Nghiên cứu mối liên quan giữa đột biến trong vùng điều khiển hệ gen ty thể và bệnh ung thư phổi

i VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT ****************** TRẦN MẠNH HÀ NGHIÊN CỨU MỐI LIÊN QUAN GIỮA ĐỘT BIẾN TRONG VÙNG ĐIỀU KHIỂN HỆ GEN TY THỂ VÀ BỆNH UNG THƢ PHỔI LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC Hà Nội - 2013 Số hóa Trung tâm Học liệu Tai ngay!!! Ban co the xoa dong chu nay!!! http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ii VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT **************** TRẦN MẠNH HÀ NGHIÊN CỨU MỐI LIÊN QUAN GIỮA ĐỘT BIẾN TRONG VÙNG ĐIỀU KHIỂN HỆ GEN TY THỂ VÀ BỆNH UNG THƢ PHỔI Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60 42 01 14 LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS LÊ QUANG HUẤN Hà Nội – 2013 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ iii LỜI CẢM ƠN Trước hết, em xin bày tỏ lòng biết ơn lời cảm ơn trân trọng tới bệnh nhân hiến mẫu cho nghiên cứu Với lịng kính trọng biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn PGS.TS Lê Quang Huấn tạo điều kiện tận tình bảo động viên suốt thời gian thực luận văn tốt nghiệp Em xin chân thành cảm ơn giúp đỡ quý báu kiến thức lẫn tinh thần từ tập thể phịng Cơng nghệ tế bào động vật, Viện Cơng nghệ sinh học Trong suốt thời gian khóa luận, em nhận giúp đỡ vơ q báu TS.BS Đào Huyền Quyên, Khoa Sinh Hóa Bệnh viện Bạch Mai Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới chị Nhân dịp em xin bày tỏ lịng biết ơn tới thầy, cơ, bạn bè gia đình dẫn giúp đỡ em suốt thời gian qua Hà Nội, ngày tháng 12 năm 2013 Học viên Trần Mạnh Hà Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ iv MỤC LỤC Trang LỜI MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục tiêu Nội dung CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung ty thể 1.1.1 Cấu trúc ty thể 1.1.2 Chức ty thể 1.1.3 Hệ gen ty thể 1.1.4 Sự phân chia ty thể trình chép gen ty thể 1.2 Di truyền gen ty thể đột biến gen ty thể liên quan đến bệnh học 11 1.2.1 Di truyền gen ty thể 11 1.2.2 Đột biến gen ty thể liên quan đến bệnh học 12 1.3 Mối liên quan ung thư phổi đột biến gen ty thể 14 1.3.1 Giới thiệu chung ung thư 14 1.3.1.1 Định nghĩa ung thu dịch tễ học ung thư 14 1.3.1.2 Cơ chế nguyên nhân gây ung thư 15 1.3.2 Ung thư phổi 18 1.3.2.1 Giới thiệu ung thư phổi tình hình dịch tễ 18 1.3.2.2 Nguyên nhân gây ung thư phổi trình phát triển ung thư phổi 20 1.3.3 Mối liên quan chức ty thể phát triển ung thư 21 CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.1 Vật liệu 23 2.1.1 Sinh phẩm 23 2.1.2 Hóa chất 23 2.2 Trang thiết bị 23 2.3 Phần mềm tin sinh học 24 2.4 Phương pháp nghiên cứu 25 2.4.1 Phương pháp tách chiết DNA từ mẫu máu 25 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ v 2.4.2 Định lượng DNA tách chiết phương pháp quang phổ kế 26 2.4.3 Nhân đoạn gen PCR 26 2.4.4 Phương pháp giải trình tự 30 2.4.5 Phương pháp phân tích chất lượng liệu trình tự 31 2.4.6 Phương pháp tìm đột biến gen 32 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33 3.1 