Xây dựng quy trình xác định genotype hcv của hepatitis c virus bằng kỹ thuật giải trình tự nucleotide vùng core và ns5b

SỞ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRUNG TÂM CƠNG NGHỆ SINH HỌC BÁO CÁO NGHIỆM THU ĐỀ TÀI CƠ SỞ CẤP TRUNG TÂM Tên nhiệm vụ: XÂY DỰNG QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH GENOTYPE CỦA HEPATITIS C VIRUS BẰNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ NUCLEOTIDE VÙNG CORE VÀ NS5B Đơn vị chủ trì nhiệm vụ: Phòng CNSH Y dược Chủ nhiệm nhiệm vụ: TS Nguyễn Đăng Quân Cán tham gia: TS Nguyễn Hoàng Chương CN Lê Ngụy Hồng Linh Thành phố Hồ Chí Minh, tháng năm 2018 MỤC LỤC MỤC LỤC DANH MỤC HÌNH DANH MỤC BẢNG BIỂU TÓM TẮT PHẦN THÔNG TIN CHUNG PHẦN NỘI DUNG KHOA HỌC I ĐẶT VẤN ĐỀ II TỔNG QUAN TÀI LIỆU .6 Vòng đời (life cycle) HCV Dịch tễ học viêm gan virus C Đặc điểm bệnh lý viêm gan virus C Sự đa dạng di truyền HCV Chẩn đoán điều trị bệnh viêm gan virus C 10 Các phương pháp xác định genotype HCV 11 III VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .12 Vật liệu 12 Phương pháp 14 IV KẾT QUẢ - THẢO LUẬN .19 Kết 19 Thảo luận 40 V ĐÁNH GIÁ CHUNG 40 VI ĐỀ NGHỊ 40 PHẦN SẢN PHẨM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ .41 PHẦN TÀI LIỆU THAM KHẢO .41 I TIẾNG VIỆT 41 II TIẾNG ANH .41 PHỤ LỤC 44 Chuẩn bị hóa chất tách chiết axit nucleic 44 Tách chiết axit nucleic phương pháp silica 45 Nhân vùng core NS5B nested RT-PCR .46 PHỤ LỤC 51 DANH MỤC HÌNH Hình II.1: Sơ đồ cấu trúc genome HCV Hình II.2: Sự lưu hành virus hepatitis C người lớn phân bố genotype .9 Hình IV.1: Kết BLAST mồi Co-f 20 Hình IV.2: Kết BLAST mồi Ci-f 20 Hình IV.3: Kết BLAST mồi C-r .20 Hình IV.4: Kết BLAST mồi NS5Bo-f 20 Hình IV.5: Kết BLAST mồi NS5Bi-f .20 Hình IV.6: Kết hoạt động cặp mồi nhân vùng core NS5B 21 Hình IV.7: Kết so sánh phương pháp tách chiết kit silica 22 Hình IV.8: Kết so sánh phương pháp tách chiết silica phenol – chloroform .23 Hình IV.9 Kết nhân bước vùng core NS5B HCV 23 Hình IV.10: Kết nhân bước vùng core NS5B HCV 24 Hình IV.11: Kết khảo sát nhiệt độ bắt cặp nested-PCR bước vùng core vùng NS5B HCV .25 Hình IV.12: Kết khảo sát nhiệt độ bắt cặp cặp mồi nhân vùng core NS5B HCV nested-PCR bước 25 Hình IV.13: Kết tinh sản phẩm nested-PCR 26 Hình IV.14: Kết giải trình tự nucleotide vùng core HCV 29 Hình IV.15: Kết giải trình tự nucleotide vùng NS5B HCV 30 Hình IV.16: Kết so sánh trình tự nucleotide vùng core HCV 31 Hình IV.17: Kết so sánh trình tự nucleotide vùng NS5B HCV 31 Hình IV.18: Cây phát sinh lồi dựa kết gióng cột trình tự vùng core NS5B mẫu HCV 32 Hình IV.19: Cây phát sinh lồi dựa kết gióng cột trình tự vùng core NS5B 48 mẫu HCV 33 DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng III.1: Trình tự oligonucleotide cặp mồi 12 Bảng IV.1: Kết thông số oligonucleotide 21 Bảng IV.2: Kết đo nồng độ sản phẩm nested-PCR sau tinh 27 Bảng IV.3: Kết so sánh genotype HCV mẫu HCV47.1, 58 59 với phần mềm trực