VIEN CHAN NUOI
BAO CAO TONG KET DE TAI
NGHIEN CUU CAI TIEN TO HOP CONG NGHE SINH SAN PHUC VU CONG TAC VA NHAN GIONG BO
CNDT : NGUYEN THỊ THOA
Trang 2LOINOI DAU
Công nghệ Cấy truyền phôi bò đã được nghiên cứu ứng dụng ở Việt Nam từ những năm 1978, nhưng từ đó đến nay hầu như chưa có một cải tiến đáng kể nào vẻ kỹ thuật sản xuất phôi ia-vivo, phôi ïa-xitro ở bò sữa Với kết quả nghiên cứu trước đây, số lượng phôi ia-vivo trung bình thu được từ bò cho phôi dao động từ 2,4-3,6 phôi/bò/lần thu phoi, mat khác khoảng cách thu phôi lặp lại sau 60-90 ngày, như vậy một năm chỉ tiến hành thu phôi 4-5 lản/bò và sồ phôi bình quân/bò/năm chỉ đạt 15 phổi Nghiên cứu cải tiến rút
ngắn khoảng cách giữa các lần thu phôi từ 60-90 ngày xuống 28-35 ngày/bò/lần đã tăng
số phôi thu được từ 2,4-3,6 phôi/bò/lần lên 3,3-3,7 phôi/bò/lần và tăng số phôi thu được 30- 45 phôi/bò/aăm Nghiên cứu tạo phôi bò ¿r-viro từ tế bào trứng thu ở lò mỗ trước đây với mục đóch nghiên cứu để hoàn thiện phương pháp chỉ có ý nghĩa trong nghiên cứu khoa học và không có ý nghĩa vẻ giống trong sản xuất Nghiên cứu tạo phôi ia-vitro từ tế bào trứng thu trên bồ sống bằng phương pháp siêu âm đã đưa ra được quy trình thu
tế bào trứng với tần xuất 2 lần/ tuần và áp xuất chân khụng 120 mmHg ở bò sữa 3-6 tuổi
có thể thu được 7-8 tế bào trứng/bò/lần và tạo được nguôn phôi ia-vitro từ nhứng bò sữa có giá trị giống và tiềm năng dĩ truyền cao
Ở Việt Nam, nghiên cứu đông lạnh phôi bồ đã được nghiên cứu từ năm 1984 tại Viện Khoa học Việt Nam Phương pháp đông lạnh nhanh (tốc độ hạ nhiệt 12°C/phúi) sau khi khử nước một phẩu ở nhiệt độ phòng với phôi bò đã thành công (Bùi Xuân
Nguyên và cs 1984) Năm 2003, Lưu Công Khánh và cộng sự đã báo cáo thành công
việc nghiên cứu ứng dụng đông lạnh chậm phôi bò bằng giycerol Năm 2005 Nguyễn Thi Thoa và cộng sự đã nghiên cứu phương pháp đông lạnh phôi Vitrivication (tạo thuỷ tỉnh thể) bước đầu đã thành công nhưng tỷ lệ phôi sống sau đông lạnh còn thấp chỉ đạt
73,24%
Trong nghiên cứu này đã đưa ra được quy trình đông lạnh thuỷ tỉnh thể
(vitrification) cải tiến đã tăng tỷ lệ sống của phôi đông lạnh sau giải đông từ 73;24% lên 80% Chúng tôi đưa ra các quy trình cải tiến với mục tiêu cung cấp chính xác vẻ các bước tiến hành trong quy trình cho cán bộ nghiên cứu và kỹ thuật viên có thể ứng dụng
Trang 3BAO CAO TONG HOP
KẾT QUÁ ĐÈ TÀI NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ SINH HỌC
2007-2010
THONG TIN CHUNG VE DE TAI
Tên đề tài: “ Nghiên cứu cải tiến tẲ hợp công nghệ sinh sản phục vụ công tác tạo và nhân giống bò”
Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Thị Thoa
Họcvị: — Thạc sĩ
Điện thoại: 0913321521
Địa chỉ: Nhà số 1, Ngách 148, Phố Hoàng Ngân- Trung Hoa- Cau Giấy- Hà Nội Cơ quan: Vién Chăn nuôi
Địachỉ: Thuy Phương-Từ Liêm- HàNội Số điện thoại: 048389971 Cơ quan phối hợp:
1 Viện Công nghệ Sinh học- Viện Khoa học Việt Nam
2 Trung tâm Thực nghiệm và Bảo tổn vật nuôi- Viện Chăn nuôi 3 Trung tâm Nghiên cứu Bò và Đồng cỏ Ba Vì; Hà Tây
4 Trung tâm, Trạm trại tỉnh Thanh Hoá, Hải Dương Thời gian thực hiện:
Từ năm 2007-2010
Trang 4PHANI: M6 DAU
1 ĐẶT VẤN ĐÈ
Chăn nuôi ở nước ta có vai trò quan trọng đối với nông nghiệp và phát triển kinh tế quốc dân, giá trị ngành chăn nuôi hàng năm chiếm tỷ lệ 30% tổng giá trị trong nông nghiệp Trong những năm vừa qua chăn nuôi đang góp phần quan trọng đối với chuyển đổi cơ cấu kinh tế trong nông nghiệp, tăng thu nhập cải thiện đời sống cho nông dân Tốc độ phát triển chăn nuôi và sản phẩm chăn nuôi hàng năm tăng bình quân từ 6-8% đáp ứng nhu cẳu tiêu dùng trong nước ngày càng cao về sản phẩm chăn nuôi Tổng sản lượng thịt sản xuất năm 2009
của nước ta đạt trên 3,7 triệu tấn thịt hơi và có tốc độ tăng trưởng bình quân năm đạt trén 6%/nam đưa bình quân sản lượng thịt trên đầu người lên trên
43kg/người/năm
Phát triển chăn nuôi bò thịt, bò sữa và gia súc ăn cỏ được Bộ Nông nghiệp và Nhà nước cũng như các địa phương quan tâm đâu tư và có chính sách khuyến khích phát triển từ những năm cuối của thế kỷ trước va đầu thế kỷ XXI Quyết định số 167 của Thủ tướng Chính phủ về một số biện pháp và chính sách phát triển bò sữa Việt Nam giai đoạn 2001-2010, ngày 20 tháng 10 năm 2001 là một trong những minh chứng cho sự quan tâm đó Trong thời gian từ 2001 đến nay, thực hiện Chương trình phát triển bò sữa theo Quyết Định 167 của Thủ tướng
Chính phủ, chăn nuôi bò sữa Việt nam đã thu được nhiều kết quả tốt đẹp, phát
triển một cách bền vững đáp ứng nhu cầu tiêu dùng sữa ngày càng cao của xã hội Tổng đàn bò sữa và sản lượng sữa của cả nước tăng từ 40.000 con và 64.000
tấn năm 2001 lên 140.000 con và 290.000 tấn năm 2010 Chăn nuôi bò sữa đã
thực sự mang lại hiệu quả kinh tế và xã hội cao đối với nông nghiệp của Việt
Trang 5Để có được số lượng và chất lượng bò sữa HF Việt Nam như hiện nay là
kết quả áp dụng khoa học kỹ thuật và công nghệ sinh học trong lại tạo và nhân giống bò sữa Việt Nam của các nhà khoa học trong suốt thời gian hon 50 năm Kỹ thuật thụ tỉnh nhân tạo và công nghệ phôi trong đó có kỹ thuật đông lạnh tỉnh, phôi là một trong những kỹ thuật sinh sản quan trọng nhất đã và đang được áp dụng trong cải tiến và nhân giống bò sữa HF Việt Nam
Đối với bò thịt mặc dù đã có nhiều tiến bộ kỹ thuật áp dụng trong công tác lai tạo và nhân giống, nhưng chăn nuôi bò thịt tại Việt Nam vẫn chưa đáp
ứng kịp nhu cẩn tiêu thụ thịt bò của thị trường nôi địa về số lượng và chất lượng Hầu hết các nhà hàng, khách sạn và siêu thị cao cấp vẫn phải nhập thịt bò từ Mỹ, Australia, New Zealand Theo số liệu thống kê năm 2009 sản lượng thịt trân, bò
hơi chỉ đạt 330 ngàn tấn thịt trâu bò/năm; tương đương mức tiêu thụ trung bình
trên đầu người chưa đến 1,5 kg/thịt/năm là rất thấp so với mức tiêu thụ 9-10 kg/năm tại các nước trong khu vực như Trung Quốc, Nhật Bản
Để phát triển chăn nuôi bò thịt, thành một ngành sản xuất hàng hoá, dự án
Cải tiến và nâng cao chất lượng giống bò thịt Việt Nam 2006-2010 và Chiến lược phát triển chăn nuôi đến năm 2020 theo Quyết định số 10/2008/QĐ-TTg của Thủ tướng Chính phủ ngày 16 tháng 1 năm 2008 đã đặt mục tiều tăng cường
cơ cấn giống bò lai, bò thịt chất lượng cao nhằm đạt tổng sản lượng thịt bò 310 ngàn tấn vào năm 2015 và 425 ngàn tấn năm 2020 Để đạt được mục tiêu trên của bò thịt và bò sữa, việc cải tiến các công nghệ sinh học sinh sản, như cải tiến
Trang 6nhanh số lượng, chất lượng của đàn bò hạt nhân đây là biện pháp kỹ thuật then
chốt cần được quan tâm đẳu tư nghiên cứu
Căn cứ vào mục tiêu và yêu cầu cấp bách về thịt sữa cho tiéu ding trong
nước trong những năm vừa qua, Bộ Nông nghiệp và PTNT đã phê duyệt và cho
phép chúng tôi tiến hành đề tài: “Wghiên cứu cải tiến tỖ hợp công nghệ sink sản phục vụ công tác tạo và nhân giống bò”
TI MỤC TIÊU
Dé tai này được xây dựng theo hướng sử dụng tổ hợp công nghệ sinh học
sinh sản tiên tiến phục vụ cho việc tạo và nhân giống bò như:Công nghệ phôi,
công nghệ đông lạnh tế bào sinh sản, để nâng cao năng xuất sinh sản và chất lượng giống bò một cách nhanh chóng và hiệu quả
Mục tiêu chính của đề tài là : Cải tiến và ứng dụng thành công các công nghệ sinh sản hiện đại (công nghệ sản xuất phôi invivo, phôi invitrro, công nghệ đông lạnh tỉnh, đông lạnh phôi ) để nâng cao năng suất sinh sản và chất lượng
Trang 7PHAN II
TONG QUAN CAC VAN DE CAN NGHIEN CUU
I COSGKHOA HQC CONG NGHE CAY TRUYEN PHOI BO
1.1 Kích thích noãn bao phát triển đồng loạt bằng sw tác động hormone
Nhiều tác giả cho thấy rằng tiềm năng sinh sản của bò lớn hon rất nhiều so với khả năng sinh sản thực của chúng Theo Erickson (1966) cho biết buồng trứng của bò có trên 70.000 noãn bao nguyên thuỷ có thể phát triển thành tế bào trứng để thụ tỉnh và tạo phôi Nghiên cứu trên bò có chu kỳ động dục đều Danell(1987) cho biết trung bình số tế bào trứng là 12636 và ở bò không hoạt động có số tế bào trứng là 10132, sự khác nhau này không rõ ràng (P>0,05) Nghiên cứu vẻ tế bào và mô học buồng trứng bò, Hafbigo (1947) đã công bố rằng bê 3 tháng tuổi có 21000 và ở bò già có 2500 tế bào trứng
Ở bò, mỗi chu kỳ chỉ rụng 1 trứng, nếu thy tinh chỉ được một bê, trong một đời bò cái chỉ sinh được 7-8 bê như vậy trong thực tế số noãn bào được sử dụng hữu ích là rất ít, đối với một đời con cái cao sản thật là lãng phí
Nhiều nghiên cứu cho thấy trong một chu kì ở bò thường có 2 đến 3 đợt
sóng nang phát triển cá biệt có tới 4 đợt Sóng nang là sự phát triển của một số
noãn bao ở cùng một thời gian Nghiên cứu theo dõi về sự phát triển của nang trứng trên buồng trứng ở bò sống bằng phương pháp siêu âm được nhiều tác giả
