Đánh giá khả năng chịu hạn và nhân gen p5cs của một số giống đậu tương địa phương của tỉnh cao bằng

đại học tháI nguyên Tr-ờng đại học s- phạm    Hà tiến sỹ ĐáNH GIá KHả NĂNG CHịU HạN Và NHÂN GEN P5CS CủA MộT Số GiốNG ĐậU TƯƠNG ĐịA PHƯƠNG CủA TỉNH CAO BằNG Chuyên ngành : Di truyền học MÃ số : 60.42.70 Luận văn thạc sỹ sinh học Ng-êi h-íng dÉn khoa học : pgs.ts.Chu hoàng Mậu TháI nguyên - 2007 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Tai ngay!!! Ban co the xoa dong chu nay!!! http://www.lrc-tnu.edu.vn đại học tháI nguyên Tr-ờng đại học s- ph¹m    Hà Tiến S ĐáNH GIá KHả NĂNG CHịU HạN Và NHÂN GEN P5CS CủA MộT Số GiốNG ĐậU TƯƠNG ĐịA PHƯƠNG CủA TØNH CAO B»NG Luận văn thạc sỹ sinh học Th¸I nguyªn - 2007 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỤC LỤC Lời cam đoan Lời cảm ơn Mục lục Những chữ viết tắt Danh mục bảng Danh mục hình MỞ ĐẦU Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 10 1.1 CÂY ĐẬU TƢƠNG 10 1.1.1 Đặc điểm thực vật học 10 1.1.2 Tình hình sản xuất đậu tương giới Việt Nam 11 1.1.3 Thành phần hoá sinh hạt đậu tương 12 1.1.3.1 Protein dự trữ thành phần axit amin 13 1.1.3.2 Lipit, vitamin số chất khác 13 1.2 ĐẶC TÍNH CHIỤ HẠN VÀ NGHIÊN CỨU TÍNH CHỊU HẠN Ở CÂY ĐẬU TƢƠNG 14 1.2.1 Ảnh hưởng hạn trồng 14 1.2.2 Đặc tính chịu hạn nghiên cứu khả chịu hạn đậu tương 15 1.2.3 Cơ sở sinh lý, sinh hố sinh học phân tử tính chịu hạn 17 1.3 GEN LIÊN QUAN ĐẾN SỰ TỔNG HỢP PROLINE 21 Chƣơng NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 25 2.1 NGUYÊN LIỆU 25 2.2 HOÁ CHẤT THIẾT BỊ VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 25 2.3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.3.1 Nhóm phương pháp sinh lý, hố sinh 26 2.3.2 Các phương pháp sinh học phân tử 31 2.3.3 Phương pháp xử lý kết tính tốn số liệu 33 Chƣơng KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 34 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 3.1 ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, KHỐI LƢỢNG VÀ THÀNH PHẦN HOÁ SINH HẠT CỦA CÁC GIỐNG ĐẬU TƢƠNG NGHIÊN CỨU 34 3.1.1 Đặc điểm hình thái khối lượng 1000 hạt 34 3.1.2 Hàm lượng lipit protein hạt 35 3.1.3 Kết phân tích hàm lượng axit amin liên kết hạt 37 3.1.4 Nhận xét đặc điểm hoá sinh giống đậu tương 40 3.2 KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHỊU HẠN CỦA CÁC GIỐNG ĐẬU TƢƠNG NGHIÊN CỨU 41 3.2.1 Ảnh hưởng hạn sinh lý đến hoạt độ  - amylase hàm lượng đường giai đoạn hạt nảy mầm 41 3.2.2 Đặc điểm phản ứng đậu tương non hạn 47 3.2.2.1 Tỷ lệ thiệt hại giống đậu tương giai đoạn non tác động hạn 47 3.2.2.2.Khả chịu hạn giống đậu tương giai đoạn non 48 3.2.2.3 Hàm lượng protein proline giống đậu tương giai đoạn non 51 3.2.3 Mối quan hệ giống đậu tương dựa biểu tính trạng hạn 53 3.2.4 Nhận xét khả chịu hạn giống đậu tương 55 3.3 KẾT QUẢ NHÂN ĐOẠN ADN THUỘC GEN P5CS CỦA CÁC GIỐNG ĐẬU TƢƠNG NGHIÊN CỨU 56 3.3.1.Tách chiết ADN tổng số giống đậu tương 56 3.3.2 Nhân đoạn ADN thuộc gen P5CS giống đậu tương 58 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 60 CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN 61 TÀI LIỆU THAM KHẢO 62 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT ABA : Axit abscisic (Abscisis acid) ADN: Axit deoxyribonucleic ARN : Axit ribonucleic ASTT: Áp suất thẩm thấu ATP : Adenosin triphosphat ATP – ase : Enzym phân giải ATP AtproT1 : Arabidopsis proline transporter AtproT2 : Arabidopsis proline transporter Bp : Cặp bazơ cADN : Sợi ADN bổ sung tổng hợp từ mARN nhờ enzyme