Kết tách chiết DNA 33 3.2 Kết nhân gen PCR 35 3.3 Kết giải trình tự gen 38 3.4 Kết phân tích đột biến 40 3.5 Thảo luận 41 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO 44 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ vi THUẬT NGỮ VIẾT TẮT Bp Base pair (Cặp base) DNA Deoxyribonucleic acid D-loop Displacement loop EDTA Ethylene diamine tetra acetic acid HV Hypervariable regions kb kilo base mtDNA Mitochondrial Deoxyribonucleic acid(DNA ty thể) OD Optical Density (mật độ quang) PCR Polymerase Chain Reaction (phản ứng chuỗi tổng hợp nhờ enzyme Polymerase) RNA Ribonucleic acid rRNA Ribosome Ribonucleic acid SDS Sodium Dodecyl Sulfate SSC Standard saline citrate TAE Tris - Acetate - EDTA TE Tris - EDTA Tm Melting Temperature (nhiệt độ nóng chảy) tRNA Transfer Ribonucleic acid Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ vii DANH SÁCH CÁC HÌNH VẼ Danh Tên hình Trang mục hình 1.1 Cấu trúc ty thể 1.2 Quá trình sinh tổng hợp ATP ty thể 1.3 Cấu trúc hệ gen ty thể 1.4 Sự phân chia ty thể 10 1.5 Cơ chế chép mtDNA 11 1.6 Di truyền ty thể theo dòng mẹ 12 1.7 Cơ chế phát triển ung thư 15 1.8 Quá trình chết theo chương trình tế bào 17 1.9 Sự phát triển ung thư phổi 20 2.1 Sơ đồ nguyên lý PCR 28 2.2 Các bước chu kỳ PCR 29 2.3 Kiểm tra chất lương tín hiệu dựa liệu trình tự 31 2.4 Kiểm tra chất lượng giải mã trình tự phương pháp 32 phổ thơng 3.1 Kết tách chiết DNA tổng số 33 3.2 Đồ thị kiểm tran độ tinh phương pháp đo OD 35 3.3 Trình tự vùng D-loop vị trí bắt cặp mồi 36 3.4 Sản phẩm PCR kiểm tra gel agarose 1% 38 3.5 Kết giải trình tự số mẫu bệnh mẫu đối 40 chứng 3.6 Kết phân tích đột biến Số hóa Trung tâm Học liệu 41 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ viii DANH SÁCH BẢNG BIỂU Danh mục Tên bảng Trang bảng 1.1 So sánh mã di truyền gen nhân gen ty thể 1.2 Các triệu chứng ung thư phổi 18 2.1 Danh sách trang thiết bị sử dụng cho nghiên cứu 24 2.2 Phần mềm sử dụng 24 2.3 Sơ đồ nguyên lý PCR 30 3.1 Kết kiểm tra độ tinh DNA phương 34 pháp OD 3.2 Thành phần dùng cho phản ứng PCR 37 3.3 Chương trình thực phản ứng PCR 37 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ LỜI MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Từ năm 1805 ty thể nhà khoa học phát cấu trúc nhân tế bào (Ernster and Schatz, 1981) Sau gần 100 năm nghiên cứu kéo dài, mối liên hệ ty thể hô hấp tế bào xác định ngày ty thể đánh giá “trung tâm lượng tế bào” (“Powerhouse of the Cell”) Ngoài ra, phát đột phá ty thể việc xác định tồn vật liệu di truyền ty thể vào năm đầu thập kỷ 60 kỷ trước Từ đến nay, nghiên cứu lĩnh vực ty thể phát triển mạnh từ giải trình tự hệ gen ty thể, nghiên cứu chức ty thể bệnh liên quan tới rối loạn chức ty thể Tầm ảnh hưởng ty thể tới phát triển bệnh ung thư ngày giới nghiên cứu công nhận Các đột biến mtDNA (Mitochondrial Deoxyribonucleic) phát bệnh ung thư ung thư bàng quang, ung thư phổi, ung thư đại tràng, ung thư cổ đầu, ung thư thận, gan, phổi, dày ung thư máu ác tính Quan trọng hơn, vùng D-loop (displacement loop) hệ gen ty thể lại nơi có tần suất đột biến