công bố Đợt một bắt đầu diễn ra sau khi rụng trứng vào ngày thứ 3-9 của chu kì,
đợt hai vào ngày 11-17, đợt ba là ngày 18-0 Mỗi đợt sóng nang có thể huy động
tới 15 nang kích thước từ 5-7 mm phát triển, sau này có một nang phát triển
Trang 8phát triển nang là sự phát triển có tính tự điều khiển và cạnh tranh giữa các nang Mỗi đợt có 1-2 nang trội, vài nang lớn phát triển và sự phát triển của các nang
còn lại bị kùm hăm Tuy vậy trong khi thể vàng còn tồn tại, nang khống chế và nang lớn sẽ bị thoái hoá, chỉ có đợt cuối cùng khi thể vàng không còn thì nang khống chế mới phát triển tối chín và rụng Đây là lí do giải thích rại sao mỗi chu
kì động dục của bò chỉ có một trứng chín và rụng (cá biệt có 2 trứng) Do đặc
điểm này các đợt phát triển nang còn được gọi là các sóng nang phát triển Trong
mỗi đợt sóng như vậy sự tổn tại của các nang không phải nang khống chế dao
dong tir 5-6 ngay (ireland 1987, Fortune va cs 1988) Riéng nang khống chế có
thể phát triển nhanh sau ngày 18 của chu kì, tốc độ phát triển của nang khống
chế vào thời điểm này có thể đạt 1,6mm một ngày (Fortune và cs.1988, Savio và cs 1988)
Trén cơ sở nghiên cứu về về quy luật phát triển của nang trên buồng trứng
và những hiểu biết hormone diéu khiển sinh sản, nhiều các nhà khoa học đã rạo
cho trứng rụng đồng loạt trong một chu kì và rạo được nhiễu phôi có chất lượng vào điểm được xác định bằng kỹ thuật gây rụng trứng nhiều Kỹ thuật gây rụng trứng nhiều đã thu được nhiều kết quả khả quan Gây rụng trứng nhiều (GRTN)
lần đầu tiên được nghiên cứu trên chuột của Engle (1927); trên bò và cừu của Col và Miller (1933); Parker và Hammond (1940) và Casida và cs (1944) Các phương pháp GRTN trong giai đoạn này bước đầu nghiên cứu chủ yếu trên cơ sở
về mối tương quan tuyến yên-buồng trứng và sự phát hiện hocmon ECG và
estrogen & phu nữ có thai và ngựa chửa (Smith và Engle: 1927; Zondek và
Aschheim: 1927) Két qua GRTN ở giai đoạn này còn rất hạn chế và vì vậy tỷ lệ
thụ thai sau cấy phôi chỉ đạt từ 2-10%
Nghiên cứu xây dựng các phương pháp GRTN một cách hệ thống và trên
Trang 9đầu thực hiện từ những năm 1970 Trong giai đoạn này, sự phát triển công nghệ
phôi ờ quy mô lớn đối với các đối tượng chăn nuôi quan trọng như cừu, bò; các phương tiện nghiên cứu hiện đại và chính xác như miễn dịch phóng xạ, siêu am cũng đã được áp dụng phổ biến trong nghiên cứu sinh học sinh sản Những đóng góp quan trọng liên quan đến việc xây dựng các phương pháp GRTN trong
giai đoạn này đã được thực hiện trên cơ sở nghiên cứu quy luật phát triển nang, rụng trứng và vai trò thé vàng trong hoạt động chu kỳ tính buồng trứng Nghiên
cứu của nÍ tác giả cho thấy sự rụng trứng chỉ xảy ra ở các nang đã phát triển
tới độ chín cần thiết, bao gồm sự tăng tối đa kích thước nang và xoang chứa dịch
nang, và sự chín noãn được thể hiện qua các hiện tượng tan màng nhân, phân lập
câu cực 1, và phân bố thể nhiễm sắc È giai đoạn meraphase II (M II) (Thibault 1985, Blerk Van và bell, 1986)
Điều kiện cần thiết để các quá wioh chín và rụng trứng xảy ra là sự răng
cường phân tiết LH của tuyến yên trong máu ngoại vi Sự chín và rụng trứng chỉ
xây ra sau khi xuất hiện đỉnh LH Quan sát ở bò cho thấy trong chu kỳ bình thường, sự an màng nhân xuất hiện khoảng 5 giờ sau đỉnh LH, sự hình thành nhiễm sắc thể M II xẩy ra khoảng 17-22 giờ sau đỉnh LH, và rụng trứng xảy ra 22 giờ sau đỉnh LH (Dieleman 1993) Vào thời điểm sắp rụng trứng, sự tăng các thể tiếp nhận LH được quan sát thấy trong các nang khống chế sẽ dẫn tới tăng
tổng hợp Progesterone và PGE Các hocmon này có tác động gây sự vỡ nang
thông qua sự kích thích hoạt động co các cơ trơn nằm ở lớp màng ngoài buồng
trứng (Akamura và es 1972; Virutamanen 1972, Chaning và cs 1980) hoặc tăng
sự tổng hợp các enzym gây ran màng nang như plasmin, hyaluronidaza (Beer
1975; Espey 1974) Những nghiên cứu này góp phần đưa ra các chỉ dẫn về vai trò
Trang 10có rất nhiều rác giả nghiên cứu vẻ các phương pháp và sử dụng các loại hocmôn khác nhau để GRTN ở bò cho phôi
Theo Elsden và es (1974), gây rụng trứng nhiều bằng PMSG và PGE,„ trên bò cho kết quả rất tốt Bò được tiêm PMSG vào giữa chu kì động dục với
liều 1500 -2000 UI, sau 48h tiêm 2 liều 1,9mg PGE,„ cách nhau 12 h Trong
tổng sối 24 bò được tiến hành gây rụng trứng nhiều có 18 bò động dục trong
vòng 5 ngày kể từ khi riêm PGE,„ Trong số đó có 14 bò động dục vào ngày thứ
2 và 4 Bằng phương pháp phẫu thuật để đánh giá kết quả cho thấy rằng cả 24 bò
đều có phản ứng mạnh và có số trứng rụng bình quân là 13,2+19, trong đó có 20
bò có noãn bao không rụng bình quân là 3,3 Thí nghiệm khác trên 35 bò với liễu
2000 UI, PMSG tác dụng vào ngày thứ 16 của chu kì động dục, kết quả chỉ có 24
bò phát hiện có phản ứng với PMSG bằng phương pháp khám lâm sàng qua trực
tràng Khi mổ khám có 7 bò trong số 29 bd không rụng trứng và có u nang buồng trứng Trên 17 bò bình quân trứng rụng là 8,0+1,5 có 4 bị vẫn cịn nỗn bao khơng rụng Một nghiên cứu nữa được tiến hành trên 10 bò với sự kết hợp cả PMSG và PGF,„ đã phối giống trong thời gian động dục Trong tổng số 141 trứng
rụng đã thu được 97 phôi (đạt tỉ lệ 69% trứng rụng), rong đó có 88% phôi thụ
tính Từ những kết quả thu được tác giả có nhận xét rằng kết hợp PMSG với
PGF,„ cho kết quả rốt hơn khi dùng một mình PMSG để gây rụng trứng nhiều
trên bò Boland và cs 1978; Chupin và Procureur, 1982; Newcomb và cs 11976)
cho thấy việc sử dụng eCG để GRTN ở bò thường kèm theo các hạn chế có thể
ảnh hưởng âm tính lên kết qua thy tioh va sự phát triển phôi như thời điểm xuất
hiện động dục không chính xác, động dục kéo dài Trong các trường hợp này tỷ
lệ bò có phản ứng rụng trứng cao (89% có phản ứng), nhưng chỉ có hơn 44% bò
có trên 5phôi/1 lần, và chỉ có 25% số phôi đạt tiêu chuẩn tốt Trong thực tiễn khả
Trang 11Hasler và es (1983) đã làm thí nghiệm so sánh kết quả gây rụng trứng
nhiều bằng eCG lặp lại nhiều lần trến bò sữa Holsteia cho thấy số trứng rụng
không giảm (10 thể vàng), nhưng rỷ lệ thu phôi và tỷ lệ trứng thụ tinh co thé
giảm từ 30-40% ở những lần GRTN lặp lai Savage va Maleroft (1984) da sir dụng Estradiol -17 ð hoặc GnRH với FSH-P Với số bò là 54 được gây rụng từ ngày 10-12 của chu kì động dục với liều 28 FSH-P, mỗi ngày
trứng nÍ
tiêm hai lần với liễu giảm dân, trong 4 ngày liên tục Sau khi tiêm 48h mỗi bò
được tiêm 500mg PGE,„, Số trứng rụng trung bình là 12,332.3, số phôi thu được
là 0,35+2,7, số trứng được thụ tỉnh là 6,3+5,4 trên tất cả bò thí nghiệm
Boland và cộng sự (1986) thông báo kết quả gây rụng trứng nhiều trên 30
bò cái tơ với liều 2500UT PMSG tiêm vào ngày thứ 9-12 của chu kì động dục Sau khi tiêm PMSG 48h, mỗi bò được tiêm mg Fenprosralene và đã có 27 bò đã động dục sau khi tiêm Eenproralen từ 2-5 ngày Trung bình số trứng rụng là 11,5 (từ 1-25 rong đó có 17 bò có số trứng rụng lớn hơn 10) Trong số trứng phôi thu
được có 72% trứng đã thụ rỉnh và 74% trong số đó phát triển bình thường
Gay rụng trứng nhiều bằng Norgestomer và FSH da duoc Hill ves (1986) tiến hành Thí nghiệm được chia thành 5 ô kí hiệu từ A tới E và Norgestomet đã được cấy vào các thời gian khác nhau của chu kì động dục: ngày 0-3 (A); ngày
4-8 (B); ngày 8-11(C); Ngày 16-20 (D); Còn ESH (37mg) tiêm vào ngày thứ 7
sau khi cấy Norgestomet với liêu giảm dân trong 4 ngày, mỗi ngày 2 lần Norgestormer được lấy ra sau khi cấy được 9 ngày Nhóm đối chứng (F) cũng được tiêm 37mg ESH vào ngày rhứ 8-13 của chu kì động duc PGE;„ liều 25mg
được tiêm cho tất cả bò thí nghiệm và đối chứng sau khi tiêm ESH 48h và 60h Trung bình số trứng rụng và phôi đảm bảo chất lượng cho tất cả bò thí nghiệm là
Trang 12đã rút ra kết luận rằng dùng Norgestomet kết hợp với ESH để gây rụng trứng
nhiêu cho bò cân quan tâm ngày của chu kì động dục của bò và đây là một
phương pháp tốt và có hiệu quả Bằng phương phương pháp này chúng ra không
mất nhiều thời gian phát hiện động dục và tạo động dục đồng pha đối với bò cho
phôi trong kỹ thuật cấy truyền phôi bò
Năm 1986, tác giả Kostov và es đã tiến hành gây rụng trứng nhiều ở bò bằng Syachromate B va Estradiol, PMSG va PGF,,, Két qua bd đã động dục sau
tiêm 96h và có 17,6% số bò không động dục Số bò có thể vàng từ 2-4; 5-10; 11- 15 và trên 15 rương ứng là 3; 6; 2 và 4 con Sau khi gây rụng trứng nhiều bằng FSH va Estradiol Dieleman va cs (1987) báo cáo kết quả gây rụng trứng nhiều ờ bò bằng sử dụng PMSG, PGF,„ và ani-PMSG Bình quân số trứng rụng và noãn bao tương ứng là 15,732.5 và 15,4+1,6 cho mỗi bò thí nghiệm Kết quả ở bò thí