tuyến 32 Bảng IV.4: Kết xác định genotype HCV 48 mẫu .36 Bảng IV.5: So sánh kết xác định genotype HCV 38 TÓM TẮT Viêm gan virus C bệnh truyền nhiễm Hepatitis C Virus (HCV) gây Điểm bật bệnh tiến triển thầm lặng thời gian dài nên người bệnh khơng chẩn đốn điều trị kịp thời Quan trọng chưa có vaccine phịng bệnh viêm gan virus C nên điều trị phương thức giúp ngăn ngừa việc lan truyền HCV cộng đồng đem lại ích lợi cho sức khỏe bệnh nhân Trong điều trị bệnh viêm gan virus C, genotype HCV mắc phải yếu tố cần phải xác định trước điều trị ảnh hưởng đến định phác đồ điều trị, thời gian điều trị tiên lượng đáp ứng điều trị Hiện vùng trình tự core vùng NS5B HCV sử dụng làm đối tượng nghiên cứu xác định phân biệt genotype HCV vùng biến động genotype HCV Có nhiều phương pháp để xác định genotype HCV phục vụ điều trị, nhiên phương pháp giải trình tự kỹ thuật lựa chọn tối ưu để có kết định genotype xác Vì vậy, chúng tơi tiến hành thực đề tài “Xây dựng quy trình xác định genotype HCV kỹ thuật giải trình tự nucleotide vùng core NS5B” nhằm phục vụ cho mục tiêu điều trị hiệu bệnh viêm gan virus C Nhóm nghiên cứu xây dựng quy trình tách chiết mẫu huyết phương pháp silica, nhân vùng core NS5B nhằm tiến hành giải trình tự xác định genotype HCV Kết xác định genotype 48 mẫu bệnh phẩm gồm 1, 6; chủ yếu genotype PHẦN THÔNG TIN CHUNG Tên nhiệm vụ: Xây dựng quy trình xác định genotype Hepatitis C Virus kỹ thuật giải trình tự nucleotide vùng core NS5B (Mã số: YD05/16-17) Đơn vị chủ trì: Phịng Cơng nghệ Sinh học Y dược Đơn vị phối hợp chính: (nếu có) Chủ nhiệm nhiệm vụ: TS Nguyễn Đăng Quân Cán tham gia thực hiện: TS Nguyễn Hồng Chương (thành viên chính), CN Lê Ngụy Hồng Linh (thành viên) Thời gian thực hiện: 24 tháng (Từ tháng 01/2016 đến 12/2017) Kinh phí: - Tổng dự tốn: 400.000.000 VNĐ - Kinh phí sử dụng: 389.882.460 VNĐ Mục tiêu nhiệm vụ: Xây dựng quy trình xác định genotype virus viêm gan C (HCV) dựa kỹ thuật giải trình tự nucleotide vùng core vùng NS5B thuộc gen HCV để phục vụ điều trị hiệu bệnh viêm gan virus C Các nội dung công việc thực so với đăng ký STT Nội dung đăng ký Xây dựng đề cương Thiết kế mồi Xây dựng quy trình nested RT-PCR nhân vùng core NS5B Xây dựng quy trình giải trình tự nucleotide vùng core NS5B Phân tích trình tự nucleotide vùng core NS5B để xác định genotype Viết báo cáo nghiệm thu đề tài Thời gian (bắt đầu Thực – kết thúc) 12/2015 – 01/2016 Đã hoàn thành đề cương nghiên cứu 02/2016 – 4/2016 Đã thiết kế cặp mồi nhân vùng core NS5B 5/2016 – 11/2016 Đã xây dựng quy trình nested RT-PCR nhân vùng core NS5B Đánh giá Đúng tiến độ Đúng tiến độ 12/2016 – 3/2017 Đã xây dựng quy trình giải trình tự nucleotide vùng core NS5B Đúng tiến độ 4/2017 – 10/2017 Đã xác định genotype HCV Đúng tiến độ 11/2017 – 12/2017 Đã hoàn thành báo cáo nghiệm thu Đúng tiến độ Đúng tiến độ PHẦN NỘI DUNG KHOA HỌC I ĐẶT VẤN ĐỀ Viêm gan virus C bệnh nhiễm Hepatitis C Virus (HCV) gây Đặc điểm