào đất, chúng tham gia hút nƣớc thức ăn Số lƣợng rễ, số lông rễ độ dài rễ khác giống Đây tiêu quan trọng để đánh giá khả chịu hạn Thân ngơ đặc, đƣờng kính từ - cm, cao từ 1,8 - m Thân ngô trƣởng thành bao gồm nhiều lóng nằm đốt kết thúc bơng cờ Thân ngơ ngồi nhiệm vụ giúp đứng vững, phận dự trữ vận chuyển chất hữu cơ, ngồi cịn có khả quang hợp để tổng hợp chất hữu Lá ngô mọc từ mắt đốt mọc đối xứng xen kẽ Các phận bao gồm: bẹ lá, phiến lá, thìa Theo hình thái vị trí thân, ngơ đƣợc chia thành nhóm: mầm, thân, bẹ, bi Số lá, độ lớn phụ thuộc vào giống, điều kiện thời tiết, kỹ thuật canh tác, mùa vụ, số ngô thƣờng biến động từ 15 - 20 Đặc điểm bật ngơ có nhiều khí khổng Trung bình ngơ có từ - triệu khí khổng, 1mm2 có từ 500 - 900 khí khổng Cơ chế đóng mở lỗ khí khổng liên quan chặt chẽ tới điều kiện hạn hán Lá ngô quan làm nhiệm vụ quang hợp, đồng thời làm nhiệm vụ trao đổi khí, hô hấp, dự trữ dinh dƣỡng… Ngô loại có hoa khác tính gốc Cơ quan sinh sản đực (bông cờ) (bắp) nằm song vị trí khác Hoa đực nằm đỉnh Hoa phát sinh từ mầm nách thân, số mầm nách nhiều nhƣng có từ - mầm nách phát triển thành bắp Số bắp phụ thuộc vào giống, vùng sinh thái, mật độ phân bón Hạt ngơ thuộc loại dĩnh gồm phần chính: vỏ hạt, lớp alơrôn, phôi, nội nhũ chân hạt Vỏ hạt bao xung quanh hạt màng nhẵn Lớp alơrôn nằm dƣới vỏ hạt Nội nhũ phần hạt chứa 70 - 78% khối lƣợng hạt với giá trị dinh dƣỡng cao so với loại hạt ngũ cốc khác Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Phôi ngơ có: ngù (phần ngăn cách nội nhũ phôi), mầm, trụ dƣới mầm, rễ mầm chồi mầm Trong bốn phần mầm thƣờng phát triển rõ rệt Phôi ngô lớn chiếm - 15% trọng lƣợng hạt Màu sắc hạt phụ thuộc đặc tính di truyền giống chủng loại, hạt ngơ có nhiều màu sắc khác nhƣ: trắng, vàng, tím, da cam, đỏ…Mỗi bắp ngơ có từ 200 1000 hạt phụ thuộc vào giống, điều kiện ngoại cảnh, sinh thái, trung bình bắp có từ 500 - 600 hạt Quá trình sinh trƣởng, phát triển ngô đƣợc chia thành hai giai đoạn: giai đoạn sinh dƣỡng giai đoạn sinh thực Giai đoạn sinh dƣỡng đƣợc tính từ gieo đến trỗ cờ Giai đoạn sinh thực đƣợc tính từ trỗ cờ đến chín hồn tồn Căn vào đặc điểm q trình sinh trƣởng phát triển chia giai đoạn sinh trƣởng phát triển quan trọng sau đây: giai đoạn hạt nảy mầm mọc; giai đoạn từ mọc đến lá; giai đoạn từ đến lá; giai đoạn từ đến trổ cờ; giai đoạn từ trỗ cờ đến tung phấn, phun râu; giai đoạn từ thụ phấn đến chín [8] Trong giai đoạn ngô yêu cầu điều kiện khác giai đoạn có ảnh hƣởng khác đến yếu tố tạo thành suất chất lƣợng hạt ngô [8] 1.1.3 Giá trị kinh tế ngô Ngô lƣơng thực quan trọng kinh tế toàn cầu Bên cạnh vai trị cung cấp lƣơng thực cho ngƣời, ngơ cịn nguyên liệu quan trọng công nghiệp chế biến thức ăn gia súc công nghệ sinh học Nhiều nƣớc sử dụng ngô để chế biến ethanol - lƣợng tƣơng lai Ngô lƣơng thực ni sống gần 1/3 dân số tồn giới, tất nƣớc trồng ngơ nói chung ăn ngô mức độ khác Nếu nhƣ châu Âu phần ăn là: bánh mỳ, khoai tây, sữa; châu Á cơm Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn (gạo), cá, rau xanh (canh) châu Mỹ La Tinh bánh ngơ, đậu đỗ ớt Ngồi ra, bắp ngơ bao tử cịn đƣợc sử dụng làm rau cao cấp, lấy hạt làm nguyên liệu chế biến mặt hàng có giá trị dinh dƣỡng cao nhƣ sữa ngơ, ngơ đóng hộp, đóng lọ… Ngơ thức ăn giàu