nghiệm cao gấp 2 lần so với bò đối chứng vẻ số lượng trứng rụng và độ tin cậy
(P<0,05)
Kim và cộng sự (1987) đã công bố kết quả của việc sử dụng PMSG và
ani-PMSG Thí nghiệm đã riến hành trén 80 bò và chia làm 3 lô: lô A : PMSG
và ani-PMSG; lô B: PMSG +monoanti-PMSG và lô C: ESH tiêm 4 ngày mỗi
ngày 2 lần Bình quân số thể vàng trên bò là:12,4; 11,9 và 4,4, bìmh qn nỗn
bao khơng rụng là 1,2; 2,2 và 0,4 tương ứng cho các lô A; B; C Số phôi tương ứng cho các loại A, B và C là 8,2 (66,1%);7,3(61,3%) và 3,9(88,6%) Trong đó tỷ lệ phôi có khả năng cấy trên các phôi thu được là 5,9(71,9% ; 5,11(69,8%0; và 3,6 (92,3%) tương ứng cho các lô A; B; C Kết qủ tương tự cũng được Kostov thông báo (1986) vẻ gây rụng trứng nhiều ờ bò dùng PMSG và anti-PMSG
Bergfelr và cs (1994) đã thông báo như sau: bd tơ Simenral từ 17 đến 22
tháng sau khi gây rụng trứng nhiều đã động dục 100%, số trứng rụng và phôi
Trang 13tương ứng là 16,4+1,89 và 10,1+1,79, trong đó số phôi cấy được bình quân cho mỗi bò là 5,3+1,09
Theo Crister va cs (1988) sit dung FSH va eCG để GRTN tuy không dẫn
tới sự khác nhau về số trứng rụng (10 thé vàng) nhưng có thể ảnh hường dương
tính lên chất lượng phôi Tỷ lệ phôi có thể cấy được ở lô bò được xử lý ESH cao
hơn so với lô bò được xử lý eCG (58% so với 42% Tuy vậy, Aleivar và es (1983) trong thí nghiệm so sánh sử dụng ESHp (26mg, kiểu giảm dần) và Pergonal (15001U) tiêm vào ngày 9-11 của chu kỳ, đã thông báo những kết quả ngược lại :
số thể vàng và số phôi thu được ở lô bò được xử lý FSH (11 thé vàng, 9 phôi) cao
hơn so với lô dùng Pergonal (10 thể vàng, 7,5 phôi), song số phôi cấy được không khác nhau giữa 2 lô (5 phôi cấy được) Theo Aoygi và cs (1987) sự biến
đổi nồng độ hocmon Progesterone và estradiol trong máu ngoại vi của bò được
gây rụng trứng nhiều bằng ESH và eCG không khác nhau rõ rệt
Theo Yadav va cs (1985), Ellington va cs (1987) viée si dụng
Progesterone va PGF tong gay rụng trứng nhiều để khống chế thời điểm, thời
gian và mức độ động dục có thể đem lại những cải tiến vẻ số trứng rụng và chất lượng phôi Trong trường hợp bò cho phôi có hoạt động sinh sản kém, kết quả
gay rụng trứng nhiều thấp, thì việc sử dụng PGF (50mg) tiêm nhiều lần (3 lần,
cách nhau 6 giờ thay vì tiêm 2 lần cách nhau 12 giờ) có thể tăng đáng kể tỷ lệ động dục (96% so với 86 %), tỷ lệ phôi thụ tỉnh (62% so với 51%), số phôi tốt thu được (5,4 so với 3,8) (Donaldson 1986)
Estradiol cũng có ảnh hưởng quan trọng lên kết quả gây rụng trứng nhiều
Bồ xung 20mg estradiol-17B vào ngày thứ 1-2 sau khi xử lý eCG, làm tăng số
nang phát triển và tăng số trứng rhụ tỉnh Kết quả sử dụng estradiol-17 bổ xung vào FSH hoặc eCG để gây rụng trứng nhiều ở bò Simenral được Broadbenr và cs
Trang 14(1995) thông báo gần đây là 15 thể vàng với số bò được xử lý ESH, và 16 thể vàng với bò được xử lý eCG
Theo Dieleman và cs (1993) dùng anti-eCG bổ xung vào thời điểm động dục là phương pháp hiệu quả và đơn giản để tăng hiệu quả của eCG và chất lượng phôi thu được Tuy vậy, anti-eCG có thể cho những kết quả khác nhau tuỳ theo phương pháp sử dụng Chất lượng phôi sẽ giảm sút khi anti-eCG được đưa vào
trước khi xuất hiện đỉnh LH
Trạng thái buồng trứng của bò cho vào thời điểm gây rụng trứng nhiều là yếu tố ảnh hưởng quan trọng đến kết quả gây rụng trứng nhiều Theo Lindell và cs (1986), xử lý ESH vào ngày thứ 9 của chu kỳ của bò cho kết quả rụng trứng và chất lượng phôi cao hơn hẳn so với xử lý vào ngày thứ 3 hoặc 6 Gouding và
ces (1990) cũng thông báo kết quả tương tự trên đối tượng bò thịt
Về góc độ sinh lý và môi rường, các nghiên cứu đã được công bố cho thấy
các yếu tố cá thể, giống, mùa vụ dé ảnh hường rất lớn tới kết quả gây rụng trứng
nhiều ở bd Kết quả thí nghiệm của Foore và Onuma (1976) cho thấy tuỳ thuộc
theo trang thái cá thể phản ứng rụng trứng ở bò có thể dao động từ 0-104 trứng
rụng/con Trong trường hợp gây rụng trứng nhiều nẵng cùng một quy trình, bò có
trạng thái sinh sản bình thường cho 10 trứng rụng trong đó có 6,4 trứng tốt, trong
khi bồ vô sinh chỉ cho 6 trứng rụng và 2,4 trứng dùng được Phản ứng rụng trứng
ở bò có chu kỳ ngắn hơn 15 ngày cũng kém hơn so với bò có chu kỳ dài 15-27 ngày (Crister và cs (1988)
Tuổi bò lúc xử lý gây rụng trứng nhiều cũng ảnh hưởng quan trọng đến kết
quả tạo phôi Phản ứng rụng trứng nhiều ở bò rơ chưa đẻ và bò đẻ 1-5 lần thường
cao hơn so với bò đã đẻ trên 6 lần (Grevet 1982) Chất lượng phôi thu được sau
gây rụng trứng nhiều ờ bò sữa 12 tháng tuổi kém hơn so với bò sữa đã đẻ 1-2 lứa;
trong trường hợp bò tơ, số trứng rụng có xu hướng cao hơn (22 thể vàng/con/lần),
Trang 15nhưng tỷ lệ phôi đạt tiêu chuẩn cấy phôi rất thấp (2/22 phôi) (Sehilling va cs
1981) Olivera-Angel và cs (1984) nghiên cứu về rỷ lệ thu phôi và chất lượng của
phôi sau khi gây rụng trứng nhiều bằng eCG (2000 TU) trên bò thịt rơ và bò thịt
đang cho bú cho thấy ở bò rơ rỷ lệ rhu phôi chỉ đạt 15% và tỷ lệ phôi phát triển
bình thường là 40%, thấp hơn nhiều so với tỷ lệ thu phôi đạt 39% và tỷ lệ phôi phát triển bình thường 67% ở bò đang cho bú
Phản ứng rụng trứng nhiều cũng rất khác nhau giữa các giống bò Theo
Gauthier (1983), số trứng rụng trung bình trong các xử lý gây rụng trứng nhiều bằng eCG là 2,9 ở bò Fir noir, 6,2 ở bò Charolaise, 4,9 rứng ở bò lai Holstein-
Fresian, và 8,2 trứng ở bò Holstein Kết quả gây rụng trứng nhiều cũng có thể
thay đổi do ảnh hường của các điều kiện địa lý khí hậu khác nhau Phản ứng buồng trứng và chất lượng phôi thu được trong mùa Đông -Xuân thường tốt hơn
so với mùa Hè- Thu
Theo thông báo của Hasler và es (1983) phản ứng rụng trứng nhiều của bò
Holstein nuôi trong điều kiện ôn đối là 11 thế vàng nếu được xử lý vào mùa
đông-xuân, và 9,5 thể vàng nếu được xử lý vào mùa hè-thu Tương tự, kết quả
rụng trứng nhiều và thu tỉnh ở bò Holstein nuôi tại điều kiện nhiệt đới Chau phi là 12 thể vàng, 73% phôi tốt, 95% trứng thụ tỉnh đối với bò được xử lý eCG vào mùa đông, và 7 thể vàng, 46% phôi tốt, 85% trứng thụ tỉnh đối với bò được xử lý vào mùa hè (Gordon và cs 1987),
Qua kết quả nghiên cứu về ứng dụng GRTN rrong cấy truyền phôi của nhiều tác giả, có thể đưa ra nhận xét rằng hầu hết các phương pháp GRTN được sử dụng phổ biến hiện nay, đều được sử dụng các hocmon sinh sản và ở mức độ
các cơ chế điều khiển nội iết-thản kinh thể dịch
Nguyên tắc chưng của các phương pháp này là:
Trang 161) Khống chế thể vàng bằng các hocmon có hoạt tính làm tiêu thể vàng như
oestrogen, prostaglandin và dẫn xuất của chúng
2) Khống chế hoặc làm mất nang khống chế bằng các hocmon Esưadiol, ùCG
3) Tăng khả năng huy động nang mới phát triển, và khả năng phát triển các
nang đã được huy động bằng ESH, eCG
4) Tạo sự chín đều và rụng trứng cùng lúc cho các nang ở cou cho, hoặc giữa con cho và con nhận, bằng cách sử dụng kết hợp progestin và PGE
1.2 Gây động dục đồng pha và cấy phôi cho bò nhận
Gây động dục đồng pha (GĐDĐP) là quá trình kích thích cho cái nhận phôi động dục đúng vào thời điểm động dục của cái cho phôi Đông pha giữa cái ¡ cho phôi còn có ý nghĩa trạng thái sinh lý sinh dục ở cái nhận cho phôi
nhận phôi và
phôi phù hợp với tuổi của phôi Như vậy nếu tiến hành cấy phôi tươi, c:
và cái nhận phôi phải đông thời động dục Khi cấy phôi đông lạnh, cái nhận phôi đã động dục trước đấy một thời gian, thường là 7 ngày (đúng với tuổi của phôi)
Chu kỳ động dục của bò bình quân 21 ngày, dao động 17-24 ngày Chu kỳ này được phân thành các thời kỳ nhỏ kế tiếp nhau Trước động đực, động đực, sau động đực và yên tĩnh Nó được đặc trưng bởi hai pha: pha noãn nang và pha thể vàng Mỗi thời kỳ, mỗi pha đều có những đặc điểm và biểu hiện riêng biệt, có
thể nhận thấy hoặc không thể nhận thấy được Sự thay đổi vẻ trạng rhái sinh lý
của cơ quan sinh dục tương ứng ở các thời kỳ như: sưng, xung huyết, phân tiết niêm dịch, độ pH niêm dịch, thành phần các chất trong niêm dịch và sự vận động của cơ quan sinh dục đặc biệt tử cung phải phù hợp, tương ứng với trạng thái sinh lý của hợp tử sau là phôi ở từng giai đoạn phát triển Có như vậy mới tạo điều
kiện cho phôi thai sống phát triển bình thường trong cơ thể mẹ Vì lẽ đó, cấy
Trang 17phù hợp với giai đoạn phát triển của phôi hoặc phù hợp với tuổi phôi Sự không đồng pha sẽ làm cho mẹ nhận phôi đào thải phôi, phôi không thể tiếp tục sống, phát triển trong tử cung mẹ nhận Khi cái nhận phôi động dục đồng thời với cái cho phôi, hoặc trạng thái sinh lý sinh dục của nó phù hợp với tuổi phôi người ta gọi là đông pha hoàn toàn và lấy số 0 làm biểu tượng Người ra cũng lấy dấu (+) hoặc (-) đặt trước thời gian cái nhận phôi động dục trước hoặc sau cái cho phôi để biểu hiện mức độ đông pha Ví dụ +1: cái nhận phôi động dục trước 1 ngày; -1: cái nhận phôi động dục sau 1 ngày, v.v