cao, đặc biệt vùng siêu biến HV1 (hypervariable regions) Vì đột biến vùng D-loop tiềm ẩn nhiều mối liên quan tới phát triển ung thư Ung thư phổi giới nói chung Việt Nam nói riêng bệnh phổ biến nguy hiểm tất loại ung thư Đây bệnh có tiên lượng xấu tiến triển nhanh, di sớm, phát bệnh thường giai đoạn muộn Ung thư phổi thường khơng có triệu chứng đặc biệt có đặc điểm giống bệnh lý khác gây Vì việc tiến hành chẩn đốn y học tin cậy cần thiết Việc xác định trình tự nucleotide vùng điều khiển DNA ty thể xem công cụ hữu hiệu để đánh giá liên quan mật thiết tỉ lệ đột biến vùng điều khiển gen ty thể với phát triển, biểu Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ung thư phổi Trong khuôn khổ luận văn này, tiến hành “Nghiên cứu mối liên quan đột biến vùng điều khiển hệ gen ty thể bệnh ung thƣ phổi” Mục tiêu Giải trình tự vùng D-loop tách chiết từ mẫu bệnh phẩm (máu) bệnh nhân ung thư phổi bệnh viện Bạch Mai – Hà Nội – Việt Nam người khỏe mạnh So sánh trình tự đoạn gen HV1 vùng D-loop với trình tự tham khảo cơng bố ngân hàng gen tìm điểm đột biến đặc trưng cho bệnh nhân ung thư phổi Việt Nam Đề xuất chức đột biến gen ty thể liên quan tới bệnh ung thư phổi Nội dung Tách chiết DNA tổng số từ máu bệnh nhân mắc bệnh ung thư phổi người bình thường Nhân đoạn gen HV1 thuộc vùng D-loop Xác định phân tích trình tự gen vùng HV1 mẫu bệnh phẩm mẫu đối chứng So sánh trình tự với trình tự chuẩn Cambridge Reference Sequence (CRS) để tìm điểm đột biến sai khác Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 36 Mồi xuôi bắt cặp gắn vào đầu 5‟ mạch khuôn, mồi ngược bắt cặp bổ xung gắn vào đầu 3‟ mạch khuôn Mồi ảnh hưởng nhiều đến hiệu PCR, để đảm bảo tốt cho phản ứng PCR, cần trọn mồi xuôi mồi ngược có trình tự khơng bổ xung với tránh xảy tượng tự bắt cặp mồi với Các mồi có Tm (Melting temperature) gần giống hiệu phản ứng tăng cường, khoảng cách mồi xuôi mồi ngược nhỏ 1kb thích hợp Để phân lập tách dịng đoạn gen vùng siêu biến I, chúng tơi thiết kết cặp mồi dựa trình tự gen ty thể công bố Ngân hàng gen quốc tế (Gene Bank), số đăng ký J01415, trình tự gọi trình tự Anderson Trong cơng bố Anderson cộng (1981), trình tự vùng siêu biến I (HVI) D-Loop DNA ty thể nằm từ vị trí 16024 đến 16368 15841 aataccaact atctccctaa ttgaaaacaa aatactcaaa tgggcctgtc cttgtagtat L15945 15901 aaactaatac accagtcttg taaaccggag atgaaaacct ttttccaagg acaaatcaga 15961 gaaaaagtct ttaactccac cattagcacc caaagctaag attctaattt aaactattct 16021 ctgttctttc atggggaagc agatttgggt accacccaag tattgactca cccatcaaca 16081 accgctatgt atttcgtaca ttactgccag ccaccatgaa tattgtacgg taccataaat 16141 acttgaccac ctgtagtaca taaaaaccca atccacatca aaaccccctc cccatgctta 16201 caagcaagta cagcaatcaa ccctcaacta tcacacatca actgcaactc caaagccacc 16261 cctcacccac taggatacca acaaacctac ccacccttaa cagtacatag tacataaagc 16321 catttaccgt acatagcaca ttacagtcaa atcccttctc gtccccatgg atgacccccc 16381 tcagataggg gtcccttgac caccatcctc cgtgaaatca atatcccgca caagagtgct R16410 16441 actctcctcg ctccgggccc ataacacttg ggggtagcta aagtgaactg tatccgacat 16501 ctggttccta