phiên mã ngược dNTP : Deoxynucleotide EDTA : Ethylendiamin tetraacetic acid HSP : Heat shock protein - Protein sốc nhiệt Kb : Kilo bazơ = 1000 bp KTPT : Kích thước phân tử LEA : Late embryogenesis abundant LeproT1 : The proline transporter LeproT2 : The proline transporter LeproT3 : The proline transporter MGPT : Môi giới phân tử - Molecular chaperone MW : Molecular weight - Khối lượng phân tử NaOAC : Natriacetat P5C : Deltal - pyrroline - 5- carboxylate P5CS : Delta pyrroline - - Carborxylate Synthetase P5CR : Deltal pyrroline – 5- Carboxylate reductase PCR : Polymerase chain reaction - Phản ứng chuỗi polimerase TBE : Tris - Boric acid - EDTA Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1 Sản lượng đậu tương Thế giới niên vụ 2006 – 2007 12 Bảng 2.1 Nguồn gốc giống đậu tương 25 Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR 33 Bảng 3.1 Hình dạng, kích thước, màu sắc, khối lượng 1000 hạt giống đậu tương nghiên cứu .34 Bảng 3.2 Hàm lượng protein lipit giống đậu tương 36 Bảng 3.3 Hàm lượng axit amin hạt giống đậu tương 38 Bảng 3.4 Thành phần hàm lượng axit amin protein hạt giống đậu tương (g axit amin/100g protein 39 Bảng 3.5 Hàm lượng axit amin không thay hạt 40 giốngđậu tương (g axit amin/100g protein 42 Bảng 3.6 Hoạt độ  - amylase giai đoạn hạt nảy mầm xử lý sorbitol 7% (ĐVHĐ/mg hạt nảy mầm) 42 Bảng 3.7 Hàm lượng đường tan giống nghiên cứu giai đoạn mầm 44 Bảng 3.8 Tương quan hoạt độ  - amylase hàm lượng đường tan giai đoạn hạt nảy mầm…………………………………………… 46 Bảng 3.9 Tỷ lệ thiệt hại giống đậu tương giai đoạn non 47 Bảng 3.10 Bảng tổng hợp tiêu đánh giá khả chịu hạn 50 Bảng 3.11 Hàm lượng protein proline đậu tương .52 Bảng 3.12 Hệ số khác giống đậu tương 54 Bảng 3.13 Hàm lượng độ tinh ADN tổng số giống đậu tương .57 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1 Sơ đồ mơ tả trình biến đổi proline tế bào .22 Hình 3.1 Hạt giống đậu tương nghiên cứu .35 Hình 3.2 Biểu đồ so sánh hàm lượng axit amin không thay giống đậu tương nghiên cứu với tiêu chuẩn FAO .40 Hình 3.3 Sự biến động hoạt độ α - amylase giai đoạn hạt nảy mầm xử lý sorbitol 7% giống đậu tương 42 Hình 3.4 Hoạt độ  - amylase giống đậu tương giai đoạn hạt nảy mầm 43 Hình 3.5 Hàm lượng đường tan giai đoạn hạt nảy mầm xử lý sorbitol 7% giống đậu tương .45 Hình 3.6 Tỷ lệ thiệt hại giống đậu tương 48 Hình 3.7 Ảnh đậu tương non sau ngày hạn .48 Hình 3.8 Chiều dài rễ giống đậu tương sau ngày hạn 49 Hình 3.9 Đồ thị thể khả chịu hạn giống đậu tương 51 Hình 3.10 Biểu đồ so sánh biến động hàm lượng protein trước sau hạn 53 Hình 3.11 Biểu đồ so sánh biến động hàm lượng proline trước sau hạn 53 Hình 3.12 Sơ đồ quan hệ giống đậu tương dựa biểu tính trạng hạn 55 Hình 3.13 Hình ảnh điện di ADN tổng số giống đậu tương 57 Hình 3.14 Hình ảnh điện di đoạn gen P5CS (1,8kb) nhân lên kỹ thuật PCR giống đậu tương 58 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỞ ĐẦU LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI Đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) loại thuộc họ đậu, có hàm lượng chất dinh dưỡng cao, đặc biệt giàu protein, nên đậu tương trồng để làm thức ăn cho người gia súc Sản phẩm từ đậu tương sử dụng đa dạng dùng trực tiếp hạt thô chế biến thành đậu phụ, ép thành dầu đậu nành, sữa đậu nành, làm bánh kẹo, nước giải khát, nước chấm…đáp ứng nhu cầu đạm phần ăn hàng ngày người gia súc [10] Cây đậu tương có thời gian sinh trưởng ngắn, hệ rễ có nốt sần mang vi khuẩn cố định đạm, nên trồng đậu tương cịn