Hoàn thiện công nghệ và hệ thống thiết bị sản xuất sirô fructoza 42phần trăm để sử dụng trong công nghiệp thực phẩm

va Công nghiệp môi trường Trang 2 MO DAU Trên thế giới, công nghệ thuỷ phân tỉnh bột bằng enzym phát triển đã cho phép điều khiển được quá trình thuỷ phân tỉnh bột, tạo ra các loại tỉn

Trang 1

BO KHOA HOC LIÊN HIỆP CÁC HỘI

VÀ CÔNG NGHỆ KHOA HỌC VÀ KỸ THUẬT

Chương trình:“Wgiidên cứu ứng dụng và phái triển công nghệ phục vụ công nghiệp hod,hign đại hóa

nông ngiiệp nông thôn”, mã số: KC07⁄ 06-10

BAO CAO TONG KET

KHOA HOC CONG NGHE

DU AN SAN XUAT THU NGHIEM

Dự án: “Hoàn thiện công nghệ và hệ thông tiết bị

sản xuất sirô Fructoza 42%

để sử dụng trong công nghiệp thực phẩm a

Mã số: KC 07 DA09/ 06 - 10

Tên cơ quan chit tri: Trung tâm Công nghệ thực phẩm

va Công nghiệp môi trường

Trang 2

MO DAU

Trên thế giới, công nghệ thuỷ phân tỉnh bột bằng enzym phát triển đã cho phép điều khiển được quá trình thuỷ phân tỉnh bột, tạo ra các loại tỉnh bột biến

tính, maltodextrin, sirô khác nhau như: Maltoza, glucoza, fructoza Sản xuất sirô

fiuctoza bằng phương pháp enzym qua ba giai đoạn chính Trước tiên, sử dụng

d- amylaza để dịch hoá tỉnh bột, enzym glucoamylaza để đường hóa, cuối cùng

sit dung glucoizomeraza dé đồng phân hoá glucoza thành fructoza Phương pháp thuỷ phân tinh bột bằng enzym đã thu được hiệu suất chuyển hoá cao (> 95 % so với lý thuyết, độ phân cắt chính xác, giảm tạp chất trong sản phẩm Phương pháp đồng phân hoá tạo ra sản phẩm cuối cùng là fructoza với hàm lượng 42- 45

% thích hợp cho việc ứng đụng trong công nghệ nước giải khát, bánh kẹo, kem,

sữa Hàng năm, trên thế giới khoảng 40 triệu tấn sirô fructoza đã được sản xuất, trong đó có tới 50 % sản lượng fuctoza được sử dụng để sản xuất nước

giải khát như: Cocacola, Pepsicola, nước quả tươi, nước giải khát

Ở Việt Nam, các kết quả nghiên cứu về công nghệ còn hạn chế ở quy mô phòng thí nghiệm, chưa có cơ sở nào sản xuất sirô fructoza, nguồn nguyên liệu tỉnh bột sắn nhiều và rẻ hơn các loại tỉnh bột khác Đến nay vẫn chưa hình thành ngành công nghiệp sản xuất sirô fructoza Nhiều nhà máy, xí nghiệp sản xuất nước giải khát, sữa và các sản phẩm của sữa, bánh kẹo có nhu cầu sử dụng siré fructoza phải nhập khẩu Đó là những yếu tố thuận lợi về thị trường nguyên liệu và sản phẩm đồng hành cùng với nhu cầu nghiên cứu và phát triển sản xuất

siré fructoza

Xuất xứ của dự án là đề tài nghiên cứu khoa học và công nghệ cấp Nhà nước: “Nghiên cứu ứng đụng công nghệ em trong chế biến mộ SỐ mông sản thực phẩm” thuộc Chương trình nghiên cứu khoa học và phát triển công

Trang 3

Ngô Tiến Hiển, nguyên Viện trưởng Viện Công nghiệp thực phẩm làm Chủ nhiệm đề tài Để tài đã tập hợp 16 nhà khoa học, các giáo sư, tiến sỹ, trên 100

cán bộ khoa học có trình độ đại học, trên 10 doanh nghiệp tham gia Đề tài đã đạt

được một số kết quả: Xác định 22 qui trình công nghệ, xây dựng 5 mô hình thiết bị, tạo ra 27 sản phẩm hàng hoá, 12 chủng vi sinh vật mới và tái tổ họp ADN, nghiên cứu sinh tổng hợp, thu nhận, ứng dụng 6 nhóm enzym, có 46 công trình công bó, tham gia đào tạo 8 tiến sỹ, 4 thạc sỹ, trên 200 kỹ sư, có 4 hỗ sơ đăng ký giải pháp hữu ích, có 10 hợp đồng chuyển giao công nghệ trị giá 1.353 triệu đồng Đề tài đã được nghiệm thu cấp Nhà nước ngày 05-5-2005, đạt loại A theo quyết định số 213/ QĐÐ- BKHCN ngày 16-02-2006 và được Bộ Khoa học và Công nghệ tặng Bằng khen và giấy Chứng nhận kết quả nổi bật theo Quyết định

số: 2799/ QĐ- BKHCN, ngày 25-12-2006

Một trong số các kết quả đạt được của để tài này là nghiên cứu công nghệ và thiết bị sản xuất fructoza 42% từ glucoza bằng công nghệ enzym Tổng khối lượng sản phẩm các đọt thí nghiệm cộng lại đạt 2000kg Tuy nhiên, về công nghệ thì chưa xác định được các điều kiện tối ưu trong sản xuất thử nghiệm quy mô công nghiệp, về thiết bị còn ở mức độ thô sơ, chưa kiểm soát, điều chỉnh được các thông số kỹ thuật như nhiệt độ, pH, lưu lượng dòng chảy, sản phẩm fructoza 42% chưa trở thành hàng hoá, chất lượng sản phẩm chưa cao, chưa ổn

định, thị trường chưa chấp nhận, chưa xác định được hiệu quả kinh tế, chưa đăng

ký được tiêu chuẩn chất lượng sản phẩm, chưa bảo hộ giải pháp hữu ích, chưa phát triển được các sản phẩm thực phẩm ứng dụng fructoza 42%, chưa phát triển được thị trường tiêu thụ sản phẩm

Trang 4

Mục tiêu

1 Nâng cao giá trị chế biến tỉnh bột sắn, nhân rộng mô hình chuyển giao công nghệ, ồn định và nâng cao chất lượng fructoza ở quy mô công nghiệp bằng công

nghệ enzyme

2 Có được công nghệ và hệ thống thiết bị hoàn thiện để sản xuất sirô fructoza 42% quy mô công nghiệp, sản phẩm được thương mại hố trong cơng nghiệp thực phẩm Nội dung 1 Thực hiện 6 nội đưng xác định các số kỹ thuật t6i wa của quy trink cong nghệ 1.1 Xác định nổng độ và lưu lượng glucoza thích hợp cho quá trình công nghệ đồng phân hoá

1.2 Xác định nhiệt độ và thời gian thích hợp cho quy trình công nghệ đồng phân hoá 1.3 Xác định pH và kỹ thuật điều chỉnh pH thích hợp cho quy trình cơng nghệ

đồng phân hố

1.4 Sản xuất thử nghiệm sirô #uctoza liên tục trong các điều kiện tối ưu 1.5 Xác định hiệu suất tổng thu hồi sản xuất sirô fructoza từ sirô glucoza 1.6 Sử dụng bao bì, bảo quản và phương án vận chuyển sirô fructoza 42% 2 Nghiên cứu hoàn thiện 16 quy trùnh công nghệ

2.1 Quy trình công nghệ làm sạch nguyên liệu

2.2 Quy trình công nghệ tẩy trắng nguyên liệu glucoza 2.3 Quy trình công nghệ hồ hóa

2.4 Quy trình công nghệ địch hóa 2.5 Quy trình công nghệ đường hóa

Trang 5

2.7 Quy trình vệ sinh va bảo dưỡng thiết bị hỗ hoá, dịch hoá, đường hố quy mơ sản xuất công nghiệp 30 tấn/ ngày

2.8 Quy trình phân tích kiểm tra, đo lường, chất lượng nguyên liệu

2.9 Quy trình phân tích kiểm tra, đo lường, chất lượng bán thành phẩm và sản phẩm

2.10 Quy trình công nghệ làm sạch nguyên liệu sirô glucoza

2.11 Quy trình công nghệ đồng phân hóa liên tục bằng công nghệ enzym

2.12 Quy trình công nghệ bảo quản enzym

2.13 Quy trình công nghệ cô đặc sirô ftructoza 42 %

2.14 Quy trình công nghệ bảo quản sản phẩm

2.15 Quy trình vận hành hệ thống thiết bị hồ hoá, dịch hoá và đường hoá quy mô sản xuất công nghiệp 30 tấn/ ngày

2.16 Quy trình công nghệ vận hành, vệ sinh và bảo dưỡng hệ thống thiết bị đồng phân 3 Xây đựng 6 tài liệu, đào tạo, lurớng đẫn va te van kỹ tưuật

3.1 Tài liệu đào tạo công nghệ vi sinh trong công nghiệp thực phẩm 3.2 Tài liệu đào tạo về công nghệ enzym trong công nghiệp thực phẩm

3.3 Tài liệu đào tạo về công nghệ sản xuất sạch hon trong công nghiệp thực phẩm 3.4 Tài liệu hướng dẫn, tư vấn đầu tư công nghệ và thiết bị giảm thiểu ô nhiễm

môi truờng trong công nghiệp đường bột

3.5 Tài liệu hướng dẫn, tư vấn đầu tư một số giải pháp về công nghệ và thiết bị sản xuất sạch hơn trong công nghiệp đường bột

