BỘ Y TẾ
VIỆN SỐT RẾT - KỸ SINH TRÙNG - CƠN TRÙNG TRUNG ƯƠNG
KẾT QUÁ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI
NGHIÊN CŨU KỸ THUẬT NUƠI CẤP CHỦNG
ANOPHELES MINIMUS
TRONG PHỊNG THÍ NGHIỆM
- Chủ trì đề tài: TS Vũ Đình Chit
- Cơ quan chủ trì đề tài: Viện Sốt rét - KST- CT TƯ - Cấp quản lý: Viện Sốt rét - KST- CT TƯ
+ Thời gian thực hiện: Từ tháng 4 năm 2001 đến tháng 12 năm 2005
+ Tổng kinh phí thực hiện để tài: 55 triệu đồng
Hà Nội - 2005
6/09
Trang 2KET QUA NGHIEN COU BE TAI
NGHIÊN CỨU KỸ THUẬT NUƠI CẤP CHỦNG ANOPHELES MINIMUS TRONG PHỊNG THÍ NGHIỆM + Chủ trì đề tài: TS Vũ Đình Chữ + Cơ quan chủ trì đề tài: Viện Sot rét- KST- CT TU + Cấp quản lý: Viện Sốt rét- KST- CT TU + Những người thực hiện chính: -TS Vũ Đình Chữ -CN Lương Xuân Dũng - KTV Phạm Thị Hoan -TS Pham Thị Khoa - KTV Trịnh Thị Kim Oanh -CN Nguyễn Thị Hồ
-KTV Nguyễn Thị Minh Tân
Trang 3NHŨNG CHỮ VIẾT TẤT
CTV: Cộngtácviên
CS : Cộng sự
GPNT: Giao phối nhân tạo GPTN: Giao phối tự nhiên
LTðO: Thời gian chết 50% số lượng muỗi theo dõi
TQ: Trung Quốc
Trang 44.4.3 444 4.4.5 446 5 Sĩ 52 53 5.4 wT MỤC LỤC Trang 'Tĩm tắt kết quả nghiên cứu Đặt vấn đề Mục tiêu
Téng quan tai lig
"Tình hình nghiên cứu ở ngồi nước
“Tình hình nghiên cứu ở trong nước
Vật liệu, địa điểm, thời gian, phương pháp nghiên cứu
Vật lie
Địa điểm nghiên cứu “Thời gian nghiên cứu
Phương pháp nghiên cứu
“Tạo đồng An.miimus giao phối tự nhiên Ana Bw www Theo đối ảnh hưởng của ánh sáng đến sự phát triển của An.minimus 5 Theo đội ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của An.minimus 6
"Theo dõi ảnh hưởng của mật độ muỗi, kích thước lồng nuơi đến
sự phát triển của ÁAnminimus we OF
Theo dõi ảnh hưởng của máu vật chủ tới khả năng sinh sản, tỷ lệ
trứng nở và sự phát triển của bọ gay An.mininus 8
Xây dựng kỹ thuật nuơi 9
Kết quả 9
Kết quả tạo ding An.minimus giao phdi tr nhién 9
“Tho dõi ảnh hưởng của ánh sing đến sự phát triển của
An.minimus 10
“Theo dõi ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của
Anminimus,
Theo dõi ảnh hưởng của mặt độ muỗi, kích thước lồng nuơi đến su phat trién cla An.minimus
"Theo đối ảnh hưởng của máu vật chủ tới khả năng sinh s
trứng nở và sự phát triển của bọ gậy Ản.HÍHPHư, 19
Trang 5'Tốm tắt kết quả nghiên cứu đẻ tài
NGHIÊN CỨU KỸ THUẬT NUƠI CẤP CHỦNG
ANOPHELES MINIMUS TRONG PHONG THI NGHIEM
Vũ Đình Chủ, Lương Xuân Dũng, Phạm Thị Hoan, Phạm Thị Khoa, Trịnh Thị Kim Oanh, Nguyễn Thị Hồ, Nguyễn Thị Minh Tân
1 Kết quả nổi bật của để tài:
a Dong gĩp mới của để tài:
- Lần đầu tiên tạo và duy trì được đồng An.winumux giao phối tự nhiên trong lồng hẹp ở Việt Nam
- Xây dựng được kỹ thuật nuơi, làm cơ sở cho việc nuơi các lồi Anopheles khác
b Kết quả cụ thể:
~ Anaminimus thu thập tại xã Hịa Sơn, huyện Lương Sơn, tỉnh Hịa Bình
được nuơi giữ trong phịng nuơi Viện Sốt rét - KST - CT TƯ Từ tháng 11 năm
1997 đến tháng 6 năm 2001, chủng được duy trì bằng kỹ thuật giao phối nhân tạo Từ tháng 7 nam 2001, thử nghiệm giao phối tự nhiên và thả thêm muỗi dực Aedes aegypti vào lơng nuơi để kích thích Án.minimus giao phối, thấy chủng đã
cĩ khả năng giao phối tự nhiên trong lồng hẹp và địng này đã dần thay thé dong giao phối nhân tạo
- Các đặc điểm sinh học:
+ Giai đoạn trứng: Thời gian trứng tổn tại trong mơi trường nước sau khi để tỷ lệ nghịch cịn tỷ lệ trứng nở tỷ lệ thuận với cường độ ánh sáng Ở 200 - 220 Lux, thời gian phát triển trứng từ 2-3 ngày, tỷ lệ trứng nở 83,8% Cường độ ánh sáng giảm, thời gian trứng tơn tại trong nước kéo đài tới 4 ngày và tỷ lệ trứng nở
giảm
Thời gian giai đoạn trứng trong nước kéo dài từ 2 - 4 ngày Trong điều kiện 22-25°C, tỷ lệ trứng nở cao hơn & 28°C
+ Giai đoạn ấu tring:
Cường độ ánh sáng thích hợp nhất là 200- 220 Lux với 62,7% bọ gậy lột
xác thành quãng và 94,7% quăng lột xác thành muỗi Nhiệt độ thích hợp cho ấu trùng phát triển là 25 + I%C với 39,8% bọ gậy lột xác thành quãng và 38% bọ
gây phát triển tới giai đoạn trưởng thành Nhiệt độ bất lợi đối với bọ gậy
Anminimus ta < 22°C
+ Giai đoạn trưởng thành: Thời gian sống của muỗi đực luơn ngắn hơn muỗi cái; Thời gian sống trung bình của muỗi đực từ 13-17 ngày, muỗi cái từ 14
-18 ngày Tuy ánh sáng và nhiệt độ khơng ảnh hướng rõ rệt nhưng điều kiện
thích hợp cho sự sống sĩt cla mudi 14 130-150 Lux, 22-25 °C
Trang 6Máu vật chủ chỉ ảnh hưởng đến khả năng sinh sản và tý lệ trứng nở, khơng
ảnh hưởng tới sự phát triển của bọ gậy Muỗi đốt máu người, một muỗi cái đẻ trung bình 172 trứng, tỷ lệ trứng nở là 78,3%, trong khi đĩ muỗi đốt mầu chuột đề trung bình 151 trứng và tỷ lệ trứng nở là 69,5%
~ Kỹ thuật nuơi:
+ Thức ăn thích hợp cho bọ gậy gồm: 6gam bột bánh mỳ + 2 gam bột tơm
+2 gam bột đậu xanh + 10 mg vitamin Bị, lượng thức ăn cho mội khay nuơi kích
thước 20 x 25 x 3cm là 0,018gam/ ngày/2 lân
+ Mat độ nuơi bọ gậy: 0,4 con/lcmẺ diện tích bể mặt nước nuơi hay
150con/khay men (kích thước 20 x 25 x 3cm)
+ Nước nuơi: nước máy để 2-3 ngày cho bay hơi Clo, sục oxy trước khi sử
dụng để nuơi bo gay
+ Mật độ nuơi muỗi thích hợp là 0,025 con/cm? thể tích lồng nuơi, kích
thước lồng nuơi là 30 x 30 x 30 cm
e Hiệu quả về đào tạo: cung cấp các dẫn liệu về sinh học của lồi An.minimus trong điều kiện phịng thí nghiệm
2 Ap dụng vào thực tiễn sẵn xuất và đời sống xã hội: làm ca st dp dung trong
việc nuơi các lồi muỗi khác,
3 Đánh giá thực hiện để tài đối chiếu với dé cương nghiên cứu đã được phĩ duyệt:
a.Tiến độ thực hiện: Đề tài thực biện đúng tiến độ với đề cương nghiên
cứu đã được phê duyệt
b Thực hiện các mục tiêu nghiên cứu đố để ra: Thực hiện đây đủ các mục tiêu đã dé ra
e Các sẩn phẩm tạo ra so với du kiến trong đê cương: Tạo ra đây di
các sản phẩm đã dự kiến trong để cương: cĩ số liệu và chủng muỗi
a Đánh giá việc sử dụng kinh phí:
Tổng kinh phí thực hiện đề tài 55 triệu đồng
"Trong đĩ kinh phí sự nghiệp khoa học 55 triệu đồng
Trang 71.ĐẶT VẤN ĐỀ
Các lồi Anopheles truyền bệnh sốt rét và một số bệnh khác Vì vậy chúng Tà đối tượng nghiên cứu tại nhiều nước, nhất là các nước nhiệt đới Các khảo sát về phân bố, đặc điểm sinh thái học của Anopheles, phương pháp phịng chống
chúng đã cĩ nhiều cơng trình nghiên cứu được tiến hành Đồng thời các lồi cĩ