cttcagggtc ataaagccta aatagcccac acgttcccct taaataagac Hình 3.3 Trình tự đoạn HV1 vùng D-loop vị trí bắt cặp mồi Theo tính tốn trên, cặp mồi thiết kế nhân đoạn DNA đặc hiệu vùng siêu biến I với kích thước 440 bp Cặp mồi thiết kế có trình tự sau Primer forward (LF): 5‟ - atctccctaa ttgaaaacaa - 3‟ Primer reverse (LR): 5‟ - gtcccttgac caccatcctc - 3‟ Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 37 Phản ứng nhân gen HV1 Dloop Để nhân đoạn DNA đặc hiệu, có số lượng lớn ngồi việc thiết kế cặp mồi đặc hiệu cịn phải có thành phần hỗ hợp PCR chu trình nhiệt tối ưu Chúng thử điều kiện khác để tìm điều kiện tối ưu cho PCR Bảng 3.2 3.3 thành phần phản ứng chu trình nhiệt phù hợp để nhân đoạn DNA liên quan Bảng 3.2 Thành phần dùng cho phản ứng PCR Thành phần Thể tích (µl) Dung dịch đệm 10X (Buffer) 2.5 MgCl2 (25nM) dNTPs (10nM) Mồi xuôi Mồi ngược DNA khuôn (50-100ng) Taq DNA polymease (5U/µl) 0.2 Nước khử ion 14.3 Tổng 25 Bảng 3.3 Chƣơng trình thực PCR Bước Phản ứng Nhiệt độ thời gian Chu kỳ Biến tính 94 phút Biến tính 94 phút Bắt cặp 58 phút Kéo dài 72 phút Hoàn tất kéo dài 72 phút Kết thúc phản ứng ∞ Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ×35 38 Sản phẩm PCR điện di kiểm tra gel agarose 1% (Hình 3.4) 500 bp Hình 3.4 Sản phẩm PCR kiểm tra gel agarose 1% Giếng -14, mẫu máu bệnh nhân ung thư phổi; Giếng 15 thang DNA chuẩn (1kb plus Fermentas); ĐC: mẫu đối chứng Kết điện di Hình 3.4 cho thấy gel sản phẩm PCR có dạng băng DNA nhất, đậm rõ nét, có kích thước 440bp phù hợp với kích thước đoạn DNA cần nhân Điều chứng tỏ cặp mồi chúng tơi thiết kế có độ đặc hiệu cao chương trình thành phần phản ứng PCR phù hợp Với sản phẩm PCR chúng tơi tiếp tục tiến hành giải trình tự trực tiếp Sản phẩm PCR đặc hiệu sau tinh đọc trình tự gen máy đọc tự động, sử dụng hai mồi đọc trình tự mồi L15945 xuôi mồi H16410 ngược Thành phần phản ứng: BigDye l Đệm 2,5X l Mồi (0,01 g/ l) 1,275 l Sản phẩm PCR (100 ng/ l) l Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 39 H2O 4,375 l Tổng thể tích 15 l Chu trình nhiệt: 960C-1 phút; 25 chu kỳ (960C- 10 giây : 500C- giây: 600C- phút) kết thúc 40C Sản phẩm PCR tinh sạch: Tinh sản phẩm PCR + Bổ sung l EDTA 12,5 mM, pH=8 Ly tâm 4000v/p 45 giây + Bổ sung 60 l cồn 100%, ủ nhiệt độ phòng 15 phút + Ly tâm 4500 v/p 45 phút để thu cặn + Rửa cặn 60 l cồn 70% Ly tâm 10.000 v/p để thu cặn + Làm khơ cặn phút + Hồ cặn 10 l Hidiformamide + Biến tính 95oC phút Trình tự đoạn gen đặc hiệu xác định theo phương pháp Sanger máy giải trình tự gen máy ABI Prism 3100 Avant Viện Công nghệ Sinh học (tốc độ 2,5 giờ/4 mẫu ~ 4000 nucleotide) Kết phân tích máy tính, sử dụng chương trình phần mềm Genedoc, phần mềm BioEditor Trình tự nucleotide so sánh với trình tự nucleotide đoạn DNA khác ngân hàng gen trang Web: http://www.ebi.ac.uk chương trình EMBL FASTA Hình 3.5 trình bày số ví dụ điển hình mẫu đọc trình tự Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 40 Hình 3.5 Kết giải trình tự số mẫu bệnh mẫu đối chứng 3.3 Kết phân tích đột biến Để tìm điểm đột biến, tiến hành so sánh trình tự D- loop mẫu bệnh với trình tự tham khảo CRS công bố Ngân hàng Gen Để đảm bảo loại trừ tập hợp đột biến, chúng tơi sử dụng phương pháp so sánh trình tự dùng phần mềm chuyên dụng cho việc xác định đột biến Kết cho thấy, so sánh với trình tự CRS, phần lớn mẫu (bao gồm 80% mẫu bệnh 93% mẫu đối chứng) có sai khác vị trí 16189 (T→C) (Hình 3.6) Tuy nhiên, bệnh nhân ung thư phổi có xuất thêm đột biến điểm 16519 (T→C) đột biến hồn tồn khơng có cá thể đối chứng Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 41 Hình 3.6 Kết phân tích đột biến Đột biến điểm vị trí 16189 (T→C) xuất bệnh nhân ung thư phổi cá thể đối chứng Đột biến vị trí 16519 (T→C) có tần xuất cao bệnh nhân ung thư phổi không xuất cá thể khỏe mạnh đối chứng 3.4 Thảo luận Gen ty thể dù có kích thước bé so với gen nhân mã hóa cho lượng nhỏ protein tRNA rRNA Tuy nhiên, đột biến gen ty thể làm ảnh hưởng đến chức ty thể, đặc biệt chức tạo lượng tế bào liên quan tới bệnh Một số nghiên cứu đột biến gen ty thể có liên quan tới số bệnh ung thư (Lu cs., 2009) Quan trọng hơn, tần xuất đột biến gen ty thể vùng D-loop cao Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 42 Thêm vào đó, vùng D-loop vùng chứa trình tự tham gia vào trình khởi đầu chép, phiên mã dịch mã Do đó, đột biến gen ty thể, đặc biệt vùng D-loop có ảnh hưởng nghiêm trọng tới chức quan trọng ty thể, kênh truyền tín hiệu, tạo lượng, sản sinh, loại bỏ gốc tự do, điều khiển trình chết theo chương trình, nhiều chức tiềm ẩn khác Phần lớn rối loạn có liên quan chặt chẽ với q trình phát triển ung thư (Barthelemy cs., 2002) Kết nghiên cứu góp phần mối liên quan đột biến gen ty thể biểu bệnh bệnh nhân ung thư phổi Việt Nam Hiện nay, phần lớn bệnh nhân ung thư phổi phát bệnh bước sang giai đoạn muộn Xác định đột biến đặc trưng bệnh hỗ trợ cho tiên lượng, chẩn đoán bệnh xác từ có phác đồ điều trị hiệu Tuy số lượng bệnh nhân nghiên cứu chưa nhiều, kết nghiên cứu đưa chứng mối liên quan đột biến vùng D-loop với ung thư phổi Nghiên cứu mở hướng nghiên cứu nghiên cứu nghiên cứu lâm sàng đột biến gen ung thư Việt Nam Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 43 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Đã xác định đột biến điểm 16189 T>C vùng HV1 mẫu bệnh nhân ung thư phổi mẫu người khỏe mạnh so với trình tự CRS đặc trưng cho người Việt Nam Đã xác định đột biến điểm 16519 T>C vùng HV1 mẫu bệnh phẩm ung thư phổi người Việt Nam so với trình tự CRS Kiến nghị • Kiểm tra đột biến diện rộng mẫu bệnh ung thư phổi (nhằm khẳng định chắn tồn dột biến này) • Kiểm tra đột biến tra loại ung thư khác (để kiểm tra xem đột biến đặc điểm riêng ung thư phổi chung với bệnh ung thư khác nhau) • Bổ sung kiểm tra mẫu bệnh giai đoạn khác ung thư (điều giúp khẳng định thêm vai trò đột biến tiên lượng chẩn đoán ung thư, theo dõi điều trị) Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG ANH Attardi, G., and Schatz, G., 1988, Biogenesis of mitochondria, Annu Rev Cell Biol 4:289-333 Barthelemy, C., de Baulny, H O., and Lombes, A., 2002, D-loop mutations in