có tác dụng cải tạo đất, tăng suất trồng khác, đậu tương thường trồng luân canh với lúa ngô để tăng vụ cải tạo đất bạc màu Ở Việt Nam đậu tương có vị trí quan trọng sản xuất nơng nghiệp, đặc biệt vùng nông thôn nghèo, kinh tế chưa phát triển Hiện đậu tương gieo trồng 43 số 61 tỉnh thuộc vùng nông nghiệp nước [10] Các giống đậu tương nước ta đa dạng phong phú gồm giống đậu tương nhập nội, giống lai tạo giống đậu tương đột biến tập đoàn giống đậu tương địa phương Trong năm gần với việc tạo giống đậu tương cho suất cao, nhà chọn giống đậu tương quan tâm nghiên cứu giống đậu tương địa phương, giống thường có suất thấp chất lượng hạt cao có khả chống chịu tốt với điều kiện ngoại cảnh bất lợi nóng, lạnh, hạn… [10] Địa bàn nước ta chủ yếu đồi núi, diễn biến khí hậu phức tạp, lượng mưa phân bố không vùng miền thời kỳ năm, hạn hán thường xuyên xảy với yếu tố môi trường bất lợi khác làm giảm suất, chất lượng khả chống chịu thực vật nói chung đậu tương nói riêng Đậu tương tương đối mẫn cảm với điều kiện ngoại cảnh thuộc vào nhóm chịu hạn Cho đến nay, nước ta có số cơng trình nghiên cứu đặc tính chịu hạn đậu tương [6], [5] Tiêu biểu số nghiên cứu tìm hiểu sở phân tử đặc tính số nhóm protein chịu nhiệt LEA, Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn HSP, axit amin proline enzyme hạt số giống đậu tương chịu hạn khác protein dự trữ protease, amylase [7], [8], [9], [11], [12] Proline axit amin có vai trị quan trọng q trình điều hồ áp suất thẩm thấu tế bào, đồng thời cịn axit amin ưa nước có khả giữ lấy nước cho tế bào Sự tổng hợp proline tế bào có liên quan đến gen detal – pyrroline – – carboxylate synthetase (P5CS) Trên giới gen P5CS nghiên cứu số đối tượng Lúa, Thuốc lá, Arabidopsis thaliana, Ngô, Đậu tương [20], [28], [31], [35] Tuy nhiên Việt Nam việc nghiên cứu gen P5CS vấn đề mẻ Xuất phát từ lý tiến hành đề tài luận văn thạc sĩ là: "Đánh giá khả chịu hạn nhân gen P5CS số giống đậu tƣơng địa phƣơng tỉnh Cao Bằng" MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU - So sánh khả chịu hạn phân tích sở hố sinh tính chịu hạn số giống đậu tương địa phương tỉnh Cao Bằng - Phân lập gen P5CS giống đậu tương địa phương tỉnh Cao Bằng NỘI DUNG NGHIÊN CỨU - Phân tích đặc điểm hình thái hạt (màu sắc, hình dạng, kích thước hạt) khối lượng 1000 hạt giống đậu tương nghiên cứu -Xác định hàm lượng protein, lipit thành phần axit amin giống đậu tương nghiên cứu - Xác định hoạt độ - amylase hàm lượng đường tan giai đoạn hạt nảy mầm - Phân tích số tiêu sinh lý, hoá sinh đậu tương non điều kiện hạn nhân tạo - Xác định mối quan hệ giống đậu tương dựa phản ứng kiểu gen trước tác động hạn - Nhân đoạn ADN thuộc gen P5CS giống đậu tương kỹ thuật PCR Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn gây hạn, hạn ngày hạn ngày Kết phân tích hàm lượng protein prolin giống đậu tương trình bày bảng 3.11 Bảng 3.11 Hàm lượng protein proline giống đậu tương giai đoạn non Hàm lượng protein (% KL tươi) Giống Trước hạn Hạn ngày Hạn ngày Hàm lượng proline (mM/g KL tươi) Trước hạn Hạn ngày Hạn ngày CB4 9,45 ± 0,154 8,18 ± 0,609 6,15 ± 0,042 1,79 ± 0,052 4,12 ± 0,055 5,67 ± 0,026 HL 8,17 ± 0,051 7,12 ± 0,004 6,20 ± 0,137 1,85 ± 0,051 3,24 ± 0,072 4,78 ± 0,111 QH 9,50 ± 0,104 8,85 ± 0,009 7,14 ± 0,050 2,03 ± 0,056 4,77 ± 0,186 6,12 ± 0,049 VCB 9,21 ± 0,070 8,09 ± 0,008 7,18 ± 0,072 2,3 ± 0,031 4,03 ± 0,049 5,12 ± 0,096 2,69 ± 0,065 4,67 ± 0,021 5,86 ± 0,102 TL 10,03 ± 0,110 8,56 ± 0,005 7,25 ± 0,038 ĐK 10,13 ± 0,127 8,96 ± 0,005 7,64 ± 0,067 2,34 ± 0,115 4,89 ± 0,079 6,17 ± 0,083 DT84 8,12 ± 0,117 7,05 ± 0,011 7,85 ± 0,242 1,90 ± 0,042 3,15 ± 0,359 4,32 ± 0,206 Bảng 3.11 cho thấy hàm lượng protein đậu tương non tất giống bị hạn 5, ngày giảm so với thời điểm trước bị hạn Tuy nhiên hàm lượng proline lại có gia tăng thời gian gây hạn kéo dài gia tăng khác giống Giống ĐK có hàm lượng proline tăng cao (trước hạn 2,34mM/g hạn ngày 4,89mM/g ngày 6,17mM/g) Giống DT84 có hàm lượng proline thấp (trước hạn 1,90 mM/g hạn ngày 3,15mM/g hạn ngày 4,32mM/g ) Sự tăng cường tổng hợp proline tiêu quan trọng phản ánh khả chống chịu gặp điều kiện hạn hán, phản ứng giúp trì áp lực thẩm thấu cấu trúc thành tế bào, đảm bảo trao đổi nước sống môi trường khô hạn Ở tất giống đậu tương, bị hạn hàm lượng protein giảm hàm lượng proline tăng Sự gia tăng hàm lượng proline giảm hàm lượng protein giống đậu tương sau gây hạn chứng tỏ đậu tương có phản ứng cách tích cực trước thay đổi điều kiện môi trường Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn 52 http://www.lrc-tnu.edu.vn Hàm l-ợng protein (% KL t-ơi) 12 10 CB4 HL Truoc han QH VCB Han TL ĐK DT84 Gièng Han H.l-ỵng proline (mM/g) Hình 3.10 Biểu đồ so sánh biến động hàm lượng protein trước sau hạn CB4 HL QH VCB TL ĐK DT84 Gièng Truoc han Han Han Hình 3.11 Biểu đồ so sánh biến động hàm lượng proline trước sau hạn 3.2.3 Mối quan hệ giống đậu tƣơng dựa biểu tính trạng hạn Bằng chương trình NTSYS pc 2.02i xác định khoảng cách thiết lập mối quan hệ giống đậu tương dựa phân tích Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 53 http://www.lrc-tnu.edu.vn biểu tính trạng giống đậu tương điều kiện hạn (Bảng 3.12, Hình 3.12) Bảng 3.12 Hệ số khác giống đậu tương TL HL VCB CB4 QH DK TL 0,00 HL 1,78 0,00 VCB 3,76 5,13 0,00 CB4 2,83 1,76 2,63 0,00 QH 2,23 2,93 1,52 1,15 0,00 DK 1,74 2,61 1,05 1,23 5,06 0,00 DT84 1,14 6,85 8,18 4,19 7,18 6,52 DT84 0,00 Bảng 3.12 cho thấy hệ số khác giống đậu tương dao động từ 1,05 đến 8,18 chia làm mức khác biệt Hai giống ĐT84 VCB có khoảng cách lớn (8,18), cịn hai giống VCB ĐK có khoảng cách nhỏ (1,05) Hình 3.12 cho thấy giống đậu tương phân thành nhóm Nhóm I gồm giống TL HL; nhóm II có giống VCB, ĐK, QH; nhóm III có giống CB4; nhóm IV có giống ĐT84 Từ kết phân tích phản ứng kiểu gen giống đậu tương hạn chia giống đậu tương mức chịu hạn khác Mức chịu hạn cao gồm hai giống ĐK VCB; mức II có giống TL, HL, QH; mức III có giống CB4; mức IV có giống ĐT84 Vấn đề cịn tiếp tục nghiên cứu so sánh cấu trúc gen liên quan đến tính chịu hạn giống đậu tương nhóm chịu hạn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 54 http://www.lrc-tnu.edu.vn Hình 3.12 Sơ đồ quan hệ giống đậu tương dựa phản ứng kiểu gen trước tác động hạn 3.2.4 Nhận xét khả chịu hạn giống đậu tƣơng Hoạt độ α – amylase hàm lượng đường hạt nảy mầm tăng từ giai đoạn đến ngày tuổi bắt đầu giảm ngày tuổi Mức độ chịu tác động sorbitol giống đậu tương khác nhau, giống ĐK có hoạt độ α amylase hàm lượng đường giai đoạn hạt nảy mầm cao thấp giống DT84 Hoạt độ α - amylase hàm lượng đường có mối tương quan thuận chặt chẽ, hệ số tương quan 0,96 - 0,99 Kiểu gen giống đậu tương nghiên cứu có phản ứng khác hạn, biểu tiêu theo dõi tỷ lệ sống, khả giữ nước… số chịu hạn tương đối giống Giống ĐK có số chịu hạn cao thấp giống DT84 Khả chịu hạn đậu tương liên quan đến hàm lượng proline Khi gặp hạn đậu tương cường tổng hợp proline giảm tổng hợp protein Sự gia tăng proline có mối tương quan thuận chặt chẽ với khả