Kết quả nghiên cứu của Rowson và cty (1972) cho biết khi cấy phôi cho cái nhận phơi đồng pha hồn toàn tỷ lệ dau thai đạt đến 91%, trước 1 ngày (+1)
tỷ lệ này là 57%, còn sau 1 ngày (-1) đạt 52%, +2 ngày: 40%, -2 ngày: 30%
Thông báo của Church (1974) cho biết tỷ lệ có chửa dao động 35-80% tuỳ thuộc vào sự đồng pha giữa cái cho phôi và cái nhận phôi Lowson và crv (1975); Church va ctv (1976); Sreenan và Beehan (1976) cùng nhận thấy nếu cái nhận
phôi được chọn lọc cần thận, thể trạng tốt, chăm sóc nuôi dưỡng chu đáo, trạng
thái sinh lý phù hợp với tuổi phôi, tỷ lệ đậu thai đạt 50-60% nếu cấy một phôi và đạt đến 90% nếu cấy hai phôi
Mỗi phôi đã được tạo ra và lựa chọn để cấy, số phận tiếp theo của nó phụ thuộc vào kết quả đánh giá phản ứng động dục đồng pha và chuẩn bị con nhận phôi Thực chất quá trình chuẩn bị con nhậu phôi là gây động dục nhân rạo và đồng pha nhằm tạo điều kiện bảo đảm cho phôi được tiếp nhận và làm tổ sau khi
cấy vào cơ rhể bò nhận Chất lượng của con nhận phôi được thể hiện qua chỉ tiêu:
1- Trạng thái động dục bên ngoài (dịch nhày, dấu hiệu động dục )
2- Sự chín của nang, rụng trứng và hình rhành thé vàng
3- Trạng thái nội tiết cần thiết cho sự phát triển của phôi
4- Sự phát triển của cơ quan sinh sản cần thiết cho quá trình làm tổ, mang
thai và cuối cùng là sự đồng pha của tất cả các trạng thái trên với tuổi phôi
Trang 18Việc gây động dục nhân tạo và đồng pha được thể hiện chủ yếu bằng các
hormone nội tiết điều khiến sinh sản với các nguyên tắc sau:
1- Tạo trạng thái khởi động chu kỳ đồng đều giữa các bò thông qua việc
tiêu huỷ thể vàng bằng Prostaglandine E;„ (PGF;¿) 2- Kích thích nang trứng phát triển ờ số lượng thích hợp 3- Cho sự rụng trứng đồng pha vào thời điểm dự kiến bang PGF,,,, Progesterone, PMSG, PRID, CIDR
Cũng như việc gây rụng trứng nhiều, quá trình này chịu sự điều khiển nội
tiết của cơ thể và qua đó chịu sự ảnh hường rõ rệt của các yếu tố môi trường,
giống và trạng thái cơ thể
Đánh giá chất lượng gây động dục đồng pha qua tỉ lệ động dục và thụ thai
cho thấy gây động dục đồng pha theo nguyên tắc rút ngắn giai đoạn thể vàng
bằng PGE trong trường hợp bò được chọn lọc kỹ và nuôi trong điều kiện tiêu
chuẩn hoá có thể tỉ lệ thụ thai bằng hoặc cao hơn với động dục tự nhiên (75% so
với 68%) Việc gây động dục bằng Chlormadion Acetate Progesteron (CAP) doa
lẻ không đáp ứng nhu cầu chuẩn bị con nhận phỏi Tỉ lệ động dục ở bd Zebu
Brahman: được tiêm hoặc cho ăn 50 mg CAP trong 5 ngày, chi dat 22 - 41% (Joche va es, 1978)
Tỷ lệ động dục và thụ thai được cải tiến đáng kể khi Progesteron được kết hợp với Estradiol-17 Sử dụng Synchro-Mate-B có thể cho kết quả 88% động
dục, 70% thụ thai & bd Holstein da đẻ vài lần (Anderson và cs, 1982) Kết quả tượng tự cũng đã được Eoore và Hunter (1964) công bố rrong các thí nghiệm rrên bò thịt ảnh hưởng dương tính của việc bổ xung Estrogen lên tỉ lệ động dục và thụ
thai cũng đã được thông báo ở bò Herefors-Angus duoc gay dong duc bang PGF
(Feters, 1984) hoặc Progesterone Releasing Intravanginal Divice (PRID; smith va
McGowan, 1982) Theo thông báo của rác giả này, việc bổ xung Estropen
(400ug) và thời điểm 48 giờ sau khi tiem PGF lam ting rỷ lệ động dục và thụ thai
Trang 19thêm 30%; song kết quả tương tự không xảy ra trong trường hợp bổ xung
Estradiol-17Bb vào thời điểm 48 giờ sau khi tiêm PGF
Việc bổ xung Bquin Chorionic Gonadotropia (eCG) cũng có thể đem lại những cải tiến rỷ lệ rụng trứng và thụ thai Sự tăng tỷ lệ bò có rụng trứng đã được (Sreenan và cs, 1975) thông báo ờ bò thịt được bổ xung ECG 750 LU vào kết thúc xử lý Progesteron vào thứ 9 Việc bổ xung eCG được xem là cần thiết đối với bò thịt nghỉ ngơi sinh sản do mùa hoặc cho con bú, vì phản ứng động dục sau khi được xử lý PGE thường thấp ở các bò này
Máu sinh sản có ảnh hưởng rõ rệt lên kết quả gây động dục Kết quả gây doag duc bang Chlormadion Acetate Progesteron (CAP) & bd Zebu Brahman cia
Joche va cs (1978) cho thấy tỷ lệ động dục thầm lặng trong mùa mưa cao hơn
hẳn so với mùa khô (41% so với 22%)
Kết quả gây động dục đồng pha cũng phụ thuộc nhiều vào tính năng sản xuất của bò Gây động dục đồng pha bằng PGF thường không hiệu quả đối với bò
thịt đang cho con bú ở trạng thái nghỉ ngơi (anoestrus) Tỷ lệ động dục trong
trường hợp này chỉ đạt 30 - 50% (Roche va cs, 1979) Theo Roche va cs (19%) va Aquino va cs (1989), viée sit dung Gonadotropin Stimulating Hormon(GaRH)
và Estradiol-17B đều không đem lại những cải tiến đáng kể trong trường hợp này
Gosling và es (1975) quan sát nồng độ hormon Luteinising Stimulating Hormon
(LH) trong máu ngoại vi của bò thịt sau khi tiêm Gonadowopin Stimulating
Hormon(GnRH) 100ng và Estradiol-17B 400g hai lần, vào ngày15 và lặp lại vào ngày 30 sau khi đẻ cho thấy chỉ có 7/72 bò có đỉnh LH rõ nét
Liên quan đến việc động dục và cấy phôi, Cooper và Furr (1976) thông báo
90% bò sữa tơ được sử lý PGF (500 pg, hai lần, cách nhau 11 ngày) có biểu hiện
động dục trong vòng một ngày (n=175) Tuy vậy kết qua do thời điểm riêu thể vàng qua nồng độ Progesteron trong máu và thời điểm xuất hiện đỉnh LH, rụng
Trang 20trứng của Hahn (1976) trên bò sữa được xử lý PGF CI 80 996) vào ngày thứ 10
- 1Ichu kỳ cho thấy thời điểm tiêu thể vàng tương đối tập trung (sai lệch 3,3 giờ
so với trung bình), nhưng thời điểm rụng trứng còn phân tán (sai lệch 18 giờ so
với trung bình 81 giờ)
Theo Roche (1976) tỷ lệ động dục ở bò tơ và bò sữa Holstein được cấy
Progesteron vào rrong âm đạo trong 12 ngày là 99% và trong đó 90% rỷ lệ bò có động dục cùng ngày là 72% và 70% Cũng theo Roche việc bổ xung Estradiol-
17B vào ngày đâu cấy Progesteron đem lại những cải tiến quan wong: 94% bd
trong trường hợp này có biểu hiện động dục đồng pha cung ngày
Ảnh hường của Equin Chorionie Gonadotropin (CG) và Esradiol-17B lên
sự đồng pha cũng được Nancarraw và Miller (1976) thông báo trên bò được xử lý
PGF, PGE kết hợp ECG (750 1.U) và PGE kết hợp với estradiol benzoare 500 Hạ Sai lệch thời gian xuất hiện động dục tương ứng cho các lô trên là 5,5 - 7 giờ (trên 78,9%); 3 giờ (trên 67,2%) và trên 2,4 giờ (trên 52,9%)
So sánh kết quả thụ thai sau cấy phôi ở bò có độ lệch pha khác nhau,
Hensen (1976) thông báo tỷ lệ thụ thai sau cấy phôi bò Belgian blue-white bred
được xử lý PGE dao động từ 40 tới 65% trong độ lệch pha cho nhận -24 tới + 12 giờ và cao nhất ở mức lệch: +6 giờ (trước con cho, tức phôi trẻ hơn), -24 giờ (con nhận rụng trứng sau con cho)
Theo Rowson và cs (1969) giới hạn lệch pha động dục chp phép tối đa là 24 giờ Việc cấy phôi vào con nhận động dục 36 giờ trước con cho hoặc hơn 12 giờ sau con cho đều cho kết quả chửa thấp, trong khi theo Haha (1976) sự lệch
pha +0,5 ngày có thể chấp nhận
Phương pháp sử dụng hormone có thể khác nhau, phải được lựa chọn, điều chỉnh cho từng trường hợp cụ thể mới đem lại hiệu quả cao Sử dụng SMB cho
kết quả 88% động dục, 70% có chửa ở bò Holstein (Anderson và crv, 1982)
Trang 21Kết quả cuối cùng của cấy phôi được thể hiện qua tỷ lệ thụ thai Quá trình làm tổ chỉ xảy ra trong khoảng thời gian giới hạn Trong trường hợp sinh sản bình thường, sự phối hợp nhịp nhàng giữa phôi và cơ thể mẹ được thực hiện nhờ các
Steroid (Maurer và Echrernkamp, 1982) Prorein nội mạc tử cung Uretroglobia va
các tín hiệu trao đổi thông tin do phôi tổng hợp như Triphoblaxin, PSPB
(Pregnaney Specifie Protein)
Cấy phôi là sự chuyển phôi từ cơ thể mẹ này (mẹ cho) sang một cơ thể mẹ
khác (mẹ nhận), số phận phôi sau khi cấy vào cơ thể mẹ nhận, sẽ phụ thuộc vào:
1 Môi trường cơ thể mẹ nhận
2 Giới hạn miễn dịch
3 Sự trao đổi tín hiệu mẹ - phôi trong trường hợp cấy phơi cùng lồi Yếu tố quan trọng nhất là sự trao đổi rín hiệu giữa phôi và cơ thể mẹ là sự đồng pha
Theo thông báo của các tác giả, tỷ lệ có chửa tren 50% nếu độ lệch pha giới hạn xung quanh 1 ngày, sẽ giảm xuống chỉ còn 20% nếu độ lệch pha lớn hơn 2 ngày
Newcomb va Rowon (1975), Yadan (1986), Newcomb (1977) cho rằng để có tỷ lệ đạu phôi cao, thì bò nhận phôi động dục muộn hơn 1 ngày so với bò cho phôi Iglesias (1971), Alcalas (1986) cho rằng để có tỷ lệ đậu thai cao hơn, thì bò nhận phôi biểu hiện động dục sau bò cho phôi 1 ngày
Tỷ lệ bò có chửa cao nhất nếu cặp cho nhận phôi có độ lệch pha trong phạm vi 6 đến 24 giờ (Bùi Xuân Nguyên và crv, 1996)
1.3 Đông lạnh phôi
Cơ chế đông lạnh phải: Nghiên cứu về cơ chế đông lạnh tế bào, theo định luật