bật bệnh bệnh tiến triển thầm lặng thời gian dài nên người bệnh khơng chẩn đốn điều trị kịp thời Việc khơng điều trị lúc dẫn đến biến chứng xơ gan (khoảng 10 – 20% số bệnh nhân nhiễm HCV) nguy hiểm ung thư gan (khoảng 5% số bệnh nhân nhiễm HCV) Quan trọng chưa có vaccine phịng bệnh viêm gan virus C nên điều trị phương thức giúp ngăn ngừa việc lan truyền HCV cộng đồng đem lại ích lợi cho sức khỏe bệnh nhân Trong điều trị bệnh viêm gan virus C, genotype HCV mắc phải yếu tố cần phải xác định trước điều trị ảnh hưởng đến định phác đồ điều trị, thời gian điều trị tiên lượng đáp ứng điều trị Có nhiều phương pháp sinh học phân tử phát triển để xác định genotype HCV phục vụ điều trị bao gồm real-time PCR, lai phân tử, giải trình tự nucleotide Trong số phương pháp xác định genotype HCV giải trình tự nucleotide xem phương pháp tiêu chuẩn xác định xác genotype HCV dựa phân tích trình tự vùng gen đặc trưng virus Trên thực tế, phương pháp xác định genotype HCV khác sử dụng phương pháp giải trình tự nucleotide chuẩn vàng để so sánh Việt Nam nước có tỷ lệ lưu hành HCV thuộc loại cao giới nên nhu cầu kiểm soát bệnh nhiễm thông qua điều trị vô to lớn Đứng trước nhu cầu thực tiễn này, đề xuất thực đề tài “Xây dựng quy trình xác định genotype HCV kỹ thuật giải trình tự nucleotide vùng core NS5B” nhằm phục vụ cho mục tiêu điều trị hiệu bệnh viêm gan virus C Đề tài có ý nghĩa thực tiễn cao nhằm tới việc đưa quy trình xác định genotype HCV cách xác hiệu dựa phương pháp giải trình tự nucleotide vùng gen đặc trưng virus Quy trình xác định genotype ứng dụng để phục vụ điều trị bệnh viêm gan virus C thực tế lâm sàng mà cịn có sử dụng công cụ phân tử để nghiên cứu dịch tễ genotype HCV tìm biến chủng HCV Việt Nam Bên cạnh đó, thơng qua việc thực đề tài quy trình kỹ thuật giải trình tự gen xác định genotype HCV thiết lập Trung tâm Công nghệ Sinh học tạo tiền đề quan trọng cho nghiên cứu ứng dụng có liên quan II TỔNG QUAN TÀI LIỆU Vào thập niên 60 kỷ 20, người ta phát hai loại viêm gan với cách lây nhiễm khác nhau: lây lan qua đường tiêu hóa trường hợp virus A (Hepatitis A Virus – HAV); lây lan qua đường tiêm chích qua sản phẩm máu trường hợp virus B (Hepatitis B Virus – HBV) Một thời gian ngắn sau đó, người ta ghi nhận thêm nhóm virus HAV HBV gọi tên chung nhóm virus khơng A khơng B (non A – non B hepatitis virus) [1] Trong vòng 16 năm kể từ phát tồn nhóm virus khơng A khơng B người ta chưa xác định nhân tố bí ẩn gây bệnh Năm 1975, Prince cộng nhận định có chứng bệnh viêm gan virus sau truyền máu khơng HBV có thời kì ủ bệnh dài thời kì ủ bệnh HAV Sau đó, tác giả khác chứng minh mặt huyết học bệnh viêm gan virus loại liên quan đến bệnh viêm gan virus A từ lúc danh từ "bệnh viêm gan virus không A không B" đời Vào tháng năm 1989, có phát viêm gan virus không A không B công bố Bằng phương pháp li tâm siêu tốc huyết tương thu từ tinh tinh bị bệnh viêm gan virus, Choo cộng tách chiết