chịu hạn giống đậu tương giai đoạn non Tổng hợp đánh giá khả chịu hạn giống đậu tương giai đoạn hạt nảy mầm non dựa phương diện sinh ý, hoá sinh xác định mức chịu hạn khác Hai giống ĐK VCB có khả chịu hạn cao nhất, giống ĐT84 có khả chịu Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 55 http://www.lrc-tnu.edu.vn 3.3 KẾT QUẢ NHÂN ĐOẠN ADN THUỘC GEN P5CS LIÊN QUAN ĐẾN KHẢ NĂNG TỔNG HỢP PROLINE Ở CÂY ĐẬU TƢƠNG 3.3.1 Tách chiết ADN tổng số giống đậu tƣơng Mọi nghiên cứu hệ gen việc tách chiết ADN hệ gen dạng tinh Đậu tương có hàm lượng protein ARN cao, nghiên cứu tách chiết để thu nhận dung dịch ADN tinh gặp khó khăn so với đối tượng khác Chúng sử dụng mầm ngày tuổi giống đậu tương để tách chiết ADN tổng số bao gồm giống: Cao Bằng 4, Hạ Lang – Cao Bằng, Quảng Hoà – Cao Bằng, Vàng - Cao Bằng, Trà Lĩnh – Cao Bằng, Đông Khê – Cao Bằng giống DT84 Mầm tách khỏi mầm, giữ -85°C sử dụng Mầm nghiền thành dạng bột mịn nitơ lỏng hoà tan dung dịch đệm chiết có chứa Tris HCL 1M, pH 8,0; EDTA 0,5M pH 8,0; NaCL 6M, CTAB 4% CTAB đệm chiết làm màng tế bào bị phá vỡ hoàn toàn tạo điều kiện cho ADN thành phần nội bào giải phóng ngồi Dung dịch đệm chiết có pH kiềm (pH 8) làm ADN dễ tan ổn định cấu trúc chất tích điện âm ADN Đồng thời, mơi trường kiềm làm giảm tương tác tĩnh điện ADN với protein kiềm histon Dung dịch muối NaCl 6M nồng độ cao loại bỏ tương tác ion ADN catrion, phân tách hoàn toàn phức hệ ADN protein Đặc biệt với đậu tương tế bào chúng chứa nhiều protein nên chúng tơi cịn loại bỏ protein tạp chất khỏi dung dịch cách sử dụng thể tích tương đương phenol: chloroform: isoamyl alcohol tỷ lệ (25: 2: 1) để ADN có đủ độ tinh Tiếp theo, dung dịch phenol:chloroform sử dụng để làm biến tính kết tủa protein hồ tan Từ 0,5g loại thu 200l dịch chiết ADN Các mẫu ADN có độ tinh kiểm tra máy quang phổ bước sóng  = 260/280 nm có đỉnh cực đại bước sóng 260nm Sau xác định nồng độ, chúng tơi kiểm tra chế phẩm ADN phương pháp điện di gel agarose 0,8% Kết cho thấy, có băng tập trung phân tử ADN, có phân tử lượng lớn (hình 3.14) Điều chứng tỏ, ADN tách chiết từ giống đậu tương tương đối sạch, khơng bị đứt gãy, tạp chất đảm bảo cho nghiên cứu Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 56 http://www.lrc-tnu.edu.vn M p  Hình 3.13 Hình ảnh điện di ADN tổng số giống đậu tương M- Thang DNA chuẩn; – CB4; - HL; - QH; - VCB; - TL; - ĐK; – DT84 Sau điện di kiểm tra mẫu ADN gel agarose, tiến hành định lượng mẫu quang phổ kế bước sóng 260nm (OD260nm) 280nm (OD280nm) Phương pháp cho phép xác định nồng độ ADN có mẫu Kết trình bày bảng 3.13 Bảng 3.13 Hàm lượng độ tinh ADN tổng số giống đậu tương STT Tên Mẫu Hàm lượng ADN (ng/l) Tỉ số OD260/ OD280 CB4 268,0 1,87 HL 241,6 1,93 QH 237,7 1,91 VCB 254,6 1,85 TL 247,3 1,94 ĐK 239,5 1,86 DT84 267,3 1,85 Kết bảng 3.13 cho thấy mẫu ADN tách có nồng độ từ 237,7 đến 268,0 ng/l tỷ lệ OD260nm/ OD280nm từ 1,85 đến 1,94 Như lần khẳng định mẫu ADN đáp ứng đủ yêu cầu nồng độ độ tinh để tiến hành thí nghiệm Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 57 http://www.lrc-tnu.edu.vn 3.3.2 Nhân đoan ADN thuộc gen P5CS từ giống đậu tƣơng Khi gặp hạn thực vật tăng cường trình tổng hợp proline Sự tổng hợp proline tế bào từ axit glutamic xúc tác hai enzyme P5CS P5CR Gen mã hoá cho enzym P5CS biểu mạnh rơi vào tình rạng thiếu nước nên nói gen P5CS nhân tố giới hạn cho nhịp độ tổng hợp proline thực vật bị hạn Trên sở xác định nồng độ khuôn tối ưu cho phản ứng PCR, tiến hành nhân gen P5CS