mitochondrial DNA: link with mitochondrial DNA depletion?, Hum Genet 110(5):479-87 Berger, K H., and Yaffe, M P., 1996, Mitochondrial distribution and inheritance, Experientia 52(12):1111-6 Bowmaker, M., Yang, M Y., Yasukawa, T., Reyes, A., Jacobs, H T., Huberman, J A., and Holt, I J., 2003, Mammalian mitochondrial DNA replicates bidirectionally from an initiation zone, J Biol Chem 278(51):50961-9 Brown, T A., Cecconi, C., Tkachuk, A N., Bustamante, C., and Clayton, D A., 2005, Replication of mitochondrial DNA occurs by strand displacement with alternative light-strand origins, not via a strand-coupled mechanism, Genes Dev 19(20):2466-76 Chen, X J., and Butow, R A., 2005, The organization and inheritance of the mitochondrial genome, Nat Rev Genet 6(11):815-25 Cheng, Y L., Chang, W L., Lee, S C., Liu, Y G., Chen, C J., Lin, S Z., Tsai, N M., Yu, D S., Yen, C Y., and Harn, H J., 2004, Acetone extract of Angelica sinensis inhibits proliferation of human cancer cells via inducing cell cycle arrest and apoptosis, Life Sci 75(13):1579-94 Clayton, D A., 2003, Mitochondrial DNA replication: what we know, IUBMB Life 55(4-5):213-7 Cooper, G., 2000, The Cell: A Molecular Approach, Sunderland Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 45 10 Dahout-Gonzalez, C., Nury, H., Trezeguet, V., Lauquin, G J., PebayPeyroula, E., and Brandolin, G., 2006, Molecular, functional, and pathological aspects of the mitochondrial ADP/ATP carrier, Physiology (Bethesda) 21:242-9 11 Ernster, L., and Schatz, G., 1981, Mitochondria: a historical review, J Cell Biol 91(3 Pt 2):227s-255s 12 Evan, G I., and Vousden, K H., 2001, Proliferation, cell cycle and apoptosis in cancer, Nature 411(6835):342-8 13 Fliss, M S., Usadel, H., Caballero, O L., Wu, L., Buta, M R., Eleff, S M., Jen, J., and Sidransky, D., 2000, Facile detection of mitochondrial DNA mutations in tumors and bodily fluids, Science 287(5460):2017-9 14 Ginther, C., Issel-Tarver, L., and King, M C., 1992, Identifying individuals by sequencing mitochondrial DNA from teeth, Nat Genet 2(2):135-8 15 Goldstein, S., and Shmookler Reis, R J., 1984, Genetic modifications during cellular aging, Mol Cell Biochem 64(1):15-30 16 Greenberg, B D., Newbold, J E., and Sugino, A., 1983, Intraspecific nucleotide sequence variability surrounding the origin of replication in human mitochondrial DNA, Gene 21(1-2):33-49 17 Hanahan, D., and Weinberg, R A., 2000, The hallmarks of cancer, Cell 100(1):57-70 18 Herbst, R., 2008, Molecylar origind of cancer: Lung Cancer, N Engl J Med (359):1367-80 19 Hernandez-Resendiz, S., Buelna-Chontal, M., Correa, F., and Zazueta, C., 2013, Targeting mitochondria for cardiac protection, Curr Drug Targets 14(5):586-600 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 46 20 IARC, 2013, IARC releases the latest global cancer trends in five continents, in: WHO Press Release 21 Lu, J., Sharma, L K., and Bai, Y., 2009, Implications of mitochondrial DNA mutations and mitochondrial dysfunction in tumorigenesis, Cell Res 19(7):802-15 22 