Khóa luận tốt nghiệp đại học nghiên cứu khả năng nhân giống lan hài vân nam (paphiopedilum callosum) từ phôi bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM o0o - Th NGUYỄN THỊ THU HẰNG N Tên đề tài: gu “NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHÂN GIỐNG LAN HÀI VÂN NAM n ye (Paphiopedilum callosum) TỪ PHÔI BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY IN VITRO” ve ni U ity rs KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC – U TN Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Khoa : CNSH - CNTP Khoá học : 2015 - 2020 Thái Nguyên, năm 2020 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM o0o - Th NGUYỄN THỊ THU HẰNG gu N Tên đề tài “NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHÂN GIỐNG LAN HÀI VÂN NAM ye (Paphiopedilum callosum) TỪ PHÔI BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY n rs ve ni U IN VITRO” ity KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC – : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Lớp : K47 CNSH Khoa : CNSH - CNTP Khoá học : 2015 - 2019 U TN Hệ đào tạo Giảng viên hướng dẫn: ThS Nguyễn Thị Tình Thái Nguyên, năm 2020 i LỜI CẢM ƠN Được sự đồng ý của Ban giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm, thời gian thực tập tốt nghiệp em đã thực hiện đề tài:“Nghiên cứu khả nhân giống lan hài Vân Nam (Paphiopedilum callosum) từ phôi kỹ thuật nuôi cấy invitro” Trang đầu tiên của khoá luận này em xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm cùng các thầy cô giáo Khoa đã tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành đề tài nghiên Th cứu này Đặc biệt, em xin cám ơn ThS Nguyễn Thị Tình đã giúp đỡ và tạo điều kiện N tốt nhất cho em śt quá trình thực tập tớt nghiệp gu Ći cùng, em xin cảm ơn gia đình đã tạo điều kiện vật chất và là chỗ ye dựa tinh thần cho em suốt thời gian thực tập, cảm ơn bạn bè đã hết lòng động n viên, giúp đỡ suốt thời gian qua U ni Trong quá trình thực tập, cũng là quá trình làm báo cáo thực tập thời gian ve có hạn không tránh khỏi sai sót Em rất mong nhận được ý kiến đóng rs góp của thầy cô và các bạn để đề tài của em được hoàn thiện ity Lời cuối em xin kính chúc các thầy, cô giáo nhà trường, khoa Công – nghệ Sinh học và Công nghệ thực phẩm, cùng các bạn đồng nghiệp sức khoẻ, thành Em xin chân thành cảm ơn! U TN công cuộc sống Thái Nguyên, ngày tháng năm 2020 Sinh viên thực hiện Nguyễn Thị Thu Hằng ii DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu 21 Bảng 4.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả nhân nhanh chồi từ phôi lan hài Vân Nam (sau 40 ngày nuôi cấy) 28 Bảng 4.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với Kinetin đến khả nhân nhanh chồi của lan hài Vân Nam 30 Th Bảng 4.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với Kinetin và TDZ đến khả nhân nhanh giống lan hài Vân Nam (sau 30 ngày gu N nuôi cấy) 33 Bảng 4.4 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả rễ ye lan hài Vân Nam (sau 30 ngày nuôi cấy) 36 n U Bảng 4.5 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của NAA kết hợp với than hoạt tính đến ity rs ve ni khả rễ lan hài Vân Nam (sau 30 ngày nuôi cấy) 38 – U TN iii DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Hình ảnh về lan hài Vân Nam (Paphiopedilum callosum) 10 Hình 3.1 Sơ đồ nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng đến khả tái sinh, nhân nhanh chồi từ phôi và rễ của lan hài Vân Nam 23 Hình 4.1 Hình ảnh ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả nhân nhanh chồi lan hài Vân Nam (sau 40 ngày nuôi cấy) 30 Th Hình 4.2 Hình ảnh BA kết hợp với Kinetin đến khả nhân nhanh chồi của lan hài Vân Nam 32 gu N Hình 4.3 Hình ảnh ảnh hưởng của BA kết hợp với Kinetin và TDZ đến khả nhân nhanh giống lan hài Vân Nam (sau 30 ngày nuôi cấy) 35 ye Hình 4.4 Hình ảnh rễ bị ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả rễ n U lan hài Vân Nam (sau 30 ngày nuôi cấy) 37 ve ni Hình 4.5 Hình ảnh rễ bị ảnh hưởng của NAA kết hợp với than hoạt tính đến khả rễ lan hài Vân Nam (sau 30 ngày nuôi cấy) 40 ity rs – U TN iv DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 4.1 Ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả nhân nhanh chồi lan hài Vân Nam (sau 40 ngày nuôi cấy) 28 Biểu đồ 4.2 BA kết hợp với Kinetin đến khả nhân nhanh chồi của lan hài Vân Nam 31 Biểu đồ 4.3 Ảnh hưởng của BA kết hợp với Kinetin và TDZ đến khả Th nhân nhanh giống lan hài Vân Nam (sau 30 ngày nuôi cấy) 33 Biểu đồ 4.4 Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả rễ lan hài Vân N Nam (sau 30 ngày nuôi cấy) 36 gu Biểu đồ 4.5 Ảnh hưởng của NAA kết hợp với than hoạt tính đến khả n ye rễ lan hài Vân Nam (sau 30 ngày nuôi cấy) 39 ity rs ve ni U – U TN v MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i DANH MỤC BẢNG ii DANH MỤC HÌNH iii DANH MỤC BIỂU ĐỒ iv MỤC LỤC v DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT viii Th Phần MỞ ĐẦU 1.1.Đặt vấn đề N gu 1.2 Mục tiêu của đề tài ye 1.3 Yêu cầu của đề tài n 1.4 Ý nghĩa khoa học thực tiễn U ni 1.4.1 Ý nghĩa khoa học của đề tài ve 1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn của đề tài ity rs Phần TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan về lan Hài (Paphiopedilum) – 2.1.1 Phân loại và nguồn gốc U TN 2.1.2 Đặc điểm hình thái 2.1.3 Sinh thái 2.1.4 Hiện trạng lan Hài Việt Nam 2.2 Giới thiệu về giống lan hài Vân Nam 2.2.1 Nguồn gốc và sự phân bố 2.2.2 Hình thái 2.2.3 Các điều kiện bản để nuôi trồng giống lan hài Vân Nam 10 2.3 Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật 12 2.3.1 Sự phân hoá tế bào 12 vi 2.3.2 Sự phản phân hoá tế bào 12 2.3.3 Một sớ ́u tớ ảnh hưởng đến quá trình ni cấy mô tế bào thực vật 12 2.3.4 Môi trường dinh dưỡng 13 2.4 Tình hình nghiên cứu về ni cấy mô lan Hài thế giới và nước 17 2.4.1 Tình hình nghiên cứu về ni cấy mô lan Hài thế giới 17 2.4.2 Tình hình nghiên cứu về ni cấy mơ lan Hài nước 19 Phần ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 3.1 Vật liệu, hoá chất và thiết bị nghiên cứu 21 Th 3.1.1 Đối tượng, vật liệu nghiên cứu 21 3.1.2 Hoá chất sử dụng 21 N gu 3.1.3 Thiết bị,dụng cụ nghiên cứu 21 ye 3.2 Phạm vi, địa điểm và thời gian nghiên cứu 22 n 3.2.1 Phạm vi nghiên cứu 22 U ni 3.2.2 Địa điểm nghiên cứu 22 ve 3.2.2 Thời gian nghiên cứu 22 ity rs 3.3 Nội dung nghiên cứu 22 3.3.1 Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA, Kinetin, TDZ đến – khả nhân nhanh chồi lan hài Vân Nam 22 U TN 3.3.2 Nội dung 2: Xác định môi trường rễ tạo hoàn chỉnh lan hài Vân Nam 22 3.4 Phương pháp nghiên cứu 22 3.4.1 Chuẩn bị môi trường nuôi cấy mô 22 3.4.2 Phương pháp nghiên cứu 23 3.4.3 Phương pháp bố trí thí nghiệm 23 3.5 Phương pháp đánh giá và xử lý số liệu 26 3.5.1 Thu thập số liệu 26 3.5.2 Các tiêu theo dõi 26 3.5.3 Phương pháp sử lý số liệu 27 vii Phần KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 28 4.1 Kết quả ảnh hưởng của nồng độ BA, Kinetin, TDZ đến khả nhân nhanh chồi từ phôi lan hài Vân Nam 28 4.1.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả nhân nhanh chồi lan hài Vân Nam (sau 40 ngày nuôi cấy) 28 4.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với Kinetin đến khả nhân nhanh giống lan hài Vân Nam 30 4.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với Kinetin và TDZ đến Th khả nhân nhanh giống lan hài Vân Nam 32 4.4 Kết quả nghiên cứu môi trường rễ tạo hoàn chỉnh lan hài Vân Nam N gu 35 ye 4.4.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả rễ của n lan hài Vân Nam 35 U ni 4.4.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của NAA kết hợp với than hoạt tính đến ve khả nhân nhanh lan hài Vân Nam 38 ity rs Phần KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41 5.1 Kết luận 41 – 5.2 Kiến nghị 41 U TN TÀI LIỆU THAM KHẢ0 42 PHỤ LỤC viii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT : Thidiazol BA : 6-Benzyl amino purine CS : Cộng sự CT : Công thức CV : Coeficient of Variation Đ/C : Đối chứng Kinetin : 6-Furfurylaminopurine LSD : Least Singnificant Difference Test : Murashighe Skoog, 1962 MT : α-Napthalene acetic acid : Paphiopedilum malipones n P malipoens : Môi trường ye NAA gu N MS Th TDZ U : Than hoạt tính TN : Thí nghiệm RE : Robert Ernst ity rs ve ni THT – U TN 32 kích thích mẫu phân chia mạnh nhất nên số chồi mới sinh nhiều nhất Ở CT5 tương ứng với nồng độ 2,0 mg/l Kinetin hệ số nhân chồi thấp so với CT4 Nồng độ Kinetin thích hợp kích thích chồi sinh trưởng, nhiên nồng độ Kinetin tăng cao, vượt quá ngưỡng cần thiết có thể ức chế khả tạo chồi Th N CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 gu (xanh đậm, mập) (xanh đậm, mập) (xanh đậm, mập) (xanh đậm, mập) (xanh nhạt, gầy) ye Hình 4.2 Hình ảnh BA kết hợp với Kinetin đến khả nhân nhanh chồi n lan hài Vân Nam ni U CT1: 0,5 mg/l BA+ 0mg/l Kinetin ; 0,5 mg/l BA+ 0,5mg/l Kinetin CT3: 0,5 mg/l BA+ 1mg/l Kinetin; CT4: 0,5 mg/l BA+ 1,5mg/l Kinetin;CT5: 0,5 mg/l BA+ 2mg/l ve Kinetin rs nhân nhanh giống lan hài Vân Nam ity 4.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng BA kết hợp với Kinetin và TDZ đến khả – U TN TDZ là cytokinin ít bị phân huỷ bởi emzyme nội sinh so với các cytokinin khác, đó nó có hoạt tính cao và có thể cho hệ số nhân chồi cao các cytokinin khác Vì vậy thí nghiệm này, chúng tơi sử dụng nồng độ BA kết hợp với Kinetin thích hợp nhất quá trình nhân nhanh (cơng thức thích hợp nhất ở thí nghiệm trước) kết hợp với TDZ ở các nồng độ để nghiên cứu ảnh hưởng của BA, Kinetin, TDZ đến khả nhân nhanh giống lan hài Vân Nam 33 Bảng 4.3 Kết nghiên cứu ảnh hưởng BA kết hợp với Kinetin và TDZ đến khả nhân nhanh giống lan hài Vân Nam (sau 30 ngày nuôi cấy) Nồng độ Nồng độ Số mẫu Công Nồng độ Tổng số Hệ số chồi thu nhân Chât lượng được chồi chồi (chồi) (lần) Kinetin TDZ nuôi cấy (mg/l) (mg/l) (mẫu) CT 0,0 30 65 2,17 Xanh đậm, mập CT 0,5 30 73 2,43 Xanh đậm, mập 1,0 30 85 2,83 Xanh đậm, mập 1,5 30 62 2,07 Xanh, bé 2,0 30 59 1,19 Xanh, bé thức BA (mg/l) 1,5 CT 0,5 Th CT LSD05 gu N CT 0,17 ye CV (%) 4,0 n ni U Kết quả thí nghiệm được biểu thị qua biểu đồ 4.3: 2.83 ity rs ve Hệ số nhân chồi (lần) 2.43 2.5 2.07 – 2.17 U TN 1.5 1.19 Hệ số nhân chồi (lần) 0.5 CT CT CT CT CT Biểu đồ 4.3 Ảnh hưởng BA kết hợp với Kinetin và TDZ đến khả nhân nhanh giống lan hài Vân Nam (sau 30 ngày nuôi cấy) 34 Từ kết quả bảng 4.3 biểu đồ 4.3 ta nhận thấy: Ở tiêu hệ số nhân chồi với giá trị LSD05 đạt 0,17 các công thức thí nghiệm có sự sai khác có ý so với công thức đối chứng ở mức độ tin cậy 95% Khi bổ sung BA 0,5 mg/l, Kinetin 1,5 mg/l và TDZ từ 0,0 - 2,0 mg/l vào môi trường nuôi cấycho thấy ảnh hưởng đến khả nhân chồi lan hài Vân Nam Các công thức có bổ sung TDZ đều cho hệ số nhân chồi cao công thức đối chứng không bổ sung TDZ (công thức đối chứng có hệ số nhân chồi đạt 2,17 lần) Khi tăng nồng độ TDZ từ 0,0 - 1,0 mg/l tổng số chồi thu được và hệ số nhân chồi có xu hướng Th tăng lên, ở công thức đối chứng TDZ nồng độ 0,5 mg/l cho tổng số chồi thu được là 73 chồi và hệ số nhân là 2,43lần Trong thí nghiệm này, nồng độ TDZ 1,0 mg/l N cho tổng số chồi thu được là 85 chồi và hệ số nhân cao nhất là 2,83 lần Tuy nhiên, gu nồng độ TDZ từ 1,5 - 2,0 mg/l thu được tổng số chồi và hệ số nhân giảm, ở CT4 ye tổng số chồi thu được là 62 chồi và hệ số nhân là 2,07 lần; CT5 tổng số chồi thu n được là 59 chồi và hệ số chồi là 1,19 lần U ni Chất lượng chồi: Với CT đối chứng (TDZ 0,0 mg/l) cho chất lượng chồi thu ve được xanh nhạt, mập Khi tăng dần nồng độ TDZ từ 0,5 - 1,0 mg/l chất lượng rs chời xanh nhạt, mập lên chời xanh đậm mập, khuôn khổ thí nghiệm này, CT ity bổ sung TDZ từ 0,5 - 1,0 mg/l cho chất lượng chồi tốt nhất Tăng nồng độ TDZ từ – 1,5 - 2,0 mg/l chất lượng chời giảm xuống, chồi thu được xanh, bé U TN Kết quả thí nghiệm được giải thích sau: TDZ là chất kích thích sinh trưởng có tác dụng kích thích tế bào phân chia hình thành chời mới Ở cơng thức đối chứng không có TDZ môi trường nuôi cấy nên khả tạo chồi thấp các công thức bổ sung TDZ Ở CT2 với nồng độ TDZ 0,5 mg/l có tác dụng kích thích phát triển chồi mới nồng độ TDZ thấp nên mẫu ít chịu tác động kích thích phân chia tế bào của chất này Ở CT3 cho hệ số nhân chồi cao nhất là TDZ 1,0 mg/l kích thích mẫu sinh trưởng và phát triển tốt nhất, đồng thời tế bào phân chia mạnh mẽ nhất Khi nồng độ TDZ tăng dần từ 1,5 – 2,0 mg/l ứng với CT4, CT5 cho thấy chồi nhỏ chồi này không thể kéo dài hoặc bị biến dạng, nồng độ TDZ càng cao hệ sớ nhân chời càng giảm dần 35 Kết luận khuôn khổ thí nghiệm này, để nâng cao hệ số nhân chồi cần bổ sung BA 0,5 mg/l; Kinetin 1,5 mg/l, TDZ 1,0 mg/l thu được số chồi lớn nhất là 85 với hệ số nhân chồi là 2,83 Th CT3 CT4 gu CT2 N CT1 CT5 ye (xanh đậm, mập) (xanh đậm, mập) (xanh đậm , mập) ( xanh ,bé ) (xanh, bé ) n Hình 4.3 Hình ảnh ảnh hưởng BA kết hợp với Kinetin và TDZ đến khả ni U nhân nhanh giống lan hài Vân Nam (sau 30 ngày nuôi cấy) ve CT1: 0,5 mg/l BA+ 0mg/l Kinetin + 0mg/lTDZ+ ; CT2 0,5 mg/l BA+ 0,5mg/l rs Kinetin + 0,5mg/lTDZ ; CT3: 0,5 mg/l BA+ 1mg/l Kinetin + 1mg/lTDZ; CT4: 0,5 ity mg/l BA+ 1,5mg/l Kinetin + 1,5mg/lTDZ;CT5: 0,5 mg/l BA+ 2mg/l Kinetin + – 2mg/lTDZ U TN 4.4 Kết quả nghiên cứu môi trường rễ tạo hoàn chỉnh lan hài Vân Nam 4.4.1 Kết nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ NAA đến khả rễ lan hài Vân Nam Bộ rễ là quan rất quan trọng đối với tất cả các loài thực vật Trong nuôi cấy mô, sau nhân chồi với số lượng lớn, giai đoạn tiếp theo là tạo hoàn chỉnh để đưa ngoài vườn ươm Khi mợt ḿn chủn tự nhiên có một bộ rễ khỏe mạnh, hoàn chỉnh giúp có khả hút nước và dinh dưỡng khoáng tốt, làm tiền đề cho sự sinh trưởng và phát triển sau này Vì vậy, giai đoạn kích thích tạo rễ của các chồi là giai đoạn quan trọng và không thể thiếu Sau kết thúc giai đoạn nhân nhanh tạo 36 số lượng chồi lan hài Vân Nam đồng nhất và khỏe mạnh, các chồi tạo thành đạt tiêu chuẩn được tách đưa vào mỗi trường kích thích rễ NAA là chất điều tiết sinh trưởng thực vật có tác dụng thúc đẩy sự phân bào hình thành rễ nhánh, rễ lá Với ưu điểm vậy, chúng đã chọn NAA để thử nghiệm khả rễ của lan hài Vân Nam Bảng 4.4 Kết nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ NAA đến khả rễ lan hài Vân Nam (sau 30 ngày nuôi cấy) Số mẫu rễ (mẫu) 26 21 18 23 n ye gu N CT1(Đ/c) CT CT CT CT Nồng độ Số mẫu NAA nuôi cấy (mg/l) (mẫu) 0,0 30 0,3 30 0,5 30 1,0 30 1,5 30 LSD05 CV(%) Th Công thức Tỷ lệ mẫu rễ (%) 16,67 86,67 70 60 76,67 2,92 8,2 Chất lượng rễ Ngắn, nhỏ, đen Dài, mập, trắng Ngắn, nhỏ,đen Ngắn, nhỏ,đen Ngắn, nhỏ,đen U ve ni Kết quả thí nghiệm được thể hiện qua biểu đồ 4.4: rs Tỷ lệ mẫu rễ (%) ity 100 86.67 90 – 76.67 80 70 60 60 U TN 70 50 Tỷ lệ mẫu rễ (%) 40 30 20 16.67 10 CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 Biểu đồ 4.4 Ảnh hưởng nồng độ NAA đến khả rễ lan hài Vân Nam (sau 30 ngày nuôi cấy) 37 Từ bảng kết quả 4.4 biểu đồ 4.4 cho ta thấy: giá trị CV (%) 8,2 LSD05 đạt 2,92; các công thức khác có sự sai khác có ý nghĩa ở mức độ tin cậy 95% Nồng độ NAA có tác dụng rõ rệt đến sự hình thành rễ đới với lan Hài P.callusum Xét về tỷ lệ mẫu rễ CT2 chiếm tỷ lệ cao nhất 86,67%, tiếp theo CT5 đạt được 76,67%, CT3 đạt được 70%, CT4 60% Xét về chất lượng rễ CT2 thu được rễ có chất lượng tớt: rễ dài, mập, có màu trắng Kết quả được giả thích sau: NAA là chất kich thích chồi tạo rễ Công Th thức đối chứng (CT1) chưa bổ sung NAA nên số mẫu rễ thấp, nhỏ Nồng độ NAA 0,3 mg/l CT2 tỷ lệ chời rễ cao nhất, khỏe nhất; đồng thời tạo điều kiện N gu phát triển Cịn CT3, CT4, CT5 nờng đợ NAA từ 0,5; 1,0; 1,5; chất lượng rễ thu được giảm dần, bởi nờng đợ NAA cao có khả gây ức chế chời rễ, sớ ye lượng rễ hình thành cũng giảm, ngắn và nhỏ n U Vì vậy, khuôn khổ thí nghiệm này để kích thích rễ lan hài Vân Nam cần ity rs ve ni bổ sung vào môi trường nuôi cấy NAA 0,3 mg/l – U TN CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 (Ngắn, nhỏ, đen) (Dài, mập, trắng) (Ngắn, nhỏ, đen) (Ngắn, nhỏ, đen) (Ngắn, nhỏ) Hình 4.4 Hình ảnh rễ bị ảnh hưởng nồng độ NAA đến khả rễ lan hài Vân Nam (sau 30 ngày nuôi cấy) CT1: mg/l NAA; CT2: 0,3 mg/l NAA; CT3: 0,5 mg/l NAA; CT4: mg/l NAA; CT5: 1,5 mg/l NAA 38 4.4.2 Kết nghiên cứu ảnh hưởng NAA kết hợp với than hoạt tính đến khả nhân nhanh lan hài Vân Nam Than hoạt tính là một hợp chất vô thường được sử dụng giai đoạn rễ nuôi cấy mô tế bào thực vật Than hoạt tính có vai trò là tạo điều kiện “tối” cho môi trường nuôi cấy, hấp thụ các chất độc và các chất ức chế sinh trưởng thực vật Ngoài ra, than hoạt tính còn có khả làm giảm hiện tượng thuỷ tinh thể ở một số loài thực vật Để số mẫu nuôi cấy có thể nhiều rễ với chất lượng rễ tốt, thí nghiệm này chúng sử dụng nồng độ NAA 0,3 mg/l thích hợp nhất cho quá trình Th rễ kết hợp với than hoạt tính ở các hàm lượng khác để thử nghiệm khả rễ của lan hài Vân Nam N Bảng 4.5 Kết nghiên cứu ảnh hưởng NAA kết hợp với than hoạt tính gu đến khả rễ lan hài Vân Nam (sau 30 ngày nuôi cấy) Nồng độ Nồng độ Số mẫu ye Tỷ lệ nuôi cấy chồi n Công Số rễ trung (mg/l) (g/l) (mẫu) rễ (rễ) chồi(rễ) 0,0 30 48 1,6 Ngắn, nhỏ 0,5 30 90 Dài mập CT 1,0 30 79 2,63 Dài, mập CT 1,5 30 75 2,5 Ngắn, nhỏ CT 2,0 30 58 ity – U TN CV(%) rs LSD05 ve 0,3 ni CT U THT CT bình Chất lượng rễ NAA thức 1,93 0,78 5,8 Kết quả thí nghiệm được thể hiện qua biểu đồ 4.5: Ngắn, nhỏ 39 Số rễ trung bình chồi( chồi) 3.5 3 2.63 2.5 2.5 1.9 1.6 Số rễ trung bình chồi( chồi) 1.5 Th 0.5 N CT CT CT CT CT gu ye Biểu đồ 4.5 Ảnh hưởng NAA kết hợp với than hoạt tính đến khả n rễ lan hài Vân Nam (sau 30 ngày nuôi cấy) ni U Từ bảng kết quả 4.7 4.5 cho thấy: Số rễ trung bình chời rễ với giá trị LSD05 đạt 0,78; công thức khác thí nghiệm đều có sự sai khác có ý nghĩa ve ở mức độ tin cậy 95% Các công thức có bổ sung than hoạt tính đều có tỷ lệ mẫu rs ity rễ cao công thức đối chứng không bổ sung than hoạt tính CT1 Ở CT2 với hàm lượng than hoạt tính 0,5 g/l cho sớ rễ trung nình chồi rễ cao nhất là 90 chồi Tăng – tỷ lệ mẫu rễ giảm dần U TN dần hàm lượng than hoạt tính từ 1,0; 1,5; 2,0 tương ứng với CT3; CT4; CT5 có cho Ở tiêu chất lượng rễ: Các CT2, CT3 cho chất lượng rễ dài, mập Ở CT1; CT4 và CT5 tương ứng với hàm lượng than hoạt tính 1,5 g/l; 2,0g/l cho rễ ngắn, và nhỏ CT2 cho chất lượng tốt nhất là dài, mập Kết quả được giả thích sau: Ở CT1 chưa có than hoạt tính cho tỷ lệ rễ ít nhất Ở các công thức có bổ sung than hoạt tính, hàm lượng than hoạt tính tăng khả rễ cùa cũng tăng, số lượng rễ tăng THT 0,5 g/l (CT2) ở hàm lượng này THT thúc đẩy rễ nhanh và mạnh nhất Ở CT3, CT4, CT5 tạo điều kiện tối kích thích chồi rễ nhiều CT1 (công thức Đ/c) Tuy nhiên tăng dần hàm lượng THT lên g/l (CT3) ; 1,5 g/l (CT4) 2,0 g/l (CT5) đồng thời THT ở hàm 40 lượng cao ngăn cản quá trình trao đởi chất của chời nên cũng hạn chế sự hình thành rễ của chời Từ kết quả thí nghiệm cho thấy hàm lượng THT thích hợp nhất cho lan hài Vân Nam rễ là 0,5 g/l, đó tổng số rễ là 90 rễ và cho rễ dài, mập Th CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 N gu (ngắn , nhỏ) (dài, mập) (dài, mập) (ngắn, nhỏ) (ngắn , nhỏ) ye Hình 4.5 Hình ảnh rễ bị ảnh hưởng NAA kết hợp với than hoạt tính đến n khả rễ lan hài Vân Nam (sau 30 ngày nuôi cấy) ni U CT1: 0,3 mg/l NAA +0g/lTHT; CT2: 0,3 mg/l NAA + 0,5g/lTHT; CT3: 0,3 mg/l NAA + 1g/lTHT; CT4: 0,3 mg/l NAA + 1,5g/lTHT; CT5: 0,3 mg/l NAA+ 2g/lTHT ity rs ve – U TN 41 Phần KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Trong khuôn khổ thí nghiệm chúng đưa một số kết quả sau: - Hàm lượng BA tốt nhất cho sự phát sinh chồi lan hài Vân Nam (Paphiopedilum callosum) là: Môi trường MS + 0,5 mg/l BA với tỷ lệ tái sinh chồi đạt 66,67% - Hàm lượng các chất kích thích sinh trưởng tốt nhất cho giai đoạn nhân nhanh chồi lan hài Vân Nam BA 0,5 mg/l + Kinetin 1,5 mg/l + TDZ 1,0 mg/l thu được hệ Th số nhân chồi đạt 2,23 lần - Hàm lượng chất kích thích với than hoạt tính tốt nhất ở giai đoạn rễ là N gu NAA 0,3mg/l + nồng độ than hoạt tính 0,5g/l cho số rễ trung bình chời tớt nhất n 5.2 Kiến nghị ye 3, tổng số chồi rễ 90 chồi ve ni hài Vân Nam U - Nghiên cứu ảnh hưởng của một số môi trường đến khả tái sinh chồi lan - Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng khác đến khả ity rs nhân nhanh chồi Vân Nam - Nghiên cứu điều kiện ngoại cảnh (nhiệt độ, giá thể, độ ẩm) đến khả phát – U TN triển của lan hài Vân Nam 42 TÀI LIỆU THAM KHẢ0 I Tiếng Việt Leonid Averyyanov, Phillip Cribb, Phan Kế Lộc, Nguyễn Tiến Hiệp (2004), Lan Hài Vệt Nam, Nxb Giao thơng vận tải Trịnh Đình Đạt Cơng nghệ sinh học tập – Công nghệ di truyền (NXB giáo dục 2006) –,173 trang Hoàng Thị Giang, Nguyễn Quang Thạch, Mạch Hồng Thắm, Đỗ Thị Thu Hà (2010), “Nghiên cứu nhân giống in vitro và nuôi trồng giống lan hài quý P Th hangianum perner Gurss (Hài Hằng) thu thập ở Việt Nam”, Tạp chí Khoa học và Phát triển 2010 - tập 8, số 2, tr 194-201, Trường Đại Học Nông Nghiệp Hà Nội N Nguyễn Thu Hậu, Nguyễn Trí Minh, Đinh Văn Khiêm, Nguyễn Thị Thanh gu ye Hằng, Cao Đình Hùng, Phan Xuân Nguyên, Ngũn Đình Sĩ (2013), “Nghiên n cứu nhân giớng cỏ ngọt (Stevia rebaudiana Bertond) in vitro”, Hội thảo Quốc U tế Khoa học và Công nghệ phục vụ sản xuất Nông nghiệp Công nghệ cao tỉnh ve ni Lâm Đồng, Đà Lạt ngày 29 tháng năm 2013, trang 239-245 Lê Thị Huyên, Nguyễn Tiến Hiệp (2004), Hình thái và phân loại thực vật, Nhà rs ity xuất bản Nông nghiệp, Trường Đại học Lâm Nghiệp Hà Nội Trần Thị Lệ, Trương Thị Bích Phượng, Trần Thị Triêu Hà (2008), Giáo trình Cơng – U TN nghệ sinh học thực vật, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội Nguyễn Công Nghiệp (2006), Trồng hoa lan, Nxb Trẻ Nguyễn Như Khanh, Nguyễn Văn Đính (2011), Giáo trình các chất điều hoà sinh trưởng thục vật, Nxb Giáo dục Việt Nam Hoàng Thị Sản (2002), Phân loại học thực vật, Nxb Giáo dục 10 Nguyễn Thị Sơn, Nguyễn Thị Lý Anh, Vũ Ngọc Lan, Trần Thế Mai (2012), “Nhân giống in vitro loài lan Dendrobium fimbriatum Hook (Hoàng thảo long nhãn)”, Tạp chí Khoa học và Phát triển 2012, tập 10(2), trang 263-271 11 Nguyễn Kim Thanh, Nguyễn Thuận Châu (2005), Giáo trình sinh lý học thực vật, Nxb Giáo dục, Hà Nội 43 12 Nguyễn Đức Thành (2000), Nuôi cấy mô tế bào thực vật – Nghiên cứu và ứng dụng, Nxb Nông nghiệp 13 Nguyễn Quang Thạch (2009), Cơ sở công nghệ sinh học – T3, Nxb Giáo dục 14 Bùi Trang Việt (2002), Sinh lý thực vật đại cương, Nxb Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh Vũ Văn Vụ, Nguyễn Mộng Hùng, Lê Hồng Điệp (2009), Công nghệ sinh học tập – Công nghệ sinh học tế bào, Nxb Giáo dục 15 Vũ Văn Vụ, Nguyễn Mộng Hùng, Lê Hồng Điệp (2002), Công nghệ sinh học – T2, Nxb Giáo dục Th II Tài liệu tiếng anh 16 Bubeck S.K (1973), A suty of Paphiopedilum meristem culture Ph.D Thesis, N Rutgers University Microfilm International, Ann Arbor, Mivhigan, The USA gu 17 Chen T Y., Chen J T., Chang W C (2002), “Multiple shoot formation and plant ye regeneration from stem nodal explants of Paphiopedilum orchids”, In vitro Cell, n Dev Biol Plant 38, p 595-597 U ni 18 Chen S C., Liu F Y (1982), “Notes on some species of Paphiopedilum from ve Yunnan”, Acta Bot, Yunnanica 4, p 163-167 ity rs 19 Huang L C (1988), “A procedure for asexual multiplication of Paphiopedilum in vtro, American Orchid Society Bulletin 57, p 274-278 – 20 Huang L C., Lin C J., Kou C I., Huang B L., Murashige T (2001), U TN “Paphiopedilum cloning in vitro”, Scientia Horticulturae 91, p 111-121 21 Kauth P (2005), In vitro seed germination and seedling development of Calopogon tuberosus and Sacolia lanceolata var lanceolata: Two Florida native terrestrial orchids, Master thesis, University of Florida 22 Liao Y J., Tsai Y C., Sun Y W., Lin R S., Wu F S (2011), “In vitro shoot induction and plant regeneration from flower buds in Paphiopedilum orchids”, In vitro Cell, Dev Biol plant 47, p 702-709 23 Lin Y H., Chang C., Chang W C (2000), “Plant regeneration from callus culture of a Paphiopedilum hybrid”, Plant Cell Tiss Org Cult Vol 62, pp 21 – 25 44 24 Liu ZJ, Liu KW, Chen LJ (2006), “Conservation ecology of endangered species Paphiopedilum armeniacum (Orchidaceae)”,Acta Ecol Sinica, Volume 26(9), pp 2791–2800 25 Nieman D (1980), “Plantlet formation of Paphiopedilum flower stem”, American Orchid Society Bulletin 49, p 372-373 26 Nhut D T, Thuy D T T., Luan V Q., Don N T., Khiem D V., Tran Thanh Van K (2005), “ Micropropagation of Paphiopedilum delenatii via stem node culture”, Vietnam – Korea International Symposium, Bio-Technology & Bio- Nhut D T., Trang P T T., Vu N H., Thuy D T T., Khiem D V., Binh N V., 27 Th System Engineering, p 184-190 N Tran Thanh Van K (2005), “ A wounding method and liquid culture in 5(3), p.156-161 ye gu Paphiopedilum delenatiii propagation”, Propagation of Ornamental Plants n 28 Stewart J., Button J (1975), “Tissue culture studies in Paphiopedilum”, U ity rs ve III www.vuonhoalan.net ni American Orchid Society Bulletin 44, p 591-599 – U TN PHỤ LỤC PHỤ LỤC MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY Bottle I NH4NO3 82,5 KNO3 95 MgSO4.7H2O 37 370,0 1,058 CuSO4.5H2O 0,0025 0,025 CaCl2.2H2O 44 440,0 KI 0,083 n ye ZnSO4.7H2O 10 ni U 10 0,0025 ve Na2MoO4.2H2O 0,025 FeSO4.7H2O 2,784 Na2EDTA.2H2O 3,724 10 ity 0,62 10,6 0,83 170,0 rs H3BO4 22,3 0,025 17 6,2 – 0,25 U TN 27,85 Nicotinic acid 100 0,5 0,5 Glycine 100 2,0 2,0 Thiamine acid 100 0,1 0,1 Pyridocine HCl 100 0,5 0,5 mg/100ml Vitamin 1.900,0 2,23 KH2PO4 V 1.650,0 MnSO4.4H2O CoCl2.6H2O IV 20 Final concentratic (mg/l) gu III Amount to take preparation (ml) N Th II Component Stock Solution (g/l) 10 37,25 Sucrose 30.0000,0 Agar 5.500,0 pH 5,6-5,8 PHỤ LỤC 2: KẾT QUẢ XỬ LÝ SỐ LIỆU Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ BA đến khả nhân nhanh chồi lan hài Vân Nam Th BALANCED ANOVA FOR VARIATE HSNC FILE TN3 21/ 6/20 22:15 :PAGE Anh huong cua nong BA den kha nang nhân nhanh choi tu phoi cua cay lan hai Van Nam VARIATE V003 HSNC LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1T 5.51829 1.37957 87.49 0.000 2R 585334E-02 292667E-02 0.19 0.835 * RESIDUAL 126147 157684E-01 * TOTAL (CORRECTED) 14 5.65029 403592 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE TN3 21/ 6/20 22:15 :PAGE Anh huong cua nong BA den kha nang nhân nhanh choi tu phoi cua cay lan hai Van Nam N n ye gu MEANS FOR EFFECT T T NOS HSNC 0.200000 1.86667 3 0.666667 1.50000 0.703333 ve ni U ity rs SE(N= 3) 0.724991E-01 5%LSD 8DF 0.236412 Anh huong cua nong BA den kha nang nhân nhanh choi tu phoi cua cay lan hai Van Nam – U TN MEANS FOR EFFECT R R NOS HSNC 0.996000 1.00600 0.960000 SE(N= 5) 0.561576E-01 5%LSD 8DF 0.183124 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE TN3 21/ 6/20 22:15 :PAGE Anh huong cua nong BA den kha nang nhân nhanh choi tu phoi cua cay lan hai Van Nam F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |T (N= 15) SD/MEAN | | | NO BASED ON BASED ON % | | | OBS TOTAL SS RESID SS | | | HSNC 15 0.98733 0.63529 0.12557 8.5 0.0000 0.8347 |R |