PHÁT HIỆN VIRUS BỆNH DỊCH tả HEO dựa TRÊN đoạn GEN NS5B

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC  KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP PHÁT HIỆN VIRUS BỆNH DỊCH TẢ HEO DỰA TRÊN ĐOẠN GEN NS5B Ngành học: CƠNG NGHỆ SINH HỌC Niên khố: 2003 – 2007 Sinh viên thực hiện: NGÔ THỊ THU NGÂN Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC  KHỐ LUẬN TỐT NGHIỆP PHÁT HIỆN VIRUS BỆNH DỊCH TẢ HEO DỰA TRÊN ĐOẠN GEN NS5B Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: PGS.TS TRẦN THỊ DÂN NGÔ THỊ THU NGÂN KS VƢƠNG HỒ VŨ KS LƢƠNG QUÝ PHƢƠNG Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com LỜI CẢM TẠ Trước tiên xin gởi ngàn lời cảm ơn đến ba mẹ kính yêu, ba mẹ ln hy sinh để dành tốt đẹp cho Con xin cảm ơn tất người thân yêu thương, quan tâm cổ vũ cho học tập Em xin chân thành cảm ơn:  Ban giám hiệu trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ Mơn Công nghệ sinh học, tất quý thầy cô truyền đạt kiến thức quý báu cho em suốt năm học  Ban giám đốc tập thể cán Trung tâm Phân Tích Thí Nghiệm trường Đại học Nơng Lâm thành phố Hồ Chí Minh tạo điều kiện thuận lợi tận tình giúp đỡ em suốt thời gian thực tập Em xin trân trọng biết ơn cô Trần Thị Dân thầy Nguyễn Ngọc Tuân hết lòng hướng dẫn tạo điều kiện thuận lợi cho em suốt trình thực đề tài tốt nghiệp Em xin chân thành cảm ơn anh Vương Hồ Vũ, anh Lương Quý Phương ln dẫn tận tình cho em suốt trình thực tập Em xin gởi lời cảm ơn đến:  Thầy Phát, anh Út, chị Hưng, chị Trang, với anh chị Trung tâm ln giúp đỡ, động viên em lúc khó khăn  Các bạn lớp CNSH K29 thân yêu chia xẻ, cổ vũ giúp đỡ suốt thời gian thực tập tốt nghiệp iii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com TÓM TẮT KHĨA LUẬN Ngơ Thị Thu Ngân, Đại học Nơng Lâm TP Hồ chí Minh, tháng 9/2007, “PHÁT HIỆN VIRUS DTH DỰA TRÊN ĐOẠN GEN NS5B” Hướng dẫn khoa học: PGS TS Trần Thị Dân KS Vương Hồ Vũ KS Lương Quý Phương Đề tài tiến hành từ ngày 01 tháng 03 năm 2007 đến ngày 01 tháng 08 năm 2007 Trung tâm Phân tích Thí nghiệm Hố sinh trường Đại học Nơng Lâm thành phố Hồ Chí Minh Gen NS5B gen gen virus DTH ngày sử dụng nhiều nghiên cứu xác định chủng, phân loại di truyền virus DTH Do đó, việc phát virus DTH phương pháp RT-PCR khuếch đại đoạn gen NS5B nhằm ứng dụng vào cơng tác chuẩn đốn bệnh sử dụng để hình thành liệu di truyền đánh dấu dịch tễ virus Kết đạt sau: Xác định quy trình tách chiết RNA thích hợp từ mẫu lách Nồng độ LiCl 2,5 M cho tủa RNA với độ tinh chất lượng sản phẩm khuếch đại cao Đưa quy trình RT-PCR bước phát gen NS5B virus DTH với nồng độ Taq giảm từ 2,5 UI xuống UI chất lượng sản phẩm khuếch đại không thay đổi Mức tỉ số OD ELISA lớn cho kết RT-PCR dương tính cao Kết hợp đặc điểm bệnh tích thường gặp heo nhiễm bệnh DTH với thông qua kết chẩn đốn RT-PCR dương tính iv LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com SUMMARY Ngô Thị Thu Ngân, Department of Biotechnology, Nong Lam University, HCMC September, 2007 The title of thesis: “DETECTION OF CLASSICAL SWINE FEVER VIRUS BASED ON NS5B GENE” Thesis were carried out from 01/03/07 to 