3.6 Tài liệu hướng dẫn, tư vấn đâu tư xử lý chất thải trong công nghiệp đường bội 4 Xây đựng mô hình thiết bị đồng bộ san xudt siré fractoza 42%

5 Xây đựng 2 bằng tiêu chuẩn chất lượng

3.1 Bảng tiêu chuẩn chất lượng enzym dịch hoá, đường hoa va déng phan hoa

Trang 6

6 Sản xuất tuừ nghiệm sân pham hang hod siré fractoza 42 %

7 Ung dung siré fructoza 42 % trong công nghiệp thực phẩm (6 sản phẩm

sing dung)

7.1 Ung dung fructoza 42 % trong công nghiệp sản xuất sữa

7.2 Ứng dung fructoza 42 % trong công nghiệp sản xuất bánh tươi hoặc bánh quy 7.3 Ứng dụng fuctoza42 % trong công nghiệp sản xuất kem

7.4, Ung dung fructoza 42 % trong công nghiệp sản xuất kẹo

7.5 Ứng dụng fructoza42 % trong công nghiệp sản xuất đồ uống 7.6 Ung dung fructoza 42 % trong sản xuất thực phẩm chức năng

8 Các sản phẩm Khoa học và công nghệ khác 8.1 Đào tạo sau đại học

8.2 Bảo hộ Giải pháp hữu ích

8.3 Công trình công bố

8.4 Tham gia Hội chợ Asean 5+3, Hội thảo Quốc tế, ký hợp đồng nguyên tắc và chuyển giao công nghệ

Trang 7

CHUONG I TONG QUAN TAI LIEU

1.1, Sén va tinh bột sắn

1.1.1 Vài nét về cây sắn

Cây sắn, còn gọi là cây khoai mì (Manihot esculenta Crantz), tiéng Anh 1a cassava hay con gọi là tapioca hoặc manioc, là một trong số những loại cây có củ được trồng ở hơn 80 quốc gia có khí hậu nhiệt đới, nóng ẩm trên thế giới Đây là cây lương thực và thực phẩm có hàm lượng tỉnh bột cao Đối với nhiều người dân ở vùng nhiệt đới, sắn là sản phẩm chủ đạo và là cây cứu đói truyền thống Sản lượng sắn hàng năm trên thế giới khoảng 175 triệu tấn với diện tích canh tác 14,15 triệu hécta phân bó trên 80 quốc gia Ở các nước nhiệt đới, hầu hết sắn sản xuất ra được sử dụng làm thức ăn cho người, phần còn lại được dùng để làm thức

ăn gia súc và sử dụng trong công nghiệp tỉnh bột [1, 19]

1.1.2 Tinh hành sẵn xuất và sử đụng sẵn ở Châu Á và trên toàn cầu

Sắn là loại cây lương thực quan trọng ở các nước nhiệt đới như Brazil,

Nigeria, Thai Lan, Indonesia, Việt Nam Trên 55 % sản lượng sắn của Thái Lan được sử dụng ở dạng sắn lát phơi khô làm thức ăn gia súc, trong đó 90%

được xuất khẩu trực tiếp sang châu Âu, chỉ có 10 % tiêu thụ trong nội địa Dù sản lượng sắn củ tươi chỉ chiếm 18 triệu tấn trên tổng sản lượng toàn cần là 175 triệu tấn, nhưng Thái Lan lại là nước đứng hàng đầu trên thế giới về sản xuất và xuất khẩu tỉnh bột sắn (Hình 1 1)

Trang 8

Án Độ (31,43 tấn/ ha), kế đến là Thái Lan (21,09 tấn/ ha), so với năng suất sắn bình quân của thế giới là 12,16 tắn/ ha (EAO, 2008)

Tình 1.1 Sản lượng tình bột sẵn của một số nước ( x 1000

Viện Nghiên cứu Chính sách lương thực thế giới (EPRI), đã tính toán và

Trang 9

tăng hàng năm là 1,3 %, so với châu Phi là 2,44 % và chau A là 0,84 - 0,96 %

Cây sắn tiếp tục giữ vai trò quan trọng trong nhiều nước châu Á, đặc biệt là các nước vùng Đông Nam Á nơi cây sắn có tổng diện tích đứng thứ ba sau lúa và ngô và tổng sản lượng đứng thứ ba sau lúa và mía Chiều hướng sản xuất sắn phụ thuộc vào khả năng cạnh tranh cây trồng Giải pháp chính là tăng năng suất sắn

bộ [23]

Việt Nam đứng thứ mười trên thế giới về sản lượng sắn (7,71 triệu tấn),

bằng cách áp dụng giống mới và các biện pháp kỹ thuật

nhưng lại là nước xuất khẩu tỉnh bột sắn đứng hàng thứ ba trên thế giới sau Thái

Lan và Indonesia Sản phẩm sắn xuất khẩn của Việt Nam chủ yếu là tỉnh bột, sắn lát và bột sắn Thị trường chính là Trung Quốc, Đài Loan, Nhật Bản, Singapore, Hàn Quốc [1, 23]

Trang 10

tấn Cùng với diện tích sắn được nâng lên, năng suất thu hoạch sắn cũng như sản lượng tinh bột sắn được sản xuất cũng tăng lên theo thời gian Hình 1 mô tả tốc độ tăng trưởng vẻ diện tích trồng sắn, năng suất và sản lượng tỉnh bột sắn của Viét nam Tốc độ phát triển của sản lượng tỉnh bột sắn cao hơn gấp nhiều lần so với sự gia tăng của diện tích trồng sắn (Hình 1.2) 2008 2001 2002 2003 2004 2005 2005 2008 Diện tích (1.000 ha) ® Sản lượng (10.000 tắn) EiNăng suất (100 tắn/ ha)

Hình 1.2 Diện tích, năng suất và sân lượng tùh bột sẵn ở nước fa [11] Ngoài tinh bột sắn, các sản phẩm khác chế biến từ tỉnh bột sn la: Cén,

rượu, bột ngọt, axit glutamic, axit amin, cdc loại tỉnh bột biến tính, maltodextrin, sirô maltoza, glucoza, ftuctoza, đường chức năng, thức ăn gia súc, phân bón hữu cơ vi sinh

1.1.3 Tính bột sắm

1.1.3.1 Đặc tính của lình bật

Tỉnh bột có nhiều ở các loại củ như khoai tây, sắn, củ mài Tỉnh bột có vai

trò dinh dưỡng đặc biệt lớn , được thuỷ phân thành đường glucoza là chất tạo

Trang 11

Trong hat, tinh bét tén tai duéi dạng các hạt có kích thước biến đổi từ 0,02

- 0,12 mm Hạt tỉnh bột của các loại hạt khác nhau có hình dáng và kích thước khác nhau Hạt tỉnh bột khoai tây có kích thước lớn hơn cả, còn hạt tỉnh bột của lúa mỳ có kích thước nhỏ hơn Hạt tỉnh bột lúa mỹ, lúa mạch có cấu tạo đơn giản

còn hat tinh bột ngô có cấu tạo phức tạp Khi tác dụng với iot tỉnh bột có màu rất

đặc trưng Phản ứng này dùng để định tính tỉnh bột [4, 16, 24, 38, 40]

4.1.3.2 Câu tạo của tính bột

Tỉnh bột không phải là một chất riêng biệt, nó bao gồm hai cấu tử là amylose (AM) và amylopectin (AP) AM thường chiếm 12- 25 %, còn AP chiếm 75- 85 % phân tử tỉnh bột [15] CH,OH H ` So Lo H OHO, hw cree CH.OH oer Ôn oe 4 athe

Hinh 1.3 Cau tao cita tinh bột

AM va AP déu la a- polysaccarit va đều do cac géc a- D- glucoza cấu tạo nên AM có trọng lwong phan ti tir 3,10°- 1,10” được cấu tạo từ 200- 2000 gốc D - glucoza Các gốc glucoza nối với nhau bằng liên kết œ- 1,4 glucozit và tạo thành một mạch xoắn dài Cấu trúc xoắn được giữ vững nhờ liên kết hydrô được tạo thành giữa các nhóm OH tự đo

Chiều dài cực đại của phân tử AM đạt tới 7000 A" Mỗi vòng xoắn của mạch AM gồm 3 gốc glucoza và có chiều dai mach 14 10,6 A" Trong dung dịch mạch xoắn của AM co lại, vòng xoắn lớn lên và gồm 6 gốc glucoza [15, 16]

Trang 12

Hình 1.4 Câu trúc cha Amyloza

AP duoc cấu tạo từ 600- 37000 gốc D- glucoza Chúng gắn với nhau bằng các liên kết œ- 1,4 và ơ- 1,6 glucozit Chiều dài trung bình của mạch có nhánh tự do gồm 21- 27 gốc glucoza (có trường hợp chỉ 15- 18 gốc) AP có phân tử lượng

trong khoảng 10’- 10° trong khi phân tử lượng của AM chỉ khoảng 5.107- 10°

Người ta còn thấy một số liên kết a- 1,3 glucozit trong tỉnh bột Trong thành phần của AP còn có một ít phospho (0,012- 0,111 %) Phospho được gắn vào nguyên tử cacbon thứ 6 của gốc glucoza

