Luận văn nghiên cứu khả năng nhân giống lan hài vân nam (paphiopedilum callosum) từ phôi bằng kỹ thuật nuôi cấy invitro

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM o0o - NGUYỄN THỊ THU HẰNG Tên đề tài: “NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHÂN GIỐNG LAN HÀI VÂN NAM (Paphiopedilum callosum) TỪ PHÔI BẰNG KỸ THUẬT NI CẤY IN VITRO” KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Khoa : CNSH - CNTP Khoá học : 2015 - 2020 Thái Nguyên, năm 2020 m ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM o0o - NGUYỄN THỊ THU HẰNG Tên đề tài “NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHÂN GIỐNG LAN HÀI VÂN NAM (Paphiopedilum callosum) TỪ PHƠI BẰNG KỸ THUẬT NI CẤY IN VITRO” KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Lớp : K47 CNSH Khoa : CNSH - CNTP Khoá học : 2015 - 2019 Giảng viên hướng dẫn: ThS Nguyễn Thị Tình Thái Nguyên, năm 2020 m i LỜI CẢM ƠN Được sự đồng ý của Ban giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm, thời gian thực tập tốt nghiệp em đã thực hiện đề tài:“Nghiên cứu khả nhân giống lan hài Vân Nam (Paphiopedilum callosum) từ phôi kỹ thuật nuôi cấy invitro” Trang đầu tiên của khoá luận này em xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm cùng các thầy cô giáo Khoa đã tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành đề tài nghiên cứu này Đặc biệt, em xin cám ơn ThS Nguyễn Thị Tình đã giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất cho em śt quá trình thực tập tớt nghiệp Ći cùng, em xin cảm ơn gia đình đã tạo điều kiện vật chất và là chỗ dựa tinh thần cho em suốt thời gian thực tập, cảm ơn bạn bè đã hết lòng động viên, giúp đỡ śt thời gian qua Trong quá trình thực tập, cũng là quá trình làm báo cáo thực tập thời gian có hạn không tránh khỏi sai sót Em rất mong nhận được ý kiến đóng góp của thầy cô và các bạn để đề tài của em được hoàn thiện Lời cuối em xin kính chúc các thầy, cô giáo nhà trường, khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ thực phẩm, cùng các bạn đồng nghiệp sức khoẻ, thành công cuộc sống Em xin chân thành cảm ơn! Thái Nguyên, ngày tháng năm 2020 Sinh viên thực hiện Nguyễn Thị Thu Hằng m ii DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu 21 Bảng 4.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả nhân nhanh chồi từ phôi lan hài Vân Nam (sau 40 ngày nuôi cấy) 28 Bảng 4.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với Kinetin đến khả nhân nhanh chồi của lan hài Vân Nam 30 Bảng 4.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với Kinetin và TDZ đến khả nhân nhanh giống lan hài Vân Nam (sau 30 ngày nuôi cấy) 33 Bảng 4.4 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả rễ lan hài Vân Nam (sau 30 ngày nuôi cấy) 36 Bảng 4.5 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của NAA kết hợp với than hoạt tính đến khả rễ lan hài Vân Nam (sau 30 ngày nuôi cấy) 38 m iii DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Hình ảnh về lan hài Vân Nam (Paphiopedilum callosum) 10 Hình 3.1 Sơ đờ nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng đến khả tái sinh, nhân nhanh chồi từ phôi và rễ của lan hài Vân Nam 23 Hình 4.1 Hình ảnh ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả nhân