giống đậu tương (Cao Bằng 4, Hạ Lang Cao Bằng, Quảng Hoà Cao Bằng, Vàng Cao Bằng, Trà Lĩnh Cao Bằng, Đông Khê Cao Bằng giống DT84) Sử dụng ADN hệ gen làm khuôn để nhân gen P5CS với cặp mồi Pro Soy2R Pro Soy2F thiết kế dựa trình tự nucleotit cADN thuộc gen mã hố cho P5CS đậu tương công bố ngân hàng gen quốc tế Chúng tiến hành phản ứng PCR với điều kiện khác nhận thấy phản ứng PCR xảy tối ưu điều kiện bổ sung 2,5µl 10Mm MgCl2 , nhiệt độ gắn mồi 560C Sau 30 chu kỳ phản ứng, sản phẩm PCR kiểm tra điện di gel agarose 1% chụp ảnh (hình 3.14 ) M kb 1,8 kb Hình 3.14 Hình ảnh điện di đoạn ADN thuộc gen P5CS (1,8kb) nhân lên kỹ thuật PCR giống đậu tương M; Thang ADN chuẩn; 1- CB4; – HL; – QH; – VCB; – TL; – ĐK; 7- DT84 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 58 http://www.lrc-tnu.edu.vn Kết nhân gen cho thấy, giống đậu tương thu sản phẩm PCR với kích thước phân tử khoảng 1,8kb So sánh với trình tự đoạn cDNA thuộc gen P5CS có kích thước 1,2kb giống đậu tương công bố Ngân hàng gen quốc tế sản phẩm PCR chúng tơi thu có nhiều 600bp Có thể tiến hành phản ứng PCR nhân đoạn ADN thuộc gen P5CS từ ADN hệ gen nên đoạn ADN thuộc gen P5CS có chứa intron dài 600 bp.Tuy nhiên, để khẳng định chắn đoạn ADN có thuộc gen P5CS khơng cần phải tiến hành giải trình tự Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 59 http://www.lrc-tnu.edu.vn KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận 1.1 Các giống đậu tương địa phương tỉnh Cao Bằng có biểu đa dạng đặc điểm hình thái hố sinh hạt Hàm lượng protein giống đậu tương cao giống DT84 Hàm lượng protein hàm lượng lipit có mối tương quan nghịch Hàm lượng axit amin không thay protein giống đậu tương nghiên cứu đa số cao tiêu chuẩn FAO (trừ Met) 1.2 Hoạt độ α - amylase hàm lượng đường có xu hướng tăng từ 1, 3, 5, 7, ngày tuổi bắt đầu giảm ngày tuổi Giữa hàm lượng đường hoạt độ amylase có mối tương quan thuận chặt chẽ, hệ số tương quan 0,96-0,99 Các giống đậu tương địa phương tỉnh Cao Bằng có hoạt độ - amylase hàm lượng đường tan cao giống DT84, giống ĐK có hàm lượng đường hoạt độ - amylase cao 1.3 Ở giai đoạn non lá, giống đậu tương phản ứng khác hạn giống đậu tương địa phương tỉnh Cao Bằng có khả chịu hạn cao giống DT84, cao giống ĐK ( số chịu hạn Sn= 7756,78) 1.4 Tổng hợp đánh giá khả chịu hạn cho thấy giống đậu tương nghiên cứu phân bố thành nhóm tương ứng với mức chịu hạn khác Mức chịu hạn cao gồm hai giống ĐK VCB, mức gồm giống TL, HL, QH; mức có giống CB4; mức giống DT84 có khả chịu hạn 1.5 Bằng kỹ thuật PCR nhân đoạn ADN thuộc gen P5CS từ hệ gen giống đậu tương với cặp mồi Pro Soy2F Pro Soy2R, ước tính kích thước đoạn ADN khoảng 1,8kb Đề nghị 2.1 Đề tài cần tiếp tục tách dịng giải trình tự gen P5CS so sánh với trình tự gen công bố ngân hàng gen quốc tế 2.2 Giống ĐK có khả chịu hạn cao số giống nghiên cứu, nên tuyển chọn giống làm vật liệu cho công tác chọn giống đậu tương chịu hạn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 60 http://www.lrc-tnu.edu.vn CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN Chu Hoàng Mậu - Hà Tiến Sỹ (2007), “Đánh giá khả chịu hạn số giống đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) địa phương tỉnh Cao Bằng”, Tạp chí Khoa học Cơng nghệ, Đại học Thái Nguyên, số 3(43), Tr 13 - 19 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 61 http://www.lrc-tnu.edu.vn TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Lê Trần Bình , Lê Thị Muội (1998), Phân lập gen chọn dòng chống chịu ngoại cảnh