Hình 1.5 Cấu trúc cha amylopectin 11.3.3 Tink chét aia tinh bot

- Phan tng thuy phan

Một tính chất quan trọng của tỉnh bột là quá trình thủy phân liên kết giữa các đơn vị glucozơ bằng axit hoặc bằng enzym Enzym chỉ thủy phân hiệu quả ở dang hỗ hóa Một số enzym thường dùng là ơ- amylaza, B- amylaza Axit và enzym giống nhau là đều thủy phân các phân tử tỉnh bột bằng cách thủy

phân liên kết œ-D (1,4) glycozit Đặc trưng của phản ứng này là sự giảm nhanh độ nhớt và sinh ra đường [7, 13, 35, 48]

Trang 13

con chon

làm ole

Hình 1.6 Phân ứng thấy phân của tình bột

Các nhóm hydroxyl trong tỉnh bột có thể bị oxi hóa tạo thành andehyt, xeton và tạo thành các nhóm cacboxyl Quá trình này còn làm giảm chiều dài mạch tỉnh bột và tăng khả năng hòa tan trong nước, đặc biệt trong

môi trường loãng Các nhóm hydroxyl trong tỉnh bột có thể tiến hành ete hóa và

este hóa Những nhóm hydroxyl trong tỉnh bột có khả năng phản ứng với

andehyt trong môi trường axit Khi đó xảy ra phản ứng ngưng tụ tạo liên kết ngang giữa các phân tử tỉnh bột gần nhau Sản phẩm tạo thành không có khả

năng tan trong nước [2, 35]

~ Tính hấp trụ của tĩnh bột

Hat tinh bột có cấu tạo lỗ xốp nên khi tương tác với các chất bị hấp thụ thì bề mặt trong và ngoài của tỉnh bột đều tham dự Vì vậy trong quá trình bảo quản, sấy và chế biến cần phải hết sức quan tâm tính chất này Các ion liên kết với tinh bột thường ảnh hưởng đến khả năng hấp thụ của tỉnh bột Khả năng hấp thụ của các loại tinh bột phụ thuộc cấu trúc bên trong của hạt và khả năng

trương nở của chúng

~ hả năng hdp thy neée va kha nang hoa tan cha tink b6t

Xác định khả năng hấp thụ nước và khả năng hòa tan của tỉnh bột cho

Trang 14

phép điều chỉnh được tỉ lệ dung dịch tỉnh bột và nhiệt độ cần thiết trong quá trình công nghiệp, còn có ý nghĩa trong quá trình bảo quản, sấy và chế biến

thủy nhiệt Rất nhiều tính chất chức năng của tỉnh bột phụ thuộc vào tương tác của tỉnh bột và nước (tính chất thủy nhiệt, sự hồ hóa, tạo gel, tạo màng) Ngoài ra, nó cũng là cơ sở để lựa chọn tỉnh bột biến hình thích hợp cho từng ứng dụng cụ thể Ví dụ: Để sản xuất các sản phẩm nước uống hòa tan như cà phê, trà hòa tan thì nên chọn tinh bột biến hình nào có độ hòa tan cao nhất

~ Tính chất hồ hóa của tĩnh bột

Phản lớn tỉnh bột bị hồ hóa khi nấu và trạng thái trương nở được sử dụng nhiều hơn ở trạng thái tự nhiên Các biến đổi hóa lí khi hồ hóa như sau: Hạt tinh bột trương lên, tăng độ trong suốt và độ nhớt, các phân tử mạch thẳng và nhỏ thì hòa tan và sau đó tự liên hợp với nhau để tạo thành gel Tùy điều kiện hồ hóa như nhiệt độ, nguồn gốc tinh bột, kich thước hạt và pH mà nhiệt độ phá vỡ và trương nở của tỉnh bột biến đổi một cách rộng lớn [8, 9, 15]

Một trong những tính chất quan trọng của tỉnh bột có ảnh hưởng đến chất lượng và kết cấu của nhiều sản phẩm thực phẩm đó là độ nhớt và độ dẻo Phân tử tỉnh bột có nhiều nhóm hydroxyl có khả năng liên kết được với nhan

làm cho phân tử tỉnh bột tập họp lại, giữ nhiều nước hơn khiến cho dung địch có

độ đặc, độ dính, độ dẻo và độ nhớt cao hơn Yếu tố chính ảnh hưởng đến độ

nhớt của dung dịch tỉnh bột là các phân tử hoặc của các hạt phân tán, đặc tính

bên trong của tỉnh bột như kích thước, thể tích, cấu trúc và sự bất đối xứng của phân tử Nông độ tinh bột, pH, nhiệt độ, tác nhân oxi hóa, các thuốc thử phá

hủy liên kết hydro đầu làm thay đổi độ nhớt của dung địch tỉnh bột

1.1.3.4 Đặc tính tình bột sắn

Tỉnh bột sắn có màu rất trắng Trong quá trình sản xuất, nếu củ được nghiền khi chưa bóc vỏ, tỉnh bột thu được thường có màu tối Màu xám của tinh

Trang 15

bột sắn ảnh hưởng tới chất lượng cũng như giá cả của sản phẩm Củ sắn và tỉnh bột sắn thường có pH trong khoảng 4,7- 7,0 Còn theo tiêu chuẩn của Mỹ, các loại sắn tốt có pH từ 4,5- 6,5 và độ axit thấp Tỉnh bột sắn tốt được sấy khô tốt cũng có tính di động tốt Tỉnh bột bị hồ hoá biến thành màu trong hơi ngả về xám Tỉnh bột sắn không có mùi đặc trưng, khi hồ hoá dậy mùi đặc trưng dễ phân biệt với các loại tỉnh bột khác Khi hồ hoá, độ nhớt tăng rất nhanh, độ dính rất cao so với tỉnh bột khoai và các loại củ khác

Quan sát bằng kính hiển vi điện tử quét (Scanning Electron Microscope SEM), hạt tỉnh bột sắn có kích thước từ 5 đến 40um với những hạt lớn 25- 35m, hạt nhỏ 5- 15pm va nhiéu hình dạng, chủ yếu là hình tròn, bề mặt nhẫn,

một bên mặt có chỗ lõm hình nón và một núm nhỏ ở giữa Dưới ánh sáng phân

cực, các liên kết ngang với mật độ từ trung bình tới dày đặc có thể thấy rõ

Khi hạt tỉnh bột sắn bị vỡ, có thể quan sát được các rãnh tạo cấu trúc xốp của hạt Các rãnh vô định hình kéo dài từ bề mặt tới tâm của hạt tạo thành các 16 xốp Chính các lỗ xốp này giúp nước thâm nhập làm trương nở tỉnh bột, phá vỡ các liên kết hydro giữa các phân tử trong cấu trúc tỉnh thể tạo điều kiện cho tác dụng phân huỷ của enzym Tỉnh bột sắn có cấu trúc hạt tương đối xóp, liên kết giữa các phần tử trong cấu trúc tỉnh thể yếu, vì vậy nó để bị phân huỷ bởi các tác

nhân như axit và enzym hơn so với các loại tỉnh bột khác như bắp, gạo

Tỉnh bột sắn có hàm lượng amylopectin và phân tử lượng trung bình tương đối cao và hàm lượng amylose nằm trong khoảng 8- 29 %, nhưng nói chung da số các giống sắn có tỷ lệ amyloza 16- 18 % Tinh bột sắn có những tính chất

tương tự các loại tỉnh bột chứa nhiều amylopectin như độ nhớt cao, xu hướng

thoái hoá thấp và độ bền gen cao Hàm lượng amylopectin và amyloza trong tinh bột sắn liên quan tới độ dính của tỉnh bột nấu chín và nhiều tính chất khác trong

các ứng dụng công nghiệp

Trang 16

Tỉnh bột sắn có nhiệt độ hồ hoá trong khoang 58,5- 70 °C so với 56- 66 °C 6 khoai tay va 62 - 72°C ở tỉnh bột ngô Việc tạo ra các dẫn xuất của tỉnh bột nhờ các liên kết ngang hay việc thêm các chất có hoạt tính bề mặt có thể thay đổi nhiệt độ hồ hoá Nhiệt độ hồ hoá cũng ảnh hưởng đến chất lượng nấu của tỉnh bột, nhiệt độ hồ hoá thấp thường làm chất lượng nấu thấp do tinh bột dễ bị phá

vỡ [8, 9, 40]

1 2 Các enzym thủy phân tỉnh bột [27, 37, 53]

Ngoài tác nhân thủy phân là axit và bazơ, sự thuỷ phân tỉnh bột còn được

thực hiện bởi các enzym amylaza từ các nguồn khác nhau Với những ưu điểm vượt trội so với các chất xúc tác hoá học, các chế phẩm enzym được sản xuất ngày càng nhiều và được sử dụng trong hau hết các lĩnh vực kinh tế Một số nước sử dụng nguồn enzym từ thóc mảm, malt đại mạch, phan lon dùng chế phẩm enzym từ việc nuôi cấy các chủng vi sinh vat [5, 34]

Hiện nay có nhiều hãng enzym đã cho ra rất nhiều loại chế phẩm enzym hữu hiệu để ứng dụng trong quá trình thuỷ phân tỉnh bột như hãng NOVO Đan