nhanh chồi lan hài Vân Nam (sau 40 ngày nuôi cấy) 30 Hình 4.2 Hình ảnh BA kết hợp với Kinetin đến khả nhân nhanh chồi của lan hài Vân Nam 32 Hình 4.3 Hình ảnh ảnh hưởng của BA kết hợp với Kinetin và TDZ đến khả nhân nhanh giống lan hài Vân Nam (sau 30 ngày ni cấy) 35 Hình 4.4 Hình ảnh rễ bị ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả rễ lan hài Vân Nam (sau 30 ngày ni cấy) 37 Hình 4.5 Hình ảnh rễ bị ảnh hưởng của NAA kết hợp với than hoạt tính đến khả rễ lan hài Vân Nam (sau 30 ngày nuôi cấy) 40 m iv DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 4.1 Ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả nhân nhanh chồi lan hài Vân Nam (sau 40 ngày nuôi cấy) 28 Biểu đồ 4.2 BA kết hợp với Kinetin đến khả nhân nhanh chồi của lan hài Vân Nam 31 Biểu đồ 4.3 Ảnh hưởng của BA kết hợp với Kinetin và TDZ đến khả nhân nhanh giống lan hài Vân Nam (sau 30 ngày nuôi cấy) 33 Biểu đồ 4.4 Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả rễ lan hài Vân Nam (sau 30 ngày nuôi cấy) 36 Biểu đồ 4.5 Ảnh hưởng của NAA kết hợp với than hoạt tính đến khả rễ lan hài Vân Nam (sau 30 ngày nuôi cấy) 39 m v MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i DANH MỤC BẢNG ii DANH MỤC HÌNH iii DANH MỤC BIỂU ĐỒ iv MỤC LỤC v DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT viii Phần MỞ ĐẦU 1.1.Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu của đề tài 1.3 Yêu cầu của đề tài 1.4 Ý nghĩa khoa học thực tiễn 1.4.1 Ý nghĩa khoa học của đề tài 1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn của đề tài Phần TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan về lan Hài (Paphiopedilum) 2.1.1 Phân loại và nguồn gốc 2.1.2 Đặc điểm hình thái 2.1.3 Sinh thái 2.1.4 Hiện trạng lan Hài Việt Nam 2.2 Giới thiệu về giống lan hài Vân Nam 2.2.1 Nguồn gốc và sự phân bố 2.2.2 Hình thái 2.2.3 Các điều kiện bản để nuôi trồng giống lan hài Vân Nam 10 2.3 Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật 12 2.3.1 Sự phân hoá tế bào 12 m vi 2.3.2 Sự phản phân hoá tế bào 12 2.3.3 Một số ́u tớ ảnh hưởng đến quá trình ni cấy mơ tế bào thực vật 12 2.3.4 Môi trường dinh dưỡng 13 2.4 Tình hình nghiên cứu về ni cấy mô lan Hài thế giới và nước 17 2.4.1 Tình hình nghiên cứu về ni cấy mơ lan Hài thế giới 17 2.4.2 Tình hình nghiên cứu về ni cấy mơ lan Hài nước 19 Phần ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 3.1 Vật liệu, hoá chất và thiết bị nghiên cứu 21 3.1.1 Đối tượng, vật liệu nghiên cứu 21 3.1.2 Hoá chất sử dụng 21 3.1.3 Thiết bị,dụng cụ nghiên cứu 21 3.2 Phạm vi, địa điểm và thời gian nghiên cứu 22 3.2.1 Phạm vi nghiên cứu 22 3.2.2 Địa điểm nghiên cứu 22 3.2.2 Thời gian nghiên cứu 22 3.3 Nội dung nghiên cứu 22 3.3.1 Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA, Kinetin, TDZ đến khả nhân nhanh chồi lan hài Vân Nam 22 3.3.2 Nội dung 2: Xác định môi trường rễ tạo hoàn chỉnh lan hài Vân Nam 22 3.4 Phương pháp nghiên cứu 22 3.4.1 Chuẩn bị môi trường nuôi cấy mô 22 3.4.2 Phương pháp nghiên cứu 23 3.4.3 Phương pháp bố trí thí nghiệm 23 3.5 Phương pháp đánh giá và xử lý số liệu 26 3.5.1 Thu thập số liệu 26 3.5.2 Các tiêu theo dõi 26 3.5.3 Phương pháp sử lý số liệu 27 m vii Phần KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 28 4.1 Kết quả ảnh hưởng của nồng độ BA, Kinetin, TDZ đến khả nhân nhanh chồi từ phôi lan hài Vân Nam 28 4.1.