nucleic acid virus, tổng hợp cDNA từ RNA tách chiết, chèn vào genome (bộ gen) gt11 xâm nhiễm E coli Trong số hàng triệu dịng thu có dịng có phản ứng đặc hiệu với kháng thể có huyết người bị bệnh viêm gan virus không A không B sau truyền máu Cuối cùng, họ xác định bệnh viêm gan virus không A không B loại virus gây ra, virus C (HCV) [2], [3] HCV virus thuộc họ Flaviviridae Đây loại virus nhỏ, có vỏ lipid, kích thước khoảng 30-50nm Vật liệu di truyền HCV chuỗi RNA mạch (+), chứa khoảng 9600 nucleotide mã hóa cho polyprotein tiền thể gồm 3.011 amino acid Genome chứa khuôn đọc mở (Open Reading Frame) với trình tự trình bày Hình II.1 Hình II.1: Sơ đồ cấu trúc genome HCV - Đầu 5’ khơng dịch mã: có chức điều hòa dịch mã - C (nucleocapsid): protein lõi - E1 (envelope): protein vỏ - E2 (envelope): protein vỏ - NS2 (membrane binding protein): protein liên kết với màng - NS3 (protease/helicase): enzyme thủy giải cắt đứt liên kết hydro - NS4 (membrane binding protein): protein liên kết với màng - NS5 (polymerase): enzyme nhân vật liệu di truyền - Đầu 3’ khơng dịch mã Vịng đời (life cycle) HCV Đầu tiên, HCV gắn vào receptor (thụ thể) chưa xác định bề mặt tế bào gan nhờ hai glycoprotein bề mặt E1 E2 HCV xâm nhập vào bên tế bào gan sau q trình hịa màng (membrane fusion) RNA mạch dương (+) HCV dịch mã nhờ hệ thống dịch mã tế bào chủ Protein tiền thể tạo phân cắt enzyme tín hiệu (signalase) để tạo protein cấu trúc (C, E1, E2) protein không cấu trúc (NS1 – NS5) Sau HCV tạo reverse transcriptase enzyme bắt đầu phiên mã ngược để tạo mạch RNA mạch âm (-) bổ sung với mạch (+) có Chính mạch RNA (-) khn để tạo RNA genome HCV Sau đó, capsomer tạo từ protein thành phần C, E1, E2 kết hợp với RNA genome HCV để tạo thành dạng nucleocapsid Nucleocapsid tiến đến tương tác với màng tế bào để ngồi, trở thành dạng virus hoàn chỉnh xâm nhiễm tế bào khác Dịch tễ học viêm gan virus C Đa số trường hợp nhiễm HCV lây truyền qua đường máu tiêm chích nửa số bệnh nhân bị nhiễm khơng có tiền tiêm chích truyền máu Vấn đề đặt đường lây truyền bệnh nhân Một mặt, HCV lây truyền qua đường tiếp xúc sinh dục (bao gồm đồng tính dị tính luyến ái) đường mẹ truyền sang với tỉ lệ thấp Mặt khác, HCV diện dịch thể nên đường lây tiếp xúc thơng thường Vì vậy, câu trả lời cho nguyên HCV bỏ ngỏ Khoảng 70% bệnh nhân viêm gan virus C trở thành người mang mầm bệnh mạn tính Trên giới, theo ước tính WHO (3/2011), tỉ lệ nhiễm HCV giới 2,2% khoảng 170 triệu người, – triệu người nhiễm năm Ở Việt Nam, theo thống kê Bộ Y tế có triệu người mắc viêm gan virus C, tỉ lệ tử vong chiếm gần 6% Khoảng 85% trường hợp nhiễm HCV biến chuyển thành viêm gan C mạn tính, khoảng 20 – 25% chuyển qua giai đoạn xơ gan, ung thư gan [1], [4], [5] Tính đến năm 2014, có nghiên cứu HCV genotype Việt Nam công bố, nghiên cứu Messina cộng sự, lưu hành genotype Việt Nam 86 ngàn người mắc genotype (60,56%), ngàn người mắc genotype (5,9%), ngàn người