01/08/07 at Biochemical Analysis and Experimental Center, Nong Lam University One of the genes of CSFV genome is NS5B gene, which is widely used for research on CSFV isolation and genetic typing Therefore, CSFV detecting based on amplification of the NS5B gene by RT-PCR method for the purpose of disease diagnostic application and this process may be used for the generation of genetic sequence data to be used for epidemiological tracing of virus Results obtained from the study: (1) Determined RNA extracted protocol suitable for spleen sample At LiCl 2,5 M concentration, we collected higher pure RNA precipitate which was used in RT-PCR resulted in highly qualitative product (2) Advanced single RT-PCR protocol to detect CSFV NS5B gene with Taq concentration decreased from 2,5 UI down UI, but RT-PCR product quality was not different (3) OD ratio of ELISA was more than value resulted in high positive RTPCR diagnostic (4) Combined symptoms of CSFV infected pigs together through positive RT-PCR diagnostic result v LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com MỤC LỤC NỘI DUNG TRANG Bìa i Trang tựa ii Lời cảm tạ iii Tóm tắt khóa luận iv Summary v Mục lục vi Danh sách chữ viết tắt viii Danh sách bảng ix Danh sách hình biểu đồ x Chƣơng MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu yêu cầu 1.2.1 Mục tiêu 1.2.2 Yêu cầu Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3 2.1 Bệnh DTH 2.2 Một số bệnh tích đặc trưng bệnh DTH 2.2.1 DTH điển hình 2.2.2 DTH khơng điển hình 2.3 Cấu trúc gen virus DTH 2.4 Một số phương pháp chẩn đốn phịng thí nghiệm 2.5 Sơ lược nghiên cứu liên quan 15 Chƣơng NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH .17 3.1 Thời gian địa điểm 17 3.1.1 Thời gian 17 vi LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 3.1.2 Địa điểm 17 3.2 Nội dung nghiên cứu 17 3.3 Vật liệu hóa chất 17 3.3.1 Vật liệu nghiên cứu 17 3.3.2 Hóa chất 17 3.4 Bố trí thí nghiệm 19 3.5 Phương pháp tiến hành .21 3.5.1 Thu thập mẫu bệnh phẩm .21 3.5.2 Ly trích RNA tổng số .21 3.5.3 Phản ứng RT-PCR 24 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27 4.1 Kết tủa RNA nồng độ LiCl khác 27 4.2 Thay đổi nồng độ Taq phản ứng 28 4.3 So sánh tỉ số OD ELISA với kết RT-PCR 30 4.4 Mối liên hệ kết RT-PCR với đặc điểm bệnh tích 32 Chƣơng KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 34 5.1 Kết luận 34 5.2 Đề nghị .34 TÀI LIỆU THAM KHẢO .35 Tài liệu tiếng Việt 35 Tài liệu tiếng Anh 36 PHỤ LỤC 38 vii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT BDV : Border disease virus BVDV : Bovine viral diarrhoea virus cDNA : Complementary deoxyribonucleotide acid ctv : cộng tác viên DEPC : Diethyl pyrocarbonate DTH : Dịch tả heo EDTA : Ethylendiaminetetraacid acetic ELISA : Enzyme linked immunosorbent assay dNTP : Deoxyribonucleoside triphosphate IRF-3 : IFN regulatory factor IFN : Interferon M-MLV : Moloney murine leukemia virus MOPS : [N-morpholino] propanesulfonic acid 3’NTR : 3’ nontranslated NSP : Nonstructural protein PBS : Phosphate buffered saline OD : Optical density OIE : Office