Majamaa, K., Moilanen, J S., Uimonen, S., Remes, A M., Salmela, P I., Karppa, M., Majamaa-Voltti, K A., Rusanen, H., Sorri, M., Peuhkurinen, K J., and Hassinen, I E., 1998, Epidemiology of A3243G, the mutation for mitochondrial encephalomyopathy, lactic acidosis, and strokelike episodes: prevalence of the mutation in an adult population, Am J Hum Genet 63(2):447-54 23 McFarland, R., Elson, J L., Taylor, R W., Howell, N., and Turnbull, D M., 2004, Assigning pathogenicity to mitochondrial tRNA mutations: when "definitely maybe" is not good enough, Trends Genet 20(12):591-6 24 McKinney, E A., and Oliveira, M T., 2013, Replicating animal mitochondrial DNA, Genet Mol Biol 36(3):308-315 25 Miyazono, F., Schneider, P M., Metzger, R., Warnecke-Eberz, U., Baldus, S E., Dienes, H P., Aikou, T., and Hoelscher, A H., 2002, Mutations in the mitochondrial DNA D-Loop region occur frequently in adenocarcinoma in Barrett's esophagus, Oncogene 21(23):3780-3 26 Mootha, V K., Lindgren, C M., Eriksson, K F., Subramanian, A., Sihag, S., Lehar, J., Puigserver, P., Carlsson, E., Ridderstrale, M., Laurila, E., Houstis, N., Daly, M J., Patterson, N., Mesirov, J P., Golub, T R., Tamayo, P., Spiegelman, B., Lander, E S., Hirschhorn, J N., Altshuler, D., and Groop, L C., 2003, PGC-1alpha-responsive genes involved in oxidative phosphorylation are coordinately downregulated in human diabetes, Nat Genet 34(3):267-73 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 47 27 Moraes, C T., Srivastava, S., Kirkinezos, I., Oca-Cossio, J., van Waveren, C., Woischnick, M., and Diaz, F., 2002, Mitochondrial DNA structure and function, Int Rev Neurobiol 53:3-23 28 Muller-Hocker, J., 1990, Cytochrome c oxidase deficient fibres in the limb muscle and diaphragm of man without muscular disease: an agerelated alteration, J Neurol Sci 100(1-2):14-21 29 Nass, M M., and Nass, S., 1963, Intramitochondrial Fibers with DNA Characteristics I Fixation and Electron Staining Reactions, J Cell Biol 19:593-611 30 Parkin, D M., Pisani, P., and Ferlay, J., 1993, Estimates of the worldwide incidence of eighteen major cancers in 1985, Int J Cancer 54(4):594-606 31 Petersen, K F., Befroy, D., Dufour, S., Dziura, J., Ariyan, C., Rothman, D L., DiPietro, L., Cline, G W., and Shulman, G I., 2003, Mitochondrial dysfunction in the elderly: possible role in insulin resistance, Science 300(5622):1140-2 32 Polyak, K., Li, Y., Zhu, H., Lengauer, C., Willson, J K., Markowitz, S D., Trush, M A., Kinzler, K W., and Vogelstein, B., 1998, Somatic mutations of the mitochondrial genome in human colorectal tumours, Nat Genet 20(3):291-3 33 Ralph, S J., Rodriguez-Enriquez, S., Neuzil, J., Saavedra, E., and Moreno-Sanchez, R., 2010, The causes of cancer revisited: "mitochondrial malignancy" and ROS-induced oncogenic transformation - why mitochondria are targets for cancer therapy, Mol Aspects Med 31(2):145-70 34 Reed, J C., and Green, D R., 2002, Remodeling for demolition: changes in mitochondrial ultrastructure during apoptosis, Mol Cell 9(1):1-3 