Nghiên cứu khả năng nhân nhanh lan hài việt nam (paphiopedilum vietnamense) đã bị tuyệt chủng ngoài tự nhiên

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM DƯƠNG THỊ THU HOÀI NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHÂN NHANH LAN HÀI VIỆT NAM (Paphiopedilum vietnamense) ĐÃ BỊ TUYỆT CHỦNG NGOÀI TỰ NHIÊN LUẬN VĂN THẠC SỸ CÔNG NGHỆ SINH HỌC THÁI NGUYÊN - 2022 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM DƯƠNG THỊ THU HỒI NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHÂN NHANH LAN HÀI VIỆT NAM (Paphiopedilum vietnamese) ĐÃ BỊ TUYỆT CHỦNG NGỒI TỰ NHIÊN Ngành: Cơng nghệ sinh học Mã số ngành: 8420201 LUẬN VĂN THẠC SỸ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS BÙI TRI THỨC TS LÃ VĂN HIỀN THÁI NGUYÊN - 2022 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan rằng: Số liệu kết nghiên cứu luận văn hoàn toàn trung thực chưa sử dụng cơng bố cơng trình khác Mọi giúp đỡ cho việc thực luận văn cảm ơn thơng tin trích dẫn luận văn ghi rõ nguồn gốc Tác giả luận văn Dương Thị Thu Hồi ii LỜI CẢM ƠN Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy cô môn Công Nghệ sinh học – Công nghệ thực phẩm thuộc trường Đại Học Nông Lâm Thái Nguyên tận tình giúp đỡ tơi q trình học tập nghiên cứu để hoàn thành luận văn tốt nghiệp Đặc biệt, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Bùi Tri Thức TS Lã Văn Hiền dành nhiều thời gian, tâm huyết, trực tiếp hướng dẫn tận tình tạo điều kiện thuận lợi cho tơi suốt q trình thực nghiên cứu đề tài hoàn thiện luận văn Thạc sĩ Cuối cùng, tơi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè động viên, khích lệ, chia sẻ, giúp đỡ, đồng hành tơi q trình học tập, nghiên cứu Trong q trình học tập nghiên cứu khó tránh khỏi thiếu sót Do đó, tơi mong nhận đóng góp ý kiến thầy để luận văn hồn thiện Một lần tơi xin chân thành cảm ơn! Thái Nguyên, ngày tháng năm 2022 Tác giả luận văn Dương Thị Thu Hoài iii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Các nhóm lan Hài Việt Nam theo thứ hạng bảo tồn Tổ chức Bảo tồn Thiên nhiên Quốc tế (IUCN) [1] .12 Bảng 2.1 Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu 21 Bảng 2.2 Nghiên cứu ảnh huởng nồng độ, thời gian chất khử trùng H202 đến khả tạo vật liệu vô trùng phôi lan hài Việt Nam 25 Bảng 2.3 Nghiên cứu ảnh hưởng môi trường dinh dưỡng đến khả tái sinh chồi lan hài Việt Nam 26 Bảng 2.4 Nghiên cứu ảnh hưởng số giá thể đến khả sống, sinh trưởng mô giai đoạn sau nuôi cấy in vitro 33 Bảng 3.1 Kết nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ, thời gian khử trùng H2O2 đến khả tạo vật liệu vô trùng (sau 14 ngày nuôi cấy) 37 Bảng 3.2 Kết nghiên cứu ảnh hưởng môi trường dinh dưỡng đến khả tái sinh phát triển phôi lan hài Việt Nam (sau 30 ngày nuôi cấy) .39 Bảng 3.3 Kết nghiên cứu ảnh hưởng GA3 đến khả tái sinh phát triển phôi lan hài Việt Nam (sau 30 ngày nuôi cấy) 41 Bảng 3.4 Kết nghiên cứu ảnh hưởng BAP đến khả tái sinh phát triển phôi lan hài Việt Nam (sau 30 ngày nuôi cấy) 43 Bảng 3.5 Kết nghiên cứu ảnh hưởng TDZ đến khả tái sinh phát triển phôi lan hài Việt Nam (sau 30 ngày nuôi cấy) 45 Bảng 3.6 Kết nghiên cứu ảnh hưởng BAP đến khả nhân nhanh chồi lan hài Việt Nam (sau 30 ngày nuôi cấy) 47 Bảng 3.7 Kết nghiên cứu ảnh hưởng BAP Kinetin đến khả nhân nhanh chồi lan hài Việt Nam (sau 30 ngày nuôi cấy) 49 Bảng 3.8 Kết nghiên cứu ảnh hưởng số hợp chất hữu (nước dừa, khoai tây, chuối nghiền, cà rốt, dịch chiết nấm men) đến khả nhân nhanh chồi lan hài Việt Nam (sau 30 ngày nuôi cấy) 52 iv Bảng 3.9 Kết nghiên