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả nhân nhanh chồi lan hài Vân Nam (sau 40 ngày nuôi cấy) 28 4.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với Kinetin đến khả nhân nhanh giống lan hài Vân Nam 30 4.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với Kinetin và TDZ đến khả nhân nhanh giống lan hài Vân Nam 32 4.4 Kết quả nghiên cứu mơi trường rễ tạo hồn chỉnh lan hài Vân Nam 35 4.4.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả rễ của lan hài Vân Nam 35 4.4.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của NAA kết hợp với than hoạt tính đến khả nhân nhanh lan hài Vân Nam 38 Phần KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41 5.1 Kết luận 41 5.2 Kiến nghị 41 TÀI LIỆU THAM KHẢ0 42 PHỤ LỤC m viii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT TDZ : Thidiazol BA : 6-Benzyl amino purine CS : Cộng sự CT : Công thức CV : Coeficient of Variation Đ/C : Đối chứng Kinetin : 6-Furfurylaminopurine LSD : Least Singnificant Difference Test MS : Murashighe Skoog, 1962 MT : Môi trường NAA : α-Napthalene acetic acid P malipoens : Paphiopedilum malipones THT : Than hoạt tính TN : Thí nghiệm RE : Robert Ernst m 32 kích thích mẫu phân chia mạnh nhất nên số chồi mới sinh nhiều nhất Ở CT5 tương ứng với nồng độ 2,0 mg/l Kinetin hệ số nhân chồi thấp so với CT4 Nồng độ Kinetin thích hợp kích thích chồi sinh trưởng, nhiên nồng độ Kinetin tăng cao, vượt quá ngưỡng cần thiết có thể ức chế khả tạo chồi CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 (xanh đậm, mập) (xanh đậm, mập) (xanh đậm, mập) (xanh đậm, mập) (xanh nhạt, gầy) Hình 4.2 Hình ảnh BA kết hợp với Kinetin đến khả nhân nhanh chồi lan hài Vân Nam CT1: 0,5 mg/l BA+ 0mg/l Kinetin ; 0,5 mg/l BA+ 0,5mg/l Kinetin CT3: 0,5 mg/l BA+ 1mg/l Kinetin; CT4: 0,5 mg/l BA+ 1,5mg/l Kinetin;CT5: 0,5 mg/l BA+ 2mg/l Kinetin 4.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng BA kết hợp với Kinetin và TDZ đến khả nhân nhanh giống lan hài Vân Nam TDZ là cytokinin ít bị phân huỷ bởi emzyme nội sinh so với các cytokinin khác, đó nó có hoạt tính cao và có thể cho hệ số nhân chời cao các cytokinin khác Vì vậy thí nghiệm này, chúng sử dụng nồng độ BA kết hợp với Kinetin thích hợp nhất quá trình nhân nhanh (công thức thích hợp nhất ở thí nghiệm trước) kết hợp với TDZ ở các nồng độ để nghiên cứu ảnh hưởng của BA, Kinetin, TDZ đến khả nhân nhanh giống lan hài Vân Nam m 33 Bảng 4.3 Kết nghiên cứu ảnh hưởng BA kết hợp với Kinetin và TDZ đến khả nhân nhanh giống lan hài Vân Nam (sau 30 ngày nuôi cấy) Công Nồng độ Nồng độ Nồng độ Số mẫu Tổng số Hệ số chồi thu nhân Chât lượng được chồi chồi (chồi) (lần) Kinetin TDZ nuôi cấy (mg/l) (mg/l) (mẫu) CT 0,0 30 65 2,17 Xanh đậm, mập CT 0,5 30 73 2,43 Xanh đậm, mập 1,0 30 85 2,83 Xanh đậm, mập CT 1,5 30 62 2,07 Xanh, bé CT 2,0 30 59 1,19 Xanh, bé thức BA (mg/l) CT 0,5 1,5 LSD05 0,17 CV (%) 4,0 Kết quả thí nghiệm được biểu thị qua biểu đồ 4.3: Hệ số nhân chồi (lần) 2.83 2.43 2.5 2.17 2.07 1.5 1.19 Hệ số nhân chồi (lần) 0.5 CT CT CT CT CT Biểu đồ 4.3 Ảnh hưởng BA kết hợp với Kinetin và TDZ đến khả nhân nhanh giống lan