lƣợng, thành phần quan trọng thức ăn hỗn hợp cho gia súc gia cầm Hầu nhƣ 70% chất dinh dƣỡng thức ăn tổng hợp từ ngơ Cây ngơ cịn thức ăn xanh ủ chua lý tƣởng cho đại gia súc, đặc biệt bị sữa Ngơ cung cấp ngun liệu cho công nghiệp Ngƣời ta sản xuất khoảng 670 mặt hàng khác ngành công nghiệp lƣơng thực - thực phẩm, công nghiệp dƣợc công nghiệp nhẹ Ngồi ngơ cịn nguồn hàng hóa xuất có giá trị cao Trên giới hàng năm lƣợng ngô xuất nhập khoảng 70 triệu đem lại nguồn lợi nhuận kinh tế lớn [9] Ở Việt Nam, ngô lƣơng thực quan trọng thứ hai sau lúa màu quan trọng đƣợc trồng nhiều vùng sinh thái khác Cây ngô không cung cấp lƣơng thực cho ngƣời, vật ni mà cịn trồng xóa đói giảm nghèo tỉnh có điều kiện kinh tế khó khăn [4] 1.1.4 Đặc điểm hóa sinh hạt ngơ Thành phần hydratcacbon ngô chủ yếu tinh bột (60 - 70%), lipid chủ yếu acid béo, protein dạng zein chiếm đa số, hàm lƣợng đƣờng khoảng 3,5%, lƣợng tro khoảng - 2,4%, chất khoáng chiếm 60% khối lƣợng phơi [8] Tinh bột ngơ hình trịn, hình đa diện, góc cạnh rõ rệt, kích thƣớc khoảng - 35 µm Tinh bột tập trung chủ yếu nội nhũ đƣợc chia thành hai dạng tinh bột mềm (tinh bột bột) tinh bột cứng (tinh bột sừng) Đặc Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn điểm tinh bột nội nhũ hạt tiêu chuẩn để phân loại lồi ngơ phụ Hàm lƣợng tinh bột ngô tẻ (68%) nhiều ngô nếp (65%) [8] Tỷ lệ chất béo hạt ngô tƣơng đối cao (3 - 6%), chủ yếu tập trung mầm ngô Trong chất béo ngơ có 50% acid linoleic, 31% acid oleic, 13% acid panmitic 3% stearic Hàm lƣợng lipid tiêu quan trọng để đánh giá chất lƣợng hạt [5] Tỷ lệ protein hạt ngơ - 12% Protein ngơ zein, loại prolamin gần nhƣ khơng có lysine tryptophan Protein ngô đƣợc chia thành loại chính: protein hoạt tính (enzyme), protein cấu tạo protein dự trữ, protein dự trữ chiếm tỷ lệ cao Hàm lƣợng protein nhƣ thành phần amino acid bị thay đổi tác động yếu tố di truyền (giống) môi trƣờng, kỹ thuật canh tác Vitamin ngô tập trung lớp ngồi hạt ngơ mầm Ngơ có nhiều vitamin C, vitamin B (B1, B2, B6 ) Vitamin PP thấp cộng với thiếu tryptophan amino acid tạo vitamin PP Riêng ngơ vàng chứa nhiều carotene (tiền vitamin A) [9] 1.1.5 Tình hình sản xuất ngơ giới Việt Nam 1.1.5.1 Tình hình sản xuất ngô giới Với giá trị kinh tế sử dụng mình, ngơ đƣợc xem lƣơng thực quan trọng kinh tế toàn cầu đứng thứ ba sau lúa gạo lúa mỳ Ngơ có địa bàn phân bố rộng giới, trải rộng từ 40o N đến gần 55o B, từ độ cao - m đến 400 m so với mực nƣớc biển [9] Do ngơ đƣợc trồng hầu hết nơi giới nhƣ Châu Mỹ, Châu Âu, Châu Úc, Châu Phi Châu Á Diện tích, suất, sản lƣợng ngơ châu lục có chênh lệch tƣơng đối lớn đƣợc thể bảng 1.1 [58] Diện tích trồng ngơ châu lục có chênh lệch nhau, Châu Mỹ khu vực có diện tích trồng ngơ lớn nhất, năm 2008 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 60,4 triệu đến năm 2010 63,1 triệu ha, chiếm gần 40% diện tích ngơ tồn giới Đứng thứ hai Châu Á chiếm 33,2% Châu Âu có diện tích trồng ngơ thấp, chiếm khoảng 8,7% diện tích trồng ngơ giới Châu Mỹ khu vực có suất cao đạt 71,0 tạ/ha, đứng thứ hai khu vực Châu Âu: 60,6 tạ/ha, thấp Châu Á: 45,8 tạ/ha (năm 2010) Sở dĩ Châu Á có suất thấp nhƣ khu vực có điều kiện bất thuận nhƣ; hạn hán, lũ lụt, đất canh tác chƣa thuận lợi Bảng 1.1 Tình hình sản xuất ngơ số khu vực giới giai đoạn 2008 - 2010 Khu vực Diện tích Năng suất Sản lượng (Triệu ha) (Tạ/ha) (Triệu tấn) 2008 2009 2010 2008 2009 2010 2008 2009 2010 Châu Âu 15,4 13,8 14,1 60,5 60,7 60,6 93,2 84,0 85,6 Châu Á 52,4 53,5 53,7 45,5 43,8 45,8 238,4 234,5 246,1 Châu Mỹ 60,4 61,4 63,1 68,6 71,9 71,0 439,5 441,5 447,9 Thế giới 161,2 158,8 161,9 51,3 51,6 52,1 827,5 819,7 844,4 (Nguồn FAOSTAT, 2011) Giai đoạn 2008 - 2009, Châu Mỹ có suất tăng mạnh, tăng 3,3 tạ/ha; Châu Âu tăng nhẹ: 0,2 tạ/ha; khu vực Châu Á có suất giảm (giảm 1,7 tạ/ha) điều kiện bất thuận Về sản lƣợng, Châu Mỹ khu vực dẫn đầu sản lƣợng ngơ tồn giới, năm 2008 đạt 439,5 triệu chiếm 53,1% tổng sản lƣợng ngô toàn giới Đứng thứ hai khu vực Châu Á đạt 238,4 triệu tấn, chiếm 28,8% tổng sản lƣợng ngơ tồn giới Năm 2010 Châu Mỹ đạt 447,9 triệu tấn, chiếm 53,0% tổng sản lƣợng ngô toàn giới, khu vực Châu Á đạt 246,1 triệu tấn, chiếm 29,1% tổng sản lƣợng ngơ tồn giới Nhƣ vậy, giai đoạn từ năm 2008 đến năm 2010 diện tích trồng ngơ tồn giới tăng không đáng kể, nhƣng áp dụng thành tựu Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn khoa học kỹ thuật tiên tiến, đặc biệt việc mở rộng diện tích trồng ngô lai nên suất sản lƣợng ngô giới có nhảy vọt, nƣớc có kinh tế phát triển có điều kiện thâm canh cao sử dụng 100% giống ngô lai sản xuất Bên cạnh đó, việc ứng dụng cơng nghệ sinh học tạo giống ngô chuyển gen có suất cao, có khả chống chịu sâu bệnh góp phần đƣa sản lƣợng ngơ giới tăng cao Tình hình sản xuất ngơ nƣớc giới có khác [58] Bảng 1.2 Tình hình sản xuất ngơ số quốc gia giới năm 2010 Diện tích Năng suất Sản lượng (Triệu ha) (Tạ/ ha) (Triệu tấn) Argentina 2,90 78,12 22,68 Mỹ 32,96 95,92 316,17 Brazin 12,81 43,75 56,06 Trung Quốc 32,52 54,60 177,54 Ấn Độ 7,18 19,60 14,10 Tên nước (Nguồn FAOSTAT, 2011) Trên giới, Mỹ nƣớc có diện tích, suất, sản lƣợng ngơ lớn đạt 32,96 triệu ha, với tổng sản lƣợng đạt 316,17 triệu tấn, suất bình quân đạt 95,92 tạ/ha Kết có đƣợc, trƣớc hết nhờ đầu tƣ cho nghành nông nghiệp, không ngừng cải thiện kỹ thuật canh tác, đồng thời ứng dụng công nghệ sinh học vào việc chọn tạo giống góp phần đƣa suất sản lƣợng ngô nƣớc cao nƣớc khác Các giống trồng chuyển gen đƣợc tạo nhờ công nghệ sinh học đƣợc trồng phổ biến, đem lại lợi nhuận nông nghiệp cao, nƣớc Mỹ tập trung vào mũi nhọn bơng, đậu tƣơng ngơ Có thể nói Mỹ Trung Quốc hai nƣớc có diện tích trồng ngơ lớn cao gấp nhiều lần so với quốc gia khác Mỹ Trung Quốc, với Ấn Độ nƣớc xuất ngơ lớn, nƣớc nhập ngơ Nhật Bản, Nam Triều Tiên, Malaysia, Mexico, châu Phi…[9] Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận Khả chịu hạn giống ngơ có khác nhau, giống C919 giống chịu hạn tốt nhất, giống LVN885 giống chịu hạn Giống C919 có hoạt tính α – amylase cao (18 mm), giống LVN885 có hoạt tính α – amylase yếu (11 mm) Giống C919 có hoạt tính protease mạnh (17 mm), giống LVN885 có hoạt tính protease yếu (12mm) Chiều dài rễ giai đoạn non sau ngày gây hạn có kích thƣớc dao động từ 18,73 cm (LVN885) – 30,80 cm (C919) Có liên quan khả chịu hạn với enzyme α – amylase, protease chiều dài rễ Đã khuếch đại, chọn dòng tách plasmid mang gen Cystatin giống ngô chịu hạn tốt (C919) giống ngô chịu hạn (LVN885) Đã xác định trình tự gen cystatin giống ngơ: LVN885 giống chịu hạn Đề nghị