Mạch, GENENCOR Sử dụng enzym để chế biến tỉnh bột và các nguyên liệu có chứa tỉnh bột đã mở ra những triển vọng mới trong việc phát triển ngành chế biến nông sản, thực phẩm Thị trường enzym toàn cầu đạt khoảng 1,4 ty USD

năm 1996; 1,6 tỷ USD năm 1997 và tăng từ 6,5- 10 % hàng năm Các enzym được

sử dụng trong công nghiệp thực phẩm và công nghiệp biến tính tỉnh bột như

proteaza, amylaza, lipaza, xenlulaza chiếm 70 % tổng khối lượng enzym sử dụng,

trong số đó 60 % hiện được sản xuất ở dạng enzym tái tổ họp Năm 1996, tổng

giá trị các enzym sử dụng trong công nghiệp biến tính tỉnh bột là 156 triệu USD, trong đó ơ- amylaza bền nhiệt, glucoisomeraza glucoamylaza là những enzym

được sử dụng nhiễu nhất [17, 27]

Trang 17

Trong qua trinh san xuất fructoza từ nguyên liệu tinh bột có sử dụng 3 loại

enzym: ơ- amylaza trong quá trình dịch hoá, glucoamylaza trong quá trình đường

hoa va glucoisomeraza trong qua trình đồng phân hoá để chuyển hoá glucoza

thành fruetoza 1.2.1 ø~ aimyluga

Theo danh pháp quốc tế, ơ- amylaza gọi là a- 1,4 glucan-4 glucahydrolaza (EC 3.2.1.1), có khả năng phân cắt các liên kết ơ- 1,4 glucozit trong phan tử polysacarit một cách ngẫu nhiên không theo trật tự nào Do đó ơ- amylaza có thể thuy phan duoc amyloza, amylopectin, glycogen và các sản phẩm trung gian của

quá trình thủy phân Nhưng không có khả năng thủy phân liên kết œ- 1,6 và o- 1,3 glucozit [5, 15, 22]

Amylaza là enzym thủy phân tinh bột, đồng thời là một chế phẩm sinh học được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm, đặc biệt trong sản xuất sirô

chứa olisosacchari, maltoza va giucoza Enzym amylaza được dùng từ lâu đời

theo phương pháp cổ truyền, để thủy phân tinh bột trong sản xuất mạch nha, rượu,

bia, Ngày nay, với các tiến bộ của khoa học kỹ thuật người ta đã sử dụng

phương pháp enzym để thay thế phương pháp axit trước đây trên quy mô công nghiệp ở Mỹ, 75 % sirô và glucoza tỉnh thể được sản xuất bằng phương pháp enzym Việc sử dụng amylaza ngày càng trở nên rộng rãi hơn kể từ khi có ơ- amylaza tính chiết từ một số chủng vi sinh vat nhw Bacillus licheniformis duoc phát hiện là có tính bền nhiệt

ơ- amylaza được phân bố rộng rãi trong các tế bào vi sinh vật Các vi sinh

vật có khả năng sinh tổng hợp a- amylaza 1a cde ching Bacillus (nhu Bacillus acidoaldarius, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis, Bacillus stearo-

thermophilus), Streptomyces aureojacien, Thermophilus vulgaris va mét sé

ching Pseudomonas, Aspergillus, Endomycopsis,

Trang 18

Cae a- amylaza thu nhận từ xạ khuẩn và nấm men có hoạt lực không cao, vì vậy phần lớn nghiên cứu được tập trung vào ơ- amylaza của nấm mốc va vi khuẩn ơ- amylaza có trong nước bọt, hạt hoà thảo, đặc biệt có rất nhiều trong chế phẩm nuôi cấy nắm mốc, vi khuẩn Nhiều vi sinh vật có khả năng tổng hợp ơ- amylaza, nhưng phổ biến nhất là các chủng vi khudn Bacillus va cdc chủng ndém méc Aspergillus, Rhizopus Xa khuaén va nam men Endomycopsis citing có khả năng tổng hợp ơ- amylaza, tuy nhiên hoạt độ a- amylaza của chúng không

cao [21, 22]

ơ- amylaza của nấm mốc: Được chia làm 2 loại: Chịu axit và kém chịu axit, thường hoạt động ở pH axit ơ- amylaza của nắm mốc lần đầu tiên được phát hiện từ chủng Aspergillus oryzae Sau này người ta tìm thấy A miger, A awamori, Rhizopus ulencer, R nevear cing có khả năng tông hợp ơ- amylaza

d- amylaza của vi kh ược chia làm 2 loại: Chịu nhiệt và kém chịu nhiệt,

thường hoạt động ở pH trung tính hoặc kiểm nhẹ ơ- amylaza của vi khuẩn là loại bên với nhiệt nhất so với các loại a- amylaza sinh ra từ các chủng vi sinh vật khác

a- amylaza cha ching Bacillus stearothermophilus, ở nhiệt độ 50- 60 °C bị mắt hoạt tính sau 24 giờ; ở 90 °C giảm hoạt lực 17 % sau 6 phút trong khi a- amylaza của

ching Bacillus subtilis bi mat hoat lyc hoan tồn

Trong cơng nghiệp, ơ- amylaza của vi khuẩn được sử dụng rộng rãi nhất vì

nó thường không có độc tố, lại có hoạt lực cao và chịu được nhiệt độ cao, trong khi œ- amylaza của nấm mốc bj mat hoat tinh ngay sau khi hé hoa Bacillus 1a

giống vi khuẩn có khả năng tổng hợp ơ- amylaza mạnh nhất và có ý nghĩa trong công nghiệp, nhất là Bacillus subtilis, B coagulans, B stearothermophilus, B

licheniformis

ơ- amylaza từ các chủng vi sinh vật khác nhan có nhiễu tính chất giống nhau nhưng cũng có các tính chất khác nhau Chúng giống nhau chủ yếu về tính

Trang 19

năng tác dụng với cơ chất nhưng lại rất khác nhau về khả năng bền vững với nhiệt độ và pH, đồng thời các sản phẩm thuỷ phân cơ chất của chúng cũng rất

khác nhan

ơ- amylaza có bản chất là protein nên tan được trong nước và không bị

phân hủy bởi proteaza a- amylaza con được gọi là enzym kim loại vì trong phân

tử của enzym có ít nhất là 1 ion Ca'” nằm ở trung tâm hoạt động Số lượng ion Ca” trong phân tử enzym, mức độ liên kết của các ion Ca'” với protein rất khác nhau và phụ thuộc vào nguồn gốc của từng loại d- amylaza Tất cả các enzym ơ- amylaza đều chứa từ 1- 30 nguyên tử Ca””/ mol enzym Hoạt lực của enzym không thay đổi khi thay thế tất cả các ion Ca'” bằng ion Mg””, loại trừ ion Ca” ở

trung tâm hoạt động Khi tách ion Ca`” ra khỏi enzym bing EDTA thì enzym bị

mắt khả năng hoạt động, không còn khả năng thủy phân cơ chất và bị biến tính

khi đun nóng, đặc biệt bị thủy phân bỏi proteaza Vì vậy, ion Ca” đóng vai trò

quan trọng trong việc duy trì cấu trúc phân tử cũng như khả năng hoạt động của

enzym này

Tất cả các d- amylaza đều có khả năng phân hủy nhanh chóng phân tử tỉnh

bột, làm thay đổi màu của iot và giảm độ nhớt của tỉnh bột một cách nhanh chóng Các sản phẩm thủy phân của ơ- amylaza là maltoza, oligosaccharid, maltotrioza va

các dextrin phân tử thấp œ- amylaza tác động rất yếu lên các dextrin phân tử thấp như maltotrioza và đặc biệt yếu hon nữa là maltoza ơ- amylaza phân hủy amylopectin thanh cdc dextrin có chứa 4 hoặc nhiều hơn gốc glucoza bằng các liên két a- 1,6 glucozit, maltoza va glucoza

1.2.2 Glucoamylaza (AMG)

Theo danh pháp quốc té, glucoamylaza con goi 1a a- 1,4 glucan

glucohydrolaza, amyloglucozidaza, y- amylaza Glucoamylaza có khả năng thủy

Trang 20

của phân tử tỉnh bột từ đầu không khử Ngoài ra, glucoamylaza còn có khả năng

phân cắt mối liên kết ơ- 1,6 và ơ- 1,3 glucozit nhưng với tốc độ chậm hơn

Giucoamylaza được sinh tổng hợp từ các chủng méc Aspergillus niger, Aspergillus awamori hay Rhizopus Glucoamylaza có nguồn gốc từ nắm mốc có tính bền nhiệt cao nhưng thường hay lẫn enzym transglucozidaza Đó là một

enzym chuyển nhóm giucozit thành oligosaccharid (quá trình chuyển hoá ngược) Vì vậy, để thu nhận được glucoamylaza không lẫn transglucozidaza cần

phải phân lập và tuyển chọn giống để loại bỏ enzym này

Hầu hết các glucoamylaza đều có đầy đủ 20 axit amin không thay thế Tùy thuộc vào loại glucoamylaza của các chủng khác nhau mà số lượng axit amin

cũng khác nhau

pH và nhiệt độ là 2 yếu tố ảnh hưởng mạnh đến hoạt độ của enzym pH tối ưu cho hoạt động của các glucoamylaza là 3,3- 3,5 Đa số glucoamylaza của nắm mốc

-Asnergillus hoạt động tối thích ở 60 °C Glucoamylaza hồn tồn bị vơ hoạt ở 70 °C

Tất cả các glucoamylaza của nắm mốc đều là glucoprotein có chứa trong phân tử từ 5- 20 % hydratcacbon, trong đó chủ yếu là glucoza, glucoamin, maltoza và galactoza Trọng lượng phân tử của glucoamylaza nắm mốc vào

khoảng 26.850- 112.000 dalton Chúng đều có chứa các amino axit: Metionin, triptophan va cistein