hài Vân Nam (sau 30 ngày nuôi cấy) m 34 Từ kết quả bảng 4.3 biểu đồ 4.3 ta nhận thấy: Ở tiêu hệ số nhân chồi với giá trị LSD05 đạt 0,17 các công thức thí nghiệm có sự sai khác có ý so với công thức đối chứng ở mức độ tin cậy 95% Khi bổ sung BA 0,5 mg/l, Kinetin 1,5 mg/l và TDZ từ 0,0 - 2,0 mg/l vào môi trường nuôi cấycho thấy ảnh hưởng đến khả nhân chồi lan hài Vân Nam Các công thức có bổ sung TDZ đều cho hệ số nhân chồi cao công thức đối chứng không bổ sung TDZ (công thức đối chứng có hệ số nhân chồi đạt 2,17 lần) Khi tăng nồng độ TDZ từ 0,0 - 1,0 mg/l tổng số chồi thu được và hệ số nhân chồi có xu hướng tăng lên, ở công thức đối chứng TDZ nồng độ 0,5 mg/l cho tổng số chồi thu được là 73 chồi và hệ số nhân là 2,43lần Trong thí nghiệm này, nồng độ TDZ 1,0 mg/l cho tổng số chồi thu được là 85 chồi và hệ số nhân cao nhất là 2,83 lần Tuy nhiên, nồng độ TDZ từ 1,5 - 2,0 mg/l thu được tổng số chồi và hệ số nhân giảm, ở CT4 tổng số chồi thu được là 62 chồi và hệ số nhân là 2,07 lần; CT5 tổng số chồi thu được là 59 chồi và hệ số chồi là 1,19 lần Chất lượng chồi: Với CT đối chứng (TDZ 0,0 mg/l) cho chất lượng chồi thu được xanh nhạt, mập Khi tăng dần nồng độ TDZ từ 0,5 - 1,0 mg/l chất lượng chời xanh nhạt, mập lên chồi xanh đậm mập, khuôn khổ thí nghiệm này, CT bổ sung TDZ từ 0,5 - 1,0 mg/l cho chất lượng chồi tốt nhất Tăng nồng độ TDZ từ 1,5 - 2,0 mg/l chất lượng chời giảm xuống, chồi thu được xanh, bé Kết quả thí nghiệm được giải thích sau: TDZ là chất kích thích sinh trưởng có tác dụng kích thích tế bào phân chia hình thành chời mới Ở cơng thức đới chứng không có TDZ môi trường nuôi cấy nên khả tạo chồi thấp các công thức bổ sung TDZ Ở CT2 với nồng độ TDZ 0,5 mg/l có tác dụng kích thích phát triển chồi mới nồng độ TDZ thấp nên mẫu ít chịu tác động kích thích phân chia tế bào của chất này Ở CT3 cho hệ số nhân chồi cao nhất là TDZ 1,0 mg/l kích thích mẫu sinh trưởng và phát triển tốt nhất, đồng thời tế bào phân chia mạnh mẽ nhất Khi nồng độ TDZ tăng dần từ 1,5 – 2,0 mg/l ứng với CT4, CT5 cho thấy chồi nhỏ chồi này không thể kéo dài hoặc bị biến dạng, nờng đợ TDZ càng cao hệ số nhân chồi càng giảm dần m 35 Kết luận khuôn khổ thí nghiệm này, để nâng cao hệ số nhân chồi cần bổ sung BA 0,5 mg/l; Kinetin 1,5 mg/l, TDZ 1,0 mg/l thu được số chồi lớn nhất là 85 với hệ số nhân chồi là 2,83 CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 (xanh đậm, mập) (xanh đậm, mập) (xanh đậm , mập) ( xanh ,bé ) (xanh, bé ) Hình 4.3 Hình ảnh ảnh hưởng BA kết hợp với Kinetin và TDZ đến khả nhân nhanh giống lan hài Vân Nam (sau 30 ngày nuôi cấy) CT1: 0,5 mg/l BA+ 0mg/l Kinetin + 0mg/lTDZ+ ; CT2 0,5 mg/l BA+ 0,5mg/l Kinetin + 0,5mg/lTDZ ; CT3: 0,5 mg/l BA+ 1mg/l Kinetin + 1mg/lTDZ; CT4: 0,5 mg/l BA+ 1,5mg/l Kinetin + 1,5mg/lTDZ;CT5: 0,5 mg/l BA+ 2mg/l Kinetin + 2mg/lTDZ 4.4 Kết quả nghiên cứu môi trường rễ tạo hoàn chỉnh lan hài Vân Nam 4.4.1 Kết nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ NAA đến khả rễ lan hài Vân Nam Bộ rễ là quan rất quan trọng đối với tất cả các loài thực vật Trong nuôi cấy mô, sau nhân chồi với số lượng lớn, giai đoạn tiếp theo là tạo hoàn chỉnh để đưa ngoài vườn ươm Khi một muốn chủn tự nhiên có mợt bợ rễ khỏe mạnh, hoàn chỉnh giúp