vai trị quan trọng trong truyền bệnh sốt rết cũng được nuời giữ trong phịng thí
nghiệm, nhằm phục vụ các thử nghiệm sinh học
Õ nước ta, một số lồi muỗi là trung gian truyền bệnh đã được nuơi giữ
chủng trong phịng thí nghiệm như: Aedes aegypti, Ae.albopictus, Culex
quảnghefasciafus Tuy nhiên, việc nuơi giữ chủng các lồi muỗi Anopheles Ia
vectơ sốt rét vẫn cịn gặp nhiều khĩ khăn, chưa cĩ khả năng cung cấp chủng cho
các thử nghiệm của Viện và các cơ sở nghiên cứu khác, chưa hồn thiện được kỹ thuật nuơi Vì vậy, chúng tơi ành thực biện đề tài:” Nghiên cứu kỹ thuật
nuơi cấp chủng Anopheles mìnimus trong phịng thí nghiệm”
2 MỤC TIÊU
~ Nghiên cứu các đặc điểm sinh học, sinh that hoc cud ching An minimus trong phịng thí nghiệm
- Xây dựng kỹ thuật nuơi thích hợp để cĩ thể cấp chủng cho các thừ nghiệm với hĩa chất diệt cơn trùng và các thí nghiệm khác
3 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
3.1 Tình hình nghiên cứu Ở ngồi nước
An minimas được xác định là trung gian truyền bệnh sốt rét chủ yếu ở
nhiều nước Đơng phương từ Ấn Độ, Myanmar, Thái Lan, Lào, Campuchia, Việt
Nam, tới Nam Trung Quốc Vì thế chúng là đối tượng của nhiều cơng trình
nghiên cứu khoa học nhằm phục vụ chương trình phịng chống sốt rét ở các quốc gia này [L1] Một số lồi Anopheles đã được nuơi trong phịng thí nghiệm, như
An đừng & Thai Lan [7], An pseudopunctipennis & Mexico [12], An maculatus, An.barbirostris & Indonesia [15,18], An culicifacies & Pakistan [19] , An gambiae & chau Phi Qua cdc nghién cit nay cho thdy hau hét cdc lodi
Anopheles khơng giao phối tự nhiên trong lơng hẹp, vì vậy để duy trì chủng
trong phịng thí nghiệm đều phải thực hiện kỹ thuật giao phối nhân tạo Năm 1975, WHO đã xây dựng kỹ thuật giao phối nhân tạo trong việc to và duy trì
déng Anopheles trong phdng thi nghiệm [20] Năm 1994, Thái Lan đã duy trì
duge An minimus tong phong thi nghiém bang phương pháp giao phối nhân tạo và năm 1997 đã tạo được đồng giao phối tự nhiên [16]
3.2 Tình hình nghiên cứu Ở trong nước
© Viet Nam, An, minimus 1A trung gian truyền bệnh sốt rét chủ yến ở vùng
rừng núi tồn quốc Sinh cảnh thích hợp nhất cho lồi này phát triển là vùng bìa
rừng, nơi cĩ những đồng suối nhỏ, nước trong chảy chậm, cĩ cơ hoặc rễ cây rú
xuống ven bờ Khơng những thế, chúng cịn được xác định là trung gian truyền
Trang 8bệnh ở một số ổ địch sốt rét vùng đồng bằng sơng Hồng và ven biển Bình Thạnh,
Tuy Phong, Bình Thuận, nơi chúng đã thích nghỉ với sinh cảnh địa phương [11] Do cĩ vai trị dịch tế quan trọng và đặc điểm sinh thái học đa đạng nên An minnus đã được nghiên cứu sâu về phân loại, phân bố, vai trị truyền bệnh, Từ
những năm 7Ĩ của thế kỷ XX, Viện Sốt rét- KST- CT TƯ đã nuơi thăm dị lồi
này nhằm cung cấp chủng cho các nghiên cứu về sinh học, phục vụ cho việc phịng chống sốt rét nhưng chưa thành cơng Đến năm 1995, việc nuơi giữ chủng
An minimus lai duge tiép tục Tháng 11 năm 1997 từ một số muỗi cái no máu thu thập tại xã Hịa Sơn, huyện Lương Son, tỉnh Hịa Bình đã tạo được đồng trong phịng thí nghiệm [1] Tuy vậy, đến năm 2000, mặc dù đã duy trì được
nhưng chủng chưa thích ứng với điều kiện phịng nuơi nên số lượng cá thể nuơi
chưa nhiều
4 VẬT LIỆU, ĐỊA ĐIỂM, THỜI GIAN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
4.1 Vật liệu
- Phịng nuơi được trang bị mấy điều hịa khơng khí, máy hút ẩm, tấm
sưởi điện, các ơn ẩm kế treo tường để theo dõi và duy trì nhiệt độ và ẩm độ
- Dụng cụ nuơi:
+ Ống hút muỗi + Ống hút bọ gậy
+ Vợt bọ gậy ®2cm
+ Đĩa thủy tỉnh (petri) đường kính 10cm để muỗi đẻ trứng + Đĩa đồng hồ đựng bơng thấm dung dịch glucose + Kẹp bằng lưới thép 4 x 7 em để kẹp chuột + Chuột nhất trắng + Glucose + Thức ăn bọ gậy: gồm 6g bột bánh mì + 2g bột đậu xanh + 2g bột tơm + 10 mẹ vitamin BI + Kính lúp 2 mắt + Kính hiển vi
+ Ether gây mê
+ Nước muối sinh lý 9%s
+ Khay nuơi bọ gậy: Khay men kích thước 20 x 25 x 3cm
+ Lơng nuơi muỗi: Khung thép, bọc vải tuyn, cĩ thể tháo gập được, kích
thước 20 x 20 x 20 cm và 30 x 30 x 30cm
- Nguồn muỗi nuơi
An minimus thu thập tại xã Hịa Sơn, huyện Lương Sơn tỉnh Hịa Bình được duy tì tại phịng nuơi của Viện Sốt rét- KST- CT.TU tir thing 11- 1997 Khi để tài này bắt đầu thực hiện, vào tháng 4 năm 2001, chủng đang ở F40 và được duy trì bằng kỹ thuật giao phối nhân tạo (GPNT)
4.2 Địa điểm nghiên cứu
Nghiên cứu được tiến hành tại Viện Sốt rét -KST- CT TƯ
Trang 9
4.3.Thoi gian tiến hành nghiên cứu:
Từ thắng 4 năm 2001 đến tháng 12-2005
4.4 Phương pháp nghiên cứu
4.4.1 Tao dong An minimus giao phối tự nhiên trong lồng hẹp
- Tháng 8/1998, sau khi đã duy trì được 10 thế hệ bằng kỹ thuật giao phối
nhân tạo (GPNT), bat đâu thăm dị khả năng giao phối tự nhiên (GPTN) của
mudi An minimus trong phịng nuơi cơn trùng của Viện Sốt rét - KST- CT TƯ
Thả 100 muỗi đực và 100 muỗi cái trong lồng 30x30x30cm Thu trứng, thả trứng
và theo dõi sự phát triển từ bọ gậy tới muỗi
- Tháng 7/2001 thăm dị lần thứ hai với thế hệ 51 của đồng GPNT, thả 180
muơi đực và 180 muỗi cái vào lỏng 30x30x30cm, quá trình theo đối tương tự như thí nghiệm lần đầu
- Áp dụng phương pháp kích thích giao phối của I.W, Knight và J.K
Nayar [14]: Tha 200 muỗi duc va 200 mudi cai An minimus cing 50 mudi duc
Ae.aegypty vào lơng 30 x 30 x 30cm Sau khi thả muỗi vào lỏng 10 ngày, mồ 20% số muỗi cái để xác định sự hiện diện của tỉnh trùng trong túi chứa tính
Tring do mudi GPTN đẻ được thả, theo dõi và tính tỷ lệ trứng nở, so sánh với kết
quả nuơi thơng thường (khơng thả thêm muỗi duc Ae aegypty vào lồng nuơi) để
đánh giá hiệu quả của phương pháp dùng muỗi đực khác lồi để kích thích Án
minimus giao ph6i
44.2 Theo dõi ảnh hưởng của ánh sáng đến sự phát triển của An,
minimus,
Các thí nghiệm dược tiến hành trong điều kiện: Nhiệt độ 25 + 1%C, ẩm độ 70- 85%, thời gian chiếu sáng 8/24 giờ Việc lựa chọn cường độ ánh sáng để thử nghiệm dựa trên số liệu ghỉ nhận khi điều tra bọ gậy và muỗi ở thực địa
- Ảnh huơng của ánh sáng đến tỷ lệ trứng nd
Trứng cùng lứa đẻ được đếm, chia thành lơ và thả tại các phịng nuơi cĩ cường độ ánh sáng 200-220 Lux, 130-150 Lux và 20-50 Lux Theo đối thời gian và số lượng bọ gậy nở từ con đầu tiên tới con cuối cùng Tĩnh tỷ lệ trứng nở và so sánh tỷ lệ nở ở các điều kiện ánh sáng khác nhau Số bọ gậy tudi I Tỷ lệ trứng nở (%) = a Téng số trứng