bất lợi lúa, Nxb Đại học Quốc gia, Hà Nội Phạm Thị Trân Châu, Nguyễn Thị Hiền ,Phùng Gia Tường (1998), Thực hành hoá sinh học, Nxb Giáo dục, 54 -55 Nguyễn Hữu Cường, Nguyễn Thị Kim Anh, Đinh Thị Phịng, Lê Thị Muội Lê Trần Bình (2003), "Mối Tương quan hàm lượng proline tính chống chịu lúa ”, Tạp chí Cơng Nghệ sinh học, 1(1), Tr 85 – 95 Nguyễn Lân Dũng cộng (1978), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, Nxb KHKT Hà Nội,Tập 3, 116 -120 Nguyễn Thu Hiền, Chu Hoàng Mậu, Nguyễn Phú Hùng, Lê Thị Thanh Hương (2005), "Nghiên cứu đặc điểm hình thái, hoá sinh nhân gene dehydrrin số giống đậu tương địa phương vùng núi phía Bắc Việt Nam" Báo cáo khoa học Hội nghị toàn quốc - Nghiên cứu khoa học sống- Đại học Y Hà Nội NXB KHKT Hà Nội, 1224-1227 Nguyễn Huy Hoàng (1992), Nghiên cứu khả chịu hạn giống đậu tương nhập nội miền Bắc Việt Nam, Luận án phó tiến sĩ, Hà Nội Trần Thị Phương Liên cs (1999), "Phân lập gen dehydrin liên quan đến khả chịu hạn đậu tương” Hội nghị cơng nghệ sinh học tồn quốc, Hà Nội, 1348 – 1349 Trần Thị Phương Liên (1999), Nghiên cứu đặc tính hố sinh sinh học phân tử số giống đậu tương có khả chịu nóng, chịu hạn Việt Nam, Luận án tiến sỹ sinh học, Viện công nghệ sinh học, Hà Nội Trần Thị Phương Liên, Nguyễn Huy Hoàng, Đinh Duy Kháng, Nông Văn Hải, Lê Thị Muội (1998), ” Phân lập gen chaperonin giống đậu tương chịu nóng M103 ”, Tạp chí khoa học cơng nghệ, 36(5), – 14 10 Trần Đình Long cs (1999), Cây đậu tương, NXB Nơng Nghiệp 11 Chu Hồng Mậu, Nơng Thị Man, Lê Trần Bình (2000), “Đánh giá số tính trạng kinh tế quan trọng khả chịu hạn dịng đậu tương (Glycine Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 62 http://www.lrc-tnu.edu.vn max (L.) Merrill) đột biến”, Tạp chí khoa học công nghệ, 1(13), Đại học Thái Nguyên, 16-21 12 Chu Hoàng Mậu (2001), Sử dụng phương pháp đột biến thực nghiệm để tạo dòng đậu tương đậu xanh thích hợp cho miền núi Đơng Bắc Việt Nam, Luận án tiến sĩ sinh học, Viện công nghệ sinh học, Hà Nội 13 Đinh Thị Phòng (2001), Nghiên cứu khả chịu hạn chọn dòng chịu hạn lúa công nghệ tế bào thực vật, Luận án tiến sĩ sinh học , Hà Nội 14 Nguyễn Thị Tâm, Lê Trần Bình (2003), “Ảnh hưởng nhiệt độ cao lên hoạt độ α- amylase hàm lượng đường tan hạt nảy mầm số giống dòng lúa chọn lọc từ mơ sẹo chịu nóng”, Tạp chí công nghệ sinh học, 1(1), Tr 101 – 108 15 Nguyễn Hải Tuất, Ngô Kim Khôi (1996), Xử lý thống kê kết nghiên cứu thực nghiệm nông lâm ngư nghiệp máy tính, NXB Nơng Nghiệp, Hà Nội TIẾNG ANH 16 Aral B, Schlenzig J-S, liu G, Kamoun P (1996), “Database cloning of human delta1 - pyrroline -5- carboxylate synthetase (P5CS) cDNA: a bifunctional enzyme catalyzing the first steps in proline biosynthesis”, C.R.Acad Sci Paris 319: 171-178 17 Bates L.S.(1973), Rapid determination of free protem for water –stress studies, Plant and soil ,39, 205 -207 18 Bray E.A.(1997),“Plant responses to water deficit”,Trend Plant Sci,2( 2) 47 - 54 19 Chen T.H., Muranta N (2002), “Enhancement of tolerance of a family of plant dehydrin proteins”, Physiol Plant, pp 795 – 803 20 Delauney AJ, Verma DPS (1990), “A soybean delta1 - pyrroline-5-carboxylate reductase gene was isolated by functional complementation in Escherichia coli and is found to be osmoregulated”, Mol.Gen Genet 221: 299-305 21 Foolad, M.R SIVaA, and Rodriguer L.R,(1995), Appliction polymerase chain reaction ( PCR) to plant genom analyis , In:Tissue ADN organ culture Fundamental methods Springer verlag, Berlin, Heidelerg, 