có khả hút nước và dinh dưỡng khoáng tốt, làm tiền đề cho sự sinh trưởng và phát triển sau này Vì vậy, giai đoạn kích thích tạo rễ của các chồi là giai đoạn quan trọng và không thể thiếu Sau kết thúc giai đoạn nhân nhanh tạo m 36 số lượng chồi lan hài Vân Nam đồng nhất và khỏe mạnh, các chồi tạo thành đạt tiêu chuẩn được tách đưa vào mỗi trường kích thích rễ NAA là chất điều tiết sinh trưởng thực vật có tác dụng thúc đẩy sự phân bào hình thành rễ nhánh, rễ lá Với ưu điểm vậy, chúng đã chọn NAA để thử nghiệm khả rễ của lan hài Vân Nam Bảng 4.4 Kết nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ NAA đến khả rễ lan hài Vân Nam (sau 30 ngày nuôi cấy) Công thức CT1(Đ/c) CT CT CT CT Nồng độ Số mẫu NAA nuôi cấy (mg/l) (mẫu) 0,0 30 0,3 30 0,5 30 1,0 30 1,5 30 LSD05 CV(%) Số mẫu rễ (mẫu) 26 21 18 23 Tỷ lệ mẫu rễ (%) 16,67 86,67 70 60 76,67 2,92 8,2 Chất lượng rễ Ngắn, nhỏ, đen Dài, mập, trắng Ngắn, nhỏ,đen Ngắn, nhỏ,đen Ngắn, nhỏ,đen Kết quả thí nghiệm được thể hiện qua biểu đồ 4.4: Tỷ lệ mẫu rễ (%) 100 86.67 90 76.67 80 70 70 60 60 50 Tỷ lệ mẫu rễ (%) 40 30 20 16.67 10 CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 Biểu đồ 4.4 Ảnh hưởng nồng độ NAA đến khả rễ lan hài Vân Nam (sau 30 ngày nuôi cấy) m 37 Từ bảng kết quả 4.4 biểu đồ 4.4 cho ta thấy: giá trị CV (%) 8,2 LSD05 đạt 2,92; các công thức khác có sự sai khác có ý nghĩa ở mức độ tin cậy 95% Nồng độ NAA có tác dụng rõ rệt đến sự hình thành rễ đới với lan Hài P.callusum Xét về tỷ lệ mẫu rễ CT2 chiếm tỷ lệ cao nhất 86,67%, tiếp theo CT5 đạt được 76,67%, CT3 đạt được 70%, CT4 60% Xét về chất lượng rễ CT2 thu được rễ có chất lượng tớt: rễ dài, mập, có màu trắng Kết quả được giả thích sau: NAA là chất kich thích chồi tạo rễ Công thức đối chứng (CT1) chưa bổ sung NAA nên số mẫu rễ thấp, nhỏ Nồng độ NAA 0,3 mg/l CT2 tỷ lệ chời rễ cao nhất, khỏe nhất; đờng thời tạo điều kiện phát triển Cịn CT3, CT4, CT5 nồng độ NAA từ 0,5; 1,0; 1,5; chất lượng rễ thu được giảm dần, bởi nồng độ NAA cao có khả gây ức chế chời rễ, sớ lượng rễ hình thành cũng giảm, ngắn và nhỏ Vì vậy, khn khở thí nghiệm này để kích thích rễ lan hài Vân Nam cần bổ sung vào môi trường nuôi cấy NAA 0,3 mg/l CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 (Ngắn, nhỏ, đen) (Dài, mập, trắng) (Ngắn, nhỏ, đen) (Ngắn, nhỏ, đen) (Ngắn, nhỏ) Hình 4.4 Hình ảnh rễ bị ảnh hưởng nồng độ NAA đến khả rễ lan hài Vân Nam (sau 30 ngày nuôi cấy) CT1: mg/l NAA; CT2: 0,3 mg/l NAA; CT3: 0,5 mg/l NAA; CT4: mg/l NAA; CT5: 1,5 mg/l NAA m 38 4.4.2 Kết nghiên cứu ảnh hưởng NAA kết hợp với than hoạt tính đến khả nhân nhanh lan hài Vân Nam Than hoạt tính là một hợp chất vô thường được sử dụng giai đoạn rễ nuôi cấy mô tế bào thực vật Than hoạt tính có vai trò là tạo điều kiện “tối” cho môi trường nuôi cấy, hấp thụ các chất độc và các chất ức chế sinh trưởng thực vật Ngoài ra, than hoạt tính còn có khả làm giảm hiện tượng thuỷ tinh thể ở một số loài thực vật Để số mẫu nuôi cấy có thể nhiều rễ với chất lượng rễ tốt, thí nghiệm này chúng sử dụng nồng độ NAA 0,3 mg/l thích hợp nhất cho quá trình rễ kết hợp với than hoạt tính ở các hàm lượng khác để thử nghiệm khả rễ của lan hài Vân Nam Bảng 4.5 Kết nghiên cứu ảnh hưởng NAA kết hợp với than hoạt tính đến