International des Epizooties RNA : Ribonucleic acid RT-PCR : Reverse transcriptase – polymerase chain reaction SP : Structural protein Taq : Thermus aquaticus UV : Ultra violet UI : Unit viii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 1: Thành phần phản ứng RT-PCR 25 Bảng 1: Tỉ số OD hàm lượng RNA nồng độ LiCl 27 Bảng 2: Kết RT-PCR nồng độ Taq 29 Bảng 3: Tỉ số OD ELISA kết RT-PCR 30 Bảng 4: So sánh mức OD ELISA RT-PCR 31 Bảng 5: Đặc điểm bệnh tích mẫu RT-PCR dương tính âm tính .32 ix LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ Hình 1: Cấu trúc gen Pestivirus Hình 2: Phản ứng RT-PCR 12 Hình 1: Sản phẩm RT-PCR mẫu kết tủa nồng độ LiCl 28 Hình 2: Sản phẩm RT-PCR nồng độ Taq 29 Hình 3: Kết sản phẩm RT-PCR mẫu bệnh phẩm 33 Biểu đồ 1: Tỉ số OD hàm lượng RNA nồng độ LiCl 27 x LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 26 Buffer 10X gồm: 500 mM KCl, 100 mM Tris-Cl (pH 8,3 nhiệt độ phịng), 15 mM MgCl2 Quy trình nhiệt gen NS5B: Giai đoạn RT: 500C/30 phút, 950C/3phút Giai đoạn PCR: 35 chu kì (940C/1phút, 520C/1phút,720C/1phút) Bước kéo dài chuỗi: 720C/10phút Điện di gel Cách tiến hành: Pha lỗng dung dịch TBE 50X để có dung dịch TBE 0,5X Pha gel agarose với nồng độ 2%: Cân 0,25 g agarose cho vào 12,5 ml dung dịch TBE 0,5X Đun sơi lị viba cho agarose tan thật Để nguội đến 50-550C, đổ vào khuôn, cài lược vào Chờ 30 phút để agarose đông Gở lược đặt bảng gel vào buồn điện di cho chiều Cho dung dịch TBE ngập gel Load mẫu vào giếng với tỷ lệ μl loading dye μl mẫu Chạy điện di điều kiện 100 V, 400 mA 20 phút 60 V, 250 mA, thời gian khoảng 60 phút chạy chung với thang chuẩn Nhuộm ethidium bromide khoảng 20 phút Gel sau nhuộm chụp tia tử ngoại UV Nếu mẫu có sản phẩm băng sản phẩm phát sáng dạng vạch gel điện di Độ đậm nhạt băng điện di phản ánh độ nồng độ cao hay thấp sản phẩm RTPCR thu Đọc kết điện di Gen NS5B với sản phẩm thu băng điện di có kích thước khoảng 449 bp 3.6 XỬ LÝ SỐ LIỆU Số liệu dạng liên tục phân tích trắc nghiệm F So sánh tỉ lệ Chi bình phương LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 27 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 KẾT TỦA RNA Ở CÁC NỒNG ĐỘ LICL KHÁC NHAU Chúng tơi thực ly trích RNA từ mẫu lách dựa theo quy trình Chomeszynski Sacchi (1987) thu tủa RNA ethanol 100% kết hợp với LiCl nồng độ 1,0 M; 1,5 M; 2,0 M; 2,5 M Kết thu bảng 4.1 Bảng 1: Tỉ số OD hàm lƣợng RNA nồng độ LiCl Nồng độ LiCl Chỉ tiêu 1,0 M Tỉ số OD Hàm lượng RNA (µg/µl) 2,5 M 1,89 ± 0,2 1,99 ± 0,2 2,08 ± 0,2 2,46 ± 0,2 0,23 1,45 ± 0,2 1,61 ± 0,2 1,29 ± 0,2 1,07 ± 0,2 0,2 5 5 2,46 2,5 p 2,0 M Số mẫu 1,5 M 1,99 1,89 1,45 1,5 2,08 1,61 1,29 1,07 Tỉ số OD Hàm lượng RNA (µg/µl) 0,5 1M 1,5M 2M 2,5M Biểu đồ 4.1: Tỉ số OD hàm lƣợng RNA nồng độ LiCl Kết bảng 4.1 cho thấy độ tinh hàm lượng RNA thu nồng độ LiCl khác khơng có khác biệt có ý nghĩa phương diện thống kê LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 28 (P > 0,05) Tuy nhiên, khác biệt thí nghiệm sản phẩm RT-PCR thu được, thể hình 4.1 500 bp 449 bp Hình 4.1: Sản phẩm RT-PCR mẫu đƣợc kết tủa nồng độ LiCl Chú thích: L: Thang chuẩn (100 bp) 1: Kết tủa RNA ethanol 100% 2: Kết tủa RNA ethanol 100% + LiCl 1,0 M 3: Kết tủa RNA ethanol 100% + LiCl 1,5 M 4: Kết tủa RNA ethanol 100% + LiCl 2,0 M 5: Kết tủa RNA ethanol 100% + LiCl 2,5 M Từ kết thu nhận xét sản phẩm khuếch đại nồng độ LiCl khác khác nhau, băng sản phẩm điện di thu rõ dần lượng tạp chất giảm dần theo nồng độ LiCl tăng dần Điều giải thích chất lượng RNA ly trích Từ hình 4.1 nhận thấy sản phẩm giếng thứ (LiCl 2,5 M) rõ tạp từ biều đồ 4.1 nhận thấy độ tinh mẫu cao nồng độ LiCl 2,5 M Điều giải thích RNA thu nồng độ LiCl cao lẫn tạp Vì chọn nồng độ LiCl 2,5 M để kết tủa RNA q trình ly trích mẫu LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 29 4.2 THAY ĐỔI NỒNG ĐỘ TAQ TRONG PHẢN ỨNG Ở thí nghiệm thực phản ứng RT-PCR với nồng độ Taq khác 2,0 UI 2,5 UI, nồng độ thực phản ứng Kết thu bảng 4.2 Bảng 4.2: Kết RT-PCR nồng độ Taq Kết RT-PCR Nồng độ Taq Số mẫu thực Số mẫu thành công Tỉ lệ thành công 2,0 UI 5 100% 2,5 UI 5 100% Kết điện di sản phẩm RT-PCR thu nồng độ Taq Chú thích: L: Thang chuẩn (100 bp) 1: Ở nồng độ Taq 2,0 UI 449 bp 2: Ở nồng độ Taq 2,5 UI Hình 4.2: Sản phẩm RT-PCR nồng độ Taq Từ kết bảng 4.2 hình 4.2 cho thấy khơng có khác biệt phản ứng nồng độ Taq 2,0 UI 2,5 UI Vì vậy, chúng tơi chọn phản ứng RT-PCR với nồng độ Taq 2,0 UI, giảm lượng Taq phản ứng mà chất lượng phản ứng không thay đổi, giảm chi phí phản ứng LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 30 4.3 SO SÁNH TỈ SỐ CỦA ELISA VỚI KẾT QUẢ RT-PCR Bảng 4.3: Tỉ số OD ELISA kết RT-PCR Số thứ tự Kí hiệu mẫu Kết OD ELISA Kết RT-PCR 20 1,399 + 22 0,596 - 23 0,613 - 24 1,656 - 25 0,617 - 26 1,579 - 27 0,641 - 29 2,248 + 30 3,535 + 10 33 3,268 + 11 37 3,327 - 12 43 2,751 + 13 45 1,114 - 14 53 0,953 - 15 54 0,928 + 16 57 2,746 + 17 60 3,471 - 18 0,492 - 19 11 1,006 - 20 13 0,726 - 21 14 0,492 - 22 16 0,727 - 23 17 1,307 - LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 31 Chúng so sánh kết RT-PCR với khoảng tỉ số OD ELISA từ 0,49 – 1; > - > – 3,5 Kết so sánh trình bày bảng 4.4 Bảng 4.4: So sánh mức OD ELISA RT-PCR TỈ SỐ OD CỦA ELISA RT-PCR (+) RT-PCR (-) TỔNG TỈ LỆ (+) 0,49 – 1 10 11 9% >1–2 20% > – 3,5 71% TỔNG 16 23 30,4% SAI BIỆT THỐNG KÊ P = 0,018 Từ kết bảng 4.4 cho thấy kết RT-PCR phụ thuộc vào tỉ số OD ELISA (P < 0,05) Tỉ lệ (%) mẫu dương tính với RT-PCR cao (71%) tương ứng với mức tỉ số OD > – 3,5 Điều giải thích hàm lượng kháng ngun có mẫu xét nghiệm tỉ lệ thuận với tỉ số OD ELISA Hầu hết khoảng tỉ số OD có mẫu dương tính với RT-PCR; nhiên, tỉ lệ (%) mẫu dương tính với RT-PCR so với tổng số mẫu dương tính với ELISA khơng cao Điều mặt ảnh hưởng yếu tố OD ELISA; mặt khác ảnh hưởng yếu tố bất cập q trình ly trích RNA (giai đoạn vortex, giai đoạn phơi mẫu), bảo quản mẫu yếu tố bất lợi môi trường làm việc tác động đến phân hủy RNA trước bước vào giai đoạn RT-PCR LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 32 4.4 MỐI LIÊN HỆ GIỮA KẾT QUẢ RT-PCR VỚI ĐẶC ĐIỂM BỆNH TÍCH Bảng 5: Đặc điểm bệnh tích mẫu RT-PCR dƣơng tính âm tính Cơ quan Bệnh tích RT-PCR(+) RT-PCR (-) n Tