Nghiên cứu thành phần hóa học, độc tính và một số tác dụng sinh học của cây An xoa (Helicteres hirsuta Lour.)

Nghiên cứu thành phần hóa học, độc tính và một số tác dụng sinh học của cây An xoa (Helicteres hirsuta Lour.)Nghiên cứu thành phần hóa học, độc tính và một số tác dụng sinh học của cây An xoa (Helicteres hirsuta Lour.)Nghiên cứu thành phần hóa học, độc tính và một số tác dụng sinh học của cây An xoa (Helicteres hirsuta Lour.)Nghiên cứu thành phần hóa học, độc tính và một số tác dụng sinh học của cây An xoa (Helicteres hirsuta Lour.)Nghiên cứu thành phần hóa học, độc tính và một số tác dụng sinh học của cây An xoa (Helicteres hirsuta Lour.)Nghiên cứu thành phần hóa học, độc tính và một số tác dụng sinh học của cây An xoa (Helicteres hirsuta Lour.)Nghiên cứu thành phần hóa học, độc tính và một số tác dụng sinh học của cây An xoa (Helicteres hirsuta Lour.)Nghiên cứu thành phần hóa học, độc tính và một số tác dụng sinh học của cây An xoa (Helicteres hirsuta Lour.)Nghiên cứu thành phần hóa học, độc tính và một số tác dụng sinh học của cây An xoa (Helicteres hirsuta Lour.)Nghiên cứu thành phần hóa học, độc tính và một số tác dụng sinh học của cây An xoa (Helicteres hirsuta Lour.)Nghiên cứu thành phần hóa học, độc tính và một số tác dụng sinh học của cây An xoa (Helicteres hirsuta Lour.)Nghiên cứu thành phần hóa học, độc tính và một số tác dụng sinh học của cây An xoa (Helicteres hirsuta Lour.)Nghiên cứu thành phần hóa học, độc tính và một số tác dụng sinh học của cây An xoa (Helicteres hirsuta Lour.)Nghiên cứu thành phần hóa học, độc tính và một số tác dụng sinh học của cây An xoa (Helicteres hirsuta Lour.)Nghiên cứu thành phần hóa học, độc tính và một số tác dụng sinh học của cây An xoa (Helicteres hirsuta Lour.)Nghiên cứu thành phần hóa học, độc tính và một số tác dụng sinh học của cây An xoa (Helicteres hirsuta Lour.)Nghiên cứu thành phần hóa học, độc tính và một số tác dụng sinh học của cây An xoa (Helicteres hirsuta Lour.)Nghiên cứu thành phần hóa học, độc tính và một số tác dụng sinh học của cây An xoa (Helicteres hirsuta Lour.)Nghiên cứu thành phần hóa học, độc tính và một số tác dụng sinh học của cây An xoa (Helicteres hirsuta Lour.)Nghiên cứu thành phần hóa học, độc tính và một số tác dụng sinh học của cây An xoa (Helicteres hirsuta Lour.)Nghiên cứu thành phần hóa học, độc tính và một số tác dụng sinh học của cây An xoa (Helicteres hirsuta Lour.)Nghiên cứu thành phần hóa học, độc tính và một số tác dụng sinh học của cây An xoa (Helicteres hirsuta Lour.)Nghiên cứu thành phần hóa học, độc tính và một số tác dụng sinh học của cây An xoa (Helicteres hirsuta Lour.)Nghiên cứu thành phần hóa học, độc tính và một số tác dụng sinh học của cây An xoa (Helicteres hirsuta Lour.)Nghiên cứu thành phần hóa học, độc tính và một số tác dụng sinh học của cây An xoa (Helicteres hirsuta Lour.)Nghiên cứu thành phần hóa học, độc tính và một số tác dụng sinh học của cây An xoa (Helicteres hirsuta Lour.)Nghiên cứu thành phần hóa học, độc tính và một số tác dụng sinh học của cây An xoa (Helicteres hirsuta Lour.)Nghiên cứu thành phần hóa học, độc tính và một số tác dụng sinh học của cây An xoa (Helicteres hirsuta Lour.)Nghiên cứu thành phần hóa học, độc tính và một số tác dụng sinh học của cây An xoa (Helicteres hirsuta Lour.)

BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG HỌC VIỆN QN Y HỒNG ĐẮC THĂNG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HĨA HỌC, ĐỘC TÍNH VÀ MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA CÂY AN XOA (Helicteres hirsuta Lour.) LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÀ NỘI, 2023 BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHỊNG HỌC VIỆN QN Y HỒNG ĐẮC THĂNG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HĨA HỌC, ĐỘC TÍNH VÀ MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA CÂY AN XOA (Helicteres hirsuta Lour.) Ngành: Dược lý-Độc chất Mã số: 72 01 18 LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS TRƯƠNG THỊ THU HIỀN PGS TS HOÀNG LÊ TUẤN ANH HÀ NỘI, 2023 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam số liệu đề tài luận án phần số liệu đề tài nghiên cứu có tên: “Đánh giá tài nguyên thuốc tri thức địa loài dược liệu phục vụ phát triển cơng nghiệp hóa dược tỉnh Thừa Thiên Huế” Kết đề tài thành nghiên cứu tập thể mà tơi thành viên Tơi Chủ nhiệm đề tài tồn thành viên nhóm nghiên cứu đồng ý cho phép sử dụng đề tài vào luận án để bảo vệ lấy tiến sĩ Các số liệu, kết nêu luận án trung thực chưa công bố công trình khác Tác giả luận án Hồng Đắc Thăng LỜI CẢM ƠN Tơi hồn thành luận án với nỗ lực cố gắng thân Trong q trình học tập nghiên cứu, tơi nhận giúp đỡ động viên thầy, cô, đồng nghiệp người thân Tôi xin chân thành cảm ơn: Đảng ủy, Ban giám đốc Học viện Quân y, Phòng sau Đại học, Trung tâm Đào tạo, nghiên cứu Độc học phóng xạ - Học viện Quân Y, Viện Quân y 103, Viện bỏng Quốc gia Lê Hữu Trác, Viện nghiên cứu Khoa học Miền trung, Viện Cơng nghệ Sinh học, Viện Hóa Học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, cho phép, tạo điều kiện giúp đỡ tơi q trình học tập hồn thành luận án Đặc biệt, tơi xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc tới: TS Trương Thị Thu Hiền – Giảng viên Trung tâm Đào tạo, nghiên cứu Độc học phóng xạ - Học viện Quân Y PGS.TS Hoàng Lê Tuấn Anh Phó giám đốc Trung tâm Nghiên cứu Chuyển giao công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam người Thầy tận tình, hết lịng học trị, trực tiếp hướng dẫn, cung cấp cho kiến thức phương pháp luận quý báu suốt trình học tập, nghiên cứu Tơi xin trân trọng cảm ơn TS Hồng Anh Tuấn – Giám đốc Trung tâm Đào tạo, nghiên cứu Độc học phóng xạ, thầy cơ, đồng nghiệp Trung tâm giúp đỡ trình học tập nghiên cứu Tơi xin trân trọng cảm ơn thầy cô đồng nghiệp môn Dược lý, Viện Đào tạo Dược, Học viện Qn y giúp đỡ tơi q trình thực nghiệm, thu thập số liệu