Glucoamylaza khéng thay phân tỉnh bột ở dạng keo, vì thế cơ chất của

glucoamylaza là sản phẩm dịch thủy phân tỉnh bột của a- amylaza Kha ning

thủy phân của glucoamylaza lén các cơ chất cũng khác nhan Theo Fleming,

glucoamylaza được chia làm 2 nhóm:

Nhóm 1: Thủy phân hoàn toàn tỉnh bột và - dextrin Nhóm 2: Thủy phân 80 % tỉnh bột và 40 % B- dextrin

Vận tốc thủy phân phụ thuộc vào độ dài và cấu trúc phân tử của các cơ chất

Trang 21

1.2.3, Glucoisomeraza

Sản phẩm cuối cùng của quá trình thuỷ phân tỉnh bột là glucoza Giai đoạn tiếp theo là quá trình chuyển hố gÌucoza thành fructoza bằng enzym gluco-

isomeraza

Glucoisomeraza 1a chất xúc tác của phản ứng chuyển hoá D- glucoza thành D- fructoza trong điều kiện chuẩn (pH, nhiệt độ, nồng độ cơ chất, nồng độ enzym) Sau quá trình đồng phân sản phẩm tạo thành là #uctoza ở dạng vòng và

dạng thẳng

Glucoisomeraza theo danh pháp quốc tế được gọi là D- xylose- keto- izomeraza (EC 5.3.1.5) Glucoisomeraza có tác dụng xúc tác phản ứng chuyển hoá glucoza thành fuctoza Dưới tác dụng của glucoisomeraza nhóm andehit

(CHO) trong phân tử glucoza chuyển thành nhóm (C = O) trong phân tử fructoza cm SHOM Enzym glucoisomeraza =————ễ` #——— | —#m Hoon CH.,OH CHOH D- Glucoza D- Fructoza CH,OH CHOH_O CHOH note 4 ~~ ` ' Enzym glucoisomeraza ny Hộ đồn HOH Hon on 4 on Glucofuranoza Fructofuranoza

Hình 1.7 Chuyên hod glucoza thank fructoza bang enzyme glucoisomeraza (glucoza va fructoza ở đụng mạch thang va dang mach vòng)

Trang 22

Glucoisomeraza được thu nhận chủ yếu từ vi sinh vật, phổ biến nhất là các ching vi khuan Bacillus, phổ biến là: Bacillus megaterium, B coagulans, B

stearothermophiles

Nhóm xạ khuẩn có khả năng sinh tổng hợp glucoisomeraza mạnh nhất và có ý nghĩa công nghiệp nhất gồm: Streptomyces albus, S fradiae, S olivaceus, S olivochromgenes Các ching xạ khuẩn Streptomyces, Lactobacillus, Pseudomonas, cing có khả nang téng hop glucoisomeraza nhung enzym téng

hợp từ những chủng này kém manh mé va khéng bén nhiét, Takasaki da phan lap

duoc hai ching xa khudn Streptomyces albus và S bikiniensts ti dét, cé kha năng tổng hợp glucoisomeraza trên môi trường chứa là xylan [22]

Glucoisomeraza được thu nhận từ các nguồn khác nhan có tính chất giống, nhau nhưng cũng có tính chất khác nhau Đa số các chủng vi sinh vật có khả năng tổng hợp glucoisomeraza đều đòi hỏi môi trường có D- xyloza làm nguồn cacbon Ngoài ra các chủng xạ khuẩn có thể tổng hợp glucoisomeraza trên môi trường chứa xylan như rơm ra, ba mia, vé tréu

Glucoisomeraza có bản chất là protein Song enzym thu được nhận từ nguồn khác nhau có hàm lượng axit amin trong phân tử khác nhan Đa số

glucoisomeraza đều giàu alanin, leucin và glixin

Nhiệt độ hoạt động của glucoisomeraza thay đổi trong khoảng 45- 90 "C

ví dụ như 7 ðzeviz hoạt động ở 45 °C, § murius 6 60 °C, Actinoplanes,

Missourtensis ở 90 °C Glucoisomeraza thu nhận từ nguồn khác nhau có nhiệt độ hoạt động khác nhau Hầu hết glucoisomeraza hoạt động tốt 50- 65 °C va pH 6,5

- 8,0 [8, 9]

Enzym này cần ion kim loại như Mg ?*, Mn ?* hay Co ?* tùy theo nguồn

gốc của nó Do enzym này có độ bền nhiệt tốt nên phản ứng có thể tiến hành ở nhiệt độ từ 60-70 °C trong vòng 100h

Trang 23

1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của enzym [3, 16, 17, 18]

Trong quá trình thuỷ phân tỉnh bột, tốc độ phản ứng phụ thuộc vào sự hình thành liên kết enzym- tinh bột Liên kết này do sự hấp thụ lẫn nhan giữa các

nhóm háo nước có trên bề mặt của các hạt tỉnh bột và enzym như [ - COOH], [- OH], [ - COO], [NH;], [ - SH] Các nhóm này khi tác dụng với nhau sẽ làm giảm

năng lượng bề mặt, làm biến dạng các phan riéng biệt của phân tử amyloza và amylopectin, dẫn đến làm đứt các liên kết glucozit để tạo sản phẩm và giải phóng enzym Trạng thái này phụ thuộc vào: nồng độ enzym, cơ chất, nhiệt độ, pH mồi trường, các ion kim loại, các họp chất vô cơ và hữu cơ

1.3.1 Nông độ cơ chất

Nông độ tỉnh bột có ảnh hưởng rõ rệt đến cơ cấu sản phẩm thuỷ phân Khi nồng độ dịch bột thấp thì khả năng thuỷ phân của a- amylaza tăng, sản phẩm chủ yếu là dextrin phân tử thấp Ngược lại, nếu tác nhân thuỷ phân là ñ- amylaza, khi

dịch tỉnh bột đặc, lượng đường maltoza thu được sẽ nhiều hơn so với dịch tỉnh

bột loãng, vì điều kiện này thuận lợi cho hoạt động của enzym

Ka sy

Hình 1.8 Dụng chưng của đường biểu điễn sự phụ thuộc vào vận tốc phân ứng và nồng độ cơ chất

1.3.2 Nông độ engym

Khi nồng độ enzym quá lớn (bão hoà với nồng độ cơ chất), nếu tiếp tục tăng nỗng độ enzym thì vận tốc phản ứng tăng chậm hoặc không thay đổi Vì vậy, cần tìm nồng độ thích hợp để sử dụng, tránh lãng phí enzym

Trang 24

Néu thay déi néng 46 enzym, thanh phan va tinh chất dịch thuỷ phân sẽ

thay đổi, nhờ vậy có thể điều chỉnh cơ cấu sản phẩm sau thuỷ phân bằng cách này Sự thay đổi tính chất của dịch đường là nhân tố quyết định để sản xuất loại sản phẩm này hay sản phẩm khác

1.3.3 Ảnh hưởng của các chat kim ham

Hoạt độ enzym có thể bị thay đổi dưới tác dụng của một số chất có bản chất hoá học khác nhan Các chất làm giảm hoạt độ của enzym nhưng không bị chuyển hoá bởi enzym được gọi là các chất kìm hãm hay là các chất ức chế, thường ký hiệu là I (Inhibitor) Cac chat nay có thể là những ion, phân tử vô cơ, hữu cơ, kể cả protein

Các chất gây biến tính protein là những chất kìm hãm không đặc hiệu của enzym Nhiều chất khác không làm biến tính protein enzym nhưng vẫn làm giảm hoạt động xúc tác của nó theo cơ chế khác [4, 16]

Các chất này có thể kìm hãm thuận nghịch hoặc không thuận nghịch enzym Nếu là kiểu kìm hãm thuận nghịch, phản ứng kết hợp giữa enzym (E) và

chất kìm hãm (1) nhanh chóng đạt đến cân bằng:

Ki

xi SH 2

Trong trường hợp kìm hãm không thuận nghịch, k rat bé c6 thé xem như bằng 0, khi I kết hợp với E bằng liên kết đồng hoá trị hoặc kết hợp rất chặt chế đến mức khó lòng tách khỏi E, sự phân ly phức EI là rất chậm

1.3.4 Ảnh hưởng của các chất hoạt hóa

Các chất hoạt hoá làm tăng hoạt độ xúc tác của enzym Các chất hoạt hoá thường có bản chất khác nhan, có thể là các anion, các ion kim loại nằm từ õ thứ

1 đến ô thứ 55 của bảng nguyên tố tuần hoàn Mendeleev hoặc các chất hữu cơ có

cấu tạo phức tạp hơn làm nhiệm vụ chuyển nhóm chuyển hydro hoặc những chất

Trang 25

có khả năng phá vỡ một số liên kết trong phan tir tién enzym hoặc các chất có tác dụng phục hỏi nhóm chức năng trong trung tâm hoạt động của enzym Tuy nhiên

tác dụng hoạt hoá chỉ có giới hạn ở những nỗng độ xác định, vượt quá giới hạn

này có thể làm giảm hoạt độ của enzym

Một số chất hoạt hoá có thể kết hợp trực tiếp với phân tử enzym, làm thay đổi cấu tạo không gian của nó theo hướng có lợi cho hoạt động xúc tác của enzym Một số chất hoạt hoá khác có thể tác dụng theo cách gián tiếp như loại trừ các yếu tố gây kìm hãm khỏi môi trường phản ứng