cứu ảnh hưởng than hoạt tính đến khả rễ tạo hoàn chỉnh lan hài Việt Nam (sau 30 ngày nuôi cấy) .55 Bảng 3.10 Kết nghiên cứu ảnh hưởng NAA đến khả rễ tạo hoàn chỉnh lan hài Việt Nam (sau 30 ngày nuôi cấy) 57 Bảng 3.11 Kết nghiên cứu ảnh hưởng IAA đến khả rễ tạo hoàn chỉnh lan hài Việt Nam (sau 30 ngày nuôi cấy) 59 Bảng 3.12 Kết nghiên cứu ảnh hưởng IBA đến khả rễ tạo hoàn chỉnh lan hài Việt Nam (sau 30 ngày nuôi cấy) 61 Bảng 3.13 Kết nghiên cứu ảnh hưởng kích thước bầu đến khả sống, sinh trưởng mô giai đoạn sau nuôi cấy invitro (sau 40 ngày cây) 63 Bảng 3.14 Kết nghiên cứu ảnh hưởng số giá thể đến khả sống, sinh trưởng mô giai đoạn sau nuôi cấy in vitro (sau 40 ngày cây) 65 Bảng 3.15 Kết nghiên cứu thành phần số giá thể thích hợp đến khả sống, sinh trưởng mô giai đoạn sau nuôi cấy in vitro (40 ngày cây) 67 Bảng 3.16 Kết nghiên cứu ảnh hưởng dinh dưỡng đến khả sống, sinh trưởng mô giai đoạn sau nuôi cấy in vitro (sau 40 ngày cây) 67 v DANH MỤC CÁC HÌNH, SƠ ĐỒ Hình 1.1: Hình thái hoa Paphiopedilum Hình 1.2: Hình ảnh lan hài Paphiopedilum Vietnamense 19 Hinh 3.1 Kết nghiên cứu ảnh hưởng môi trường dinh dưỡng đến khả tái sinh phát triển phôi lan hài Việt Nam (sau 30 ngày ni cấy) .40 Hình 3.2 Kết nghiên cứu ảnh hưởng GA3 đến khả tái sinh phát triển phôi lan hài Việt Nam (sau 30 ngày nuôi cấy) .42 Hình 3.3 Kết nghiên cứu ảnh hưởng BAP đến khả tái sinh chồi lan hài Việt Nam (sau 30 ngày nuôi cấy) 44 Hình 3.4 Kết nghiên cứu ảnh hưởng TDZ đến khả tái sinh chồi lan hài Việt Nam (sau 30 ngày nuôi cấy) 46 Hình 3.5 Kết nghiên cứu ảnh hưởng BAP đến khả nhân nhanh chồi lan hài Việt Nam (sau 30 ngày ni cấy) 48 Hình 3.6 Kết nghiên cứu ảnh hưởng BAP Kinetin đến khả nhân nhanh chồi lan hài Việt Nam (sau 30 ngày nuôi cấy) 51 Hình 3.7 Kết nghiên cứu ảnh hưởng số hợp chất hữu (nước dừa, khoai tây, chuối nghiền, cà rốt, dịch chiết nấm men) đến khả nhân nhanh chồi lan hài Việt Nam (sau 30 ngày ni cấy) 53 Hình 3.8 Kết nghiên cứu ảnh hưởng than hoạt tính đến khả rễ tạo hoàn chỉnh lan hài Việt Nam(sau 30 ngày nuôi cấy) 56 Hình 3.9 Kết nghiên cứu ảnh hưởng NAA đến khả rễ tạo hoàn chỉnh cho lan hài Việt Nam (sau 30 ngày nuôi cấy) 58 Hình 3.10 Kết nghiên cứu ảnh hưởng IAA đến khả rễ tạo hoàn chỉnh cho lan hài Việt Nam (sau 30 ngày ni cấy) 60 Hình 3.11 Kết nghiên cứu ảnh hưởng IBA đến khả rễ tạo hoàn chỉnh cho lan hài Việt Nam .62 Hình 3.12 Kết nghiên cứu ảnh hưởng số giá thể đến khả sống, sinh trưởng mô giai đoạn sau nuôi cấy in vitro (sau 40 ngày cây) .66 Sơ đồ 01: Nghiên cứu nhân giống in vitro loài lan hài Việt Nam .24 vi DANH MỤC TỪ VÀ THUẬT NGỮ VIẾT TẮT Từ, thuật ngữ viết tắt B5 BAP CC CN CR Cs CT CV CW ĐC DCNM DL GA3 IAA IBA IUCN Kinetin KT KTST LSD MS MT NAA ND PLB RE RL TDZ THT TN VQGCT VW WPM Nghĩa đầy đủ từ, thuật ngữ Gamborg cs, 1976 6-Benzyl amino purine Cao Cây Chuối nghiền Cà rốt Cs Công thức Coeficient of Variation – Hệ số biến động Coconut water - Nước dừa Đối chứng Dịch chiết nấm men Dài Gibberellic acid Indole-3-acetic acid Indole-3-butyric acid International Union for Conservation of Nature and Natural Resources - Liên minh Bảo tồn Thiên nhiên Quốc tế 6-Furfurylaminopurine Khoai tây Kích thích sinh trưởng Least Singnificant Difference Test Murashige & Skoog’s, 1962 Môi trường α-Naphthalene acetic acid Nước dừa Protocorm-like body - Cơ quan giống protocorm Robert Ernst Rộng Thidiazuron Than hoạt tính Thí nghiệm Vườn Quốc Gia Cát Tiên Vacin and Went, 1949 Woody Plant Medium – Lioyd Mc Cown, 1980 vii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN .ii DANH MỤC CÁC BẢNG iii DANH MỤC CÁC HÌNH, SƠ ĐỒ v DANH MỤC TỪ VÀ THUẬT NGỮ VIẾT TẮT vi MỤC LỤC vii MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết đề tài Mục tiêu đề tài Ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn 3.1 Ý nghĩa khoa học 3.2 Ý nghĩa thực tiễn CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đánh giá tổng quan tình hình nghiên cứu thuộc lĩnh vực đề tài 1.1.1 Giới thiệu chung loài lan giới 1.1.2 Phân loại lan hài giới 1.1.3 Phân bố lan hài giới 1.1.4 Bảo tồn nhân giống lan hài giới 1.2 Tổng quan nghiên cứu lan hài nước 12 1.2.1 Hiện trạng loài lan hài Việt Nam 12 1.2.2 Công tác bảo tồn lan hài Việt Nam 15 1.2.3 Công tác nhân giống Lan Hài Việt Nam 17 1.3 Đặc điểm hình thái lồi lan hài Việt Nam 18 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1 Đối tượng, phạm vi 21 2.1.1 Đối tượng, vật liệu nghiên cứu 21 viii 2.1.2 Phạm vi, địa điểm thời gian nghiên cứu 22 2.2 Nội dung nghiên cứu 22 2.2.1 Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ, thời gian chất khử trùng H2O2 đến khả tạo vật liệu vô trùng phôi lan hài Việt Nam 22 2.2.2 Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng mơi trường dinh dưỡng số chất kích thích sinh trưởng đến khả tái sinh phát triển phôi lan hài Việt Nam 22 2.2.3 Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng số chất kích thích sinh trưởng hợp chất hữu đến khả nhân nhanh chồi lan hài Việt Nam 23 2.2.4 Nội dung 4: Nghiên cứu ảnh hưởng than hoạt tính số chất kích thích sinh trưởng đến khả rễ tạo hoàn chỉnh lan hài Việt Nam 23 2.2.5 Nội dung 5: Nghiên cứu ảnh hưởng kích thước bầu, số giá thể dinh dưỡng đến khả sống, sinh trưởng mô giai đoạn sau nuôi cấy in vitro 23 2.3 Phương pháp nghiên cứu 23 2.3.1 Chuẩn bị môi trường nuôi cấy in vitro 23 2.3.2 Phương pháp nghiên cứu quy trình nhân giống in vitro 23 2.3.3 Phương pháp bố trí thí nghiệm 24 2.3.4 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng than hoạt tính số chất kích thích sinh trưởng đến khả rễ tạo hoàn chỉnh lan hài Việt Nam 30 2.3.5 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng kích thước bầu, giá thể dinh dưỡng đến khả sống, sinh trưởng mô giai đoạn sau nuôi cấy in vitro.31 2.4 Phương pháp đánh giá xử lý số liệu 34 2.4.1 Thu thập số liệu 34 2.4.2 Các tiêu theo dõi 34 2.4.3 Phương pháp xử lý số liệu 35 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 36 3.1 Kết nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ, thời gian chất khử trùng H202 đến khả tạo vật liệu vô trùng phôi lan hài Việt Nam 36 69 Từ kết bảng 3.16 cho thấy: với giá trị LSD.05 đạt 1,0; CV (%):0,9%; cơng thức thí nghiệm có sai khác có ý nghĩa mức độ tin cậy 95% Sử dụng loại phân bón khác có ảnh hưởng khác đến số tiêu sinh trưởng phát triển lan hài in vitro, công thức có sử dụng phân bón cho tiêu theo dõi tốt hẳn so với đối chứng phun nước lã Đặc biệt đặc điểm hình thái sau sử dụng phân bón tốt hẳn, khỏe hơn, xanh hơn, cứng sức đề kháng tốt Điều chứng tỏ phân bón có ảnh hưởng tốt đến khả sinh trưởng phát triển lan giai đoạn vườn ươm Trong 10 cơng thức sử dụng phân bón lá, sử dụng rễ cực mạnh N3M (CT7) cho tỉ lệ sống cao đạt 82,5 %, với số lá/thân chiều cao 6,1 cm Cao so với sử dụng Growmore orchid (CT2) cho tỷ lệ sống 46,5% với số lá/ thân chiều cao 5,25 cm Tiếp đến sử dụng kích mầm Thái Lan (CT6) cho tỷ lệ sống 74,4%, với số lá/thân cho chiều cao 5,9 cm cho tiêu theo dõi tương đối tốt, khỏe mạnh xanh đậm Như vậy, từ kết nghiên cứu cho thấy sử dụng rễ cực mạnh N3M tốt cho