nghiên cứu Tôi xin trân trọng cảm ơn thầy cô Hội đồng Chấm luận án đóng góp nhiều ý kiến q báu giúp tơi hồn thành luận án Cuối tơi xin gửi lịng biết ơn tới gia đình, bạn bè, đồng nghiệp bên cạnh, động viên, chia sẻ khó khăn để tơi n tâm học tập hoàn thành luận án Nghiên cứu sinh Hoàng Đắc Thăng MỤC LỤC Trang phụ bìa Lời cam đoan Mục lục Danh mục chữ viết tắt luận án Danh mục bảng Danh mục biểu đồ Danh mục sơ đồ Danh mục ảnh ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan chi Helicteres 1.1.1 Phân loại 1.1.2 Thành phần hóa học tác dụng sinh học chi Helicteres L 1.2 Tổng quan An xoa (Helicteres hirsuta L.) 1.2.1 Nhận dạng thực vật 1.2.2 Thành phần hóa học An xoa 1.2.3 Tác dụng sinh học An xoa 1.2.4 Công dụng An xoa 1.3 Bệnh lý viêm gan, xơ gan 1.3.1 Tổng quan giai đoạn phát triển tổn thương gan 1.3.2 Cơ chế bênh viêm gan 11 1.3.3 Cơ chế bệnh xơ gan 14 1.3.4 Vai trò gốc oxy hóa bệnh gan 16 1.3.5 Tiến điều trị xơ gan dược liệu 20 1.4 Một số mơ hình thực nghiệm gây tổn thương gan thuốc hóa chất 23 1.4.1 Mơ hình tổn thương gan paracetamol 24 1.4.2 Mơ hình sử dụng carbon tetrachlorid gây tổn thương gan 27 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31 2.1 Đối tượng nghiên cứu 31 2.2 Hóa chất thiết bị 31 2.2.1 Hóa chất 31 2.2.2 Thiết bị 32 2.3 Động vật nghiên cứu 33 2.4 Phương pháp nghiên cứu 34 2.4.1 Phương pháp nghiên cứu thành phần hoá học 35 2.4.2 Phương pháp nghiên cứu tác dụng gây độc tế bào hợp chất 38 2.4.3 Phương pháp xác định độc tính cao chiết An xoa 40 2.4.4 Phương pháp nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa, bảo vệ gan cao chiết An xoa 44 2.4.5 Các xét nghiệm thực 52 2.5 Địa điểm nghiên cứu 55 2.6 Phương pháp xử lý số liệu 56 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 57 3.1 Thành phần hóa học hoạt tính gây độc tế bào ung thư gan hợp chất phân lập từ An xoa 57 3.1.1 Tạo cao chiết tồn phần dung mơi methanol nước 57 3.1.2 Chiết xuất phân lập hợp chất từ cao chiết methanol 57 3.1.3 Khả ức chế tế bào ung thư gan HepG2 số hợp chất 62 3.1.4 Hoạt tính cảm ứng apoptosis hợp chất HH7 63 3.2 Độc tính cao chiết An xoa 64 3.2.1 Độc tính cấp cao chiết An xoa 64 3.2.2 Độc tính bán trường diễn cao chiết HHM 66 3.3 Tác dụng chống oxy hoá bảo vệ gan An xoa 70 3.3.1 Tác dụng chống oxy hoá cao chiết in vitro 70 3.3.2 Tác dụng bảo vệ gan cao chiết An xoa in vitro 71 3.3.3 Tác dụng bảo vệ gan cấp tính cao chiết An xoa mơ hình gây tổn thương gan paracetamol 72 3.3.4 Tác dụng bảo vệ gan mơ hình gây xơ gan động vật thực nghiệm 73 3.3.5 Tác dụng điều trị xơ gan mơ hình gây xơ gan thực nghiệm 81 CHƯƠNG BÀN LUẬN 92 4.1 Thành phần hóa học hoạt tính gây độc tế bào ung thư gan hợp chất phân lập từ An xoa 92 4.1.1 Thành phần hóa học An xoa 92 4.1.2 Khả ức chế tế bào ung thư gan HepG2 số hợp chất 100 4.2 Độc tính cao chiết An xoa 103 4.2.1 Độc tính cấp cao chiết An xoa 103 4.2.2 Độc tính bán trường diễn cao chiết An xoa 104 4.3 Tác dụng