1.3.5 Nhiệt độ và thời gian phân ứng

Enzym có nguồn gốc khác nhau thì khả năng chịu nhiệt sẽ khác nhan, trong đó enzym từ vi khuẩn có khả năng chịu nhiệt cao hơn so với các nguồn khác Enzym a- amylaza tir Bacillus licheniformis hoat động tốt ở 105 "C và én

định theo thời gian phản ứng Trong khi đó nhiệt độ hoạt động của a- amylaza ở thóc mắm là 73- 76 °C, còn ơ- amylaza của 4sp oryzae 1450-55 °C

Trang 26

Nhiệt độ tối ưu còn phụ thuộc vào thời gian phản ứng Thời gian dài sẽ làm giảm khả năng chịu nhiệt của enzym Ngoài ra còn phụ thuộc vào pH cia môi trường và tăng cùng với pH trong giới hạn nhiệt độ nhất định Tuy nhiên,

ngay cả khi enzym hoạt động ở các điều kiện tối ưu thì cũng chỉ thể hiện hoạt độ

cao trong khoảng thời gian nhất định Vượt quá thời gian này thì hoạt lực của

enzym yéu dan và dẫn đến bị vô hoạt [51]

Nhìn chung, sự tác động đồng thời của các yếu tố: nồng độ cơ chất, pH, thời gian phản ứng có ảnh hưởng nhất định đến đặc tính bền nhiệt của enzym Nhu vay, điều chỉnh nhiệt độ để điều hoà sản phẩm của phản ứng thuỷ phan tinh

bột là giải pháp công nghệ hoàn toàn thực hiện được 1.3.6 pH

pH có ảnh hưởng lớn tới vận tốc phản ứng enzym, mỗi enzym chỉ hoạt động thích hợp nhất ở một pH xác định gọi là pH hoạt động tối thích của enzym (pH¿„) pH tối thích của đa số enzym nằm trong khoảng pH từ 5- 9, chỉ có một số enzym có pH hoạt động tối thích nằm trong vùng axit mạnh hoặc kiểm mạnh

(pH,„ của tripxin 5- 9; pepxin 1,8 — 2,2 ) Enzym từ các nguồn khác nhau cũng

Trang 27

1.4 Fructoza

1.4.1 Giới thiệu về fractoma

Fructoza 1a mét đường đơn tự nhiên, có trong nhiều thực phẩm và đồ uống, rau tươi, quả chín và mật ong Khi kết tỉnh fructoza có hình kim, tỉnh thể của nó

ngậm một phân tử nước: 2C;H¡;O¿.H;O Fructoza và các loại đường khác là nguồn

năng lượng quan trọng của cơ thể

Các loại đường khác nhan thường gặp trong thực phẩm và đồ uống [21, 45]: - Lactoza la disacarit gồm glucoza và galactoza trong sữa

- Maltoza là disacarit gồm 2 phân tử glucoza

- Dextroza (glucoza) sản xuất từ tỉnh bột, đường mía, đường củ cải đường - High Eructose Corn Sirup (HECS) là hỗn hợp glucoza và fructoza sản xuất từ tinh bột ngô

- Fructoza là loại đường quả, có nhiều trong quả chín và ran, đặc biệt trong,

mật ong 40%

1.4.1.1 Cấu tạo của fuctoza

Quá trình vòng hoá do nhóm chức xeton của cacbon ở vị trí thứ hai tạo

Trang 28

14.1.2 Tinh chét cia fructoza Fructoza tinh khiết ở dạng tinh thé có dang mau trắng, vị ngọt gấp 1,7 lần độ ngọt của saccaroza Do sự có mặt của nhiều nhóm hydroxyl trong phan tử nên fuctoza dễ tan trong nước và không tan trong các dung mơi hữu cơ Hố tính quan trọng của fiuctoza là tính chất của nhóm chức

xeton [44]

1.4.2, Tink hink nghién citu sin xudt sird fructoza

1.4.2.1 Trên thê giới

Quá trình thuỷ phân tinh bột bằng enzym được bắt dau trén quy mô công

nghiệp từ những năm 1950 Rechard O.Marshall và Earl R.Kooi là những người

đầu tiên sản xuất được sirô fructoza ngô nồng độ cao, tiếng Anh là High Fructose Com Sirup (HECS) vào năm 1957 [29] Đến năm 1960 một khối lượng lớn glucoza tinh thể đã được sản xuất và tiêu thụ rộng rãi trên thị trường, còn sirô fiuctoza là một để tài lớn đang được nghiên cứu Trên thế giới mới chỉ có Clinton Corn processing Co của Mỹ là cơ sở sản xuất sirô fiuctoza trên quy mô

công nghiệp Năm 1967 hàm lượng frutoza mới chỉ có 15 %, đến năm 1968 thì hàm lượng fructoza đạt 42 % [50, 52] Các nhà khoa học Nhật Bản nghiên cứu

tinh chế fructoza vào năm 1970 Từ đó HECS được sản xuất với mức độ tăng trưởng rất cao và được ứng dụng rất rộng rãi trong thực phẩm và đồ uống, đặc

biệt ở Mỹ trong những năm 1975-1985 Năm1972 khi enzym glucoisomeraza

sản xuất trên quy mô lớn và được cố định trên một chất mang thì sản lượng sirô fructoza tang lên rất nhanh ở nhiễu nơi trên thế giới Năm 1985 Canada đã sản xuất được 220.000 tấn, Nhật Bản sản xuất được 585.000 tấn, các nước Châu Âu sản lượng sirô fuctoza đạt 350.000 tấn Ở Mỹ từ những năm 1976 sản lượng đường fuctoza sản xuất được nhiều hơn 2,3 triệu tắn năm và tổng sản lượng đường tinh bột (sirô fructoza, sirô glucoza, glucoza tỉnh thể) đạt 26 % tổng sản lượng đường của cả nước [47, 48, 51] Trong những năm 90 sản lượng sirô

Trang 29

fructoza tăng 5 triệu tấn/ năm và tổng sản lượng đường tỉnh bột đạt 67% sản

lượng đường cả nước [51]

Trén thị trường thế giới, sirô fructoza 42 % được sử dụng nhiều nhất Đây

là sirô có độ ngọt tương đương với đường kính, trong thành phần sirô có 40- 42 % fiuctoza, 50- 52 % glucoza và 5- 8 % các loại đường khác Từ sirô fructoza 42

9% có thể sản xuất sirô fuctoza 55 % có độ ngọt cao hơn [28, 30] Có 3 loại

HECS thương phẩm trên thị trường là: HECS 90 %, HFCS 55 % và HECS 42 % tương ứng với hàm lượng fructoza là 90 %, 55 % và 42 % [36, 44, 46]

1.4.2.2 Trong nước

Ở Việt Nam hiện nay chưa có nhà máy, công ty nào ngồi Cơng ty cổ phần Thực phẩm Minh Dương, Hoài Đức, Hà Nội sản xuất được sirô fructoza Trong công nghiệp thực phẩm vẫn phải thường xuyên nhập khẩn fuctoza để thay thế đường mía saccaroza

1.4.3 Giá trị đùnh đưỡng của fructoza 143.1 GIlả gì?

Glycemic Index (GD) là chỉ số phản ánh tốc độ làm tăng đường huyết sau 3- 4 giờ ăn các thực phẩm giàu chất bột đường Chất bột đường hiện diện ở hau hết các loại thực phẩm chúng ta dùng hàng ngày như: Cơm, bún, bánh mỳ và ngay cả trong sữa công thức dành cho trẻ em đang lớn Chỉ số GI của 1 thực phẩm được phân loại: thấp, trung bình hoặc cao Thực phẩm có chỉ số GI cao thường chứa đường glucoza hấp thụ nhanh Điều đó có nghĩa là sau khi ăn các loại thực phẩm này thì mức đường glucoza trong máu sẽ tăng vọt lên rất nhanh, nhưng cũng giảm nhanh ngay sau đó Trong khi đó, các thực phẩm có chỉ số GI thấp sẽ tốt hơn vì mức đường huyết được tăng lên từ từ, và cũng giảm xuống từ từ, giúp cho cơ thể giữ được nguồn năng lượng ổn định, có lợi hơn cho sức khoẻ

và trí não [44,45]

Trang 30

1.4.3.2 Lợi Ích về dinh dưỡng của fiucloza

Có nhiều lợi ích khi sử dụng HECS thay cho saccaroza [46] HFCS rẻ hơn

saccaroza vì được sản xuất từ ngô thay thế saccaroza mà Mỹ phải nhập khẩu HECS dễ dàng vận chuyển vì là chất lỏng HECS cũng là sản phẩm có chất lượng bền vững, ổn định Mật ong, đường saccaroza và HECS có cùng năng

lượng trung bình 4 kcalo/ gram chất khô

William Duffy tac gia cuốn “Sugar Blues? cho rằng: Saccaroza có liên quan đến bệnh tiểu đường Đường máu vượt quá cao có thể dẫn đến bệnh tiểu đường loại I Nếu đường kính quá nguy hiểm, dù là số lượng ít thì người bệnh tiểu đường và những người có nguy cơ mắc bệnh tiểu đường tuýp II hãy sử dụng

các chất ngọt tự nhiên từ quả chín, mật ong có chứa đường fiuctoza HECS chứa

fiuctoza, không chứa saccaroza Trong cơ thể saccaroza được thuỷ phân thành

glucoza va fructoza Nhưng trao đổi chất giucoza cần insulin để vận chuyển

glueoza máu vào tế bào dùng làm năng lượng

Fructoza tinh thể ngọt hơn các loại đường khác, có lợi về mặt tiết kiệm năng lượng, có quá trình trao đổi chất độc lập với insulin, được đùng trong dé an kiêng, cho người bệnh đái tháo đường, có chỉ số Glycemic Index rất thấp (GI