lan hài giai đoạn vườn ươm sau giai đoạn ống nghiệm Phun định kỳ tuần/lần giúp sinh trưởng, phát triển tốt 70 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận Trong khuôn khổ thí nghiệm nghiên cứu chúng tơi đưa số kết luận nghiên cứu sau: - Xác định hóa chất khử trùng tốt phơi lan hài Việt Nam dung dịch H2O2 3% thời gian ngâm mẫu 15 phút, tỷ lệ mẫu sống không nhiễm đạt 64,66 % - Xác định môi trường thích hợp cho tái sinh chồi lan hài Việt Nam môi trường MS + Đường 30g/l + Agar 5,0g/l + Nước dừa 150 ml/l + Inositol 100mg/l + 0,5g/l THT, pH = 5,8 tỷ lệ tái sinh 82,2%, số chồi/bình 18,7 chồi/bình cho chất lượng chồi xanh đậm, mập - Xác định môi trường nhân nhanh môi trường MS + Đường 30g/l + Agar 5,0g/l + Inositol 100mg/l + 0,5g/l THT + 5,0 mg/l BAP; 0,4 mg/l Kinetin + nước dừa 120 ml/l + chuối nghiền 50g/l cho tỷ lệ chồi tạo 109 chồi, hệ số nhân chồi 3,07 cm, cho chất lượng chồi xanh đậm, mập - Xác định môi trường rễ lan hài Việt Nam môi trường MS bổ sung 0,5 mg/l NAA + THT 2,0 g/l + Đường 30g/l + Nước dừa 150ml/l + Agar 5,0 g/l + Inositol 100 mg/l, pH = 5,8 Cho tỷ lệ rễ 83,4%, chiều dài rễ 8,7 cm, hình thái rễ dài, mập - Xác định kích thước bầu chậu ( 20x25), giá thể thích hợp Rêu ngoại + trấu hun + xơ dừa + đá thấm thủy với tỷ lệ 1:1:1:2 cho tỷ lệ đạt 28 cây/30 cây, chiều cao 5,9 cm, dài 3,7cm, rộng 2,37 cm; kích mầm Thái Lan siêu rễ cực mạnh N3M cho tỷ lệ sống 74,4% 82,5% tương ứng với số lá/thân chiều cao từ 5,9 – 6,1 cây, chồi xanh đậm, mập thích hợp cho sinh trưởng phát triển lan hài Việt Nam giai đoạn Đề nghị - Nghiên cứu điều kiện ngoại cảnh (ẩm độ, nhiệt độ, dinh dưỡng) đến sinh trưởng phát triển lan hài Việt Nam giai đoạn vườn ươm để hồnh thiện cơng 71 nghệ nhân giống in vitro lồi lan hài q có giá trị - Nghiên cứu thêm ảnh hưởng số chất kích thích sinh trưởng khác đến khả nhân nhanh chồi lan hài Việt Nam - Nghiên cứu thêm nồng độ BAP > 5mg/l đến khả nhân nhanh Hài Việt Nam 72 TÀI LIỆU THAM KHẢO I.Tài liệu tiếng việt Averyanov, Phillip Cribb, Phan Kế Lộc, Nguyễn Tiến Hiệp (2008), Lan Hài Việt Nam, Nxb Giao thơng Vận tải TP Hồ Chí Minh Đặng Xuyến Như (2006), “Nghiên cứu kỹ thuật nhân giống ni trồng giống hai lồi Lan Hài Việt Nam”, Báo cáo tổng kết khoa học kỹ thuật đề tài, Viện Ứng dụng Công nghệ Đề tài: “Điều tra, thu thập đánh giá, bảo tồn nguồn gen hoa cảnh khu vực miền Bắc Việt Nam’’ Trung tâm Hoa cảnh - Viện Di truyền nông nghiệp Hoàng Thị Giang, Nguyễn Quang Thạch, Mạch Hồng Thắm, Đỗ Thị Thu Hà (2010), Nghiên cứu nhân giống in vitro nuôi trồng giống lan Hài quý P hangianum perner Gurss (Hài Hằng) thu thập Việt Nam, Tạp chí Khoa học Phát triển, tập (số 2), tr 194-201 Hoàng Thị Nga (2013 – 2014), “Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống ni trồng số giống lan hài quý thu thập Việt Nam”, Tạp chí khoa học phát triển, tập (số 6), trang 387-394 Hoàng Thị Sản (2002), Phân loại học thực vật, Nxb Giáo dục Nguyễn Thị Sơn, Nguyễn Thị Lý Anh, Vũ Ngọc Lan, Trần Thế Mai (2012), “Nhân giống in vitro loài lan Dendrobium fimbriatum Hook (Hồng thảo long nhãn)”, Tạp chí Khoa học Phát triển 2012, tập 10(2), trang 263-271 Leonid Averyanov, Phillip Cribb, Phan Kế Lộc, Nguyễn Tiến Hiệp 2004 Lan Hài Việt Nam, 308 trang, NXB: Giao thông vận tải TP.Hồ Chí Minh Ngơ Thị Nguyệt cs (2013), Thu thập, lưu trữ nguồn gen ứng dụng công nghệ sinh học bảo tồn phát triển số loài lan quý Quảng Ninh, Báo cáo tổng hợp kết khoa học công nghệ đề tài, Trung tâm Khoa học Sản xuất Lâm Nông nghiệp Quảng Ninh 10 Nguyễn Công Nghiệp (2006), Trồng hoa lan, Nxb Trẻ 11 Nguyễn Thị Cúc, Nguyễn Văn Kết, Dương Tấn Nhựt, Nguyễn Thị Kim Lý (2014), “Nghiên cứu ảnh hưởng số hợp chất hữu lên trình sinh trưởng phát triển lan hài Hồng (Paphiopedilumdelenatii) in vitro” Tạp chí Sinh học, tập 36 (số 1), trang 250-256 12 Nguyễn Thị Tình, Nguyễn Tiến Dũng, Nguyễn Văn Duy, Đào Xn Thanh, Ngơ Xn Bình (2017) “ Ứng dụng công nghệ nuôi cấy in vitro nhân nhanh giống lan hài Giáp (Paphiopedilum malipoense Chen &Z.H.Tsi , Tạp chí Nơng nghiệp phát triển Nơng Thơn (số 3+4) 73 13 Nguyễn Thị Tình, Nguyễn Tiến Dũng, Phạm Thị Nam, Chu Thúc Đạt, Ngơ Xn Bình (2017) “Nghiên cứu nhân giống in vitro lan hài Gấm (Paphiopedilum concolor” Tạp chí Nơng nghiệp phát triển Nơng thơn (số 2) 14 Nguyễn Thị Tình, Nguyễn Tiến Dũng, Vũ Thị Thanh Hằng, Ma Thị Hồn, Đào Xn Thanh, Ngơ Xn Bình (2018) “Nghiên cứu ảnh hưởng chất kích thích sinh trưởng đến khả tái sinh chồi lan hài Xuân Cảnh (Paphiopedilum Canhii) phương pháp in vitro”, Tạp chí Nơng Nghiệp phát triển Nơng thơn (số 5) 15 Nguyễn Thu Hậu, Nguyễn Trí Minh, Đinh Văn Khiêm, Nguyễn Thị Thanh Hằng, Cao Đình Hùng, Phan Xuân Nguyên, Nguyễn Đình Sĩ (2013), “Nghiên cứu nhân giống cỏ (Stevia rebaudiana Bertond) in vitro”, Hội thảo Quốc tế Khoa học Công nghệ phục vụ sản xuất Nông nghiệp Công nghệ cao tỉnh Lâm Đồng, Đà Lạt ngày 29 tháng năm 2013, trang 239-245 16 Nguyễn Tuấn Hưng (2014 – 2016), “Sử dụng phương pháp in vitro nhân giống sản xuất số loài lan hài địa Hà Nội” Tạp chí Nơng nghiệp phát triển Nông thôn (số 9) 17 Nguyễn Văn Kết, “ Điều tra tài nguyên di truyền loài lan rừng Vườn quốc gia Cát Tiên (VQGCT) nghiên cứu biện pháp nhân nhanh để bảo tồn” 18 Nông Văn Duy (2008) “Nghiên cứu chọn lọc phát triển số lồi lan rừng có triển vọng phục vụ cho công tác nhân giống, lai tạo bảo tồn nguồn gen đặc hữu, quý Lâm Đồng”, Viện Sinh học Tây Nguyên công bố tháng 10/2008 19 Phạm Anh Tám cs (2017 – 2019), “Nghiên cứu bảo tồn, khai thác phát triển nguồn gen lan hài vân bắclan hài lông (Paphiopedilum hirsutissimum) lan thủy tiên hường (Dendrobium amabile O’Brien.) cho vùng Bắc Trung bộ” 20 Sách đỏ Việt Nam (Phần II: Thực vật): Phần - NXB Khoa học Tự nhiên Công nghệ 21 Trần Duy Quý (2007- 2009), Thu thập đánh giá nguồn gen hoa lan Việt Nam lưu giữ chúng vùng: miền núi phía Bắc đồng Bắc bộ”, Viện Khoa học nông nghiệp Việt Nam 22 Võ Văn Chi (2017), Sách tra cứu tên cỏ Việt Nam, NXB Giáo Dục 23 Vũ Quốc Luận, Trịnh Thị Hương, Nguyễn Phúc Huy, Đỗ Khắc Thịnh, Dương Tấn Nhựt (2014), “Ảnh hưởng chất bổ sung hữu lên trình sinh trưởng phát triển chồi lan Vân Hài (Paphiopedilum callosum) ni cấy intro”, Tạp chí Khoa học Công nghệ, tập 52 (số 1), trang 49 - 62 74 II Tiếng anh 24 Ang Li cộng (2002) Viện Thực vật Bắc Kinh (Trung Quốc) tiến hành “Nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền P Micranthum’’ 25 Arditti J, Ernst (1993) Micropropagation of orchids, John Wiley and Sons 26 Averyanov, L V and A L Averyanova, 2003 Update checklist of the orchids of Vietnam Vietnam International University Publishing House, Ha Noi, 1020pp (bilingua, in English and Vietnamese) 27 Bo Long, Alex X Niemiera, Zhi-ying Cheng, Chun-lin Long (2010).In vitro propagation of four threatened Paphiopedilum species (Orchidaceae 28 Chen S C., Liu F Y (1982), “Notes on some species of Paphiopedilum from Yunnan”, Acta Bot, Yunnanica 4, p 163-167 29 Chen TY, Chen JT, Chang WC (2004a), “Plant regeneration through direct shoot bud formation from leaf cultures of Paphiopedilum orchids”, Plant Cell Tiss Organ Cult, Volume76, pp.11–15 30 Chyuam Yih Ng Norihan Mohd (2011), Micropropagation of endanged slipper orchid, Paphiopedilum rothschildianum ( rchb.F.) stein 31 Dressler RL.1981 The orchids: natural history and classification Cambridge: Harvard University Press 32 Huang L C., Lin C J., Kou C I., Huang B L., Murashige T (2001), “Paphiopedilum cloning in vitro”, Scientia Horticulturae 91, p 111-121 33 Knudson C (1946) A nutrient for germination of orchids 34 Lee Y.