khả rễ lan hài Vân Nam (sau 30 ngày nuôi cấy) Công Nồng độ Nồng độ Số mẫu Tỷ lệ nuôi cấy chồi Số rễ trung THT (mg/l) (g/l) (mẫu) rễ (rễ) chồi(rễ) 0,0 30 48 1,6 Ngắn, nhỏ 0,5 30 90 Dài mập CT 1,0 30 79 2,63 Dài, mập CT 1,5 30 75 2,5 Ngắn, nhỏ CT 2,0 30 58 1,93 Ngắn, nhỏ CT CT 0,3 bình Chất lượng rễ NAA thức LSD05 0,78 CV(%) 5,8 Kết quả thí nghiệm được thể hiện qua biểu đồ 4.5: m 39 Số rễ trung bình chồi( chồi) 3.5 3 2.63 2.5 2.5 1.9 1.6 Số rễ trung bình chồi( chồi) 1.5 0.5 CT CT CT CT CT Biểu đồ 4.5 Ảnh hưởng NAA kết hợp với than hoạt tính đến khả rễ lan hài Vân Nam (sau 30 ngày nuôi cấy) Từ bảng kết quả 4.7 4.5 cho thấy: Số rễ trung bình chời rễ với giá trị LSD05 đạt 0,78; công thức khác thí nghiệm đều có sự sai khác có ý nghĩa ở mức độ tin cậy 95% Các công thức có bổ sung than hoạt tính đều có tỷ lệ mẫu rễ cao công thức đối chứng không bổ sung than hoạt tính CT1 Ở CT2 với hàm lượng than hoạt tính 0,5 g/l cho sớ rễ trung nình chời rễ cao nhất là 90 chồi Tăng dần hàm lượng than hoạt tính từ 1,0; 1,5; 2,0 tương ứng với CT3; CT4; CT5 có cho tỷ lệ mẫu rễ giảm dần Ở tiêu chất lượng rễ: Các CT2, CT3 cho chất lượng rễ dài, mập Ở CT1; CT4 và CT5 tương ứng với hàm lượng than hoạt tính 1,5 g/l; 2,0g/l cho rễ ngắn, và nhỏ CT2 cho chất lượng tốt nhất là dài, mập Kết quả được giả thích sau: Ở CT1 chưa có than hoạt tính cho tỷ lệ rễ ít nhất Ở các công thức có bổ sung than hoạt tính, hàm lượng than hoạt tính tăng khả rễ cùa cũng tăng, số lượng rễ tăng THT 0,5 g/l (CT2) ở hàm lượng này THT thúc đẩy rễ nhanh và mạnh nhất Ở CT3, CT4, CT5 tạo điều kiện tối kích thích chồi rễ nhiều CT1 (công thức Đ/c) Tuy nhiên tăng dần hàm lượng THT lên g/l (CT3) ; 1,5 g/l (CT4) 2,0 g/l (CT5) đồng thời THT ở hàm m 40 lượng cao ngăn cản quá trình trao đởi chất của chời nên cũng hạn chế sự hình thành rễ của chồi Từ kết quả thí nghiệm cho thấy hàm lượng THT thích hợp nhất cho lan hài Vân Nam rễ là 0,5 g/l, đó tổng số rễ là 90 rễ và cho rễ dài, mập CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 (ngắn , nhỏ) (dài, mập) (dài, mập) (ngắn, nhỏ) (ngắn , nhỏ) Hình 4.5 Hình ảnh rễ bị ảnh hưởng NAA kết hợp với than hoạt tính đến khả rễ lan hài Vân Nam (sau 30 ngày nuôi cấy) CT1: 0,3 mg/l NAA +0g/lTHT; CT2: 0,3 mg/l NAA + 0,5g/lTHT; CT3: 0,3 mg/l NAA + 1g/lTHT; CT4: 0,3 mg/l NAA + 1,5g/lTHT; CT5: 0,3 mg/l NAA+ 2g/lTHT m 41 Phần KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Trong khuôn khổ thí nghiệm chúng đưa một số kết quả sau: - Hàm lượng BA tốt nhất cho sự phát sinh chồi lan hài Vân Nam (Paphiopedilum callosum) là: Môi trường MS + 0,5 mg/l BA với tỷ lệ tái sinh chồi đạt 66,67% - Hàm lượng các chất kích thích sinh trưởng tốt nhất cho giai đoạn nhân nhanh chồi lan hài Vân Nam BA 0,5 mg/l + Kinetin 1,5 mg/l + TDZ 1,0 mg/l thu được hệ số nhân chồi đạt 2,23 lần - Hàm lượng chất kích thích với than hoạt tính tốt nhất ở giai đoạn rễ là NAA 0,3mg/l + nồng độ than hoạt tính 0,5g/l cho sớ rễ trung bình chời tốt nhất 3, tổng số chồi rễ 90 chồi 5.2 Kiến nghị - Nghiên cứu ảnh hưởng của một số môi trường đến khả tái sinh chồi lan hài Vân Nam - Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng khác đến khả nhân nhanh chồi Vân Nam - Nghiên cứu điều kiện ngoại cảnh (nhiệt độ, giá