- Ảnh huơng của ánh sáng đến sự phát trién cia du trang An minimus
Bo gay và quăng được chia thành các lơ khác nhau nuơi trong điều kiện ánh sáng 200-220 Lux, 250-270 Lux, 300-320 Lux, cho ăn vào lúc 8 giờ và 16 giờ Hàng ngày nhật đếm quăng đựng trong cốc 100 mỉ, đặt trong lồng nuơi và
theo dõi số lượng quăng lột xác thành muỗi Tỷ lệ bọ gậy phát triển tới muỗi là
Trang 10tỷ lệ nuơi thành cơng trong mỗi điều kiện ánh sáng So sánh các tỷ lệ này để xác định cường độ ánh sáng thích hợp Tỷ lệ bọ gậy sống sốt và phát triển tới các giai đoạn sau được tính: Số lượng quăng Tỷ lệ bọ gậy lột xác thành quăng (%)= —- x 100 @) Téng s6 bo gay Số lượng muỗi Tỷ lệ bọ gậy phát triển tới muỗi (%) = - =— X 100 @® Téng số bọ gậy
- Ảnh hưởng của ánh sáng đến thời gian sống của muỗi
Các cốc thuỷ tỉnh đựng 100 quăng đặt trong một lồng, để ở các vị trí cĩ
cường độ ánh sáng 200-220 Lux, 130-150 Lux va 20-50 Lux Hai ngày sau,
quảng lột xác thành muỗi, đếm và thả riêng muỗi đực, cái vào các lồng 30 x 30 x
30cm, trong đĩ cĩ đặt đĩa bỏng thấm dung địch glucose 10% Vào buổi sáng
hàng ngày, kiểm tra bơng thấm glucose, đếm và nhặt bỏ bỏ số muỗi chết từ con đầu tiên đến con cuối cùng, Sự sống sĩt của muỗi ở mỗi điều kiện ánh sáng được
tính bằng tỷ lệ chết tích lũy qua từng ngày và được thể hiện bằng các đường hồi
quy Ngồi ra, khả năng sống sĩt cịn được thể hiện qua LT;a (thời gian chết 50% quần thể) và tuổi thọ trung bình của mỗi quân thể
443 Theo dõi ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của An minimus
Thí nghiệm tiến hành trong điều kiện: ánh sáng 200-220 lux, thời gian chiếu sáng §/ 24 giờ, nhiệt độ 22 +1°C, 25 41°C va 28 41°C, dm dd 70- 85%
~ Ảnh hướng của nhiệt độ tới tỷ lệ nd cia trimg An minimus,
Trứng muỗi để cùng thời điểm được đếm dưới kính lúp, thả vào những bát nước, phía trong vịng giấy để trứng tiếp xúc hồn tồn với nước, khơng bị dính vào thành bát Quan sát ghi nhận thời gian trứng bắt đầu nở cho tới khi trứng hết
nở (6 ngày sau khi đẻ) Dùng ống hút bọ gậy để hút, đếm và chuyển bọ gậy mới
nở sang các khay nuơi, tính tỷ lệ trứng nở (theo cơng thức1) và xác định thời
gian của giai đoạn trứng ở những nhiệt độ khác nhau
- Ảnh hưởng của nhiệt độ tới sự phát triển của bọ gậy
Trang 11sát, đếm số lượng quảng lột xác thành muỗi để tính tỷ lệ sống sĩt và phát triển từ
giai đoạn bọ gậy tới giai đoạn quảng và trưởng thành
- Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự đốt máu của muối
Muỗi cùng lứa, sau khi lột xác 10-12 giờ được dùng để thử nghiệm Thả 20 muỗi đực và 20 muối cái vào lỏng 30 x 30 x 30cm, đặt ở các phịng nuơi 2241°C, 25+1°C và 28+1°C, ẩm độ 70-85%, cho đĩa bơng thấm dung dich
glucose 10% vào trong lồng cho muỗi hút Cố định chuột nhất trắng trong kẹp
bằng lưới thép để muỗi đốt được đễ dàng và chuột khơng xoay chuyển khi muỗi
đốt Buổi tối, đặt kẹp chuột vào lỏng cho muỗi đốt qua đêm Sáng hơm sau, kiểm
tra từng lơng nuơi, xác định số muỗi đã đốt máu, hút ra khỏi lồng và đếm số
lượng Theo dõi tới khi muỗi trong lồng đốt máu hết hoặc đã chết hết Tý lệ muỗi
đốt máu được cộng tích luỹ qua từng ngày
- Ảnh hướng của nhiệt độ đến thời gian sống của muối
Thả 20 muỗi đực và 20 muỗi cái cùng lứa vào một lồng 30x30x30cm, đặt ở các phịng nươi 22 #1%C, 25 +I°C và 28 +1°C, ấm độ 70-85%, cho đĩa bơng thấm dung dịch glucose 10% vào trong léng cho muỗi hút Vào buổi sáng hàng ngày, đếm bỏ số muỗi chết ở các lơng nuơi từ con đầu tiên đến con cuối cùng (đực, cái tính riêng) Sự sống sĩt của muơi ở các nhiệt độ khác nhau được tính bằng tỷ 1$ chết tích luỹ qua từng ngày và được thể hiện qua các đường hồi quy
Theo dõi ảnh hướng của mật độ muối, kích thước lơng nuơi đến su phát triển cha An minimus,
- Anh hướng của mật độ nuơi đến khả năng sinh sẵn của muỗi:
Khả năng sinh sản được thể hiện ở tỷ lệ muỗi cái thụ tỉnh và số trứng trung
bình một muỗi cái đẻ
+ Tỷ lệ muỗi thụ tỉnh
Nhốt chung muỗi đực và cái trong lồng 30 x 30 x 30cm theo các mật độ
khác nhau Sau 7- 8 ngày, mổ khoảng 20% muỗi cái dưới kính lúp (10x), soi
dưới kính hiển vi (40x) để xác định sự cĩ mặt của tỉnh trùng trong túi chứa tỉnh con cái Muỗi cái cĩ tỉnh trùng là muỗi đã thụ tỉnh, được tính theo cơng thức sau: Số mị 'Tỷ lệ muỗi cái thụ tỉnh (%) = -~-¬- Ì C cĩ tỉnh trùng — xI00 — @) Số muỗi cái mổ + Số trứng trừng bình của một muỗi cái để,
Trang 12Sau khi cho đốt chuột 2 ngày, dat dia petri vio long nudi dé mudi dé
trứng Đĩa lấy trứng cĩ mức nước 2/3 chiều cao đĩa, xung quanh thành phía trong
đĩa đặt giấy thấm để trứng muỗi khơng dính vào thành và để cĩ thể thu được hết trứng Các buổi sáng kiểm tra đĩa lấy trứng, đếm số lượng trứng đẻ hàng ngày
cho tới khi muỗi cái trong lỏng chết hết Số trứng trung bình một muỗi để được tính như sau: Tổng số trứng để hàng ngày Số trứng trung bình = G) “Tổng số muỗi cái
So sanh sé ming đẻ trung bình ở các điều kiện mật độ nuơi khác nhau -_ Ảnh hướng của kích thước lơng nuơi tới khả năng sinh sản
Sau khi xác định mật độ thích hợp nhất, thí nghiệm được tiến hành trong
các lơng nuơi kích thước 30 x 30 x 30cm va 20 x 20 x 20cm Số trứng do muỗi
nuời trong các lồng khác nhau được đếm riêng hàng ngày cho tới khi muỗi cái
chết hết Hiệu quả của kích thước lồng nuơi được đánh giá bằng việc so sánh số
trứng trung bình một muỗi cái trong mỗi loại lồng đẻ Số trứng trung bình được
tính theo cơng thức (5) So sánh số trứng trung bình một muỗi cái đẻ để xác định
kích thước lồng nuơi thích hop
4.4.5 Theo dõi ảnh hưởng của máu vật chủ tới khả năng sinh sản, tỷ lệ trứng nở và phát triển của bọ gậy An.minimus
Tha 20 mudi đã giao phối vào lồng 30 x 30 x 30cm, đặt trong phịng nuơi
25 +I°C, ẩm độ 70-85% Hai ngày sau cho muỗi đốt máu Ba ngày sau khi muỗi
đốt máu lần đầu, đĩa petri đường kính 10cm, phía trong thành đĩa đặt băng giấy thấm bằng chiều cao thành dia, cho nước vào 2/3 chiểu cao đĩa được đặt vào trong lồng nuơi để muỗi đề trứng Muỗi sẽ đẻ trứng trên bề mặt nước hoặc thành giấy Ẩm quanh thành đĩa Buổi sáng lấy đĩa petri ra, dùng kính lúp đếm số lượng