Tiếp tục xác định thêm trình tự gen cystatin giống ngơ khác để có sở so sánh xác định xác thị phân tử liên quan tới tính chống chịu Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 51 http://www.lrc-tnu.edu.vn TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Lê Trần Bình, Lê Thị Muội (1998), Phân lập gen chọn dòng chống chịu ngoại cảnh bất lợi lúa, NXB Đại học Quốc Gia Hà Nội Phạm Thị Trân Châu, Nguyễn Thị Hiền, Phùng Gia Tƣờng (1998), Thực hành hóa sinh học, NXB Giáo Dục Nguyễn Lân Dũng, Phạm Thị Trân Châu, Nguyễn Thanh Hiền, Lê Đình Lƣơng, Đồn Xuân Mƣợi, Phạm Văn Ty (1978), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, tập 3, NXB Khoa Học Kỹ Thuật, Hà Nội Trƣơng Đích (2000), Kỹ thuật trồng ngô suất cao, NXB Nông nghiệp Hà Nội Nguyễn Xuân Hiển (1972), Một số kết nghiên cứu ngô, NXB Khoa Học Kỹ Thuật, Hà Nội Trần Thị Phƣơng Liên (2005), “Phân lập gen dehydrin ngơ”, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học,3(3), tr: 347-352 Trần Thị Phƣơng Liên (2010), Protein tính chống chịu thực vật, NXB Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Hà Nội Nguyễn Đức Lƣơng, Dƣơng Văn Sơn, Lƣơng Văn Hinh (2000), Giáo trình ngơ, NXB Nơng ngiệp, tr:14-32 Lê Đình Lƣơng, Dƣơng Văn Sơn, Lƣơng Văn Hinh (2002), Giáo trình lương thực (dành cho sinh viên cao học), NXB Nông nghiệp 10 Chu Văn Mẫn, Ứng dụng tin sinh học (2003), NXB Đại học Quốc Gia Hà Nội, tr: 53-163 11 Chu Hồng Mậu, Ngơ Việt Anh (2005), “Đánh giá chất lƣợng hạt khả phản ứng hạn số giống ngô miền núi”, Tạp chí Nơng nghiệp Phát triển Nơng thơn 66, tr: 20-22 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 52 http://www.lrc-tnu.edu.vn 12 Chu Hoàng Mậu, Nguyễn Thị Thúy Hƣờng, Nguyễn Vũ Thanh Thanh, Chu Hoàng Hà (2011), Gen đặc tính chịu hạn đậu tương, NXB Đại học Quốc Gia Hà Nội 13 Nguyễn Văn Mùi (2002), Xác định hoạt độ enzyme, NXB Khoa Học Kỹ Thuật, Hà Nội 14 Phạm Thị Thanh Nhàn (2007), Nghiên cứu đặc tính chịu hạn môi trường nuôi cấy in vitro số giống ngô địa phương miền núi, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trƣờng Đại học Sƣ phạm, Đại học Thái Nguyên 15 Vũ Thị Thu Thủy (2011), Tạo dòng chịu hạn phân lập gen Cystatin liên quan đến tính chịu hạn lạc, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Trƣờng Đại học Sƣ phạm, Đại học Thái Nguyên 16 Nguyễn Thị Thu Trang (2008), Đánh giá chất lượng hạt, khả chịu hạn phân lập gen Cystatin số giống đậu xanh, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trƣờng Đại học Sƣ phạm, Đại học Thái nguyên 17 Dƣơng Văn Sơn (1996), Nghiên cứu số vật liệu ngô chịu hạn nhập nội sử dụng sông tác chọn tạo giống, Luận án PTS Khoa học Nông nghiệp 18 Phan Thị Vân, Ngơ Hữu Tình, Ln Thị Đẹp (2005), “Đánh giá nhanh khả chịu hạn dịng tổ hợp ngơ lai ln giao giai đoạn phƣơng pháp gây hạn nhân tạo”, Tạp chí Nơng nghiệp phát triển nơng thơn 2/2005 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 53 http://www.lrc-tnu.edu.vn TÀI LIỆU TIẾNG ANH 19 Abe K., Emori Y., Kondo H.,Susuki K., Aria S., (1987) “Molecular cloning of a cystein proteinase inhibitor of rice (Oryzacystatin) Homology with animal cystatin and transient expression in the ripening process of rice seeds”, J Biol Chem, 262(35), pp: 16793-16797 20 Abe M., Arai S., (1991), "Some