thể, độ ẩm) đến khả phát triển của lan hài Vân Nam m 42 TÀI LIỆU THAM KHẢ0 I Tiếng Việt Leonid Averyyanov, Phillip Cribb, Phan Kế Lộc, Nguyễn Tiến Hiệp (2004), Lan Hài Vệt Nam, Nxb Giao thông vận tải Trịnh Đình Đạt Cơng nghệ sinh học tập – Công nghệ di truyền (NXB giáo dục 2006) –,173 trang Hoàng Thị Giang, Nguyễn Quang Thạch, Mạch Hồng Thắm, Đỗ Thị Thu Hà (2010), “Nghiên cứu nhân giống in vitro và nuôi trồng giống lan hài quý P hangianum perner Gurss (Hài Hằng) thu thập ở Việt Nam”, Tạp chí Khoa học và Phát triển 2010 - tập 8, số 2, tr 194-201, Trường Đại Học Nông Nghiệp Hà Nội Nguyễn Thu Hậu, Nguyễn Trí Minh, Đinh Văn Khiêm, Nguyễn Thị Thanh Hằng, Cao Đình Hùng, Phan Xuân Ngun, Ngũn Đình Sĩ (2013), “Nghiên cứu nhân giớng cỏ ngọt (Stevia rebaudiana Bertond) in vitro”, Hội thảo Quốc tế Khoa học và Công nghệ phục vụ sản xuất Nông nghiệp Công nghệ cao tỉnh Lâm Đồng, Đà Lạt ngày 29 tháng năm 2013, trang 239-245 Lê Thị Huyên, Nguyễn Tiến Hiệp (2004), Hình thái và phân loại thực vật, Nhà xuất bản Nông nghiệp, Trường Đại học Lâm Nghiệp Hà Nội Trần Thị Lệ, Trương Thị Bích Phượng, Trần Thị Triêu Hà (2008), Giáo trình Cơng nghệ sinh học thực vật, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội Nguyễn Công Nghiệp (2006), Trồng hoa lan, Nxb Trẻ Nguyễn Như Khanh, Nguyễn Văn Đính (2011), Giáo trình các chất điều hoà sinh trưởng thục vật, Nxb Giáo dục Việt Nam Hoàng Thị Sản (2002), Phân loại học thực vật, Nxb Giáo dục 10 Nguyễn Thị Sơn, Nguyễn Thị Lý Anh, Vũ Ngọc Lan, Trần Thế Mai (2012), “Nhân giống in vitro loài lan Dendrobium fimbriatum Hook (Hoàng thảo long nhãn)”, Tạp chí Khoa học và Phát triển 2012, tập 10(2), trang 263-271 11 Nguyễn Kim Thanh, Nguyễn Thuận Châu (2005), Giáo trình sinh lý học thực vật, Nxb Giáo dục, Hà Nội m 43 12 Nguyễn Đức Thành (2000), Nuôi cấy mô tế bào thực vật – Nghiên cứu và ứng dụng, Nxb Nông nghiệp 13 Nguyễn Quang Thạch (2009), Cơ sở công nghệ sinh học – T3, Nxb Giáo dục 14 Bùi Trang Việt (2002), Sinh lý thực vật đại cương, Nxb Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh Vũ Văn Vụ, Nguyễn Mộng Hùng, Lê Hồng Điệp (2009), Công nghệ sinh học tập – Công nghệ sinh học tế bào, Nxb Giáo dục 15 Vũ Văn Vụ, Nguyễn Mộng Hùng, Lê Hồng Điệp (2002), Công nghệ sinh học – T2, Nxb Giáo dục II Tài liệu tiếng anh 16 Bubeck S.K (1973), A suty of Paphiopedilum meristem culture Ph.D Thesis, Rutgers University Microfilm International, Ann Arbor, Mivhigan, The USA 17 Chen T Y., Chen J T., Chang W C (2002), “Multiple shoot formation and plant regeneration from stem nodal explants of Paphiopedilum orchids”, In vitro Cell, Dev Biol Plant 38, p 595-597 18 Chen S C., Liu F Y (1982), “Notes on some species of Paphiopedilum from Yunnan”, Acta Bot, Yunnanica 4, p 163-167 19 Huang L C (1988), “A procedure for asexual multiplication of Paphiopedilum in vtro, American Orchid Society Bulletin 57, p 274-278 20 Huang L C., Lin C J., Kou C I., Huang B L., Murashige T (2001), “Paphiopedilum cloning in vitro”, Scientia Horticulturae 91, p 111-121 21 Kauth P (2005), In vitro seed germination and seedling development of Calopogon tuberosus and Sacolia lanceolata var lanceolata: Two Florida native terrestrial orchids, Master thesis, University of