Loi Raoult, độ hạ băng điểm của dung dịch phụ thuộc vào nông độ các chất hoà
tan khi hạ nhiệt độ, lúc xuất hiện rỉnh thể nước đầu riên là bắt đầu thay đổi giai đoạn đông băng Điều này chỉ có thể xảy ra khi nhiệt độ thấp hơn hoặc bằng độ
Trang 22ha băng điểm của dung dịch Nhiều nghiên cứu cho biết bên trong tế bào chứa
hơn 80% nước, nồng độ nước này cao hơn bên ngoài rế bào Vì vậy, sự thay đổi
giai đoạn đông lạnh nội bào xảy ra ờ nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ bên ngoài Trong quá trình đông lạnh, trước tiên ở môi trường bên ngoài tế bào những tỉnh
thể nước được rạo thành, làm tăng nồng độ chất hòa tan nhanh chóng Sự tăng áp suất thẩm thấu này, nước sé đi ra ngoài rế bào, làm giảm thể tích tế bào Mức độ
mất nước tế bào phụ thuộc vào tốc độ đông lạnh (hạ nhiệt nhanh hay chậm), tốc độ này phải ở trên tốc độ giới bạn, mà tốc độ giới hạn lại thay đổi theo loại tế bào, khả năng tạo băng đá nội bào tăng lên cũng gây ra những tổn hại tế bào do đông lạnh hay giải đông Tốc độ lạnh ờ dưới tốc độ giới hạn thì sự sống của tế bao pan lién với sự biến đổi các tính chất của dung dịch, trong đó nồng độ chất hoà tan cũng đồng thời tăng lên ở bên ngoài tế bào Trong môi trường huyền phù
(vừa thể lòng vừa tỉnh thể) nước rạo thành băng đá một cách từ từ và bên trong tế bào sẽ mất nước để duy trì sự cân bằng áp suất thảm thấu với bên ngoài tế bào,
mọi trao đổi chất của tế bào ngừng hoạt động, tế bào sống tiềm sinh Như vậy,
sự hiện diện của tỉnh thể nước đá nội bào và những hiệu ứng của dung dịch là hai yếu tố chủ yếu chuyển biến theo tốc độ đông lạnh để quyết định khả năng sống
sót của tế bào
Theo Mazur (1977), cho biết những hiện tượng vật lý chính xảy ra trong
quá trình đông lạnh tế bào khi nhiệt độ hạ xuống -5°C, tế bào và môi trường xung quanh chưa đóng băng bời vì nhiệt độ lạnh chưa rạo đá (supercooling) va vi sự giảm điểm đông do sự có mặt của chất bảo vệ lạnh Tỉnh thể nước sẽ hình thành bên ngoài tế bào ờ nhiệt độ -5°C đến -15°C (do ngầu nhiên hay do rạo mầm nước - seeding), nhưng các chất bên trong tế bào vẫn chưa đông lạnh và nhiệt độ
lạnh chưa rạo đá, có thể do màng tỉnh thanh ngăn cản sự lan rộng tỉnh thé nước
Trang 23trong tế bào có nồng độ hoá học cao hơn so với nước trong dung dịch được đông
lạnh một phần bên ngoài tế bào, và đáp lại sự chênh lệch này, nước sẽ đi ra ngồi tế bào và đơng lạnh bên ngoài tế bào
Tốc độ làm lạnh ảnh hưởng đến các hiện tượng vật lý xy ra tiếp theo bên trong tế bào Nếu nhiệt độ giảm chậm, tế bào có khả năng mất nước nhanh do
ngoại thẩm rhấu làm tăng nồng độ các chất nội bào đủ để loại bò nhỉ
chưa tạo đá và duy trì tiểm năng các chất hoá học nội bào cân bằng với tiềm năng
các chất hoá học ngoại bào Kết quả là tế bào mất nước và không đông lạnh bên trong tế bào Nhưng nếu tế bào được đông lạnh quá nhanh, nó không có khả năng
mất nước nhanh để duy trì cân bằng, vì vậy nhiệt độ lạnh chưa rạo đá
(supercolling) tăng lên và cuối cùng đạt được sự cân bằng bằng việc đông lạnh
nội bào
C6 nhiều chất bảo vệ lạnh được sử dụng với các nông độ khác nhau và thường được dùng kết hợp với nhau Những chất bảo vệ lạnh được dùng phổ biến hiện nay gồm glycerol va dimethylsulphoxide (DMSO) va mot số giycol (ethylene glycol, propylene glycol )
Glycerol (C,H, (OH),) có phân tử lượng 92; có tính độc nhẹ, có tác dụng
như một chất chống đông; có khả năng thẩm thấu cao qua màng tế bào, hoà tan
trong nước và cồn Trong quá trình cân bằng, glycerol xâm nhập vào bên trong tế
bào thay thế các phân tử nước thấm xuất ra ngoài tế bào làm cho tế bào không bị giảm dung tích Khi vào bên trong tế bào, các phân tử glyeerol nằm xen kế với các phân tử nước, nên nước đóng băng ở dạng nhỏ, loại trừ được sự giãn nở của
tỉnh thể nước có kích thước lớn, ngăn cản được sự phá vỡ màng và tế bào Vì vậy
mà glycerol giữ được sự ổn định về nồng độ của các chất hoà ran, không làm thay
đổi áp suất thảm thấu và hạn chế sự phá huỷ protein của tế bào trong quá trình
đông lạnh Để phôi có thể cân bằng với glycerol, người ra chuyển phôi vào dung
Trang 24dịch PBS có nồng độ glycerol tăng dân trong một khoảng thời gian nhất định để
thực hiện quá trình rút nước nội bào và thay thé bang glycerol
Eirhylene glyeol có phân tử lượng thấp hơn (62,07) so với của glycerol
(92,10), chất này có tác dụng tương tự glycerol và có thể dùng thay thế cho
glyeerol trong đông lạnh phôi bò Ưu điểm của việc dùng ethylene glycol rong đông lạnh phôi bò là khi giải đông không cần rút chất này ra khỏi phôi bò theo các bước mà chất này tự thẩm xuất ra ngoài (Docchi và cs 1995, Voelkel va Hu,
1992)
Nguyen và es (2000) đã báo cáo rằng khi sử dụng 60% ethylene glycol
trong dung dịch PBS để đông lạnh, tỷ lệ phôi sống và tỷ phôi thốt màng sau giải đơng tương ứng là 78% và 55% Tuy nhiên, khi các tác giả này kết hợp làm mất nước một phân và sử dụng 39% ethylene glycol, 0,7M suerose và 8,6% fileoll, tỷ lệ phôi sống và tỷ phơi thốt màng sau giải đông ương ứng là 77% va 85%
Hadler và es (1997) đã đông lạnh phôi bò tạo ra trong ống nghiệm trong dung dịch PBS có nồng độ 1,4M glycerol hay 1,5M erhylene glyeol Sau khi giải
đông và nuôi 72 giờ, tỷ lệ phơi thốt màng tương ứng là 69,2% và 62,4%
Dimerhylsulfoxide (DMSO) cũng là chất bảo vệ lạnh có phân tử lượng thấp
(78,13) Chất này lần đầu tiên duge Wilmut va Rowson (1973) sử dụng để đông
lạnh phôi bò Tuy nhiên, nhiều tác giả đã nhận thấy rằng, có sự khác nhau vẻ khả năng thẩm thấu của chất bảo vệ lạnh giữa phôi của các loài và đối với phôi bò thì glycerol có khả năng thẩm thấu tốt hơn DMSO Vì thế, đến cuối những năm
1970, glycerol được dùng nhiều hơn DMSO trong việc đông lạnh phôi bò
Đường (suerose, laetose) và protein (bovine serum albumin, hyaluronie acid) cũng được dùng như những chất bảo vệ lạnh nhưng chúng thường được dùng với các chất bảo vệ lạnh khác
Kasai (1996) đã tổng kết rằng, các phòng thí nghiệm trên thế giới có thể sử
Trang 25ahu dimethyl sulphoside, acetamide, propylene glycol, glycerol, ethylene glycol, polyethylene glycol, BSA, sucrose, tebalose và glucose với các nông độ khác nhau để đông lạnh phôi đông vật có vú
Theo Bui Xuan Nguyen (1997), việc sử dụng các chất bảo vệ lạnh và khả năng sống của phôi đông lạnh có sự khác nhau giữac các loài Đối với thỏ, khả năng sống của phôi đông lạnh trong hỗn hợp suerose và giyeerol hay DMSO rất thấp (0-5%) so với đông lạnh bằng propaneol (92%) Đối với phôi dâu-phôi nang bò, sử dụng chất bảo vệ lạnh propaneol tốt hơn so với sử dụng glycerol (75% so với 0%) Trong khi đó, phôi bò được đông lạnh trong hỗn hợp chất bảo vệ lạnh
sucrose-glycerol cé ty lé sống cao hơn so với trong hỗn hợp sucrose-propaneoL
(65% so với 0%) Sự khác biệt vẻ khả năng sống của phôi khi sử dụng các chất bảo vệ lạnh khác nhau giữa các loài khác vấn chưa được rõ
'Với quan điểm sinh học lạnh, các tế bào phôi không khác biệt với các loại tế bào sống khác Điều quan trọng nhất của quá trình đông lạnh là loại bỏ nước
nội bào trước khi chúng được đông lạnh Đã có nhiều nghiên cứu về kỹ thuật
đông lạnh bao gồm loại chất bảo vệ lạnh và nồng độ sử dụng của chúng, tốc độ
hạ nhiệt độ, nhiệt độ tạo đá và nhiệt độ chuyển phôi sang nitơ lòng cũng như nhiệt độ và tốc độ giải đông (Renard và cs 1982; Lehn-Tensen, 1983; Franks và
cs 1986; Prather va cs 1987; Renard và cs 1984; Nguyen và cs 2000)
Các nghiên cứu trước đây, đông lạnh phôi có thể chia làm 2 phương pháp: đông lạnh chậm và đông lạnh nhanh Đông lạnh chậm là phương pháp mà ở đó
quá trình làm mất nước nội bào và việc hạ nhiệt độ có kiểm soát xảy ra chậm
trước khi phôi được chuyển vào bảo quản trong nirơ lòng Đối với phương pháp đông lạnh chậm, phôi được chuyển vào môi trường có chất bảo vệ lạnh theo
nhiêu bước với nông độ chất bảo vệ lạnh tăng dàn hay chuyển thẳng vào môi
trường có nồng độ chất bảo vệ lạnh thích hợp Thời gian cân bằng trong phương
pháp này thường 10-30 phút Sau khi cân bằng, phôi được đông lạnh với tốc độ
Trang 26hạ nhiệt 0,3°C/phút xuống nhiệt độ -32°C hay -35°C và từ nhiệt độ này phôi
được chuyển vào nitơ lòng (-196°C) để bảo quản Ví dụ: chuyển phôi vào dung
dịch glycerol 6 bước với nông độ tăng đần (0,25M; 0,5M; 0,75M; 1,0M; 125M
và 1,5M) hay 3 bước (0,47M; 0,93M; 1,4M glycerol) và thời gian cân bằng ờ mỗi
bước khoảng 5 phút hay 1 bước vào dung dịch 1,8M ethylene glycol va can bang 15 phút Sau đó cọng rạ chứa phôi được chuyển ngay vào máy đông lạnh và việc
tạo đá được rhực hiện ở nhiệt độ ~3°C đến —7°C Tạo tỉnh thể đá (seeding) là thuật