-I., M.C Chen, C.Y Huang (2010) Effect of medium composition on a asymbiotic seed germination of five phalaenopsis species,ISHS Acta Horticulturae 878, International Orchid SymposiumNovember 25th 35 Lee YI (1998) The study of embryo development and seed germination in vitro in slipper orchids MSc thesis National Taiwan University, Taiwan 36 Liao Y J., Tsai Y C., Sun Y W., Lin R S., Wu F S (2011), “In vitro shoot induction and plant regeneration from flower buds in Paphiopedilum orchids”, In vitro Cell, Dev Biol plant 47, pp.702-709 37 Liu ZJ, Liu KW, Chen LJ (2006), “ Conservation ecology of endangered species Paphiopedilum armeniacum (Orchidaceae)”,Acta Ecol Sinica, Volume 26(9), pp 2791–2800 38 Long B, Niemiera AX, Cheng ZY, Long CL (2010) In vitro propagation of four threatened Paphiopedilum species (Orchidaceae) Plant Cell Tissue Organ Cult, 101, 151-62 75 39 Martin KP (2003) Clonal propagation, encapsulation and reitroduction of Ipsea malabarica (Reichb.f.) J D Hook., and andangered orchid In vitro Cell Dev Biol Plant 39: 322-326 40 Nagashima T (1982) Studies in the seed germination and embryogenesis ingoeringiiRchb f and Paphiopedilum insigne var.sanderae Rchb J Jpn Soc Hortic Sci 51:94–105 41 Nhut D T, Thuy D T T., Luan V Q., Don N T., Khiem D V., Tran Thanh Van K (2007), “ Micropropagation of Paphiopedilumdelenatii via stem node culture”, Vietnam – Korea International Symposium, Bio-Technology & BioSystem Engineering, p 184-190 42 Nhut D T., Trang P T T., Vu N H., Thuy D T T., Khiem D V., Binh N V., Tran Thanh Van K (2005), “A wounding method and liquid culture in Paphiopedilum delenatiii propagation”, Propagation of Ornamental Plants 5(3), p.156-161 43 Paphiopedilum emersonii Koopowitz et Cribb in Orch Advocate 12 (3): 86 fig 1986 44 Paphiopedilum hangianum Perner & Gruss 1999 45 Paphiopedilum helenae Aver., Orchids 65: 1064 (1996) 46 Paphiopedilum henryanum Braem, Schlechteriana 1: [4] 1987 47 Paphiopedilum hiepii Aver., Orchids (West Palm Beach) 67: 261 (1998) 48 Paphiopedilum jackii H.S.Hua, Die Orchidee (Hamburg) 46 (3): U4 (1995) 49 Paphiopedilum tranlienianum O Gruss & H Perner 1998 50 Shi J, Luo YB, Bernhardt P, Ran JC, Liu ZJ, Zhou Q (2008), Pollination by deceit in Paphiopedilum barbigerum (Orchidaceae): a staminode exploits the innate colour preferences of hoverflies (Syrphidae) Plant Biol 11:17–28 51 Thomas TD, Michael A (2004) High frequency plantlet regeneration and multiple shoot induction from culture immature seeds of rhynchostylist retusa Blume., an exquiside orchid Plant Bio-technol Rep1: 243-249 PHỤ LỤC 1: MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY Bảng 1: Thành phần môi trường MS (Muashige & Skoog) Amount to Bottle Component Stock Solution take Final (g/l) preparation concentratic(mg/l) (ml) I II III IV V NH4NO3 82,5 KNO3 95 MgSO4.7H2O 37 MnSO4.4H2O 2,3 ZnSO4.7H2O 1,058 CuSO4.5H2O 0,005 0,025 CaCl2.2H2O 44 440,0 KI 0,083 CoCl2.6H2O 0,0025 0,025 KH2PO4 17 170,0 H3BO4 0,62 Na2MoO4.2H2O 0,025 FeSO4.7H2O 2,784 Na2EDTA.2H2O 3,724 