trứng muơi đẻ Buổi tối lại đặt kẹp chuột hoặc cho muỗi đốt người và đặt đĩa lấy trứng vào lồng Qúa trình được tiến hành tới khi muỗi trong lồng chết hết, Số lượng trứng do những lơng muỗi đốt người và đốt chuột được cộng riêng của tất
cả các lần đẻ
+ Khả năng sinh sản của muỗi đốt máu mỗi loại vật chữ được thể hiện ở số trứng trung bình một muỗi cái đẻ, được tính theo cơng thức (5),
+ Ảnh hưởng của máu vật chủ đến tỷ lệ trứng nở và sự phát triển của bọ gay
Tring do mudi dét méi loai vat chi đẻ được đếm riêng dưới kính lúp và thả vào phía trong vịng giấy trong khay nuơi Hàng ngày đếm số lượng bọ gậy nở cho tới khi trứng hết nở Tinh tỷ lệ trứng nở riêng cho từng loại máu vật chủ,
theo cơng thức (1)
Trang 134.4.6 Xây dựng kỹ thuật nuơi: dựa trên kết quả nghiên cứu về sinh học, sinh
thái học của chủng trong các thử nghiệm nêu trên Xứ lý số liệu: bằng chương trình EPI INFO 6
5 KẾT QUA
%1 Kết quả tạo déng An.minimus giao phối tự nhiên
Bảng 1 Kết quả thử nghiệm giao phối tự nhiên Thử Thế | Số lượng | Bọ gậy thành quăng Bọ gậy tới muỗi nghiệm |hệ | bọ gậy - theo dõi | Số lượng | Tỷlệ% | Sốlượng [TIệ% | Tỷ lệ đực Lint [FL | 432 325 75,2 267 | 61,8] 31,0 (8/1998) | pp 65 53 815 52 | 800) 420 FI} 726 324 446 254 | 35,0) 450 LânH Íp; | 1405 529 376 419 | 298] 49,2 (7/2001) F3 | 1577 790 50,1 62 | 394) 473
- Thang 8/1998 thả 100 muỗi đực và 100 muỗi cái F10 của dịng GPNT vào
lồng 30 x 30 x 30cm cho muỗi GPTN Kết quả đã đẻ 820 trứng và nở 432 bọ gậy (52,7%) Bằng 1 cho thấy: Ở F1 của địng GPTN cĩ 61,8% số bọ gậy phát triển tới giai đoạn trưởng thành nhưng đo tỷ lệ đực quá ít (31%) nên đến F2 của dịng
GPTN chỉ cĩ 65 bọ gậy và 52 muỗi Mặc dù tỷ lệ sống sĩt và phát triển của bọ gay F2 cao (81,5% tới quãng và 80% tới muỗi) nhưng do số lượng cá thể quá ít
nên muỗi khơng giao phối và phát triển tối thế hệ sau
- Tháng 7/2001 tiếp tục thăm đị khả năng GPTN với muỗi F51 của đồng GPNT Lân này thả 180 muỗi đực và 180 muỗi cái vào lồng 30 x 30 x 30cm, số trứng đẻ là 2278, tỷ lệ trứng nở là 50%, Dùng 726 bọ gậy thế hệ này (F1 của dịng GPTN) để thử nghiệm Kết quả là 35% số bọ gậy phát triển tới giai đoạn trưởng thành, tỷ lệ đực tà 45% Do số lượng cá thể nhiều, tỷ lệ đực/cái tương đối cân bằng và đã cĩ thời gian dài thích ứng với điều kiện phịng nuơi nên địng đã duy trì được, số lượng cá thể của quần thể F2 đã tăng lên 419 muỗi, F3 là 622 và đã thay thế quần thể GPNT
~ Áp dụng phương pháp dùng muỗi đực khác lồi để kích thích sự GPTN Kết quả thử nghiệm ở bảng 2 cho thấy: sự cĩ mật của muỗi đực Aø.aegypri đã tác động đến sự giao phot cha An.minimus O16 kich thích giao phối, tỷ lệ muỗi thụ tỉnh và tỷ lệ trứng nở cao hơn so với lơ khơng thả thêm muỗi đực Ae.aegypti (P<0,05) Chỉ 5 ngày sau khi nhốt chung, muỗi ở lơ thí nghiệm đã bát
Trang 14đầu đẻ trứng, trong khi đĩ, ở lơ đối chứng là 10 ngày Kỹ thuật này đã gĩp phần đẩy nhanh quá trình tạo đồng An.minimus GPTN trong lồng hẹp,
Bảng 2 Kết quả biện pháp kích thích giao phối tự nhiên
Số muỗi | Số muỗi | Tý lệ | Ngày đẻ | Số trứng | Số trứng | Tỷ lệ nở mổ |thụtinh | (%) | lan dau | theo đối nở (%) Thí 98 43 | 43,90 | Sngay | 2165 | 1555 | 71,80 nghiệm Đối 98 33 | 33/70 | 10ngay} 2399 | 1594 | 6640 chứng
Việc chủng cĩ khả năng GPTN đã giúp việc duy trì địng trong phịng thí nghiệm thuận lợi Dịng GPTN đã phát triển tốt bơn dịng GPNT những năm trước đây (hình 1) Tỷ lệ (%) 100
'Bọ gây tới muỗi (GPNT)
ine Bo p4y tới muối (GPTN) ~—C— Bọ gậy thành quãng (GPNT) = =~ Bọ gáy thành quãng (GPTN)
Hình I Tỷ lệ phát triển của bọ gậy Ansminimuy dng GPNT và dịng GPTN Tình | cho thay: chủng phát tiển tốt trong khoảng thời gian từ tháng 3 đến tháng 9 Đây cũng là thời điểm cĩ thể cấp được chủng cho các thử nghiệm
3.2 Theo dõi ảnh kuổng của ánh sáng đến sự phái triển của
An-minimas
~ Ảnh hưởng của ánh sáng đến tỷ lệ trứng nở (bảng 3)
Trang 15Bảng 3: Ảnh hưởng của anh sing dén ty lé nd cita ting An minimus
Cường dđọ| SST Số bọ gậy nở theo thồi gian ( con)
‘sig ae sau rneay | Sara ngay’ | san aaeey | "Eokểg: |"Tỷ Rg®:)
200-220 647 498 44 0 342 : 83,8 5
130-150 600 388 63 0 45) T2
20-50 | 683 0 379 54 a3 | 634
Bang 3 cho thấy: thời gian giai đoạn trứng ở trong mơi trường nước tỷ lệ nghịch với cường độ ánh sáng: trứng nở sớm hơn ở cường độ ánh sáng cao và ngược lại Dưới ánh sáng 200-220 Lux và 130-150 Lux, khoảng 90% số trứng nở
sau khi đẻ 2 ngày, trong khi dưới ánh sáng 20-50 lux, sau 3 ngày trứng mới bắt
đâu nở Tỷ lệ trứng nở tỷ lệ thuận với cường độ ánh sáng: dưới ánh sáng 200-220 Lux, tỷ lệ trứng nở cao nhất (83,8%) Cường độ ánh sáng giảm, tỷ lệ trứng nở giảm, thấp nhất là 63,4% ở 20-50 Lux
- Ảnh hưởng của ánh sáng đến sự phát triển của ấu trùng An.minimus
Bảng 4 Sự phát triển của ấu wimg An minimus trong các điều kiện ánh sáng khác nhau
Cường độ| Số bọ Bọ gậy thành quăng Quảng thành muỗi ánh sáng | SẾU 0 Số lượng |Tỷ lệ P |S6lượng|Tỷ lệ| P
(Lux) (con) (con) (%) (con) (%)
200-220| 300 188 627 178 94/7
250-270} 300 14 | 46,7 |S | lọ | 76,4 |< 908 |
300-320 | 300 155 | 547 128 | 826
Bảng 4 cho thấy cường độ ánh sáng cĩ ảnh hưởng rõ rệt đến sự sống sĩt và phát triển của ấu trùng Án minimus Trong điều kiện ánh sáng 200-220 Lux, tỷ lệ bọ gậy nở thành quảng cao nhất (62,7%) Mặc dù giai đoạn quảng chỉ kéo đài
2-3 ngày song ánh sáng cũng ảnh hưởng đến tỷ lệ lột xác của quảng Ở ánh sáng
200-220 Lux, cĩ 94,7% số quăng phái triển tới giai đoạn trưởng thành, trong khi
ở điêu kiện ánh sáng 250-270 lux là 76,45 và ở 300-320 lux là 82,6% Kết quả
Trang 16này cho thấy điều kiện ánh sáng 200-220 Lux thich hợp nhất cho au trùng An.minitmus phát triển (P<0,05)
~ Ảnh hưởng của cường độ ánh sáng đến thời gian séng ctia An mininus
+ Cường độ ánh sáng 200-220 Lux (Hình 2A) Tỷ lệ chết tích luỹ (%) 100 90 80 70 60 50, 40 30 20 10 0 1 3 5 7 9 11 13 15 17 18 21 23 25 27 29 31 Thời gian sau khi nở (ngày)
Hình 2A: Tỷ lệ muỗi chết trong điều kiện ánh sáng 200-220 Lux
Trong điều kiện ánh sáng 200-220 Lux, muỗi đực luơn cĩ tỷ lệ chết cao
hơn muỗi cái Ngay từ ngày đầu tiên sau khi nở đã cĩ một số muơi chết (14,3% muỗi đực và 6,7% muỗi cái ) Tỷ lệ chết tăng khơng đáng kể từ ngày đầu tiên đến ngày thứ 9 Từ ngày thứ 10, số muỗi chết bất đầu tăng nhanh, đến ngày thứ