propeties of a cystein proteinase inhibitor from corn endosperm", Agricultural and biological chemistry, 55(9), pp: 2417-2418 21 Abrahanson M., Ritonja A., Brown M.A., Grabb A., Machleibt W., Barrett A.J., (1987), "Identification of the probable inhibitory reactive sites of the cysteine proteinase inhibitors, Human cystatin c and chicken cystatin", J Biol, Chem, 262, pp: 9688-9494 22 Barrett A.J., (1986), “The Cystatins: a diverse superfamily of cystein peptidase inhibitor”, Biomed Biochim Acta, 45, pp: 1363-1374 23 Barrett AJ, Fritz H, Grubb A, Isemura S, Jarvinen M, Katunuma N, Machleidt W, Muller-Esterl W, Sasaki M, Turk V, (1986), "Nomenclature and classification of the proteins homologous with the cystein–proteinase inhibitor chicken cystein", Biochem J, 1, pp: 236312 24 Bray Elizabeth A., (1993), “Molecular responses to water deficit”, Plant Physiol 103, pp: 1035-1040 25 Chou W.M., Shigaki J., Dammann C., Liu J.Q., Bhattachamy M.K., (2004), "Inhibition of pathogenesis-related genes in soybean plant biology", 6, pp: 664-672 26 Close T.J, (1989), “Zea mays mRNA for dehydrin (dhn1 gene)”, Plant Mol Biol, 13(1), pp: 95-108 27 Diop N.N., Kidric., Repellin A., Gareil M., d'Acry-Lameta A., Pham Thi A.T., Zuil- Fodil Y., (2004), “A mulicystatin is induced by drough- Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 54 http://www.lrc-tnu.edu.vn stress in cowpea (Vigna unguiculata (L) Walp.) leaves”, FEBS Lett 577(3), pp: 50-545 28 Gawel N.J., Jarret R.L., (1991), “A wodified CTAB DNA extraction procedure of Musa and Ipomoea”, Plant Mol Biol Rep, 9, pp: 262 – 266 29 Grudkowska M., Zagdanska B, (2004), “Multifunctional role of plant cysteine proteinases, Acta Biochim Polonica, 51(3), pp: 609 - 624 30 Hatano K, Kojima M, Tanokura M, Takahashi K, (1996), "Solution structure of bromelain inhibitor IV from pineapple stem: structural similarity with Bowman-Birk trypsin/chymotrypsin inhibitor from soybean", Biochemistry, 35(17), pp: 5379-5384 31 Fernandes K.V.S, Paolo A., Sabelli P.A., Barratt D.H.P., Richardson., Xavier-Filho J., Shewry P.R, (1993), "The resistance of cowpea seeds to bruchid beetle is not related to levels of cystein protease inhibitors", Plant molercular biology, 23(1), pp: 215-219 32 Kader J.C., (1996), “Lipid-transfer proteins in plant”, Annu Rev Plant Phys , 47 33 Karen S and John M., (1990), “Gene expression in respone to abscisic acid and osmotic stress”, Plant cell, 34 Liu K.H., Lin T.Y., (2003), “Cloning and characterization of two novel lipid transfer protein I genes in Vigna radiate, DNA sequence”, J Seq Map, 14(6) 35 Machleidt W., Thiele U., Laber B., Arsfald, Machleidt I., Ester L., Wiegand G., Kos J., Turk V., Bode W., ( 1989), "Mechanism of inhibition of papain by chicken egg white cystatin: Inhibition constants of N-terminally truncated forms and cyano gen bromid fragments of the inhibitor.", Bio Chem, 243(2), pp: 234-238 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 55 http://www.lrc-tnu.edu.vn 36 Martinez M., Abraham Z., Carbonero P., Diaz I., (2005), "Comparative phylogenetic analysis of cystatin gen families from arabidopsis, rice and barley", Mol genet genomic, 273(5), pp: 423-432 37 Misaka T., Kuroda M.,Iwabuchi K., Abe K., Arai S., (1996), "Soyacystatin, A novel cystein proteinase inhibitor in soybean, is distinct in protein structure and gene organization from other cystatins of animal and plant origin", European Journal of biochemistry, 240, pp: 609 38 Monia A., Diaz I., Vasil I.K., Carbonero P., Garcia O.F, (1996)," Two cold-inducible genes encoding lipid transfer protein LTP from barley show differential responses to bacterial pathogens", Molercular and general genetics, 252, pp: 163-168 39 Massonneau A., Condamine P., (2005), Wisniewski J P., Zivy M., Rogowsky P M., “Maize cystatins respond to developmental cues, cold stress and drought”, Biochim Biophys Acta, 1729 (3) pp: 99-186 40 Oliveira A.S., Filho J.X., Sales M.P., (2003) “Cysteine proteinases and cystatins”, Braz Arch Biol Techn, 46(1) pp: 91-104 41 Ojima A., Shiota H., Higashi K., Shimma Y., Wada M.,Satoh S., (1997), "An extracularin soluble inhibitor of cysteine proteinase in cell cultrures and seed carrot", Plant molecular biology, 34, pp: 99-109 42 Rawlings N.D, Barrett A.J., (1994), "Families of cysteine peptidases", Methods enzymol, 244, pp: 461-486 43 Ryan S.N., Mc Manus M.J., Laiing W.A, (2003), "Indentification and characterisation of proteinase inhibitor and their gen from seeds of apple (malus domestica)", Japanese Biochemical Society, 134(1), pp: 31-42 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 56 http://www.lrc-tnu.edu.vn 44.Turk B., Turk V., Turk D., (1997), "Structural and functional aspects of papain-like cysteine proteinase and their protein inhibitor", Biol Chem Hopp seyler, 378, pp: 141-150 45.Trysellius Y., Huttmark D., (1997), "Cysteine proteinase 1, a chatepsin L-like enzyme expressed in the Drosophila melanogaster haemocyte cell line mbn-2", Insect molecular Biol, 6(2), pp: 173-181 46 Xiong L., Karen S.S.,Zhu J.K, (2001)," Cell signaling during cold, drought, and salt stress", The plant cell, pp: 165-183 47 Valdes R S., Guerrero R A., Melgoza V C., Chagolla L A., Delgado V.F., Martinez G N., Sanchez H N., Delano F J., (2007), “Cloning of a cDNA encoding a cystatin from grain amaranth (Amaranthus hypochondriacus) showing a tissue-specific expression that is modified by germination and abiotic stress”, Plant Physiology and Biochemistry 45(10-11), pp: 8-790 48.Wangxia W , Basia V., Oded S., Arie A., (2004), "Role of plant heat shock protein and molecular chaperon in the abiotic stress responds", Plant science, 9(5), pp: 244-252 49.Walsh J.A., Strick land J.A., (1993), "Proteolysis of the 85-kilodalton crystaltine cysteine proteinase inhibitor from potato release funtional cystatin domains", Plant physiol, 103(4), pp: 1227-1234 50.Waldron C., Wegrich L.M., Merlo P.A.O, Walsh J.A., (1993), "Characterization of a genemic sequence coding for potato multicystatin, An eight-domain cystein proteinase inhibitor", plant molecular biology 23(4), pp: 801-812 51.YamamotoY., Takimoto K., Izumi S., Tonyamasakurai M., Kageyama T., Takahash S.Y., (1994), "Molecular cloning and sequencing of Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 57 http://www.lrc-tnu.edu.vn cDNA that encodes cysteine proteinase in the egg of silkmoth, bombysmory", T Biochem, 116, pp: 1330-1335 52 Yang W., Jifeng Y., Minika K., Maryse C., Angela