ngữ dùng để mô tả việc hình thành đá có kiểm soát ở nhiệt độ lạnh, bằng cách chạm panh đã được nhúng trước vào nirơ lòng vào thành của cọng rạ Ngay sau khi tạo tỉnh thể đá, đá sẽ được hình thành nhanh chóng trong toàn bộ cọng rạ
chứa phôi, và việc hạ nhiệt độ vẫn được thực hiện với tốc độ 0,3°C/phút xuống —
345C, rừ nhiệt độ này, phôi được chuyển vào nitơ lòng để bảo quản (Saitoh va cs
1995)
Phương pháp đông lạnh nhanh là những phương pháp đông lạnh mà thời gian từ lúc khử nước nội bào đến lúc kết thúc quá trình đông lạnh xẩy ra rất nhanh Phôi sau khi đã được khử nước nội bào được chuyển thẳng vào niơ lông mà không cần phải sử dụng máy đông lạnh có kiểm soát nhiệt đã được lập trình
sẵn
Nguyen và es (1984) đã đẻ xuất một khả năng đông lạnh nhanh hay siêu
nhanh trên cơ sở thay thế việc mất nước tăng dân bởi nhiệt độ thấp bằng mất nước bộ phận nhanh ở nhiệt độ phòng Dựa trên nguyên tắc
pháp đông lạnh nhanh, đơn
mất nước một phần (1-2 phúp) ở nhiệt độ phòng và cân bằng ở nhiệt độ -300C đã này, một phương in trong nơ lòng được thực hiện bằng cách làm được công bố
Một trong những phương pháp đông lạnh nhanh được nghiên cứu rộng rãi
là phương pháp thuỷ tỉnh hoá (virifieation) Thuỷ tỉnh hoá là thuật ngữ chỉ quá
Trang 27hoà tan như trong các phương pháp đông lạnh truyền thống; có sự tăng đột ngột sự đặc quánh (viscovity) trong môi trường lưu phôi, rạo nên chất rắn dạng thuỷ
tỉnh Phương pháp đông lạnh thuỷ tỉnh hoá làn đầu được Rall và Fahy (1985) đẻ
xuất Sau đó phương pháp này đã được nhiều tác giả nghiên cứu thành công để đông lạnh phôi đông vật có vi (Pugh và cs 2000, Kasai 2002, Atabay va cs 2004, Diez và cs 2005) ưu điểm của phương pháp này là thời gian đông lạnh
nhanh, không cần thiết bị đông lạnh đất tiên và điều quan trọng là tỷ lệ sống của phôi sau khi đông lạnh-giải đông cao Gần đây TS George E Seidel, Colorado State University) da nghién cứu cải tiến phương pháp đông lạnh thủy tỉnh thể(Vitrification method) phôi bò cực nhanh bằng sử dụng Syngrod (Bioniche Animal Health) + 0.1% (w/v) polyvinyl alcohol, Ethylene Glycol(EG), Galactose Thời gian cân bằng ở nhiệt độ phòng trong vòng 45 giây,cọng rạ chứa
phôi được khử nước một phần trên hơi Nitơ lòng trong 1 phút với mục đích nâng
cao tỷ lệ phôi sống sau đông lạnh, giải đông
1.4 Giải đông phôi
Té bao phôi đông lạnh được bảo quản trong nitơ lòng ~196°C, trước khi sử
dụng, tế bào phôi phải được phục hồi sự sống trong điều kiện bình thường ở rạng
thái ban đâu, không có tỉnh thể nước đá và không có chất bảo vệ lạnh ở trong và ngồi tế bào phơi; tế bào phôi tiếp tục sống và phát triển trong điều kiện mới
Nhìn chung, tế bào phôi từ trạng rhái sinh học bình thường chuyển sang trạng
thái sinh học tiểm sinh lạnh (196°C) rồi lại trờ về trạng thái sinh học bình thường của môi trường, sức sống của tế bào phôi có thể bị giảm đi rất nhiều, số
lượng tế bào phôi chết có thể tăng lên
Vẻ nguyên tắc, việc tách chất bảo vệ lạnh khỏi tế bào phôi phụ thuộc vào
phương pháp đông lạnh và bổ sung chất bảo vệ lạnh Trong các quy trình pha
Trang 28loãng chất bảo vệ lạnh thông thường, phôi được tiếp xúc với nồng độ chất bảo vệ lạnh giảm dân (Lehn-Jensen, 1983, Franks và cs 1986, Prather và cs 1987) Quá trình này đời hỏi phải sử dụng kính hiển vi và thao tác trong phòng thí nghiệm Đâu những năm 1980, một số tác giả đã nghiên cứu phương pháp giải đông mới thay thế cho phương pháp giải đông nhiều bước (Renard và cs 1982) ở phương pháp này, phỏi bò đông lạnh-giải đông được chuyển từ môi trường có chất bảo vệ
lạnh sang môi trường ưu trương có các chất dinh dưỡng không thẩm thấu như sucrose Khi quá trình này xảy ra, các chất bảo vệ lạnh nội bào thảm thấu ra
ngồi phơi để duy trì sự cân bằng áp suất thẩm thấu Khi phôi không còn chứa
các chất bảo vệ lạnh nội bào nữa, nó co lại tới một thể tích do áp xuất thảm thấu
của dung dịch sucrose và phỏi nhanh chóng được pha lỗng trong mơi trường
đẳng trương Ngày nay cùng với phương pháp đông lạnh cải tiến, phương pháp giải đông phôi trở nên đơn giản,đễ ứng dụng vào sản xuất và thuận lợi hon rất nhiều so với trước đây
1.5 Môi trường đông lạnh tỉnh
"Trên cơ sở nghiên cứu về sinh lý, sinh hóa, khả năng sống của tỉnh trùng trong,
mơi trường bên ngồi cơ thể sống, khả năng chịu sốc lạnh với chất bảo quản lạnh,
các nha khoa học trên thế giới đã nghiên cứu và đưa ra những hoá chất cơ bản để thiết lập môi trường đông lạnh tinh dịch: chất cung cấp năng lượng (đường Saccharid), chất đệm (tihydroxymerhylaminomethane), lòng đỗ trứng, chất chống đóng băng (Cryoprorecranr) như glycerol
II TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRÊN THÊ GIỚI VÀ TRONG NƯỚC
2.1 Tðnh hỡnh nghiờn cũu trờn thũ gii
Ngày nay, công nghệ sinh học đang trở thành một động lực thúc đẩy sự
Trang 29đại sẽ tạo ra những bước nhảy vọt về năng suất, chất lượng giống cây trồng, vật
nuôi Nó không những tạo ra các giống năng suất cao, chất lượng tốt mà còn thích nghi với điều kiện môi trường sinh thái khác nhau Cấy truyền phôi và những kỹ thuật liên quan là công nghệ sinh học sinh sản hiện đại được rất nhiều
nhà khoa học trên thế giới quan tâm nghiên cứu và ứng dụng trong chăn nuôi Từ sau thí nghiệm của Heape (1890) về cấy truyền phôi trên thỏ được công bố,
nghiên cứu cấy truyền phôi trên gia súc như dê, cừu, lợn, trâu, bò đã được
nghiên cứu ứng dụng thành công ở nhiều nước
Cấy truyền phôi động vật có vú thành công đầu tiên được coi là của
Walter Heap Năm 1890, Heap đã cấy chuyển phôi thỏ Angora 4 tế bào vào thỏ cái BỈ đã được phối giống, kết quả đã sinh ra 4 thỏ BỈ và 2 thỏ con Angora Trong giai đoạn này, những hiểu biết rõ hơn vẻ mối liên hệ giữa tuyến yên và buông trứng đã đưa đến những tiến bộ đáng kể trong công nghệ sinh sản Sự phát
triển của các kỹ thuật gây rụng rrứng nhiều (GRTN), gây động dục đồng pha và
thụ tinh nhân tạo (TTNT) đã đưa đến thành công về CTP trong những năm 1930
và 1940 ở một số loài, nhưng chưa thành công ở loai bd Mac dia Umbaugh (1949) cũng đã báo cáo 4 trường hợp có chửa ở Texas từ cấy truyền phôi bò năm 1949, nhưng tất cả con nhận phôi đã sảy thai trước khi đẻ Năm 1951, con bê đầu tiên do CTP đã sinh ra sau khi cấy bằng phẫu thuật phôi bò 5 ngày tuổi được lấy
từ bò giết ở lò mổ
Công nghệ cấy truyền phôi (CTP) phát triển nhanh chóng cuối những năm 1970, bao gồm cả số lượng kỹ thuật viên và số bò cho phôi Tuy nhiên, đầu
những năm 1980 do chưa nghiên cứu vẻ đông lạnh và giải đông phôi, số phôi thu được nhiều, số bò động dục đồng pha ít, số phôi cấy không hết sẽ lãng phí, vì
vậy đã phải duy trì một số lượng lớn bò nhận phôi để tất cả phỏi ở ngày thu phôi sẽ được cấy cho bò nhận phôi Sau khi triển khai có hiệu quả các phương pháp
Trang 30đông lanh phoi, sir dung dimethyl sulfoside hay glycerol lam chất bảo vệ lạnh,
CTP trở thành một công nạh:
u quả hơn, mà không còn phụ thuộc vào số bò nhận phôi nữa Thành công đầu tiên của việc đông lạnh phôi động vật có vú được báo cáo ở chuột (Whittingham 1971) Năm 1973, con bê đầu riên ra đời bằng phôi đông lạnh - giải đông (Wilmut và Rowson) Từ đó đến nay, đã có nhiều tác giả nghiên cứu cải tiến các phương pháp đông lạnh truyền thống (Renard và cs 1982; Lehn-Jensen, 1983; Franks va cs 1986; Prather va cs 1987; Renard va cs 1984; Nguyen và cs 2000)
Những tiến bộ gần đây trong đông lạnh tế bào trứng và phôi động vật có vú
đã đạt được bằng phương pháp đông lạnh thể thuỷ tỉnh (virrification) Phương
pháp đông lạnh thể thuỷ tỉnh lần đầu được Rall và Fahy (1985) đẻ xuất Sau đó phương pháp này luôn luôn được nghiên cứu cải tiến của nhiều tác giả để nâng
cao tỷ lệ sống của phôi động vật có vú đông lạnh (Pugh và cs 2000, Kasai 2002,
Atabay va cs 2004, Diez và cs 2005)
Từ những năm 1970 đến những năm 1990 có rất ít báo cáo vẻ bảo quản
lạnh tế bào trứng ở giai đoạn thành thục hay tiền nhân (chỉ có một báo cáo của Sehellander và es 1988 vẻ thụ tỉnh ống nghiệm những tế bào trứng bò được bảo quản lạnh) Gân đây, đã có nhiều báo cáo về sự thành công của bảo quản lạnh tế
bào trứng của một số động vật có vú như ở chuột (Horamisligil va cs 1996; Men và cs 1997), ờ bò (Schellamder và cs 1994) và ở người (Quinn và cs 1996) Hầu
hết các tác giả trên đều sử dụng chất bảo vệ lạnh là glyeerol, ethylene glycol, propylene glycol Các phương pháp đông lạnh thường được áp dụng phổ biến là
đông lạnh chạm 3 bước, một bước trên máy đông lạnh đã được lập trình sẵn,
phương pháp đông lạnh không cần máy đông lạnh gôm có phương pháp đông lạnh thuỷ tỉnh thể (viuifieation), phương pháp đông lạnh vi giọt (mierodrop)
(Kasai M 2002; Papis và cs 2000; Lazar và cs 2000)