mắc genotype (4,79%), 41 ngàn người mắc genotype (28,57%) khơng có trường hợp nhiễm genotype [6] Hình II.2: Sự lưu hành virus hepatitis C người lớn phân bố genotype Đặc điểm bệnh lý viêm gan virus C Đặc điểm lâm sàng bệnh viêm gan virus C cấp tính khơng khác biệt so với loại viêm gan virus khác cho dù thời kì ủ bệnh (22 – 60 ngày) ngắn so với viêm gan virus B dài viêm gan virus A Hầu hết bệnh nhân cấp tính khơng thể rõ triệu chứng biểu triệu chứng nhẹ, khơng đặc trưng Chỉ có 25% bệnh nhân biểu vàng da, vàng mắt Hơn nữa, tình trạng viêm gan virus cấp tính nghiêm trọng bùng phát đột ngột xảy khó phát tình trạng nhiễm bệnh Mặc dù khơng có triệu chứng triệu chứng nhẹ khó phát viêm gan virus C cấp tính thường biểu dấu hiệu sưng gan mạn tính Người ta thấy nồng độ alanine aminotransferase (ALT) huyết tồn gián đoạn tăng cao cách định 50% trường hợp viêm gan virus C Điều cho thấy trình bệnh tiếp diễn Các mẫu sinh thiết gan cho thấy tình trạng viêm gan virus mạn tính dạng hoạt động (chronic active hepatitis – CAH) có 60% số bệnh nhân viêm gan virus C mạn tính tình trạng xơ gan 20% trường hợp Ngồi ra, người ta cịn thấy có tỉ lệ định bệnh nhân viêm gan virus C mạn tính chuyển sang tình trạng hoại tử gan biến chứng cao huyết áp Đã có hàng loạt cơng trình nghiên cứu biến chứng bệnh viêm gan virus C Kyosawa cộng (1984) mô tả trường hợp tiến triển từ viêm gan virus mạn tính dạng dai dẳng (chronic persistent hepatitis – CPH) sang CAH, sang xơ gan ung thư gan bệnh nhân viêm gan virus không A không B sau truyền máu Các báo cáo khác cho thấy tỉ lệ nhỏ bệnh nhân viêm gan virus C mạn tính xuất ung thư gan nguyên phát có diện kháng thể kháng HCV nhiều bệnh nhân bị ung thư gan [1], [4] Sự đa dạng di truyền HCV HCV có đa dạng di truyền cao đặc trưng lưu hành nhiều genotype Đây yếu tố giúp HCV đề kháng lại tác nhân chống virus tế bào chủ thách Pha dung dịch L6 tiến hành theo bước sau: Hòa 300 ml dung dịch Tris – HCl vào 66 ml dung dịch EDTA Cân 7,8 g dung dịch Triton X-100 cho vào dung dịch Cân 120 g guanidine thiocyanate cho vào dung dịch, khuấy tan cá từ Cho dung dịch L6 vào duran bảo quản tối nhiệt độ phòng Pha dung dịch silica tiến hành theo bước sau: Huyền phù g silicon dioxide 50 ml nước DEPC Đảo ống, để yên 24 nhiệt độ phòng Bỏ 43 ml dịch Thêm vào 50 ml nước DEPC Để lắng cặn nhiệt độ phòng Bỏ 44 ml dịch Thêm vào 60 μl HCl 37% Hấp khử trùng 121oC, atm, 15 phút Bảo quản tối nhiệt độ phòng Tách chiết axit nucleic phương pháp silica Hóa chất chuẩn bị: Dung dịch L6 Dung dịch L2 Aceton (Merck) Ethanol 70% (Merck) Silicon dioxide (Sigma) Các bước tiến hành: Hút 500 μl huyết cho vào eppendorf Bổ sung 900 μl dung dịch L6 30 μl dung dịch silica Vortex tan cặn silica, lắc ngang 15 phút Li tâm 13.000 vòng/ phút, 15 giây Đổ bỏ dịch nổi, thu cặn Thêm 900 μl dung dịch L2 Vortex tan cặn silica Li tâm 13.000 vòng/ phút, 15 giây Đổ bỏ dịch nổi, thu cặn Lặp lại bước – Thêm 900 μl dung dịch