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 48 35 Schatz, G., and Klima, J., 1964, Triphosphopyridine Nucleotide: Cytochrome C Reductase of Saccharomyces Cerevisiae: a "Microsomal" Enzyme, Biochim Biophys Acta 81:448-61 36 Shoubridge, E A., 2001, Nuclear genetic defects of oxidative phosphorylation, Hum Mol Genet 10(20):2277-84 37 Slonimski, P., and Ephrussi, B., 1949, Action de l'acriflavine sur les levures V Le systeme des cytochromes des mutants „petite colonie‟, Annales de l'Institut Pasteur:47-63 38 Stoneking, M., 2000, Hypervariable sites in the mtDNA control region are mutational hotspots, Am J Hum Genet 67(4):1029-32 39 Taylor, R W., and Turnbull, D M., 2005, Mitochondrial DNA mutations in human disease, Nat Rev Genet 6(5):389-402 40 Trifunovic, A., Wredenberg, A., Falkenberg, M., Spelbrink, J N., Rovio, A T., Bruder, C E., Bohlooly, Y M., Gidlof, S., Oldfors, A., Wibom, R., Tornell, J., Jacobs, H T., and Larsson, N G., 2004, Premature ageing in mice expressing defective mitochondrial DNA polymerase, Nature 429(6990):417-23 41 Verschoor, M L., Ungard, R., Harbottle, A., Jakupciak, J P., Parr, R L., and Singh, G., 2013, Mitochondria and cancer: past, present, and future, Biomed Res Int 2013:612369 42 Walberg, M W., and Clayton, D A., 1981, Sequence and properties of the human KB cell and mouse L cell D-loop regions of mitochondrial DNA, Nucleic Acids Res 9(20):5411-21 43 Wu, M., Kalyanasundaram, A., and Zhu, J., 2013, Structural and biomechanical basis of mitochondrial movement in eukaryotic cells, Int J Nanomedicine 8:4033-4042 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 49 44 Yang, M Y., Bowmaker, M., Reyes, A., Vergani, L., Angeli, P., Gringeri, E., Jacobs, H T., and Holt, I J., 2002, Biased incorporation of ribonucleotides on the mitochondrial L-strand accounts for apparent strand-asymmetric DNA replication, Cell 111(4):495-505 TÀI LIỆU INTERNET 45 http://www.benhphoitacnghen.com/show.aspx?cat=003&nid=342 DANH SÁCH BỆNH NHÂN NGHIÊN CỨU TẠI TRUNG TÂM HÔ HẤP VÀ TRUNG TÂM Y HỌC HẠT NHÂN VÀ UNG BƢỚU BỆNH VIỆN BẠCH MAI NĂM 2012-2013 Số TT Họ tên Tuổi Ngày vào Ngày Mã lƣu viện viện trữ Bùi Thị H 44 28/02/2013 21/04/2013 C34/656 Phạm Văn H 59 08/04/2013 17/04/2013 C34/495 Phạm Thị O 50 26/02/2013 10/05/2013 C34/339 Nguyễn Văn H 61 15/03/2013 27/05/2013 C34/753 Lưu Văn A 65 25/03/2013 27/05/2013 C34/759 Phạm Văn K 57 17/04/2013 22/05/2013 C34/760 Đặng Văn L 74 15/04/2013 19/05/2013 C34/752 Phạm Đức L 79 27/03/2013 13/05/2013 C34/761 Phan Chí T 62 24/04/2013 10/05/2013 C34/755 10 Võ Văn T 62 19/03/2013 19/06/2013 C34/758 11 Trần Bá N 54 29/03/2013 08/04/2013 C34/216 12 Lại Văn C 69 05/03/2013 10/05/2013 C34/756 13 Nguyễn Thị T 51 05/04/2013 14/04/2013 C34/217 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 50 Lời cam đoan Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu số kết cộng tác với đồng khác Các số liệu kết trình bày luận văn trung thực Hà Nội, ngày tháng 12 năm 2013 Học viên Trần Mạnh Hà Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/