16 -17, tỷ lệ chết ở muỗi đực lên tới 50% (LTạg = 16-17 ngày), trong khi muỗi cái LTạ là 19 - 20 ngày Đến ngày thứ 25, tồn bộ muỗi đực chết và muỗi cái chết hồn tồn ở ngày thứ 28 Điều đĩ cĩ nghĩa là thời gian sống của muỗi đực dài nhất là 25 ngày và muỗi cái là 28 ngày
Thời gian sống trung bình của muỗi đực là 14,6 ngày, muỗi cái là 17,5 ngày + Đối với ánh sáng 130-150 Lux (Hình 2B)
Trang 17Tỷ lệ chết tích lug (%) 100 90 80 79 60 30 40 30 20 1d 0 + a 5 7 8 11 13 45 17 19 21 23 25 27 29 31
Thời gian sau khi nở (ngày)
Sem usigoe oui
Hình 2B: Tỷ lệ muỗi chết trong điều kiện ánh sáng 130-150 Lux
Hình 2B cho thấy từ ngày đầu tới ngày thứ 6, tý lệ chết thấp (< 10 %) và khơng cĩ sự khác biệt giữa muỗi đực và muỗi cái Từ ngày thứ 7, tý lệ muỗi đực
chết tăng dân và tới ngày thứ 17, mudi đực chết 50% Đối với muỗi cái, từ ngày
thứ 13, tỷ lệ chết mới tang va LT,, vào ngày thứ 18 Tuy cĩ một số cá thể đực
sống sĩi lâu hơn (ngày thứ 28) nhưng thời gian sống trung bình của muỗi đực
vẫn thấp hơn muỗi cái (17,2 ngày so với 18 ngày)
Trang 18Hình 2C cho thấy: Ở cường độ ánh sáng này, nhìn chung tỷ lệ chết của muỗi đực cao hơn ở muỗi cái Ngay từ ngày đầu sau khi nở, đã cĩ hơn 5% muỗi đực chết, tới ngày thứ 12 đã chết 50% Năm ngày sau khi nở, muỗi cái mới bắt
đầu chết và đến ngày thứ 17 chết 50%
Mac dù cĩ một số cá thể sống tới 3i ngày nhưng thời gian sống trung
bình của muỗi đực vẫn thấp hơn muỗi cái (14,1 ngày sơ với 17,L ngày) Điều
đáng lưu ý là ở điều kiện ánh sáng này, tuổi thọ trung bình cũng như L,T¿; của
muỗi cái khác biệt rõ rệt so với muỗi đực: LT¿; của muỗi đực là 12 ngày, của ruuỗi cái là 17 ngày(các chỉ số P< 0,05 )
5.3 Theo dõi Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của An.minimus
- Ảnh hưởng của nhiệt độ đến thời gian nở và tỷ lệ nở của trứng An tninimus
Bảng 5: Ảnh hưởng cửa nhiệt độ đến tý lệ nở
cia tring An minimus (5/2005)
Nhật | Slượng Số bọ gây nỡ theo thời gian (con)
thnghiệm | trmg [W7 ] Saud | Su4 | Tong |TV % Co ngs ngày | ngài bĩng 241 800 0 545 49 394 | 142 29 %1 800 575 8 0 583 72,9 28 41 800 560 5 0 565 | 706
Bảng 5 cho thấy: Nhiệt độ tỷ lệ nghịch với thời gian phát triển và tỷ lệ nở
của trứng trong mơi trường nước, Ở nhiệt độ cao (25 +1°C và 28 +1°C), trứng nở
từ 2-3 ngày sau khi đề trong khi ở nhiệt độ thấp hơn (22 + 1°C) trứng nở 3-
ngày sau khi đẻ Đặc điểm chung là cĩ tới trên 90% số trứng nở tập trung trong ngày nở đầu tiên Tỷ lệ trứng nở cao nhất ở 22 + 1°C (74,2%), nhiệt độ tăng, tỷ lệ trứng n& gidm dan: 25 41°C la 72,9% và 28 +I?C là 70,6% Do thời gian giai
đoạn trứng ngắn nên nhiệt độ khơng ảnh hưởng rõ rệt đến tỷ lệ trứng nở
- Ảnh hướng của nhiệt độ tới sự sống sĩt và phát triển của bọ gậy
An.minimus
Nhiệt độ cĩ liên quan nghịch với thời gian phát triển của bọ gậy Nhi
cao, thời gian phát triển bọ gậy ngắn hơn ở nhiệt độ thấp Ở 28 + 1°C, thời gian
phát triển bọ gậy từ 12 - 23 ngày, ở 25 + I°C là 13 - 27 ngày và ở 22 + 1°C là 17 đến 30 ngày Tuy vậy, tỷ lệ lột xác từ bọ gậy tới các giai đoạn sau lại khơng theo tương quan đĩ Thời gian giai đoạn bọ gậy kếo đài đã ảnh hưởng đến tỷ lệ sống sĩt và phát triển tới các giai đoạn sau do các yếu tố bất lợi như ơ nhiễm nước nuơi, thiên địch xuất hiện, dẫn đến tỷ lệ biến thái thấp Cụ thể là ở nhiệt
độ thấp (22 + 12C), chỉ cĩ 9% bọ gậy lột xác thành quăng và 8,3 % phát triển tới
Trang 19muỗi trưởng thành và các tỷ lệ nay tang & 25 + LC nhumg lai gidm & 28 + 1°C 'Từ đĩ thấy 25 + 1% là thích hợp nhất cho bọ gay An.minimus phat triển (
P<0,001) (Bảng 6)
Bảng 6: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến thời gian phát triển và tỷ lệ lội xác của bọ gay An minimus (6/2005)
Thời gì Bo gay nở thành | Bo gậy nởtới
sie | ss [Totem | Prey in | Hoa ae CO) Ì gây Ì Ngắn nhất| Dài nhất | Số lượng | T.Iệ | Sốlượng| T.Iệ độ | to 4 ọ giai đoạn bọ gậy Sung (®) (%) 2241 | 745 | 17ngay | 30ngay | 67 90 62 83 25+1|710 |13ngy |27ngày | 283 | 398 | 269 | 380 28+1 | 600 | l2ngy |23ngy | 203 | 339 | 180 | 300
- Ảnh huơng của nhiệt độ đến sự đốt máu của An.minimus
San khi nở một ngày, muỗi cái đã cĩ nhu cầu đốt máu Tý lệ đốt máu tăng, dân theo tuổi của muỗi, nhất là từ ngày thứ 3 đến ngày thứ 6 Sau đĩ, tỷ lệ muỗi
đốt tăng chậm, thậm chí khơng đốt thêm nữa như ở 25 + 1°C Qua hình 3 thấy
Trang 20Ở 22 + 1C, tỷ lệ muỗi đốt máu luơn cao hơn so với các nhiệt độ khác và tỷ lệ muỗi đốt máu thấp nhất ở 28°C
- Ảnh hưởng của nhiệt độ đến thời gian sống của muỗi An.minimus - Ư 28 + IĐC, hai ngày sau khi nở, cĩ 3,1 muỗi đực chết Tỷ lệ chết tăng dân, đến ngày thứ 12, chết 50% và đến ngày thứ 21 chết 100% Đối với muỗi cái, 3 ngày sau khi nở mới bắt đầu chết Tỷ lệ chết tăng chậm hơn so với muỗi đực, đến ngày thứ 14 chết 50% Từ thời điểm này, tỷ lệ chết tăng nhanh và đến ngày thứ 20 chết 100% số muỗi cái thử nghiệm (Hình 4A)
Thời gian sống trung bình của muỗi đực trong điều kiện nhiệt độ này là 13,1 ngày, của muỗi cái là 13,7 ngày "Tỷ lệ chết tích lũy (%) 100 90 80 70 6 50 40 30 20 18 of Ngày sau| Khi nử
Hình 4A Tỷ lệ chết tích luỹ cha mudi An.minimus ở 28 + ISC
- Ư 25 + 1°C, đến ngày thứ 6 sau khi nở, muỗi đực và muỗi cái mới bất
đâu chết, tỷ lệ chết của muỗi đực là 7,1%, muỗi cái là 3,8% Cả muỗi đực và muỗi cái đều chết 50% vào ngày thứ 14 (Hình 4B )
Thời gian sống trung bình của muỗi đực trong điển kiện nhiệt độ này là
13,9 ngày, của muối cái là 14,8 ngày
- 622 + 1°C, sau khi nd mot ngày đã cĩ 9,5% số muỗi đực chết, Đến ngày
thứ 5 muỗi cái mới bắt đâu chết, với 11,1% Tỷ lệ chết của muỗi đực và muỗi cái
tầng đột biến vào ngày thứ 5 và ngày thứ 6 Đến ngày thứ 6, 50% số muỗi đực
chết và muỗi cái chết 50% vào ngày thứ 10 Sau thời điểm này, tỷ lệ muỗi chết
tăng rất chậm và đến ngày thứ 43, muỗi đực và muỗi cái chết hồn tồn ( Hình 4C) Mặc dù cĩ những cá thể sống đài như vậy nhưng thời gian sống trung bình
Trang 21
của muỗi trong điều kiện nhiệt độ này vẫn khơng cao, cụ thể: thời gian sống trung bình của muỗi đực là 13,4 ngày, của muỗi cái là 18,1 ngày Tỷ lệ chết tích lũy (%) i00 cy 80 7a 60 50 40 30 ?” 16 9 193 5 7 9 1 B 15 7 19 21 —D— Tý lệ muỗi đực chết _ & Tỷ lệ muỗi cái chết An Hình 4B Tỷ lệ chết tích luỹ của mudi Ansninimus 525 + 1°C Tỷ lệ chết tích lữy (%) 100 90 80 1 4 8 12 16 20 24 28 32 3 40 43 Ngày sau| TỶ lệ muỗi đực chết & Tỷ lệ muỗi cái chết Ahi gd