Ethanol 70% Vortex tan cặn silica Li tâm 13.000 vòng/phút 15 giây Đổ bỏ dịch nổi, thu cặn 10 Lặp lại bước – 45 11 Thêm 900 μl dung dịch Aceton Vortex tan cặn silica 12 Li tâm 13.000 vòng/phút 15 giây Đổ bỏ dịch nổi, thu cặn 13 Ủ cặn 60oC, phút 14 Thêm 50 μl DEPC treated H2O Vortex tan cặn silica 15 Ủ cặn 60oC, 15 phút Cứ phút ủ, vortex lần 16 Li tâm 13.000 vòng/phút phút 17 Thu 30 μl dịch Bảo quản dịch thu -80oC Dung dịch chứa RNA sử dụng để tạo cDNA xác định nồng độ để làm mẫu cho nested PCR nhân vùng core vùng NS5B Nhân vùng core NS5B nested RT-PCR 3.1 Tạo cDNA RT-PCR Hóa chất chuẩn bị: Transcriptor High Fidelity cDNA synthesis kit (Roche) Các bước tiến hành: Thiết lập phản ứng eppendorf 0,2 ml gồm thành phần sau: RNA tổng 9,4 μl Random Hexamer Primer 600 pmol/μl 60 μM Ủ 65oC, 10 phút Sau làm lạnh Thêm vào eppendorf thành phần phản ứng sau: Buffer 5X 1X RNase Inhibitor 40 U/μl 20 U dNTP 10 mM mM DTT mM RTase 10 U Chu trình nhiệt: 29oC, 10 phút 48oC, 60 phút 85oC, phút Bảo quản cDNA -20oC 3.2 Đánh giá nồng độ mẫu realtime PCR Hóa chất chuẩn bị: Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix (2X) (Thermo) Các bước tiến hành: 46 Thiết lập phản ứng eppendorf 0,1 ml gồm thành phần sau: Maxima SYBRGreen/ROX qPCR mastermix 2X 1X Mồi xuôi 10 μM 0,2 μM Mồi ngược 10 μM 0,2 μM cDNA μl dH2O vừa đủ 20 μl Chu trình nhiệt: chu kì: 95oC, 10 phút 40 chu kì: 95oC, 15 giây 60oC, 30 giây 72oC, 30 giây chu kì: 72oC, 10 phút Các mẫu cho kết realtime PCR dương tính với vùng 5’UTR HCV tiến hành nested PCR nhân vùng core NS5B HCV 3.3 Nhân vùng core NS5B HCV nested-PCR Hóa chất chuẩn bị: DEPC treated dH2O (Biobasic) TopTaq DNA Polymerase (Qiagen) dNTPs (Thermo) Các bước tiến hành: Thiết lập phản ứng PCR bước epp 0,2 ml gồm thành phần sau: Buffer 10X 1X dNTPs mM 0,2 mM Mồi xuôi 10 μM 0,1 μM Mồi ngược 10 μM 0,1 μM Polymerase U/μl 0,5 U cDNA μl dH2O vừa đủ 20 μl Parafilm 30 μl Chu trình nhiệt: chu kì: 94oC, phút 40 chu kì: 94oC, 30 giây 60oC, 30 giây 47 72oC, 30 giây chu kì: 72oC, 10 phút Bảo quản sản phẩm PCR 4oC Thiết lập phản ứng pCR bước eppendorf 0,2 ml gồm thành phần sau: Buffer 10X 1X dNTPs mM 0,2 mM Mồi xuôi 10 μM 0,1 μM Mồi ngược 10 μM 0,1 μM Polymerase U/μl 1,25 U Sản phẩm PCR bước 1 μl vừa đủ 50 μl dH2O Chu trình nhiệt: chu kì: 94oC, phút 40 chu kì: 94oC, 30 giây 55oC, 30 giây 72oC, 30 giây chu kì: 72oC, 10 phút Bảo quản sản phẩm PCR 4oC 3.4 Kiểm tra kết PCR điện di gel agarose Hóa chất chuẩn bị: Dung dịch TAE 0,5X: Tris 0,4 M, EDTA 0,1 M (Biobasic), acid acetic 0,2 M (Trung Quốc) GeneRuler 100 bp DNA Ladder, ready-to-use (Thermo) 6X GelRed™ Loading Buffer with TriColor (TBR) Các bước tiến hành: Các bước chuẩn bị gel agarose tiến hành sau: Cân 1,5 g agarose, cho dung dịch TAE 0,5X vừa đủ 100 ml Đun agarose tan, đổ agarose lỏng vào khuôn lắp lược Khi agarose đông đặc hoàn toàn, tháo lược đặt gel vào bồn điện di chứa sẵn dung dịch TAE 0,5X μl sản phẩm PCR bổ sung μl dung dịch nhuộm mẫu 6X, huyền phù nạp mẫu vào giếng Quá trình điện di xảy 100 V 30 phút Sau điện di, quan sát gel máy Gel Doc chụp hình kết 48 Các mẫu cho kết PCR dương tính với vùng core vùng NS5B tinh sạch, xác định nồng độ kiểm tra độ tinh sạch, sau sử dụng làm nguyên liệu cho phản ứng giải trình tự 3.5 Tinh sản phẩm PCR Hóa chất chuẩn bị: Expin™ PCR SV (GeneAll - Hàn Quốc) Các bước tiến hành: Trộn 225 μl buffer PB với 45 μl sản phẩm PCR chuyển lên cột Li tâm 13.000 vòng/ phút 30 giây Đổ bỏ dịch qua cột Thêm 700 μl buffer NW Li tâm 13.000 vòng/ phút 30 giây Đổ bỏ dịch qua cột Li tâm 13.000 vòng/ phút phút Chuyển cột lên eppendorf 1,5 ml Thêm 30 μl DEPC treated H2O vào cột Ủ nhiệt độ phòng phút Li tâm 13.000 vòng/ phút phút Bảo quản dịch thu -20oC 3.6 Đo mật độ quang sản phẩm PCR tinh Xác định nồng độ OD260/OD280 1,5 μl sản phẩm PCR tinh máy quang phổ 3.7 PCR giải trình tự Hóa chất chuẩn bị: BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) Các bước tiến hành: Thiết lập phản ứng eppendorf 0,2 ml gồm thành phần sau: Ready Reaction Mix 0,5X Buffer 5X 0,5X Mồi 3,2 μM 3,2 pmol Sản phẩm PCR – 10 ng dH2O vừa đủ 10 μl 49 Chu trình nhiệt: chu kì: 96oC, phút 25 chu kì: 96oC, 10 giây 50oC, giây (tốc độ gia nhiệt: 1oC/ phút) 60oC, phút Giữ: 4oC 3.8 Tinh sản phẩm PCR giải trình tự Hóa chất chuẩn bị: BigDye® XTerminator Purification Kit (Applied Biosystems) Các bước tiến hành: Chuẩn bị hỗn hợp gồm 10 µl XTerminator 45 µl SAM solution Li tâm sản phẩm PCR giải trình tự phút Chia 55 µl hỗn hợp XTerminator SAM solution chuẩn bị vào mẫu Lưu ý: chia mẫu nhanh, tránh hỗn hợp bị lắng Vortex 30 phút, tốc độ 2000 vòng/ phút Li tâm 1000 g, phút Hút 30 µl mẫu vào đĩa giải trình tự 3.9 Chạy máy 3500 Genetic Analyzer Đặt đĩa vào khay đĩa Lắp khay đĩa vào máy giải trình tự 3500 Tạo chương trình RapidSeq50_POP7 chạy máy 3.10 Phân tích trình tự nucleotide xác định genotype HCV Các trình tự nucleotide giải mã hiệu chỉnh phần mềm ATGC phiên 7.0.1 để loại bỏ tín hiệu nhiễu khoảng 20 – 100 bp phần đầu cuối trình tự, nucleotide chỉnh sửa dựa tín hiệu biểu đồ sóng thu Sau trình tự xuất tập tin định dạng fasta Các trình tự nucleotide hiệu chỉnh gióng cột với trình tự tham khảo thu thập từ Genbank phần mềm trực tuyến Clustal Omega phiên 1.2.4 Dựa phát sinh loài xây dựng liệu vùng core vùng NS5B phần mềm MEGA phiên 7.0 để xác định genotype HCV Các kết xác định genotype HCV so sánh với công cụ trực tuyến NCBI Genotyping, Oxford HCV Automated Subtyping Tool phiên 2.0, HCV BLAST Los Alamos 50 PHỤ LỤC Một số trường hợp mẫu HCV không đạt chất lượng định lượng tương đối phương pháp realtime PCR vùng 5’UTR HCV CR19 CR20 51 CR22 (34,25) CR38 52 CR39 CR44 (Cq = 33,43) 53 CR47 (Cq = 34,13) CR62 (Cq = 37,71) 54 CR67 (Cq = 37,71) CR74 (Cq = 32,10) 55 CR75 (Cq = 35,61) CR79 (Cq = 37,57) 56 CR82 (Cq = 34,67) CR87 (Cq = 33,99) 57 CR91 (Cq = 34,72) CR92 (Cq = 35,11) 58 CR93 (Cq = 35,42) 59