Florida 22 Liao Y J., Tsai Y C., Sun Y W., Lin R S., Wu F S (2011), “In vitro shoot induction and plant regeneration from flower buds in Paphiopedilum orchids”, In vitro Cell, Dev Biol plant 47, p 702-709 23 Lin Y H., Chang C., Chang W C (2000), “Plant regeneration from callus culture of a Paphiopedilum hybrid”, Plant Cell Tiss Org Cult Vol 62, pp 21 – 25 m 44 24 Liu ZJ, Liu KW, Chen LJ (2006), “Conservation ecology of endangered species Paphiopedilum armeniacum (Orchidaceae)”,Acta Ecol Sinica, Volume 26(9), pp 2791–2800 25 Nieman D (1980), “Plantlet formation of Paphiopedilum flower stem”, American Orchid Society Bulletin 49, p 372-373 26 Nhut D T, Thuy D T T., Luan V Q., Don N T., Khiem D V., Tran Thanh Van K (2005), “ Micropropagation of Paphiopedilum delenatii via stem node culture”, Vietnam – Korea International Symposium, Bio-Technology & BioSystem Engineering, p 184-190 27 Nhut D T., Trang P T T., Vu N H., Thuy D T T., Khiem D V., Binh N V., Tran Thanh Van K (2005), “ A wounding method and liquid culture in Paphiopedilum delenatiii propagation”, Propagation of Ornamental Plants 5(3), p.156-161 28 Stewart J., Button J (1975), “Tissue culture studies in Paphiopedilum”, American Orchid Society Bulletin 44, p 591-599 III www.vuonhoalan.net m PHỤ LỤC PHỤ LỤC MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY Bottle I II III IV V Amount to take preparation (ml) Component Stock Solution (g/l) NH4NO3 82,5 KNO3 95 MgSO4.7H2O 37 MnSO4.4H2O 2,23 ZnSO4.7H2O 1,058 CuSO4.5H2O 0,0025 0,025 CaCl2.2H2O 44 440,0 KI 0,083 CoCl2.6H2O 0,0025 0,025 KH2PO4 17 170,0 H3BO4 0,62 Na2MoO4.2H2O 0,025 FeSO4.7H2O 2,784 Na2EDTA.2H2O 3,724 20 Final concentratic (mg/l) 1.650,0 1.900,0 370,0 10 10 10 22,3 10,6 0,83 6,2 0,25 10 27,85 37,25 mg/100ml Vitamin Nicotinic acid 100 0,5 0,5 Glycine 100 2,0 2,0 Thiamine acid 100 0,1 0,1 Pyridocine HCl 100 0,5 0,5 Sucrose 30.0000,0 Agar 5.500,0 pH 5,6-5,8 m PHỤ LỤC 2: KẾT QUẢ XỬ LÝ SỐ LIỆU Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ BA đến khả nhân nhanh chồi lan hài Vân Nam BALANCED ANOVA FOR VARIATE HSNC FILE TN3 21/ 6/20 22:15 :PAGE Anh huong cua nong BA den kha nang nhân nhanh choi tu phoi cua cay lan hai Van Nam VARIATE V003 HSNC LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1T 5.51829 1.37957 87.49 0.000 2R 585334E-02 292667E-02 0.19 0.835 * RESIDUAL 126147 157684E-01 * TOTAL (CORRECTED) 14 5.65029 403592 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE TN3 21/ 6/20 22:15 :PAGE Anh huong cua nong BA den kha nang nhân nhanh choi tu phoi cua cay lan hai Van Nam MEANS FOR EFFECT T T NOS HSNC 0.200000 1.86667 3 0.666667 1.50000 0.703333 SE(N= 3) 0.724991E-01 5%LSD 8DF 0.236412 Anh huong cua nong BA den kha nang nhân nhanh choi tu phoi cua cay lan hai Van Nam MEANS FOR EFFECT R R NOS HSNC 0.996000 1.00600 0.960000 SE(N= 5) 0.561576E-01 5%LSD 8DF 0.183124 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE TN3 21/ 6/20 22:15 :PAGE Anh huong cua nong BA den kha nang nhân nhanh choi tu phoi cua cay lan hai Van Nam F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |T (N= 15) SD/MEAN | | | NO BASED ON BASED ON % | | | OBS TOTAL SS RESID SS | | | HSNC 15 0.98733 0.63529 0.12557 8.5 0.0000 0.8347 m |R |