Hình 4C Tỷ lệ chết tích luỹ của muỗi An.minimus 6 22 + OC
Qua các thử nghiệm trên cho thấy: thời gian sống của muỗi đực luơn ngắn
hơn muỗi cái và cố thể thấy lồi này đễ thích ứng với sự thay đổi của nhiệt độ
mơi trường
Trang 225.4 Theo đi ảnh hướng của mật độ muỗi, kích thước lồng nuơi đến hoạt động giao phối của An.tminimus
- Ảnh hưởng của mật độ muơi đến khả năng sinh sản
Bảng 7 Kết quả tự giao phoi cla An minimus & các mật độ nuơi khác nhan - ee Ts Mật độnuơi | Sốtrứng | Số muỗi mổ | Sémudithu }Tyle%| P TB/ cái tỉnh 0,030 con/lem” | 108 100 45 45.0 0,025 con/lem? | 151 80 359 73,7 <0,05 0,020 con/lem° | 129,5 100 56 56,0
Số liệu ở bảng 7 cho thấy: một muỗi cái cĩ thể đẻ trung bình 108-151 trứng Tuy vậy, số lượng trứng phụ thuộc vào mật độ nuơi Khi nuơi muỗi với
mat độ 0,025 con/1LcmỶ thể tích lồng cho hiệu quả giao phối cao hơn các mật độ
khác (P< 0.05) Hiệu quả của hoạt động giao phối cịn thể hiện ở số lượng muỗi
cái thụ tỉnh Khi mổ kiểm tra sự hiện diện của tỉnh trùng trong túi chứa tình của
muỗi cái, thấy cĩ 73,7% số muỗi nuơi ở mật độ 0,025 con/1cm” đã thụ tính Điều
này khẳng định lần nữa đây là mật độ nuơi thích hợp nhất
- Ảnh hưởng kích thước lơng nuơi tới khả năng sinh sản của muỗi
Anminimus
Sau khí thấy mật độ nuơi 0,025 con/1cmẺ là thích hợp, tiếp tục tiến hành thí nghiệm với mật độ trên nhưng với các lồng nuơi cĩ kích thước khác nhau
Thí nghiệm cho thấy Anzmimimus cĩ thể giao phối tự nhiên cả ở lồng
20x20x20cm và lồng 30x30x30cm Theo kết qua & bang 8, mudi nuơi ở lồng
20cm đẻ số trứng trung bình là 45,3/ cái, trong khi muỗi ở lồng 30°cm là 145
Như vậy nuơi An.minimus trong lơng 30°cm tốt hơn (P<0,005)
Bảng 8 Kha nang sinh sin cita An minimus trong
Trang 235.5 Theo đối ảnh hướng của máu vật chủ tới khả năng sinh sản, tỷ lệ trứng nỗ và sự phat trién cia An.minimus
Máu vật chủ cần thiết cho sự phát triển của trứng muỗi Trong phịng thí
nghiệm, cho muỗi đốt người và chuột nhất trắng Hàng ngày theo đối số tượng
trứng đo muỗi đốt từng loại vật chủ đẻ, thấy rang: mudi đốt người cĩ số lượng trứng trung bình một muỗi cái dé cao hơn so với muỗi đốt chuột Một muỗi cái
đốt máu người đẻ trung bình 172 trứng, trong khi muỗi đốt máu chuột đẻ trung bình 151 trứng ( Bảng 9 )
Bảng 9: Ảnh hưởng của máu vật chủ tới khả năng sinh sản, tỷ lệ trứng nở
và sự phát triển của bọ gậy An minimus (5-6/2005)
Máu | Sốtrứng Tỷ lệ Số bọ gậy | Tỷ lệ bọ gậy | Tỷ lệ bọ
vật chủ trang Pink trứng nở (%) theo dối | tại quảng (%) ey a
Người 172 78,3 765 254 192
Chuột 151 69,5 928 26,8 117
Máu vật chủ cũng ảnh hưởng đến sự phát triển phơi, thể hiện ở muỗi đốt máu người cĩ tỷ lệ trứng nở cao hơn so với muỗi đốt máu chuột (78,3% so với 69,5%, P< 0,001, bảng 9, hình 5) Tuy nhiên tỷ lệ sống sĩt va phát triển của bọ
sậy lại khơng phụ thuộc vào nguồn dinh dưỡng của muỗi mẹ Tỷ lệ (%) 100 Trứng nở thành bọ gây
[Bo gậy lột xác thành quãng
Trang 24Như vậy, vào những thời điểm khơng thích hợp như nhiệt độ quá cao hay quá thấp, ngồi việc điểu chỉnh nhiệt độ, ẩm độ cân phải cho muỗi đốt người để duy trì số lượng cá thể của quần thể nuơi
Thời gian cho một vịng đời của Án.minimus như sau: Mỗi trưởng thành Đực: 13 - 14 ngày a Cái; 14— I8 ngày HN Quảng Trứng (2-4 ngày) (2- ngày) oN Bo gay (13- 27 ngày)
$.6 Xây dựng kỹ thuật nuơi,
Ty những thí nghiệm vẻ các đặc điểm sinh thái, sinh học của chủng trong
phịng nuơi, kỹ thuật nuơi được xây đựng như sau:
- Phịng nuơi
+ Phịng nuơi phải cách xa nơi để hố chất, diện tích mỗi phịng khoảng 9- 12m7 Phịng nuơi nên cĩ cửa sổ rộng để tận dụng ánh sáng tự nhiên, trang bị thêm quạt thơng giĩ và quạt trân để bê mặt khay nuơi được thống hơn
+ Phịng nuơi bọ gậy: nhiệt độ 25 +°C, ẩm độ 70-75%, cường độ ánh sáng, từ 200-220 Lux, thời gian chiếu sáng 8/24 giờ
+ Phịng nuơi muỗi: nhiệt độ 25 +1°C, ẩm độ 70-75%, cường độ ánh sáng từ 130-150 Lux, thời gian chiếu sáng 8/24 giờ
+ Dùng máy điều hồ khơng khí, tấm sưởi, quạt hơi lạnh, máy phun ẩm,
máy hút ẩm để duy trì nhiệt độ và ẩm độ - Dung cu nudi
+ Lồng nuơi: khung thép, vỏ bằng vải tuyn, cĩ thể gấp lại được, kích thước 20x20 x 20cm và 30 x30 x 30cm
+ Giá hoặc bàn để lồng nuơi, cĩ hệ thống chống kiến
+ Khay nuơi: bằng sắt trắng tráng men, kích thước 20 x 25 x 3cm
+ Bàn để khay nuơi bọ gây
+ Kẹp cố định chuột bằng lưới thép, kích thước 5 x 7cm
Trang 25+ Ong hit mudi + Ống hút bọ gậy + Cốc thuỷ tính 100ml, 200ml + Glucose + Chuột nhất trắng + Thức ăn bọ gậy: gồm 6g bột bánh mì + 2g bột đậu xanh + 2g bột tơm + 10 mg vitamin BI + Kính lúp tay + Kính lúp 2 mắt + Kính hiển vi + Bơng thấm nước + Giấy thấm
+ Đĩa petri để thu trứng: đường kính 10cm, bên thành phía trong đĩa đặt băng giấy thấm cao bằng thành đĩa để trứng muỗi khơng dính vào thành đĩa
+ Nước nuơi bọ gậy: nước máy để 2-3 ngày cho bay hơi clo và sục oxy trước khi dùng để nuơi bọ gậy - Kỹ thuật nuơi - Nuơi bọ gậy: + Mật độ bọ gậy: 0,4 con/ cm ? diện tích bể mặt khay nươi, hay 150 con/ khay 20 x 25 x 3cm + Cho bọ gậy ăn: ngày 2 lần vào lúc 9 giờ và 16 giờ, lượng thức ăn 0,018g/ khay/ ngày
+ Buổi sáng nhặt quăng, thả vào cốc thủy tính 100 mi, đặt vào lồng nuơi
cho quăng lột xác thành muỗi Kiểm tra khay nuơi, vớt váng và thức ăn thừa Giải đoạn bọ gậy kéo dài từ 13-27 ngày
~ Nuơi m
+ Mật độ muỗi 0,025 con/ lem’ thé tich lồng nuơi, hay 680 con trong một
lồng 30 x30x 30cm
+ Sau khi quăng lột xác thành muỗi, cho đĩa bơng thấm dung dich glucose
10% vào lồng cho muỗi hút
+ Ba ngày sau khi trưởng thành, đùng kẹp để cố định ch: vào trong lồng nuơi cho muỗi đốt qua đêm Hai ngày cho mị
lan trong điều kiện 22-25 °C Khi cần, cĩ thể cho muỗi đốt người
+ Ba ngày sau lân đốt chuột đầu tiên, dat đĩa lấy trứng vào lồng để muỗi
dé Mudi dé trứng ban đêm, trực tiếp trên bể mặt nước họäc thành giấy thấm
quanh thành phía trong đĩa petri
+ Buổi sáng thu trứng, đặt đĩa trứng vào bên trong khung giấy nổi trong
Trang 266 BAN LUAN
- Tạo dịng giao phối tự nhiên