S., Charlene M., Tina U., Carlene S., Jiangxin W., David T.D., Peter M., Yafan H, (2005)," Molecular tailoring of faresy lation for plant drought tolerance and ield protection", The plant journal, 43, pp: 413-424 53.Yin L., Lan Y., Zhu L., 2008, "Analysis of the protein expression profiling during rice callus differentiation under different plant hormone conditions", Plant mol biol, 68(6), pp: 597-617 54 Zhang X., Liu S., Takano T., (2008), “Two cysteine proteinase inhibitors from Arabidopsis thaliana, AtCYSa and AtCYSb, increasing the salt, drought, oxidation and cold tolerance”, Plant Mol Biol, 68(1-2) , pp: 43-131 MỘT SỐ TRANG WEB 55 http: //www.ncbi.nlm.nih.gov./sites/nuccore/AF454396 56 http: //www.ncbi.nlm.nih.gov./sites/nuccore/D63342 57 http: //www.ncbi.nlm.nih.gov./sites/nuccore/D64115 58 http: //www.faostat.fao.org Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 58 http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Vũ Thanh Thanh người tận tình hướng dẫn tạo điều điện giúp đỡ tơi hồn thành cơng trình nghiên cứu Tơi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Trường Đại học Khoa họcĐại học Thái Nguyên, Viện Khoa học Sự sống- Đại học Thái Nguyên, Ban chủ nhiệm Khoa Khoa học Sự sống, thầy cô giáo cán Khoa ủng hộ, tạo điều kiện tốt để tơi hồn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn TS Lê Văn Sơn, KS Hồ Mạnh Tường cán Viện Công nghệ Sinh học tạo điều kiện giúp đỡ để tơi hồn thành luận văn Lời cảm ơn sau tơi xin gửi tới gia đình, người thân, bạn bè động viên, giúp đỡ tạo điều kiện cho tơi suốt q trình học tập, nghiên cứu hoàn thành luận văn Thái Nguyên, ngày 30 tháng năm 2012 Tác giả luận văn Nguyễn Phương Thảo i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận văn cơng trình nghiên cứu dƣới hƣớng dẫn TS Nguyễn Vũ Thanh Thanh, giúp đỡ cán Khoa Khoa học Sự Sống - Đại học Khoa học, Viện Khoa học Sự Sống - Đại học Thái Nguyên, Viện Công nghệ Sinh học Các số liệu nêu luận văn trung thực chƣa đƣợc công bố cơng trình khác Tơi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm số liệu luận văn Thái Nguyên, ngày 30 tháng năm 2012 Tác giả Nguyễn Phƣơng Thảo ii MỤC LỤC Lời mở đầu i Lời cam đoan ii Mục lục iii Danh mục ký hiệu, chữ viết tắt v Danh mục hình luận văn vi Danh mục bảng luận văn vii MỞ ĐẦU 1 ĐẶT VẤN ĐỀ MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU NỘI DUNG NGHIÊN CỨU CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 CÂY NGÔ 1.1.1 Nguồn gốc phân loại 1.1.2 Đặc điểm sinh học .3 1.1.3 Giá trị kinh tế ngô 1.1.4 Đặc điểm hóa sinh hạt ngơ 1.1.5 Tình hình sản xuất ngô giới Việt Nam 1.2 ĐẶC TÍNH CHỊU HẠN CỦA CÂY NGÔ 11 1.2.1 Hạn ảnh hƣởng hạn tới trồng 11 1.2.2 Tình hình nghiên cứu đặc tính chịu hạn ngơ 13 1.2.3 Cơ sở sinh lý, hóa sinh di truyền tính chịu hạn ngô .13 CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .25 2.1 VẬT LIỆU 25 2.2 HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ .26 2.2.1 Hóa chất 26 2.2.2 Thiết bị 26 2.3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 2.3.1 Phƣơng pháp sinh lí, hóa sinh 27 iii 2.3.2 Phƣơng pháp sinh học phân tử 29 2.3.3 Phương pháp xác định trình tự nucleotide 33 2.3.4 Phương pháp xử lí trình tự gen 33 2.3.5 Phƣơng pháp xử lý kết tính tốn số liệu 35 2.4 ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU .35 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36 3.1 KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHỊU HẠN CỦA CÁC GIỐNG NGÔ NGHIÊN CỨU Ở GIAI ĐOẠN CÂY NON .36 3.2 KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ HOẠT ĐỘ ENZYM α- AMYLASE, PROTEASE, CHIỀU DÀI RỄ CỦA CÁC GIỐNG NGÔ 38 3.2.1 Hoạt độ α - amylase 38 3.2.2 Hoạt độ protease 40 3.2.3 Chiều dài rễ giống ngô giai đoạn câynon 41 3.3 KẾT QUẢ PHÂN LẬP GEN CYSTATIN 43 3.3.1 Kết tách chiết DNA tổng số .43 3.4.2 Kết nhân gen cystatin .44 3.4.3 Kết tinh sản phẩm PCR 45 3.4.4 Kết tách dòng gen cystatin .46 3.4.5 Kết chọn lọc plasmid tái tổ hợp colony-PCR 47 3.4.6 Kết tách plasmid tái tổ hợp .48 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .51 TÀI LIỆU THAM KHẢO 52 TÓM TẮT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU vii TÓM TẮT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU vii iv DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ABA bp cDNA absicis acid base pair (cặp bazo) complementary DNA CPH CKH CTAB phục hồi không héo cetyltrimethylammonium bromide CYS cystatin đtg DNA EDTA đồng tác giả Deoxyribose nucleic acid Ethylene diamine tetraacetic acid HSP IPTG kb kDa Heat shock protein (Protein sốc nhiệt) Isopropyl  - D - 1thiogalactopyranoside kilo base kilo dalton KL LB LEA Khối lƣợng Luria - Bertani Late embryogenesis abudant (Protein đƣợc tạo thành giai đoạn cuối phôi) Lipid Transfer Protein (Protein vận chuyển lipid) LTP mRNA Messenger ribonucleic acid ( ARN thông tin ) OD PCR Optical density Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi Polymerase) P5CS TAE Pyrroline - 5- carboxylate synthetase Tris acetate EDTA X-gal 5-Bromo - cloro - indolyl D galactopyranoside v DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG LUẬN VĂN Bảng 1.1 1.2 1.3 Tên bảng Trang Tình hình sản xuất ngô số khu vực giới giai đoạn 2008 - 2010 Tình hình sản xuất ngô số quốc gia giới năm 2010 Diện tích, suất, sản lƣợng ngơ Việt Nam từ 2006 - 2010 10 2.1 Đặc điểm 10 giống ngô nghiên cứu 25 2.2 Cặp mồi nhân gen cystatin 31 2.3 Thành phần phản ứng nhân gen cystatin 31 2.4 Thành phần phản ứng gắn gen vào vector 33 3.1 3.2 Khả chịu hạn giai đoạn non 10 giống ngô Hoạt độ enzyme α – amylase 10 giống ngô nghiên cứu 36 39 3.3 Hoạt độ protease 10 giống ngô nghiên cứu 40 3.4 Chiều dài rễ 10 giống ngô nghiên cứu 42 3.5 Phổ hấp thụ DNA bƣớc sóng 260 nm 280 nm 10 giống ngơ nghiên cứu vi 44 DANH MỤC CÁC HÌNH TRONG LUẬN VĂN Hình 2.1 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 Tên hình Hình ảnh hạt 10 giống ngơ nghiên cứu Đồ thị hình rada biểu diễn khả chịu hạn 10 giống ngơ nghiên cứu Hình ảnh 10 giống ngô nghiên cứu sau ngày gây hạn Hoạt độ enzyme   amylase 10 giống ngô nghiên cứu Hoạt độ protease 10 giống ngơ nghiên cứu Hình ảnh điện di DNA tổng số 10 giống ngô nghiên cứu Trang 26 37 38 39 41 43 3.6 Hình ảnh điện di kết PCR nhân gen cystatin 45 3.7 Hình ảnh điện di sản phẩm thơi gel 46 3.8 Hình ảnh khuẩn lạc 47 3.9 Hình ảnh điện di sản phẩm conoly – PCR 47 3.10 Hình ảnh điện di tách plasmid tái tổ hợp 48 So sánh trình tự nucleotide gen cystatin LVN885 3.11 49 với D38130 So sánh trình tự amino acid giống ngô LVN885 với 3.12 50 D38130 vii