=19) và có lợi lý tưởng cho sức khoẻ người dùng Eructoza là chất ngọt có độ

ngọt cao nhất trong số các chất ngọt dinh dưỡng và có nguồn gốc tự nhiên Độ ngọt (tuỳ theo nồng độ) từ 1,2 đến 1,8 lần so với độ ngọt của saccaroza và có rất nhiều ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm [44, 45]

Sử dụng đường nhằm cung cấp năng lượng cho cơ thể Nhưng quá trình trao đổi chất và hấp thụ glucoza và fructoza theo 2 con đường khác nhan Giucoza từ thức ăn được hấp thụ, vận chuyển vẻ gan rồi chuyển động tự do vào

máu Các mô cơ tiếp nhận glucoza từ máu sử dụng làm năng lượng Quá trình

Trang 31

chất này có vai trò quan trọng điều chỉnh sự tiếp nhận thức ăn và tăng trọng

lượng cơ thể Trao đổi chất fructoza cũng thực hiện ở gan nhưng không như

glueoza vì không yêu cần sử dung insulin [20]

Bằng 1.1 Ngưỡng cảm nhận và giá trị độ ngọi tương đắt của các đường ieee Ngưỡng cảm “iệm, % Gii trị trong đối về trong lượng thể tích độ ngọt Fructoza 0,17 170 Saccaroza 0.46 100 Giucoza 0,75 61 Sorbitol 0,73 63 Maltoza 1,08 43 Maltitol 0,68 68

Hội đồng kiểm tra năng lượng (Calorie Control Council) đã có cuộc khảo sát những người tiêu dùng chất ngọt và đã có kết luận cho rằng: Hon 180 triệu người lớn ở Mỹ đang phối hợp với nhau tìm kiếm các thực phẩm và đồ uống năng lượng thấp trong một chương trình được coi là một phần của lối sống khoẻ mạnh Eructoza có thể được lựa chọn cho chương trình này vì giá trị đích thực về

độ ngọt và chức năng của fñuctoza [25]

Cục dược phẩm và thực phẩm Mỹ (EDA) đã đánh giá HECS là an toàn sử dụng trong thực phẩm như saccaroza, đường ngô, sirô ngô và các đường chuyển hoá từ tinh bột Trong những thập kỷ gần đây, fructoza được bổ sung vào đồ ăn kiêng và đang trở thành sản phẩm rất thông dụng [25] Các Tổ chức y tế, thực phẩm, khoa học công nghệ Mỹ như: Hãng Surgeon General về dinh dưỡng và sức khoẻ, Viện Hàn lâm khoa học Mỹ về dé ăn kiêng, sức khoẻ cộng đồng năm

Trang 32

2000, Cục Hỗ trợ dịch vụ con người và sức khoẻ của Mỹ cũng có những kết luận tương tự Trao đổi chất fructoza không làm tăng glucoza máu, không yêu cầu sự có mặt của insulin đối với người bệnh tiểu đường, do đó trên thực tế sử dụng fructoza tét hơn các loại đường khác Hon thế nữa, nhiều kết quả nghiên cứu đã

kiểm soát chỉ số

khẳng định với số lượng nhỏ ftuctoza còn có thể cải thiện việ

GI cho nhóm người bệnh đái tháo đường Cơ thể người hấp thụ fuctoza nhanh chóng và dễ dàng Người bệnh đái tháo đường cũng có thể sử dụng fuctoza vì fructoza kích thích insulin hoạt động Là chất ngọt đậm, fructoza có thể giảm calory trong nhiều thực phẩm và dé uống phổ thông Tuy nhiên, người tiêu ding

hãy quan tâm tới những lời cảnh báo khi sử dụng dư thừa đường các loại nói chung và sirô fructoza nói riêng [45]

Nếu năm 1970, tỷ lệ bình quân đầu người sử dụng đường saccaroza chiếm 85 % chất ngọt và chưa sử dụng đường fiuctoza, thì từ những năm sau 2005, tỷ lệ sử dụng đường fuctoza đã tăng lên đáng kể, xấp xỉ với saccaroza và đạt gần 509% sản lượng chất ngọt (hình 1.12) Per Capita Consumption of Caloric Sweeteners 1970 - 2008 i i

Hình 1.12 Biểu đồ về mức tiêu đùng chất ngọt chủ yếu bình quân đầu

người ở MẸ từ 1970 đắn 2008 tính theo potuá (1 pownds = 0,454 kạ) [20J

Trang 33

Theo sách xuất bản thường niên về chất ngọt và đường saccaroza, Cục

Nghiên cứu kinh tế của Bộ Nông nghiệp Mỹ (U.S Department of Agriculture, Economic Research Service, Sugar and Sweetener Vearbook series), mức sử

dụng bình quân đầu người đối với chất ngọt ở Mỹ đã có nhiều biến động trong

30 năm qua [20]

Ở Mỹ, năm 2004, mức sử dụng đường bình quân đầu người như sau:

19,2 kg HECS, 20 kg sacaroza Theo dữ liệu của Bộ Nông nghiệp Mỹ từ năm 1967 đến năm 2000, mức độ sử dụng HECS đã tăng trên 1.000% từ năm 1970 đến năm 1990 Hiện nay ở Mỹ đang sử dụng HECS với tỷ lệ trên 40% các loại

chất ngọt bổ sung vào thực phẩm và đỗ uống đặc biệt là nước ngọt Sử dung HECS đạt mức trung bình 132 kcal người dân Mỹ/ ngày và trong số các đối tượng dùng nhiều (top đầu chiếm 20%) đạt mức 316 kcal người/ ngày [29, 30,

34, 55]

1.4.4 Ung dung fructoza trong công nghiệp thực phẩm

Fructoza là chất ngọt có độ ngọt cao nhất trong số các chất ngọt dinh dưỡng và có nguồn gốc tự nhiên Độ ngọt (tuỳ theo nẻng độ) từ 1,2 đến 1,8 lần so với độ ngọt của saccaroza và có rất nhiễu ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm [21, 22]

Sản xuất fructoza tăng trưởng mạnh trong 30 năm qua, ñuctoza có chất lượng cao, có đặc tính quý giá về chức năng và sức khoẻ, là chất ngọt có hương thơm đặc trưng Khác với các chất ngọt khác và tỉnh bột, #uctoza bền vững trong môi trường axit, giữ 4m, tao màu nâu trên bề mặt bánh, là đường có thẻ lên men bởi nấm men trong sản xuất bánh tươi, bảo vệ kết cấu của thực phẩm lạnh đông Sirõ f#uctoza 42 % đã được ứng dụng rất rộng rãi phổ biến trong công nghiệp thực phẩm ở các nước phát triển Nếu ở Mỹ năm 1970 bình quân 40 kg

Trang 34

đường/ người chủ yếu là đường mía saccaroza thì hiện nay mức bình quân 42 kg/

người trong đó trên 50 % là đường fucioza

Fructoza được sử dụng trong thực phẩm và đổ uống như bánh tươi, nước quả cô đặc, sản phẩm năng lượng thấp, đỏ ăn kiêng, thực phẩm dinh dưỡng, bồi bổ vận động viên, các loại đồ uống bão hoà CO;, nước có hương, đồ uống có năng lượng, sữa chocolat, ngũ cốc ăn sáng, bánh kẹo, sữa chua, mứt quả, thay thế mật ong [25, 26]

Bảng 1.2 Sử đựng HFCS trong công nghiệp thựcc phẩm ở Mỹ (nghìn tan) [26]

TT Công nghiệp 1987 | 1992 | 1997 | 2002 | Mức tăng 2002/1987 (%) 1| Kẹo 27| 114|Ị 106Ị $3| 2074 2.| Bánh mỳ, bánh ngọt 411| 442| 402| 513| 198 3.| Kem và sản phẩm từ sữa 402| 568| 772| 2358| -33,8 4.| Đô uống (chai, lon) đông lạnh 3593| 647| 502| 686 15,6 5.| Nước ngọt (Becerages) 3.888 | 3,878 | 5,845 | 6693| 72.1 6.| Thực phẩm khác 101 7.| Tổng cộn; 5.321 | 5,750 | 7,627| 8,233| 34.7

Nguén: Caiculated from US Census Bureau Data

Ở nước ta, phải nhập khẩn vì chưa sản xuất được sỉ rô fructoza để sử dụng, trongn công nghiệp bánh kẹo, đồ uống, sữa và các sản phẩm của sữa

Trang 35

CHUONG IL NGUYEN VAT LIEU VA PHUONG PHAP 2.1 Nguyên vật liệu 3.1.1 Nguyên Héu 2.1.1.1 Tĩnh bột Tỉnh bột sắn ướt có hàm lượng tỉnh bột 50 % Tinh bột sắn ướt được xử lý thành dịch tỉnh bột sắn

2.1.1.2 Enzym (sản phẩm của hãng NOVO, Denmark)

- Enzym địch hoá: Termamyl 120L

- Enzym đường hoá: Glucoamy laza (AMG)

- Enzym đồng phân hoá: Sweetzyme T 2.1.2 Thiết bị

Sử dụng các thiết bị phòng thí nghiệm: Bếp điện, bể ổn nhiệt, nồi cách thuỷ, tủ sấy, nhiệt kế, chiết quang kế, máy đo pH để bàn, cột trao đổi ion, cân

phân tích, máy sắc ký lỏng cao áp, máy lọc chân không, máy so màu, máy cô chân không

Sử dụng các thiết bị và hệ thống thiết bị của Công ty Cổ phần thực phẩm Minh Dương bao gồm: Hệ thông thiết bị xử lý nguyên liệu, hệ thống thiết bị hỗ hoá, dịch hoá, đường hoá, đồng phân hoá, hệ thông thiết bị lọc tách bã, tây màu, trao đổi ion, cô đặc chân không 3 cấp, các thiết bị chứa, làm lạnh, các hệ thống thiết bị cung cấp hơi, điện, nước và xử lý chất thải

2.2 Phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Phương pháp phân tích: hoá lý, hoá sinh

2.2.1.1 Xác định nông độ chất khô bằng chiết quang kê (Bx) [12] 2.2.1.2 Xác định pH bằng máy do pH

2.2.1.3 Xác định độ nhớt của dịch sau dịch hoá [12]

Trang 36

Xác định độ nhớt của dịch đường sử dụng nhớt kế ống mao dẫn thuỷ tỉnh

Phương pháp dùng cho mọi loại dịch đường Cần phân tích trong vòng 50 phút kể từ khi bắt đầu lọc dịch đường

Xác định độ nhot ở 20 "C bằng nhớt kế đã được hiệu chuẩn

- Hiệu chuẩn: Hiệu chuẩn dụng cụ đo độ nhớt theo chỉ dẫn, đảm bảo thực hiện ở nhiệt độ không đổi 20 °C Kiểm tra độ chuẩn của dụng cụ bằng cách đo độ

nhớt ở 20 °C của nước= 1,002 mPa.s, độ nhót của dung dịch đường saccaroza 20 % (mím)= 1,945 mPa.s

Độ nhót của dịch thuỷ phân tính theo công thức: 1 = £.0,03296 (mm”/s)

Trong đó: II: Độ nhớt của dịch thuỷ phan(mm’/s)

tạ: Thời gian chảy của lượng dich (s)

0,03296: hệ số chuyển đổi (mm’/s’)

2.2.1.4 Xác định độ Âm của nguyên liệu ban đầu [12]

Độ ẩm ban đầu của nguyên liệu được xác định bằng phương pháp sấy đến

khối lượng không đổi

Độ ẫm của nguyên liệu (%) được tính theo công thức: w-m1- m2 x100 % m1

Trong đó: _m¡: Khối lượng mẫu trước khi sấy (g) mạ: Khối lượng mẫu sau khi sốy (g)

2.2.1.5 Phương pháp xác định mức độ thủy phân (DE) thông qua xác định đường khử bằng phương pháp DNS (axit 3,5 dinitrosalicylic) [20]

Dựa trên phản ứng tạo màu giữa đường khử với thuốc thử axit

dinitrosalicylic DNS Cuéng độ màu của hỗn hợp phản ứng tỷ lệ thuận với nỗng độ đường khử trong phạm vi nhất định Dựa trên để thị đường chuẩn đối với

Trang 37

Cho 5 g DNS va 300 ml nước cất vào cốc, hoà tan hoàn toàn ở 50 °C Sau

đó cho thêm 50ml dung dịch NaOH 4N Cuối cùng thêm 150 g muối tartrat kép

KNaC4H40¢.4H20, hồ tan hoàn toàn và cho vào trong bình định mức 500 ml

"Thêm nước cất tới vạch định mức Dung trong lọ thuỷ tinh màu sẫm Nếu 1- 2 ngày sau thấy xuất hiện cặn lắng thì đem lọc cặn Chuẩn 3 ml thuốc thử DNS bằng HCI 0,1N với chỉ thị phenolphtalein, nếu hết 5- 6 ml HCI là được (Nếu cần thêm NaOH để đạt môi trường mạnh cho thuốc thủ)

Dựng đồ thị chuẩn glucoza qua các bước sau: Bước 1: Pha dịch đường glucoza chuẩn

Cân 0,25 g glucoza tỉnh khiết bằng cân phân tích Cho glucoza vào bình định mức 250 ml rồi định mức bằng nước cất tới vạch định mức, lắc cho đều

Lấy dịch glucoza gốc pha loãng như sau:

Trang 38

Bước 2: Tiến hành phản ứng với DNS trong ống nghiệm có nút xoáy: 2 ml dich đường + 1 ml DNS —> Lắc đều —> ĐÐun sôi 5 phút —> Làm nguội —> Do OD 6 4= 540 nm —> Ghi kết quả

Bước 3: Vẽ đỗ thị chuẩn với trục tung là OD và trục hoành là nồng độ đường C (g/l) Thiét lap phương trình đường chuẩn

Lượng đường được tính: X = an.V; Trong đó:

X - Lượng đường trong dung dịch cần xác định (s) a- Lượng đường khử trong mẫu đo(g)

n - Hệ số pha loãng dịch

V- Số thể tích địch đo (ml)

242.16 Xác định hàm lượng đường ƒuctoza bằng phương pháp Cistein-

Carbazole (Rumany) [3]

a Xác định đường cong chuẩn

Pha fructoza tỉnh khiết thành các nông độ 0,006 mg; 0,018 mg; 0,03 mg;

0,042 mg; 0,054 mg

- Cân 15 mg fructozatinh khiết pha với 250 ml nước cất

+ Hút 1 ml fructoza ở bình định mức trên thêm vào 9 ml nước cất + Hút 3 ml fructoza ở bình định mức trên thêm vào 7 mÌ nước cất + Hút 5 ml fructoza ở bình định mức trên thêm vào 5 ml nước cất + Hút 7 ml fructoza ở bình định mức trên thêm vào 3 mÌ nước cất + Hút 9 ml fructoza ở bình định mức trên thêm vào 1 ml nước cất

- Từ các ống nghiệm trên hút ra 0.5 ml, sau đó cho lần lượt các hoá chất:

0,1 ml cistein 1,59%; 3 ml Hạ§Ox đặc; 0,1 m1 carbazole 0,12

- Đưa các ống nghiệm trên vào nỏi thuỷ phân ở 40C trong 30 phút

- 8o màu trên máy UV- PC 01 ở bước sóng = 560 nm

Trang 39

- Dựng đường cong chuẩn

b Định lượng fñuctoza

- Lấy mẫu sau quá trình đường hoá (Bx = 70- 72) pha loãng đến Bx= 6

- Đưa địch có Bx= 6 qua đầu lọc để làm sạch dịch, được dịch trong

- Hút 0,1 ml ở 6 "Bx định mức đến 250 ml nước cất

- Hút 0,5 ml ở bình định mức trên cho vào các ống nghiệm

- Thêm lần lượt các hoá chất: 0,1 ml cistein 1,5 %, 3 ml H;SO‹ đặc, 0,1 ml

carbazole 0,12 %

- Lắc đều, đem thuỷ phân ở 40 °C trong 30 phút - Làm lạnh nhanh bằng đá

- 8o màu trên máy UV- PC 01 ở bước sóng 2.= 560 nm

- Ghi lại số đo trên máy

- Tra trên đường cong chuẩn để xác định lượng fructoza tạo thành c Tính toán: % fructoza= 2? x100 % Trong đó: B: lượng fructoza đọc trên đường cong chuẩn D: độ pha loãng C: nồng độ phần trăm chất khô (“Bx) 2.2.1.7 Xác định ham lượng tình bột có trong mẫu [12]

Cân 2 g bột rồi chuyển toàn bộ vào bình tam giác 250 ml Cho 100 m1 HCI 29%, đậy nút cao su và nối với ống sinh hàn khí Lắc nhẹ rồi đặt nổi vào đun cách

thuỷ, đun tới sôi và cho sôi khoảng 2 giờ Mức nước ở nỗi cách thuỷ phải luôn

Trang 40

trung hoà axit tới khi đổi màn Chú ý chỉ trung hoà khi đã làm nguội đến 30 °C, vì ở nhiệt độ cao và kiểm cục bộ thì glucoza sé bi phân huỷ làm kết quả kém

chính xác Trung hoà xong ta chuyển toàn bộ lượng dịch vào bình định mức 250

ml, tráng bình rỗi thêm nước cất tới vạch định mức và đem lọc Dịch đường thu

được xác định theo phương pháp DNS

Hàm lượng tỉnh bột trong nguyên liệu tỉnh bột (%) được tính theo công thức sau:

TR= #09 100%

Trong đó:

X- hàm lượng đường có trong nguyên liệu (g)

0,9- hệ số chuyển đổi glucoza thành tỉnh bột 2- số g tinh bột nguyên liệu

2.2.1.8 Phương pháp đình lượng vi sinh vật

- Xée dinh vi khudn coliform va Escherichia coli (Theo TCVN 6187- 1: 1996, ISO 9308- 1: 1990 E)

- ISO 5667-1: 1980 Chét long nuée - Lay m&u Phan 1: Huéng dan cac phương án lấy mẫu

- TCVN 5992: 1995 (SO 5667-2: 1982) Chất lượng nước- Lấy mẫu Hướng dẫn các kỹ thuật lấy mẫu

- TCVN 5993: 1995 (SO 5667-3: 1985) Chất lượng nước- Lấy mẫu Hướng dẫn bảo quản và xử lý mẫu thử

- ISO 6887: 1983 Chất lượng nước- Vi sinh vật học Hướng dẫn chung về

chuẩn bị các dung dịch pha loãng để kiểm tra vi sinh vat

-I§O 7704 : 1985 Chất lượng nước- Đánh giá màng lọc dùng dé phân tích vi sinh