Trong tự nhiên, muỗi Anopheles thường tiến hành các hoạt động giao phối vào khoảng I giờ sau khi mặt trời lặn Chúng hợp đàn phía trên các bụi cây, phía
trên lưng động vật với khoảng cách từ 1- 6m tuỳ theo lồi ( Wharton, 1953) Do
đĩ khí nuơi trong phịng thí nghiệm, trong các lơng nhỏ, khơng cĩ
thuận lợi về khơng gian để chúng thực hiện GPTN Để duy trì chủng,
thuật thường được áp dụng là:
+ Phổ biến nhất là tiến hành GPNT Năm 1975, Tổ chức y tế thế giới (WHO) da tổng kết và xây dựng quy trình GPNT [201 Trước dé, nam 1963, Ow
Yang và CS đã dùng kỹ thuật này để tạo đồng An.cufiejfaciex [15] Sau này, một số tác giả đã áp dụng trong quá trình đưa chủng từ tự nhiên vào duy trì trong
phịng thí nghiệm [1,3,7,8,13,16]
+ Nhơi sau thời gian dài bằng GPNT, qua nhiều thế hệ, chủng thích ứng
đân với điều kiện phịng nuơi, số lượng cá thể tăng, bắt đầu cho muỗi GPTN, Sau
hai năm nuơi, Soombun thấy An.minimus cĩ thể tự giao phối nhưng phải kết hợp GPTN với GPNT trong một số thế hệ tiếp theo [16] Trân Đức Hình cho biết:
An.sinensis cĩ khả năng GPTN từ thế hệ thứ 10 [8]
+ Dùng ánh sáng để kích thích giao phối: sau khi tắt các đèn trong phịng nuơi, đùng ánh sáng đèn đổ hay ánh sáng đèn Flat chiếu nhiễu gĩc độ vào lồng nuơi trong thời gian 30 phút Phương pháp này duy tủ thường xuyên 5-6 thế hệ đầu trong quá trình tao dong, nhu tao dong An.pseudopunctipennis [12]
+ Thả số lượng lớn trong một lồng nuơi: Cuaultemoe Villarreal thả 1000- 3000 muỗi An.pseudopunctipennis trong long 45 x 45 x 45cm [12] hay Toto Soelano đã thả 5000 muỗi Án barbirostris trong một lồng 45 x 45 x 90cm [18]
+ Áp dụng cả hai phương pháp đùng ánh sáng kích thích và thả số lượng cá thể lớn trong quá tình tgo dong An.pseudopunctipennis [12]
+ Dùng muỗi đực khác lồi như thả thêm mudi duc Ae.taeniorhynchus
vào lồng nuơi đổ kích thích sự giao ph6i cha mudi Culex nigripalpus trong 3 thế
he dau [14] Tuy vậy, kỹ thuật này chưa được áp đụng trong tạo đồng Anopheles Trong quá trình tạo đồng Ản.mimimus, bước đấu chúng tơi áp đụng kỹ thuật GPNT Khi duy trì được 4 thế hệ bằng GPNT, bắt đầu thăm đị khả năng GPTN nhưng chỉ duy trì được một thế hệ Đến thế hệ thứ 10 của dịng GPNT, duy trì được 2 thế hệ bằng GPTN Đến thế hệ 51, tức là sau 5 năm duy trì bằng GPNT, khi số lượng cá thể đã lớn, việc tạo dịng GPTN mới thành cơng Ngồi ra, việc thả muỗi đực Ae.degypii vào lồng An.minirsus cũng cĩ tác dụng kích
thích sự giao phối của lồi này
Như vậy, khi đưa chủng Az.minimws từ tự nhiên vào phịng thí nghiệm, thời gian đầu phải tiến hành GPNT Việc dong GPTN chỉ thành cơng khi
une đã cĩ thời gian đài để thích ứng với điều kiện phịng nuơi và số lượng cá
thể lớn
Trang 27
- Các đặc điểm sinh học, sinh thái học của An.minimus trong phịng thí nghiệm
Sự thay đổi về điều kiện sinh thúi mơi trường là một trong những khĩ khăn
trong việc tạo đồng Anopheles Cac yếu tố sinh thái mơi trường ở đây bao gồm:
nhiệt độ, ánh sáng, thức ăn của bọ gậy, kích thước lồng nuơi
+ Vẻ ánh sáng: ánh sáng đã ảnh hưởng đến mọi giai đoạn phát triển của muỗi
Ngồi tự nhiên, bọ gậy An.minimus thường thấy nhiều ở những nơi nước trong chay chậm, cĩ cỏ rủ xuống ven bờ và thường cĩ ánh sáng Trong phịng
nuơi, đưới ánh sáng khoảng 200-220 lux, tỷ lệ trứng nở cao, thời gian hồn thiện
trứng ngắn, tỷ lệ bọ gậy sống sĩt và phát triển tới các giai đoạn sau cao Đối với
muỗi, cường độ ánh sáng thích hợp thấp hơn Các lơng nuơi đặt ở vị trí ánh sáng
thấp hay được phủ vải màn để hạn chế ánh sáng, thời gian sống trung bình của
mudi cao hơn so với nơi cĩ cường độ ánh sáng cao
Đối với cơn trùng, nhiệt độ là một trong những yếu tố quan trọng ảnh
hưởng tới sự phát triển và phân bố của lồi An.minimus 1 lồi phân bố rộng tồn quốc, từ những vùng rừng núi phía Bắc cĩ mùa đơng khắc nghiệt, nhiệt độ thấp tới những vùng rừng núi phía Nam và thậm chí cả ở vùng ven biển miền Trung cĩ nhiệt độ cao Trong phịng thí nghiệm, chủng cĩ thể tổn tại và phát triển ở nhiệt độ 20-30°C, giới hạn nhiệt độ thích hợp là 22-25% Tỷ lệ muỗi đốt máu cao ở 22-250C Đáng lưu ý là nhiệt độ ảnh hưởng rõ đến khả năng sống sĩt của
muỗi Ư 25°C, 5 ngày sau khi nở, muỗi mới bắt đầu chết Đây cũng là thời gian
cần thiết để muỗi trưởng thành sinh dục và giao phối hiệu quả nhất, cũng là thời
gian sử dựng muỗi cho các thử nghiệm hố chất Trong điều kiện khí hậu miễn
Bắc, việc duy trì nhiệt độ phịng nuơi từ 22-25%C cĩ thể thực hiện được suốt các tháng trong năm Để đuy trì được nhiệt độ này, cần kết hợp sử dụng máy điều hồ khơng khí với phủ khăn ướt lên lồng nuơi, dùng quạt hơi nước, máy phun 4m để tăng ẩm độ khi cân thiết
+ Ngồi việc duy trì nhiệt độ thích hợp, chế độ dinh dưỡng, mật độ nuơi
cũng cần được quan tâm Thành phản thức än ảnh hưởng đến sự phát triển của họ
gậy và tỷ lệ đực cái của muỗi Phạm Xuân Đỉnh đã dùng thức ăn của chuột cơ- bay để nuơi An.dirus ở Thái Lan [7] Carmine A Lanciani dùng hỗn hợp thức ăn cho cá con và men theo tỷ lệ 2:1 để nuơi An.quadrimaculatus Ching ti đã thử nghiệm nuơi Áz.minzrzs bằng một số loại thức ãn và nhận thấy thành phần thức
ăn bọ gậy sử dụng trong nghiên cứu này là hợp lý: nước ít bị váng, tỷ lệ muỗi
đực/ cái tương đối cân bằng Nuơi bọ gậy An.minimus với mật độ Ư,4 conf lem? điện tích bể mật mước nuơi là tốt nhất, mật độ này cũng thích hợp với
An.sundaicus [3,4], An.dirus TQ [6] Tuy nhiên, mật độ nuơi bọ gậy thay đổi mỳ
lồi, như An.quadrimaculatus 14 0,05 (Camie A 1993) hay An.maculatus 1a 0,8 (Michael J Bangs, 2002) hay An pseudopunctipennis 12 0,4- 0,6 [12]
+ Kích thước lồng nuơi muỗi trưởng thành
Trang 28
Muỗi Anopheles thường cần cĩ khoảng khơng gian tương dối lớn để giao
hoan Trong khi cặp đơi, nếu lồng hẹp, muỗi đễ bị va đập vào thành lỏng làm muỗi đực tách rời khỏi muối cái dẫn đến hiệu quả giao phối thấp Vì vậy, kích
thước lồng nuơi được đề cập nhiéu Michael J Bangs nuơi Ansmaculatus trong lồng 45 x 45 x 45cm, Toto Soelarto nuơi As.barbirosiris trong lồng 45x45x90cm
[I8] Đa số cho rằng lồng muơi phải cĩ kích thước ít nhất là 30x30x30cm Tuy
nhiên khi nuơi Án.simensis, Trần Đức Hình đã thấy chúng tự giao phối trong lồng
12x12x12cm [8] hay An.sundaieus cĩ khả năng GPTN trong lồng 20x20x20 em
[B] Đối với Án miaimu+, vào thời điểm này, chúng cũng cĩ khả năng GPTN