20 1.650,0 1.900,0 370,0 10 10 10 22,3 10,6 0,83 6,2 0,25 10 27,85 37,25 mg/100ml Vitamin Nicotinic acid 100 0,5 0,5 Glycine 100 2,0 2,0 Thiamine acid 100 0,1 0,1 Pyridocine HCl 100 0,5 0,5 Sucrose 30.0000,0 Agar 5.500,0 pH 5,6 - 5,8 Bảng 2: Thành phần môi trường WPM (Woody Plant Medium Lioyd Mc Cown, 1980) Vi lượng Đa lượng Các chất hữa Muối khoáng Nồng độ (mg/l) CuSO4.5H2O 0.25 Na2EDTA.2H2O 37.2 H3BO3 6.20 MnSO4.H2O 22.30 FeSO4.7H2O 27.8 ZnSO4.7H2O 8.6 CaCl2.2H2O 96 Ca(NO3)2.4H2O 556 KH2PO4 170 K2SO4 990 MgSO4.7H2O 370 NH4NO3 400 NaMoO4.2H2O 0.25 Myo – inositol 100 Pyridoxine HCl 0.5 Glycine 2.0 Nicotinic acid 0.5 Thiamine HCl 1.0 Agar Đường 30 Bảng 3: Thành phần môi trường B5 (Gamborg cs, 1976) Muối khoáng Nồng dộ (mg/l) (NH4)2SO4 134 CaCl2.2H2O 150 MgSO4.7H2O 246 KNO3 2.258 MnSO4.2H2O 10 KI 0.75 Na2MoO4.2H2O 0.25 Na2H2PO4.2H2O 150 ZnSO4.7H2O 2.0 Na2EDTA.2H2O 37.2 H3BO3 CoCl2.6H2O 0.025 CuSO4.5H2O 0.025 FeSO4.7H2O 27.8 Myo- inositol 100 Nicotinic acid Pyrodoxine HCl Thiamine 10 Đường 30 Đa lượng Vi lượng Các chất hữu  Phân bón * Growmore orchid: ⁃ Xuất xứ: Hoa Kì ⁃ Thành phần: Đạm tổng số (Nts) :6%; Lân hữu hiệu (P2O5hh):30%; Kali hữu hiệu (K2Ohh): 30%; Bo (B): 200ppm; Đồng (Cu): 500ppm; Sắt (Fe): 1.000ppm; Kẽm (Zn): 500ppm; Độ ẩm: 1% ⁃ Công dụng: Kích thích hoa, giúp hoa nở to, màu đẹp, dưỡng hoa, cành hoa khỏe, cành hoa giày, hương thơm lâu bền Hoa lâu tàn, tăng sức chống chịu sâu bệnh thời tiết khắc nghiệt Đặc biệt tốt thời kỳ hoa *Chế phẩm Hùng Nguyễn (là chế phẩm sinh học) ⁃ Xuất xứ: Việt Nam ⁃ Cơng dụng: Siêu kích rễ, Kích keiki, sát khuẩn - kháng bệnh, bổ sung NPK - Dưỡng khỏe mạnh (có NPK tích hợp), trừ bệnh đốm gỉ sắt Fe, phịng – trị nấm *Kích mầm chồi hoa keiki spray - Xuất xứ: Việt Nam - Thành phần: có thành phần phytorhormones - nhóm hợp chất đóng vai trị trung tâm tác động đến sinh trưởng phát triển lan, - Cơng dụng: có tác dụng đánh thức mắt ngủ (chuyển từ trạng thái ngủ sang trạng thái hoạt động) Mắt ngủ lan định dạng khối u (phình lên) *Kích mầm B1.3.6 Iron Chelates - Xuất xứ: Thái Lan - Thành phần: Vitamin B1, Vitamin B3, Vitamin B6, Iron Chelates - Công dụng: Vitamin B1-36 công thức dinh dưỡng thiếu nhà nông Giúp hạt mau nảy mầm, bảo vệ non, phát triển tốt chống lại bệnh tật *Kích mầm Thái Lan: - Xuất xứ: Thái Lan - Thành phần: chiết xuất từ tảo thiên nhiên gồm hoạt chất Cytosin, Lamino acid, 17 loại vitamin B1, B2,C, D3, E, k… glucose, Poliseccalay phù hợp cho phong lan - Cơng dụng Nano-megaplus: Kích ki (kieki), đâm chồi, tạo cho có rễ khỏe mạnh, tạo sức đề kháng tốt,giúp phục hồi cành yếu đuối khỏe mạnh thêm * Siêu rễ cực mạnh N3M: ⁃ Xuất xứ: Việt Nam ⁃ Thành phần: B 0.02%, K2O 2.5%, N 11%, P2O5 3%., Cu, Fe, Mn, Zn: loại 0,2% Phụ gia khác: 100% ⁃ Cơng dụng: • Phun thuốc N3M lên làm đâm tược mới, làm lớn lá, chống rụng hoa, tăng đậu • Kích thích rễ loại trồng, bao gồm: ăn quả, loài hoa (đặc biệt hoa lan), cảnh, vườn ươm,… • Hỗ trợ tăng kích thước độ khỏe rễ • Thúc đẩy nhanh q trình phục hồi tăng trưởng sau bị ngập úng * Nano silic + Chitosan - Xuất xứ: Việt Nam ⁃ Thành phần: Nano Chitosan 5% chiết xuất từ vỏ tôm cua, sụn mực enzym vi sinh vật (Enzym Trichoderma, Enzym Pseudomonas) Phụ gia sinh học đặc biệt ⁃ Cơng dụng: • Đặc trị nấm bệnh vi khuẩn gây hại: Phytophthora, Fusarium, Rhizoctonia,… nguyên nhân gây bệnh chết nhanh chết chậm, thối rễ, héo rũ, tiêu điên • Đặc trị Thán thư, Nấm hồng, Rỉ sắt… • Chống vàng lá, tháo đốt *Phân bón cho lan Dynamic Lifter: ⁃ Xuất xứ: nhập Úc ⁃ Thành phần: có nguồn