chống oxy hoá, bảo vệ gan cao chiết An xoa 109 4.3.1 Tác dụng chống oxy hoá, bảo vệ gan in vitro 109 4.3.2 Tác dụng bảo vệ gan cấp tính mơ hình gây độc paracetamol 112 4.3.3 Tác dụng dự phòng xơ gan mơ hình gây xơ gan động vật thực nghiệm 114 4.3.4 Tác dụng điều trị xơ gan mơ hình gây xơ gan thực nghiệm 121 KẾT LUẬN 132 KIẾN NGHỊ 134 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH NGHIÊN CỨU CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CƠNG BỐ CĨ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT TT Phần viết tắt Phần viết đầy đủ Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance 13 ALP Alkalin phosphatase ALT Alanin Aminotransferase AST Aspartat Aminotransferase ATP Adenosin Triphosphat c.c Column chromatography (Sắc kí cột) CCl4 Carbon tetrachlorid DAMPs 10 ĐCSL 11 DEPT 12 DMSO Dimethyl sulfoxid 13 DNA Deoxyribonucleic acid 14 DPPH 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl 15 ECM Extracellular Matrix (Cấu trúc ngoại bào ) 16 FBS Fetal bovine serum (Huyết bào thai bò) 17 GGT γ-glutamin transpeptidase 18 GSH Glutathion 19 HCC 20 HE C-NMR H-NMR Spectroscopy (Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13) Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (Phổ cộng hưởng từ hạt nhận proton) Damage-associated molecular patterns (Các mẫu phân tử liên quan với tổn thương) Đối chứng sinh lý Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer (Phổ DEPT) Hepatocellular carcinoma (Ung thư biểu mô tế bào gan) Hematoxylin Eosin TT Phần viết tắt Phần viết đầy đủ Human hepatocellular carcinoma (Tế bào Ung thư gan 21 HepG2 22 HFD High-fat diet (Chế độ ăn nhiều chất béo) 23 HHD Phân đoạn dichloromethan cao chiết An xoa 24 HHE Phân đoạn ethyl acetate cao chiết An xoa 25 HHH Phân đoạn n-hexan cao chiết An xoa 26 HHM Cao chiết toàn phần methanol An xoa 27 HHW Cao chiết nước An xoa 28 HHWF Phân đoạn nước cao chiết cao chiết An xoa 29 HMBC 30 HMGB1 High mobility group box protein (Protein di động cao) 31 HSC Hematopoietic stem cells (Tế bào hình gan) 32 HST Huyết sắc tố 33 HSQC 34 Hyp 35 IC50 36 IL Interleukin 37 LD50 Lethal dose 50% (Lethal dose, 50%) 38 MDA Malonyl dialdehyde 39 MMPs 40 MTT 41 NAFLD người) Heteronuclear mutiple Bond Connectivity (Phổ tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết) Heteronuclear Single-Quantum Coherence (Phổ tương tác dị hạt nhân qua liên kết) Hydroxyproline Inhibitory concentration at 50% (Nồng độ ức chế 50% đối tượng thử nghiệm) Matrix Metalloproteinases (Enzym metalloproteinase ngoại bào) Methyl-thiazolyl tertrazolium Non-alcoholic fatty liver disease (Bệnh gan nhiễm mỡ không rượu) TT Phần viết tắt Phần viết đầy đủ Nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated 42 NF-κB B (Yếu tố hạt nhân tăng cường chuỗi nhẹ kappa tế bào B) Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (Phổ cộng 43 NMR 44 OD 45 OECD 46 PAR Paracetamol 47 PS Phosphatidylserine 48 RNA Ribonucleic