281-298 22 Hare PD, Cres WA (1997), Metabolic implications of stress-induced proline accumulation in plants, Plant Growth Regulation 21: 79 * 102 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 63 http://www.lrc-tnu.edu.vn 23 Hu CA, Delauney AJ, Verma DP (1992), “A bifunctional enzyme (delta1pyrroline-5-carboxylate synthetase) catalyzes the first two steps in proline biosynthesis in plants”, Proc Natl Acad.Sci u.S.A.89:9354-9358 24 Hua X-J, van de Cottte B, Van Monatgu M, Verbruggen N (1997) , “Developmental regulation of pyrroline-5-carboxylate reductase gene expression in Arabodopsis”, Plant Physiol.1215 - 1224 25 Kishor PBK, Hong Z, Miao G - H, Hu C-AA, Verma DPS (1995) ,”Overexpression of delta1 - pyrroline-5-carboxylate synthetase increases proline production and confers osmotolerance in transgenic plants”, Plant physiol 108: 1387 - 1394 26 Krueger R, Jager HJ, Hintz M, Pahlich E (1986 ), “purification to homogeneity of pyrroline-5-carboxylate reductase of barley” Plant Physiol 80: 142 - 144 27 LaRosa PC, Rhodes D, Rhodes JC, Bressan RA, Csonka LN (1991), “Elevated accumulation of proline in NaCl-adapted tobacco cells is not due to altered delta1-pyrroline-5-carboxylate reductase” Plant physiol 96: 245 - 250 28 Lodata RF, Smith RJ, Valle D, phang JM, Aoki TT (1981), “Regulation of proline biosynthesis: the inhibition of pyrroline-5-carboxylate synthase activity by ornithine”, Metabolism 30: 908 - 913 29 Lyer S, Caplan A (1998), “Products of proline catabolism can induce osmotically regulated genes in rice”, Plant physiol 116: 203 - 211 30 Maitra N and Cushman J, C (1994), “Ioslation and characterization drought – induced Soybean cDNA encoding a D95 famyly late – embryogennesis – abudant protein”, Plant physiol., 106, 805 - 806 31 Soulage JL, Kim K, Arrese EL, Walters C, Cushman JC.(2003), “Conformation of a group late embryogennesis abudant protein from Soybean Evidence of poly ( L – proline) – Type II Structure Plant”, Physiol., 131 (3), 963 –75 32 Szoke A, Miao GH, hong Z, verma DPS (1992), “Subcellular location of delta1pyrroline-5-carboxylate reductase in root/nodule and leaf of soybean”, Plant physoil 99: 1642 - 1649 33 Verma DPS, Hu C-AA, Delauney AJ, Miao G-H, Hong Z (1992), Deciphering proline biosynthesis pathway in plants by direct, trans-, and cocomplementation in bacteria In “Biosynthesis and Molecular Regulation of Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 64 http://www.lrc-tnu.edu.vn Amino Acids in Plants (BK Singh, HE Flores, JC Shannon eds), American Society of Plant Physiologists, Warerly Press, Baltimore, MD, pp, 128-138 34 Wakabayashi Y, Jones ME (1983), “Pyrroline-5-carboxylate synthesis from glutamate by rat intestinal mucosa J biol”, Chem.258: 3865-3872 35 www worldoil.com 36 Yoshiba Y, Kiyosue T, Katagiri T, Ueda H, Mizoguchi T, Yamaguchi-Shinozaki K Wada k, Harada Y, Shinizaki K (1995), “Correlation between the induction of a gene for delta1-pyrroline-5-carboxylate synthetase and the accumulation of proline in Arabidopsis thaliana under osmotic stress” Plant J 7: 751 - 760 37 Yoshiba, Y.,Sanada,Yamaguchi – Shinozaki, Wada,K and Shinozaki,K (1997), “Characterization of the gene for P5CS and correlation between the expression of the gene and salt tolerance in Oryza sativa L” Plant Mol Biol 33(5), 857 865 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 65 http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 66 http://www.lrc-tnu.edu.vn