Trang 31Những nghiên cứu vẻ môi trường đông lạnh tỉnh dịch bò sữa được tiến
hành từ 1917 do các tác gid ngudi Nga L Ivanov V.K Milovanov (1934) là
những người đầu tiên đưa ra cơ sở khoa học và thực nghiệm vẻ pha lỗng và bảo tơn tỉnh địch với dung dich diéa gidi (NaCl, KCI ) Phillips (1940), Salisbury
(1943) cải tiến mơi trường pha lỗng và bảo tồn với long dd trứng gà, Na-Citrate
Từ đó các nghiên cứu vẻ môi trường đông lạnh tỉnh dịch bò sữa phát triển không ngừng và xuất hiện những công ty khổng lô, xuyên quốc gia tham gia vừa nghiên cứu vừa áp dụng những tiến bộ khoa học vào sản xuất như: Hãng Minitub của
Cộng hoà liên bang Đức, Hãng IVM của Cộng hoà Pháp Năm 1974 hãng
Minirub sáng chế ra môi trường đông lạnh tỉnh dịch Triladil dạng dung dịch đóng
gói sẵn Năm 1992 sáng chế ra môi trường Biladil và hiện nay là AndroMed Hãng IMV sáng chế ra Bio xcell-CSS® vv
'Vẻ thành phần hoá học của môi trường đông lạnh tỉnh dịch mỗi công ty đều có bản quyền riêng vẻ thành phản, công thức pha chế phù hợp với điều kiện của họ và họ liên tục cải tiến nhằm càng ngày càng có những môi trường đông lạnh tỉnh
dịch bò sữa hoàn thiện hơn Tuy vậy những hoá chất cơ bản để thiết lập môi trường
đông lạnh tỉnh dịch trên thế giới thường có: chất cung cấp năng lượng (đường sacharid), chất đệm (rihydroxymethylaminomethane), lòng đỗ trứng, chất chống đóng băng (cryoprotectant) như glycerol
"Trên thế giới, thụ tỉnh ống nghiệm ở gia súc đã được nghiên cứu tir những
năm đầu của thế kỷ trước và con thỏ đầu tiên ra đời bằng kỹ thuật này vào năm
1959, em bé thụ tỉnh ống nghiệm đầu tiên ra đời năm 1978 ở Anh và con bê thụ tỉnh ống nghiệm đâu tiên ra đời năm 1981 tại Mỹ Năm 1999, số phôi tạo ra trong ống nghiệm đã đạt tới con số 31.000 Khoảng 10.000 phôi thụ tỉnh ống
nghiệm sử dụng tế bào trứng nuôi chín trong ống nghiệm từ bò đen Nhật Bản giết thịt được cấy và 2600 bê được sinh trong năm 2001 để làm bò vỗ béo giết thịt
Trang 32Đến năm 2003, đã có 106.220 ca cấy phỏi tạo ra trong ống nghiệm (Thiber 2004)
Ở giai đoạn đầu của kỹ thuật tạo phôi trong ống nghiệm, nguồn tế bào trứng là buồng trứng lấy ở lò mổ Giờ đây, tế bào trứng của những con cho có giá trị được lấy thường xuyên hơn từ gia súc sống bằng việc thu tế bào trứng với sự
trợ giúp của máy siêu âm qua âm đạo (OPU) Kỹ thuật thu tế bào trứng bằng việc
đưa kim vào buồng trứng qua âm đạo nhờ hướng dẫn của hệ thống siêu âm đã được một số tác giả nghiên cứu (Pieters và cs 1988; Irvine và cs 1993; Walron va cs 1993; Kruip va cs 1994; Stubbings va cs 1995; Konishi va cs 1996; Guyader va cs 1999; Hwang va cs 1997; Goodhaad va cs 1999; Goodhaad va cs 1999; Goodhand va cs 2000; Galli va cs 2001; Reis va cs 2002; Henrique va cs 2004; De Roover va cs 2005; Rizos va cs 2005)
Đối với sản xuất phôi bò thịt, theo Arlotto va cs ( 2001), nghiên cứu ứng dụng TTON nhằm phát triển hệ thống sản xuất phôi bò thịt ở quy mô lớn ngày càng được chú ý phát triển Kĩ thuật kết hợp tiền kích thích buồng trứng bằng Gonadotropin với thu trứng bằng siêu âm (ovum pick-up) và TTON cũng đã cho kết quả khả quan để sản xuât phôi bò thịt và phôi lai các giồng thịt-sữa, với tỉ lệ
thu trứng đạt 55 - 81% , tỉ lệ phôi nang đạt 30% (Amstrong ves, 1994; Rover ves, 2008) Thí nghiệm so sánh hiệu quản TTƠN giữa các giống bò sữa Holstein
Friesian , bò thịt Belgian Blue beef' của một số tác giả cho thấy tỉ lệ phôi bò thịt
phát triển thành phôi nang có thể cao hon so với phôi bò sữa ( 179% sv 49%) (Leroy ves, 2005) Kết quả tương tự cũng được thông báo trong trường hợp phôi
TTON với tỉnh của giống bò đen (Japanese Black) với trứng bò sữa so với phôi bò sữa thuần (27% so với 20%; Boediono, 2003)
Trang 33công mới về chế độ và môi trường nuôi thành thục trứng, nuôi phdi in vitro, 4p dụng các kĩ thuật siêu âm khai thác trứng, công nghệ sản xuất phôi bằng thụ tình ống nghiệm, công nghệ đông lạnh tỉnh, phôi đông và cấy truyền phôi dang thé
hiện vai trò trung tâm; ngoài việc nâng cao hiệu quả công tác chọn lọc nhân
giống, các công nghệ này góp phần cải tiến tình trạng mang thai và sinh sản của bò thông qua việc ứng dụng liên hoàn các phương thức quản lý và kĩ thuật khác (Arlotto ves, 2001; Hansnen ves, 2006)
2.2 Nghiờn cñu trong nữc
Ở Việt Nam, năm 1978 đã có một số tác giả tại Trung tâm Khoa học Tự
nhiên và Công nghệ Quốc gia bắt đầu nghiên cứu cấy truyền phôi trên thỏ, những con thỏ đầu tiên ra đời bằng công nghệ cấy truyền phôi vào năm 1979 (Bùi Xuân
Nguyên và Nguyễn Thị Ước) Từ năm 1980, các rác này cũng đã bất đầu nghiên cứu cấy truyền phôi trên bò Từ năm 1989, rại Viện Chăn nuôi, Bộ môn Cấy
truyền phôi đã được thành lập Từ đó đến nay, cấy truyền phôi đã được nhà nước
hỗ trợ kinh phí bằng các đẻ tài 470-10-107 (1981-1985), 520-01013 (1986- 1990), KC-08-16 (1991-1995), với sự chủ trì của Viện Công Nghệ Sinh Học - Viện Khoa Học Việt Nam và sự tham gia của Trường ĐH Nông nghiệp I, Viện Quân Y 103, Viện Chăn nuôi và một số cơ quan khác Đề tài KC-04-11 giai đoạn 2001-2004 đã được thực hiện với sự chủ trì của Viện Chăn nuôi và sự tham gia của trường ĐH Khoa học Tự nhiên TP Hồ Chí Minh, ĐH Nông Lâm TP Hồ Chí Minh, ĐH Thái Nguyên, Trung tam công nghệ phôi - Viện Quân Y và nhiều cơ
quan khác Năm 1986, con bê đầu tiên ở nước ra cũng được ra đời từ công nghệ
này Năm 1994, bò sinh đôi trong đó có một bê do trứng rụng tự nhiên trong chu
kỳ động dục và một bê do cấy truyền phôi Đây là trường hợp bê đầu tiên sinh ra
ở nước ra do cán bộ Viện Chăn nuôi quốc gia thực hiện cấy uyên phôi Ngày 3/3/2002, cặp bê cái sinh đôi từ một phôi cắt thành 2 phôi đã ra đời Day là thành
Trang 34công dau tiên ở Việt Nam vẻ công nghệ cloning từ tế bào phôi Ngày 14/1/2004, con bê đầu tiên từ phôi thụ tỉnh ống nghiệm do cán bộ nghiên cứu Viện Chăn quôi quốc gia thực hiện đã sinh ra Trong những năm qua công nghệ phôi đã đạt
được một số kết quả sau: Số phôi thu được đạt 3,6 phôi/bò/lần thu phôi và 15
phôi/bò/năm; rỷ lệ động dục đạt 59,43%, tỷ lệ có chửa đạt 38% và tỷ lệ đẻ đạt 25,32% Những kết quả trên đây chứng tò rằng chúng ta đã tiếp cận thành công Công nghệ sinh học sinh sẵn của động vật
Ở Việt Nam, nghiên cứu đông lạnh phôi bò đã được nghiên cứu từ năm 1984 Phương pháp đông lạnh nhanh (tốc độ hạ nhiệt 12°C/phút) sau khi khử
nước bộ phận ở nhiệt độ hiện trường trên phôi bò đã thành công (Bùi Xuân Nguyên và cs 1984) Năm 2003, Lưu Công Khánh và cs nghiên cứu tỷ lệ sống
của phôi đông lạnh-giải đông đạt 73,24% và đã báo cáo thành công việc nghiên cứu ứng dụng đông lạnh chậm phôi bò bằng glycerol Năm 1990, bê Charolais đầu tiên được sinh ra từ phôi đông lạnh nhập khẩu Đến nay đã có hàng wim bê
hướng sữa được sinh ra do cấy phôi đông lạnh trong nước cũng như phôi đông
lạnh nhập khẩu
Thy tinh ống nghiệm (TTON) tế bào trứng bò rhu từ buồng trứng lò mổ đã
được nghiên cứu từ năm 1994, con bê thụ tỉnh ống nghiệm sinh ra tại Viện Công
nghệ sinh học và 8 bê thụ tỉnh ống nghiệm sinh ra tại Việt Nam (Bùi Xuân
Nguyên và cs 1994, 1997; Nguyễn Thị Ước và cs 1996, 1999, 2003; Nguyễn
Hữu Đức và cs 1996, 2003, 2005; Nguyễn Văn Lý và cs 2003, 2004, 2005,
2006) Tỷ lệ thụ tỉnh đạt 54,14% và tỷ lệ tạo phôi trong ống nghiệm đạt 30,78%
Nghiên cứu hàm lượng P4 bằng kỹ thuật ELA Bước đầu đã xác định được động thái 4 ở bò sinh sản bình thường, bò chậm sinh và chẩn đoán có thai sớm sau 21 - 23
phối giống (Phan Văn Kiểm va cs nam 2001 — 2005)
Từ năm 2005, tại Viện Chăn nuôi bắt đầu nghiên cứu ứng dụng siêu âm
Trang 35một số kết quả đáng khích lệ với 4 tế bào trứng rhu đượclần siêu âm từ một bò cái
© Viet Nam, nghiên cứu vẻ đông lạnh tế bào trứng bò chưa có nhiều báo
cáo, nghiên cứu vẻ môi trường đông lạnh tỉnh dịch bò sữa từ trước đến nay chúng 1a chủ yếu áp dụng các môi trường có sẵn nhập ngoại hoặc theo các công thức đã có để sản xuất tỉnh viên hay tỉnh cọng rạ bò sữa, bò rhịt
Từ những năm 1998 trờ vẻ trước, Trung tâm đông lạnh Moneada chủ yếu sản xuất tỉnh đông lạnh dạng viên bằng môi trường đông lạnh theo quy rrình va hoá chất do Cuba cung cấp Sau giải đông sức hoạt động của rỉnh trùng thường đạt 30% Từ năm 1998, nhờ những tiến bộ kỹ thuật và do nhu cầu của sản xuất, Trung tâm đông lạnh Moncada đã chuyển sang sin xuất tỉnh đông lạnh dạng cọng bằng môi trường đông lạnh tỉnh bò nhập từ hãng Miaitub của Đức là Triladil Từ năm 2001 đến nay, với sự giúp đỡ của tổ chức JICA Nhật bản, Trung, tam đông lạnh Moncada đã tự phối chế được môi trường đông lạnh tỉnh trùng theo công thức của Nhật Bản LIAJ1 Sau đông lạnh-giải đông, sức hoạt động của tỉnh trùng đạt 40% và tỷ lệ loại thải giảm từ 34% năm 2001 xuống 1,84% năm 2005 Tuy nhiên, gân đây tại Nhật Bản đã áp dụng hai loại môi trường đông lạnh tỉnh trùng mới là LIAJ2 và LIAJ3 ưu điểm của 2 loại môi trường này là giá thành đã giảm được 2/3 do không sử dụng những loại hoá chất đất tiền