acid 49 ROS Reactive oxygen species (Các gốc ôxy phản ứng ) 50 SRB Sulforhodamine B 51 TGF 52 TLC Thin layer chromatography (Sắc ký lớp mỏng) 53 TNF- Tumor necrosis factor anpha (Yếu tố hoại tử khối u 54 α-SMA α-Smooth muscle actin (Sợi alpha actin trơn) hưởng từ hạt nhân) Optical density (Mật độ quang học) Organisation for Economic Cooperation and Development (Tổ chức Hợp tác Phát triển Kinh tế ) Transforming growth factor (Yếu tố chuyển dạng tăng trưởng) anpha) PL32 Phụ lục 16 Số liệu phổ NMR hợp chất HH25 hợp chất tham khảo Pos δC δCa,b δH (mult., J in Hz) 37,4 37,3 - 48,2 48,1 1,99 (d, 17,5) a,c 2,48 (d, 17,5) 202,5 202,4 - 125,5 125,4 5,82 (s) 170,1 170,1 - 52,5 52,4 2,01 (m) 26,9 26,8 1,53 (m) 1,98 (m) 37,9 37,8 1,68 (m) 75,7 75,6 3,91 (m) 10 19,9 19,9 1,21 (d, 6,0) 11 29,1 29,1 1,03 (s) 12 27,6 27,5 1,11 (s) 13 25,0 24,9 2,07 (d, 1,0) 1ʹ 102,3 102,2 4,35 (d, 8,0) 2ʹ 75,3 75,2 3,16 (m) 3ʹ 78,3 78,2 3,36 (m) 4ʹ 72,0 71,9 3,28 (m) 5ʹ 78,0 77,9 3,27 (m) 6ʹ 63,1 62,3 3,67 (dd, 5,5, 11,5) 3,89 (dd, , 11,5) a) đo CD3OD, b) đo 125 MHz, c) đo 500 MHz, #)δC hợp chất byzantionoside B [162] PL33 Cấu trúc hóa học tương tác HM C HH25 Hợp chất HH25 thu dạng chất bột, màu trắng Trên phổ 1HNMR HH25 quan sát thấy tín hiệu 12 proton thuộc bốn nhóm methyl δH 1,03 (3H, s), 1,21 (3H, d, J = 6,0 Hz), 1,11 (3H, s), 2,07 (3H, d, J = 1,0 Hz); hai oxygenated methylene proton δH 3,67 (1H, dd, J = 5,5, 11,5 Hz) 3,89 (1H, dd, J = 1,5, 11,5 Hz) proton anome δH 4,35 (1H, d, J = 8,0 Hz) Phân tích tín hiệu phổ 13C-NMR HSQC HH25 xác định có mặt 19 carbon bao gồm 13 carbon thuộc phần khung megastigmane δC 19,9, 24,9, 26,8, 27,5, 29,1, 37,3, 37,8, 48,1, 52,4, 75,6, 125,4, 170,1 202,4 sáu carbon đặc trưng phần đường glucopyranosyl δC 62,3, 71,9, 75,2, 77,9, 78,2 102,2 Các tín hiệu tương tác HMBC từ H-13 (δH 2,07) đến C-4 (δC 125,4)/ C-5 (δC 170,1)/ C-6 (δC 52,4) xác định vị trí liên kết đơi C-4/C-5 Bên cạnh đó, tương tác H-2 (δH 1,99, 2,48) với C-3 (δC 202,4) H-1ʹ (δH 4,35) với C-9 (δC 75,6) xác định vị trí nhóm ketone C-3 phần đường gắn kết với phần khung megastigmane C-9 thơng qua cầu ether Từ phân tích kết hợp so sánh số liệu phổ NMR với tài liệu công bố hợp chất HH25 xác định byzantionoside B [162] PL34 Phụ lục 17 Số liệu phổ NMR hợp chất HH26 hợp chất tham khảo Pos δC δCa,b δH (mult., J in Hz) 136,46 136,5 - 114,17 114,3 6,85 (d, 2,0) 150,78 150,9 - 146,34 146,4 - 118,30 118,4 7,11 (d, 8,0) 122,10 122,1 6,75 (dd, 2,0, 8,0) 40,74 40,7 3,35 (m) 138,98 139,0 5,97 (m) 115,86 115,8 5,06 (m) 1ʹ 103,08 103,2 4,86 (d, 7,5) 2ʹ 74,93 75,0 3,50 (m) 3ʹ 77,82 77,9 3,48 (m) 4ʹ 71,35 71,4 3,41 (m) 5ʹ 78,15 78,2 3,40 (m) 6ʹ 62,51 62,6 3,71 (dd, 5,5, 12,0) a,c 3,89 (dd, 2,0, 12,0) OCH3 a) 56,70 56,8 8,86 (s) đo CD3OD, b) đo 125 MHz, c) đo 500 MHz, #)δC hợp chất citrusin C [163] Cấu trúc hóa học tương tác HM C HH26 Hợp chất HH26 thu dạng chất bột màu trắng Trên phổ 1HNMR HH26 xuất tín hiệu ba proton thơm thuộc hệ ABX δH 6,75 (1H, dd, J = 2,0, 8,0 Hz), 6,85 (1H, d, J = 2,0 Hz), 7,11 (1H, d, J = 8,0 PL35 Hz); ba olefinic proton thuộc nhóm vinyl δH 5,97 (1H, m), 5,06 (2H, m); anomeric proton δH 4,86 (1H, d, J = 7,5 Hz); ba proton thuộc nhóm methoxy δH 3,86 (3H, s) Phân tích tín hiệu phổ 13C-NMR HSQC HH26 xác định có mặt sáu carbon thuộc vòng thơm ABX δC 114,3, 118,4, 122,1, 136,5, 146,4 150,9; sáu carbon đặc trưng phần đường glucopyranosyl δC 62,6, 71,4, 75,0, 77,9, 78,2 103,2; hai olefinic carbon thuộc nhóm vinyl δC 115,8 139,0; nhóm methylene δC 40,7 nhóm methoxy δC 56,8 Các tương tác HMBC H-8 (δH 5,97)/ H-9 (δH 5,06) với C-7 (δC 40,7) xác định có mặt nhóm allyl Bên cạnh đó, tương tác H-7 (δH 3,35) với C-2 (δC 114,3)/ C-6 (δC 122,1) xác định nhóm allyl kết nối với vịng phenyl C-1 Vị trí nhóm methoxy C-3 phần đương C-4 xác định dựa vào tương tác HMBC proton thuộc nhóm methoxy (δH 3,86) với C-3 (δC 150,9) anomeric proton H-1ʹ (δH 4,86) với C-4 (δC 146,4) Từ phân tích trên, hợp chất HH26 xác định citrusin C [163] PL36 Phụ lục 18 Số liệu phổ NMR hợp chất HH27 hợp chất tham khảo C δC# δCa δHa (mult., J = Hz) 158.5 158.6 - 135.6 135.6 - 179.4 179.4 - 162.9 163.0 - 99.9 100.1 6.22 (s) 166.0 166.5 - 94.8 95.0 159.3 159.3 - 10 105.6 105.5 - 1′ 123.1 123.1 - 2′ 117.6 117.7 7.69 (s) 3′ 145.8 145.9 - 4′ 149.8 149.8 - 5′ 116.0 116.1 6.99 (d, 8.0) 6′ 123.5 123.6 7.65 (d, 8.0) 1′′ 104.6 104.8 5.12 (d, 7.5) 2′′ 75.7 75.7 3′′ 78.2 78.2 4′′ 71.4 71.4 5′′ 77.2 77.2 6′′ 68.5 68.6 6.41 (s) O-Glc O-Rha 1′′′ 102.4 102.4 2′′′ 72.1 72.1 4.54 (br s) PL37 δC# C δCa 3′′′ 72.2 72.2 4′′′ 73.9 73.9 5′′′ 69.7 69.7 6′′′ 17.8 17.9 δHa (mult., J = Hz) 1.14 (d, 6.5) đo CD3OD; Glc, glucopyranosyl; Rha, rhamnopyranosyl; #δC rutin đo a) CD3OD [164] Cấu trúc hóa học hợp chất HH27 Hợp chất HH27 thu dạng bột màu vàng Trên phổ 1H-NMR hợp chất HH27 thấy xuất tín hiệu proton thơm H 6.22 (1H, s) 6.41 (1H, s), 6.99 (1H, d, J = 8.0 Hz), 7.65 (1H, d, J = 8.0 Hz) 7.69 (1H, s) Thêm vào đó, hai proton anomeric δH 4.54 (1H, br s), 5.12 (1H, d, J = 7.5 Hz), nhóm metyl δH 1.14 (3H, d, J = 6.0 Hz) cho thấy có mặt đơn vị đường glucose rhamnose Trên phổ C-NMR xuất tín hiệu 27 carbon, có 15 13 carbon đặc trưng cho flavonol 12 carbon đặc trưng cho phân tử đường glucose rhamnose Từ kiện phổ trên, so sánh với hợp chất rutin, hợp chất HH27 xác định rutin [164] PL38 Phụ lục 19 Số liệu phổ NMR hợp chất HH28 hợp chất tham khảo Pos δC δCa,b 37,3 37,4 δH (mult., J in Hz) a,c 1,44 (m) 1,80 (m) 68,6 68,7 3,86 (dt, 3,5, 11,5) 68,5 68,5 3,97 (br s) 32,7 32,8 1,74 (m) 51,7 51,8 2,39 (d, 5,0) 206,6 206,5 - 122,1 122,1 5,83 (d, 2,5) 168,1 168,0 - 35,0 35,2 2,26 (td, 5,0, 12,5) 10 39,3 39,3 - 11 21,5 21,5 1,70 (m) 1,80 (m) 12 32,4 32,5 1,90 (m) 2,16 (td, 5,0, 12,5) 13 48,6 48,7 - 14 85,2 85,2 - 15 31,7 31,8 1,62 (m) 1,98 (m) 16 21,5 21,5 1,75 (m) 2,01 (m) 17 50,5 50,5 2,42 (d, 2,5) 18 18,1 18,0 0,91 (s) 19 24,4 24,4 0,99 (s) 20 78,0 77,9 - PL39 Pos δC δCa,b δH (mult., J in Hz) 21 21,1 21,1 1,22 (s) 22 78,4 78,4 3,36 (d, 5,0) 23 27,3 27,3 1,31 (m) a,c 1,68 (m) 24 42,3 42,4 1,46 (m) 1,82 (m) 25 71,4 71,3 - 26 29,1 29,0 1,21 (s) 27 29,7 29,7 1,24 (s) a) đo CD3OD, b) đo 125 MHz, c) đo 500 MHz, #)δC hợp chất 20hydroxyecdysone [165] Cấu trúc hóa học tương tác HM C HH28 Hợp chất HH28 thu dạng tinh thể, màu trắng Trên phổ 1HNMR HH28 xuất tín hiệu năm nhóm methyl δH 0,91 (3H, s), 0,99 (3H, s), 1,22 (3H, s), 1,21 (3H, s) 1,24 (3H,s); olefinic proton δH 5,83 (1H, d, J = 2,5 Hz); ba oxygenated proton δH 3,86 (1H, dt, J = 3,5, 11,5 Hz), 3,97 (1H, br s), 3,36 (1H, d, J = 5,0 Hz) Phân tích tín hiệu phổ 13C-NMR HSQC HH28 xác định có mặt 27 carbon gồm bảy carbon khơng liên kết với hydro δC 39,3, 48,7, 71,3, 77,9, 85,2, 168,0 206,5; bảy methine carbon δC 35,2, 50,5, 51,8, 68,5, 68,7, 78,4 122,1; tám methylene carbon δC 21,5 (2xC), 27,3, 31,8, 32,5, 32,8, 37,4 42,4; năm methyl carbon δC 18,0, 21,1, 24,4, 29,0 29,7; PL40 Dữ liệu phổ NMR thu cho phép dự đoán HH28 ecdysone steroid Các tương tác HMBC từ H-19 (δH 0,99) đến C-1 (δC 37,4)/ C-5 (δC 51,8)/ C-9 (δC 35,2)/ C-10 (δC 39,3) từ H-5 (δH 2,39)/H-2 (δH 3,86) đến C-3 (δC 68,5) xác định có mặt nhóm hydroxy C-2, C-3 Vị trí nhóm ketone C-6 liên kết đôi C-7/C-8 xác định bởi tương tác từ H-4 (δH 1,74)/ H-5 (δH 2,39) đến C-6 (δC 206,5) tương tác từ H-7 (δH 5,83) đến C-5 (δC 51,8)/ C-9 (δC 35,2)/ C-14 (δC 85,2) Ngoài ra, tương tác HMBC từ H-21 (δH 1,22) đến C-17 (δC 50,5)/ C-20 (δC 77,9)/ C-22 (δC 78,4) xác định có mặt nhóm hydro C-20 C-22 Từ phân tích kết hợp so sánh số liệu phổ NMR với tài liệu công bố [165] hợp chất HH28 xác định 20-hydroxyecdysone [165] PL41 Phụ lục 20 Số liệu phổ NMR hợp chất HH29 hợp chất tham khảo Pos δC δCa,b δH (mult., J in Hz) 131,29 135,3 - 105,46 105,5 6,77 (s) 154,35 154,4 - 135,27 135,9 - 154,35 154,4 - 105,46 105,5 6,77 (s) 135,88 131,3 6,57 (d, 16,0) 130,06 130,1 6,35 (d, 16,0) 63,59 63,6 4,24 (dd, 2,0, 11,5) 1ʹ 105,35 105,4 4,89 (d, 7,5) 2ʹ 75,73 75,8 3,50 (m) 3ʹ 77,82 77,9 3,44 (m) 4ʹ 71,34 71,4 3,43 (m) 5ʹ 78,36 78,4 3,23 (m) 6ʹ 62,58 62,6 3,69 (dd, 5,5, 12,0) a,c 3,80 (dd, 2,5, 12,0) 3ʹ, 5ʹ-OCH3 a) 57,05 57,1 3,88 (s) đo CD3OD, b) đo 125 MHz, c) đo 500 MHz, #)δC hợp chất siringin [95] PL42 Phụ lục 21 Số liệu phổ NMR hợp chất HH30 hợp chất tham khảo Pos δC# δCa,b 147,5 147,7 - 139,0 138,2 - 173,6 174,9 - 121,8 116,7 7,57 (d, 8,5) 117,5 115,1 6,98 (d, 8,5) 155,5 156,9 - 134,3 134,1 - 150,1 151,4 - 10 114,5 116,4 - 1ʹ 125,7 124,2 - 2ʹ 127,2 131,0 8,26 (d, 8,5) 3ʹ 116,3 116,3 8,95 (d, 8,5) 4ʹ 160,7 160,5 - 5ʹ 116,3 116,3 8,95 (d, 8,5) 6ʹ 127,2 131,0 8,26 (d, 8,5) a) δH (mult., J in Hz) a,c đo CD3OD, b) đo 125 MHz, c) đo 500 MHz #)δC hợp chất 3,4ʹ,7,8tetrahydroxyflavone đo (CD3)2SO [99] PL43 Phụ lục 22 Số liệu phổ NMR hợp chất HH31 hợp chất tham khảo C δC δCa) 146,8 147,7 - 135,6 135,8 - 175,7 175,9 - 160,6 160,8 - 98,1 98,3 6,19 (d, 2,0) 163,8 164,0 - 93,3 93,4 6,42 (d, 2,0) 156,1 156,2 - 10 103,0 103,0 - 1′ 121,9 122,0 - 2′ 115,1 115,1 7,68 (d, 2,0) 3′ 145,0 145,1 - 4′ 147,6 147,7 - 5′ 115,5 115,7 6,90 (d, 8,5) 6′ 119,9 120,1 7,42 (dd,0, 8,5) a) δHa) (mult,, J, Hz) Đo DMSO, δC quercetin [166] Cấu trúc hóa học hợp chất HH31 Hợp chất HH31 thu dạng bột vô định hình màu vàng triển khai sắc ký màu dung dịch sunforic acid 10% thấy xuất màu vàng nên dự đoán hợp chất flavonoid PL44 Trên phổ 1H-NMR hợp chất HH31 thấy xuất tín hiệu proton thơm đặc trưng hợp chất flavonoid với vùng tín hiệu H từ 6,19 ppm đến 7,68 ppm Sự xuất tín hiệu proton vịng thơm thuộc hệ tương tác spin-spin ABX H 7,42 (dd, 2,0, J = 8,5 Hz), 6,90 (d, J = 8,5 Hz ) 7,68 (d, J = 2,0 Hz) cho thấy nhóm vào vịng B phải nằm ở vị trí C-3′ C-4′ Trên phổ cịn xuất hai tín hiệu giá trị H 6,19 (d, J = 2,0 Hz) 6,38 (d, J = 2,0 Hz) khẳng định vịng A bị vị trí dấu hiệu nhận biết hợp chất flavonol Phổ 13C-NMR hợp chất HH31 xuất tín hiệu 15 carbon thơm đặc trưng hợp chất flavone C 93,4, 98,3, 103,0, 115,1, 115,7, 120,1, 122,0, 135,8, 145,1, 147,7 (x2), 156,2, 160,8, 164,0 175,9, Phân tích số liệu phổ NMR HH31 kết hợp so sánh với số liệu phổ hợp chất quercetin tài liệu cơng bố XHH31 thấy hồn tồn phù hợp, từ kết luận hợp chất HH31 quercetin (3,3′,4′,5,7pentahydroxyflavone) flavonoid phân lập từ nhiều loại thực vật thiên nhiên [166] PL45 Phụ lục 23 Số liệu phổ NMR hợp chất HH32 hợp chất tham khảo C δC# δCa,b δHa,c (mult., J = Hz) 157.1 157.1 - 134.2 134.1 - 177.6 177.6 - 161.2 161.2 - 98.7 98.9 6.19 (s) 164.2 164.9 - 93.7 93.8 6.38 (s) 156.4 156.5 - 10 104.1 103.9 - 1′ 120.5 120.5 - 2′, 6′ 130.5 130.5 7.75 (d, 8.5) 3′, 5′ 115.3 115.4 6.91 (d, 8.5) 4′ 159.9 160.0 - 3-O-rhamopyranoside a 1″ 101.7 101.8 5.30 (br s) 2″ 70.3 70.3 3.47 (m) 3″ 70.5 70.6 3.12 (m) 4″ 71.1 71.1 3.12 (m) 5″ 70.0 70.1 3.98 (m) 6″ 17.4 17.4 0.80 (d, 5.5) đo DMSO-d6, δC kaempferol-3-O- rhamnoside đo DMSO-d6 [104] PL46 Cấu trúc hóa học hợp chất HH32 Hợp chất HH32 phân lập dạng bột vơ định hình màu vàng Trên phổ 1H-NMR hợp chất HH32 thấy xuất tín hiệu proton thơm đặc trưng hợp chất flavonoid Ngồi ra, tín hiệu phần tử đường xác định phổ Trong đó, tín hiệu proton anome xuất H 5,30 (1H, br s), tín hiệu nhóm methyl bậc hai 0,80 (3H, d, J = 5,5 Hz) gợi ý có mặt đường rhamnose Phổ 13 C-NMR hợp chất HH32 xuất tín hiệu 21 carbon, có nhóm methyl C 17,4, mười nhóm methine từ C 70.1 đến C 130,5, nhóm carbonyl C 177,6 tám carbon không liên kết trực tiếp với hydro từ C 103,9 đến C 164,9 Những tín hiệu gợi ý cho có mặt khung flavon dạng kaempferol có 15 nguyên tử carbon phân tử đường rhamnose có carbon Từ phân tích nêu trên, số liệu phổ 13C-NMR hợp chất HH32 so sánh với số liệu công bố cho hợp chất keampferol-3-Oα-L-rhamnopyranoside, nhận phù hợp hồn tồn vị trí tương ứng [104] Hợp chất cịn có tên gọi khác kaempferin hay afzelin hợp chất phát từ nhiều loài thực vật khác