nguyên liệu tự nhiên với thành phần hữu 39% N-P-K hữu hiệu 3.3%-2.9%-2% thành phần trung vi lượng thiết yếu khác dùng cho trồng, giúp cấy sinh trưởng phát triển mạnh ⁃ Cơng dụng:là phân bón đậm đặc giúp Lan phát triển mạnh chống loại sâu bệnh hội Nông Nghiệp Úc khuyên dùng *Phân trùn quế bón gốc Vermis: - Xuất xứ: Việt Nam - Thành phần: dạng viên, 100% phân trùn quế nguyên chất nén thành viên giàu dinh dưỡng - Cơng dụng: • Cung cấp nguồn dinh dưỡng thiết yếu, an tồn cho • Hỗ trợ hệ miễn dịch tự nhiên trước vi khuẩn, vi rút nấm gây hại • Hỗ trợ kích thích hoa  Giá thể *Dớn - Nguồn gốc: dớn trồng lan dương xỉ loại lớn( Dicksonia antarctica), thường mọc nhiều vùng thung lũng rừng nơi có nhiều mưa - Đặc điểm: dớn dùng trồng lan tốt nhờ giữ ẩm cao, thoáng rễ Giúp lan thích nghi nhanh rễ bám chặt vào dớn Bộ rể phát triển tốt lan phát triển nhanh bền năm trở lên Dớn vừa giá thể, vừa chất trồng lợi mà bị nấm mốc Trồng lan dớn cọng lâu mục, bị đọng muối *Vỏ thơng: - Nguồn gốc: lớp vỏ ngồi thơng, vỏ thơng già sau tự rụng xuống Hoặc chúng tách từ thơng già, sau chặt, cắt thành kích thước khác Ngồi vỏ thơng cịn sử dụng thêm gỗ thông vụn thu mua từ nhà máy chế biến gỗ - Đặc điểm: Vỏ thơng có nhiều kích thước khác size: – 6mm; – 9mm, – 12mm, 12 – 18 mm, 18 – 25 mm, 20 – 30 mm • Thốt nước tốt • Giúp bị nhiễm bệnh • Vỏ thơng lâu mục • Làm lớp phủ nông nghiệp hữu Chúng giúp đất giữu ẩm tốt lớp cách nhiệt tốt, ngăn cản nhiệt độ từ nắng chiếu vào đất, giúp đất mát hơn, bảo vệ rễ vi sinh vật đất Hơn nữa, dùng vỏ thông làm lớp phủ tạo nên cảnh quan đẹp chúng ngăn cản phát triển cỏ dại tốt *Xơ dừa: - Nguồn gốc: vỏ trái dừa mà xé Là phần vỏ dạng khơ thường có màu nâu vàng - Đặc điểm: có nhiều tác dụng khác như: chống xói mịn, phủ lên bề mặt chống nóng, tăng độ ẩm trộn xơ dừa với đất, tạo điều kiện cho đất tơi xốp, kích thích phát triển rễ Nhưng lưu ý bạn phải chọn loại để lâu chất chát có xơ dừa dễ làm suy *Rêu ngoại: - Nguồn gốc: Rêu người ưa chuộng rêu có nhiều nơi mọc nhiều quốc gia khác nhau, nguồn rêu mà nhiều người biết đến rêu rừng rêu nhập new zeland, chile nhiều quốc gia khác - Đặc điểm: • Có tính mềm, đồng thời có khả kháng khuẩn tự nhiên, giúp ức chế tăng trưởng số mầm bệnh, tốt cho lan phát triển • Có khả giữ nước cho rễ bám hút cao, giữ ẩm tốt • Giúp cho hoa lan đủ nước để sinh trưởng phát triển *Than - Nguồn gốc: than củi - Đặc điểm: Than củi chất trồng chậu tuyệt vời cho lan khơng giữ ẩm, nước nhanh lại bền lâu khó bị phân hủy Than giúp khử mùi hơi, giảm tích tụ vi khuẩn giúp cân độ PH giá thể hiệu Than hấp thụ cặn muối loại phân bón tốt nên làm giảm nguy cháy rễ, đen đầu rễ Chính sử dụng than làm hỗn hợp giá thể tạo môi trường tốt cho lan phát triển Hơn nữa, than củi môi trường lý tưởng giúp lan tránh sên, loại thích gặm rễ non Bên cạnh than củi chất trồng tốt cho loại lan đơn thân Nó tạo mơi trường chắn cho rễ lan lớn bám vào ... NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM DƯƠNG THỊ THU HOÀI NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHÂN NHANH LAN HÀI VIỆT NAM (Paphiopedilum vietnamese) ĐÃ BỊ TUYỆT CHỦNG NGOÀI TỰ NHIÊN Ngành: Công nghệ sinh học Mã số ngành:... Tổng quan nghiên cứu lan hài nước 12 1.2.1 Hiện trạng loài lan hài Việt Nam 12 1.2.2 Công tác bảo tồn lan hài Việt Nam 15 1.2.3 Công tác nhân giống Lan Hài Việt Nam ... nghiên cứu ảnh hưởng số chất kích thích sinh trưởng đến khả nhân nhanh chồi lan hài Việt Nam 46 3.3.2 Kết nghiên cứu ảnh hưởng số hợp chất hữu đến khả nhân nhanh chồi lan hài Việt Nam