trong lồng 20x20x20cm nhưng với lồng 30x30x30cm, hiệu quả giao phối cao
hơn Một yếu tố khác ảnh hưởng đến hiệu quả GPTN là số lượng cá thể và mật
độ muỗi trong lơng nuơi Các kết quả tạo đồng cho thấy cần phải cĩ số lượng
muỗi lớn trong lồng nuơi, như nuơi An.macularss với 5000 muỗi trong một lồng
45x45x45 cm - mật độ 0,05 con/ 1 cm” ( Michael J Bangs 2002) hay 5000 muỗi
An.barbirostris wong lơng 45x45x90 cm- mật độ 0,027 cor/1 cm°[18| Đối với
An.minirus, mật độ muỗi thích hợp là 0,025 con/1 cmẺ thể tích lồng nuơi
+ Trong quá trình nuơi giữ, chủng đã thích ứng với điều kiện phịng nuơi và cĩ khả năng GPTN trong lỏng hẹp, phát triển ổn định hơn so với thời gian duy trì bằng GPNT Đến tháng 8 năm 2005 đã duy trì được 102 thế hệ, bước đầu cấp được chủng cho một số thử nghiệm trong Viện và một số cơ sở nghiên cứu khác Lần đâu tiên tạo và duy trì được dịng Arznirimus giao phối tự nhiên trong lồng hẹp ở Việt Nam,
Những kết quả thử nghiệm trên gĩp phân tìm hiểu vẻ đặc diểm sinh học,
sinh thái học của Anzminiarus và làm cơ sở để tiến hành nuơi các lồi Anopheles
khác
7 KẾT LUẬN,
7.1 Đã tạo được đồng Anminimus GPTN phát triển ổn định
1.2 Cường độ ánh sáng thích hợp đối với giai đoạn trước trưởng thành là
200-220 Lux, giai đoạn trưởng thành là 130-150 Lux
7,3 Nhiệt độ thích hợp với các giai đoạn phát triển của An.minimus 1a 22- 25°C
7.4, Kỹ thuật nuơi: Mật độ bọ gậy thích hợp là 0,4 con/1 cm? dién tích bể
mặt nước nuơi, mật độ muỗi là 0,025 con/l cm” thể tích lồng nuơi, kích thước
lổng nuơi 30 x 30 x 30 em Thức ăn cho bọ gậy gồm: 6g bột bánh mỳ + 2g bột
đậu xanh + 2g bột tơm + 10 mẹ vitamin BI, lượng thức ăn là 0,018g/ ngày/ 2 lần
cho một khay nuơi kích thước 20 x 25 x 3cm Cho muỗi đốt chuột nhất trắng 2
ngày/ 1 lần
* Kiến nghị:
- Tiếp tục nghiên cứu các đặc điểm vẻ sinh lý như: tuổi sinh lý, chu kỳ tiêu
sinh, khả năng sình sản của chủng trong phịng thí nghiệm
Trang 298 TAI LIEU THAM KHAO
1 Vũ Đình Chit, Nguyễn Thị Hịa, Lương Xuân Dũng và CTV, 2002 Nuơi giữ chủng Anopleles minimus Theobakd, 1901 trong phịng thí nghiệm bằng phương pháp
giao phối nhân tạo Báo cáo hội nghị khoa học cơn tràng tồn quốc lần thứ 4 NXB
Nơng nghiệp: 122-126
2 Va Dinh Chir, 2003 Tạo dong Anopheles minimus Theobald, 1901 tự giao phối trong phịng thí nghiệm Tạp chí Phịng chống bệnh sốt rét và các bệnh ký sinh trùng Vien Sot rét- KST-CT-TU, số 6:48-52
3 Vũ Đình Chủ và CTV, 2004 Bước đầu audi gitt ching Anopheles sundaicus Rodenwatd 1925 ~ vectơ sốt rết ở Việt Nam Những vấn đê nghiên cứu cơ bản trong
khoa học sự sống Nhà xuất bản Khoa học kỹ thuật : (508): 58-61
4 Va Dinh Chi, Luong Xuân Dũng và CV, 2004 Sự thích ứng của bọ gậy Anopheles smdaicus với điều kiện phịng thí nghiệm Tạp chí Phịng chống bệnh sốt rốt và các bệnh kỹ sinh tràng Viện Sốt réi- KST-CT-TU, số 1:71-15
5 Vũ Đình Chữ, Phạm Thị Hoan, 2004 Ảnh hưởng cửa ánh sáng, kích thước lồng nuơi tối sự phát triển, sình sản của Anopheles minimus Theobald, 1901, Tap chi Phang chống bệnh sốt rét về các bệnh ký sinh trùng Viện Sốt rét- KST-CT-TƯ, số 6: 66-72
6 Vũ Đình Chử, Lương Xuân Dũng và CTV, 2005 Một số dẫn liệu sinh học của ching Anopheles dirus Trung Quéc trong phong thi nghiệm Tạp chí Phịng chống bệnh sốt rét và các bệnh kỹ sinh tritng, Vién Sot rét- KST-CT-TU, số 3:10-15
7 Phạm Xuân Đỉnh, 1995, Kỹ thuật giao phối nhân tạo, nuơi giữ chủng và một số đặc tính sinh học của Anopheles dirus A va Anopheles dirus E trong điều kiện phịng thí nghiệm ở Thái Lan, Thơng tin Phịng chống sốt rét và các bệnh ký sink trùng, số 3:37-41
8 Trần Đức Hinh, Tein Thi Lich va CTV, 1987, KY thuat nu6i Anopheles sinensis trong phịng thí nghiệm Ký yếu CTNCKH Viện Sot rét- KST-CT-TU, tap 1:237-242
9 Phạm Thị Khoa, 2005 Sinh học muỗi Anopheles sinensis Wiedemann, 1828 trong phịng thí nghiệm Báo cáo khoa học Hội nghị cơn trằng tồn quốc lân thit 5 Nhà suất bản Nơng nghiệp: 637-645
10 Hồ Đình Trung, Wim van Bortel và CTV, 2002 Biến động mật độ, tỷ lệ đẻ của Anopheles minimus sensu lato, Anopheles dirus, Anopheles sundaicus và vai trị truyền bệnh của chúng tại một số địa phương ở Đơng nam Á và biện pháp phịng chống vĩc tơ thích hợp Tạp chí Phịng chống bệnh sốt rét va các bệnh ký: sinh trùng Viện Sốt réi -
KST-CT-TƯ, số 3:56-68
11 Nguyễn Thọ Viễn, Nguyễn Đức Mạnh, Trần Đúc Hinh và CTV, 1992 Nghiên cứu mudi Anopheles ( Celia) minimus Theobald và biện pháp phịng chống chúng ở
Việt Nam (Giai đoạn 1986-1990) Kỷ yếu CPNCKH Viện Sốt rét -KST-CT-TU, tập 1: 127-140
12 Cuauhtemoe Villarreal, Juan I Arredondo- Jimenez, Mario H Rodriguez and Amando Ulloa, 1998 Colonization of Anopheles pseudopunctipennis from Mexico Journal of the American Mosquito Control Association, 14 (4) : 369-372
Trang 30
13 Eugene J Gerberg, Donald R, Barnard and Ronald A Ward, 1994 Manual for mosquito rearing and experimental technique American Mosquito Control Association
Association Bulletin No 5
14, J W Knight and K Nayar, 1999 Colonization of Culex nigripalpust (Diptera; Cuticidae) by stimulation of mating using males of other mosquito species Journal of the American Mosquito Control Association, 15(1): 72-73
15 Ow Yang, C.K Sta Maria, F.L and Wharton, R.H., 1963 Maintenance of a
laboratory colony of Anophetes maculatus Theobald by artificial mating Mosquito
News, 23:34-35
16, Somboon and Suwonkerd, 1997 Estabilishment of slenogamous colony of Anopheles minimus species A Journal of Tropical & Medicine Parasitology Vol91 No.6: 673-676
17, Tianyun Su and Mir S, Mulla, 2001, Effects of temperature on development, mortality, mating and blood feeding behavior of Culiseta insidens (Diptera:
Cuticidae) Journal of Vector Ecology: 83-93
18 Toto Soelarto, Sustriayu Nalim and Michael J Bangs, 1995 Colonization of Anopheles harbirostris from Central Java, Indonesia Journal of the American Mosquito Control Association, 11 (1): 133-135
19, William K Reisen, Farida Mahinood and Tauheeda Parveen, 1979 Laboratory observation on the time of mating of Anopheles culicifacies Mosquito News: Vol 39, No.2: 328-333
20, WHO, 1975 Manual on practical entomology in malaria Part Tl: Methods and techniques: 175- 178