"Trong công nghệ phôi, công nghệ tỉnh bò từ năm 2005 hẳu như chưa có một
cải tiến nào đáng kể về quy trình sản xuất phôi invivo và phôi invitro, đông lạnh
phôi, môi trường sản xuất tỉnh đông lạnh trên bò sữa Với mức độ thành công
trước đây sản xuất phôi invivo với số lượng phôi trung bình thu được từ một bò
cho phôi chỉ dao động từ 2,4-3,6 phôi/lần thu phôi/ bò, mặt khác phải dé cho bò
nghỉ 2-3 tháng rồi mới tiếp tục gây rụng trứng nhiều lặp lại, như vậy một năm chỉ tiến hành thu phôi 3-4 lần / bò và số phôi thu được bình quân/bò/năm chỉ đạt 15
Trang 36phôi Để khai thác được tiềm năng sinh sản của bò cái chúng tôi nghiên cứu cải tiến quy trình gây rụng trứng nhiều lập lại trên bò sữa với để nâng cao được số
phôi thu được/bò/năm
Trude đây nghiên cứu về tạo phôi trong ống nghiệm bằng nguồn trứng lấy
ở lò mổ mục đích hoàn thành vẻ phương pháp, nhưng chưa có ý nghĩa trong sản xuất, vì chưa tạo được nguồn phôi từ những giống tốt, giống cao sản, với nội dung nghiên cứu cải tiến quy trình sản xuất phôi trong ống nghiệm một cách
hoàn chỉnh, bằng nguồn trứng lấy siêu âm trên bò sồng dé tao được nguồn phôi
từ bò năng xuất cao có ý nghĩa kinh tế và ý nghĩa khoa học
Để nâng cao tỷ lệ có chửa trong công nghệ cấy truyền phôi, việc gây động
dục đồng pha cho bò nhân phôi là một trong những khâu kỹ thuật quan trọng đã và đang được các nhà nghiên cứu quan tâm Cùng với kỹ thuật định lượng
hormone Progesterone (P4) để chẩn đoán có chửa sớm ở bò nhận phôi đã góp phần xác định kết quả có thai sớm ở bò sau 21 ngày là những chỉ số tin cậy để chẵn đoán sớm có chửa ở bò nhân phôi
Mục đích của gây động dục đồng pha (GĐDĐP) là tạo ra được nhiều bò nhận phôi động dục cùng thời gian động dục với bò cho phôi (nếu cấy phôi tươi) hoặc phù hợp với tuổi của phôi (nếu cấy phôi đông lạnh) Trong công nghệ cấy truyền phôi, kỹ thuật GĐDĐP giữa cái cho phôi và cái nhận phôi là vô cùng quan
trọng Kỹ thuật gây đồng pha càng tốt, hiệu quả cấy truyền phôi càng cao
Cải tiến quy trình đông lạnh phôi và quy trình sản xuất tỉnh đông lạnh sẽ uâng cao được tỷ lệ phôi sống sau đông lạnh, giải đông và chủ động được môi trường sản xuất nh đông lạnh góp phần nâng cao được hiệu quả kinh tế trong chăn nuôi bò sữa
Vì vậy chúng tôi tiến hành đề tài :“ Nghiên cứu cải tiễn tổ hợp công nghệ
Trang 37PHAN II
NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1.NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
Ndi dung 1: Nghiờn cũu củi tin cung nghÏŨ phụi bũ sĨla 1.1 Nghiên cứu cải tiến công nghệ sản xuất phôi in vivo 1.2 Nghiên cứu cải tiến công nghệ sản xuất phôi in vitro
1.3 Nghiên cứu cải tiến gây động dục đồng pha cho bò nhận phôi
NŨi dung 2: Nghiờn cỳu chỉ tin cụng nghĩ Qung nh phui bii sla
2.1 Nghiên cứu cải tiến công nghệ đông lạnh phôi in vivo, phôi in vitro
2.2 Bước đầu thử nghiệm đông lạnh trứng bò
Ndi dung 3: Nghion clu mui tring sn xullt tinh ba sila Dụng lŨnh dĨng cũng rũ
3.1 Nghiên cứu thử nghiệm 3 loại môi trường pha lỗng đơng lạnh tỉnh cọng rạ LIAI 1, LIA1 2 và LIA1 3 và sản xuất thử nghiệm tỉnh đông lạnh dạng cọng rạ 3.2 So sánh thành phan hóa học và giá thành của 3 loại môi trường LIA1I,
LIAJ2 va LIAJ 3
Ndi dung 4: Cung nghĩ phụi bũ thÚt
4.1 Thử nghiệm sản xuất phôi bò thịt bằng tổ họp công nghệ thụ tỉnh ống nghiệm và các công nghệ hộ trợ sinh sản liên quan
4.2 Đông lạnh phôi, nghiên cứu khả năng tạo ngân hàng phôi bò thịt thích hợp nhu cẩu nhân giống lâu dài
4.3 Nghiên cứu tổ chức cấy phôi
Trang 38Il PHUONG PHAP NGHIEN CUU
2.1 Nội dung 1: NGHIÊN CỨU CẢI TIẾN CÔNG NGHỆ PHÔI BÒ SỮA 2.1.1 Cải tiến công nghệ sản xuất phôi # vào
* Nâng cao khả năng tạo phôi invivo ở bò sữa bằng kỹ thuật gây rụng trứng
nhiều và thu phôi lặp lại
ÿ Rút ngắn gây rụng trứng nhiều (GRTN)và thu phôi lặp lại từ 2-3 thing xuống 35 ngày/lần/bò
- Chọn bò cho phôi
Bồ cho phôi là những bò sữa F2, F3 có năng suất >50001ír/chu kỳ, có khối lượng >500kg, lứa đẻ từ 2-4, có chu kỳ động dục bình thường, không có khuyết
tật về đường sinh dục, đã được tiêm phòng các bệnh truyền nhiễm Tiến hành
kiểm tra hoạt động của buồng trứng bằng phương pháp khám qua trực trang
Bò GRTN khi động dục được thụ tỉnh nhân tạo bằng tỉnh đông lạnh Tinh dịch phối giống phải lấy từ những đực giống tốt nhất, đặc trưng cho
giống về tính trạng mong muốn như: sản lượng sữa, sản lượng thịt, tính trạng
cao sản ở đực giống phải được di truyền cho thế hệ sau
~ Gây rụng trứng mhiều cho bò cho phôi
Chúng tôi tiến hành GRTTN lặp lại trên bò sử dụng hormone ESH và PGF,„ + Đặt PRID vào xoang âm đạo Ngày đặt là ngày 0 của quy trình
+ Tiêm FSH từ ngày thứ 10 kể từ khi đặt PRID rrong vòng 4 ngày theo liều giảm dân (3 ml; 2,5ml; 2,0ml; 1,5ml lần lượt cho 4 ngày) tiêm bắp FSH cho bo cho phôi vào buổi sáng và buổi chiêu với khoảng cách 12 giờ
+ Ngày thứ 12 tiêm 2ml FSH(sáng, chiếu) và 5ml PGE;¿ (đồng thời rút RID vào buổi sáng)
+ Ngày thứ 13 tiêm 1,5ml FSH( sáng, chiều)
Trang 39lạnh đã được giải đông
+ Thu hoạch phôi vào ngày thứ 7 sau khi phối giống bằng phương pháp không
phẫu thuật,
+ Đánh giá chất lượng phôi sau khi thu hoạch
Ngày thứ 7 ứng với giai đoạn phôi dau và phôi nang Đây là giai đoạn thích hợp cho bảo quản và cấy truyền Những phôi chất lượng tốt và phát triển đúng giai đoạn được sử dụng trong công nghệ cấy phỏi Sau khi thu phôi, tiêm prostaglandin F;„ cho bò thu phôi Sau 14 ngày tiến hành đặt PRID lặp lại quy
trình như trên lần thứ hai
ii) Gay rụng trứng nhiều và thu phôi lặp lại với lần suất 28 ngày (lằn/bò
Phương pháp GRTN trên bò tương tự như trên, nhưng rút ngắn với
khoảng cách là 28 ngày/lần/bò và lặp lại 8 lần /bò/qăm
2.1.2 Cải tiến công nghệ sản xuất phôi in viro bò sữa
* Tạo phôi bò sữa từ tế bào trứng thu trên bò sống bằng phương pháp siêu
âm
Ù Ảnh hưởng của tần xuất và áp xuất chân không đến số lượng và chất lượng
trứng thu được trên bò siu
- Chọn bò sữa E2, F3 có năng suất >5000lít/chu kỳ, có khối lượng >500kg, lứa đẻ từ 2-4, có chu kỳ động dục bình thường, không có khuyết tật về đường sinh dục, đã được tiêm phòng các bệnh truyền nhiễm theo quy định
- Tiến hành thu tế bào trứng bằng phương pháp siêu âm với các áp suất, tân suất khác nhau: áp suất chân không 60mmHg, 90mmHg, 120mmHg và
150mmHg; tần suất 1 lằn/2 tuần, 1 lần/ tuần, 2lằn/tuần
Quá trình siêu âm hút tế bào trứng được thực hiện bằng hệ thống siêu âm,
sử dụng kim 18 G đài 55 em, môi trường hút tế bào trứng (mDPBS của Sigma)
có bổ sung 50 iu/ml heparin và 5% huyết thanh bê và kháng sinh (100.000iu
Trang 40penicilin/ml + 1001 streptomycin/ml) duy trì ở nhiệt độ 37°C bang may én nhiét
Cố định bò, lấy hết phân, rửa sạch và sát khuẩn bằng cén 70” Nhẹ nhàng
cho đầu dò siêu âm có gắn hệ thống dẫn kim vào âm đạo, cho tay qua trực tràng cố định buồng trứng về phía mặt quét của đầu giò, Nhẹ nhàng xoay đưa các nang trứng về vị trí mũi kim, quan sát các nang trứng trên màn hình máy siêu âm và chọc hút dịch nang trứng Trước khi hút dịch nang trứng, hút một ít dung dịch hút trứng để làm trơn hệ thống kim và ống dẫn San khi chọc hút 2 - 4 nang trứng, rút kim ra, hút dung dịch thu tế bào trứng để tế bào trứng chảy vào ống falcon, tiến hành hút lặp lại đến khi không còn nhìn thấy nang trứng nào trên buồng trứng thì chuyển qua buồng trứng đối diện Dịch hút được thu vào ống ly
tâm 50ml và duy trì ở nhiệt độ 37C bằng máy ổn nhiệt San khi hút xong một
buồng trứng, đưa ngay về phòng thí nghiệm, lọc bằng cốc lọc Emcol có đường
kính lỗ lọc 20tưm, khoảng 10ml dung dịch còn lại được chuyển vào đĩa petri vô
trùng có đường kính 90mm để soi tìm, đánh giá, phân loại đưới kính hiển vi soi nổi Những tế bào trướng đủ tiêu chuẩn( loại A,B) được nuôi chín invitrro( Trong ống nghiệm) và thụ tỉnh để tạo phôi trong ống nghiệm(invitro ferlitization)
Đánh giá, phân loại tế bào trứng và phối được theo phương pháp của Sairo và cs.(1995) và theo kinh nghiệm của Bộ môn Cấy truyền phôi- Viện Chăn nuôi
di) Anh hưởng của tiỗi bò đến số lượng và chất lượng té bao tring (TBT ) thu đượcbằng phương pháp siêu âm và tạo phôi trong Ống nghiệm
Thí nghiệm được thực hiện trên bò sữa F2, F3 có năng suất sữa trên 5000 kg stra/chu ky ở 2 độ tuổi khác nhan (bò 3 tuổi và bò 6 tuổi), khám bộ phận sinh sản, buồng trứng chọn bò có bộ phận sinh sản và buồng trứng tốt để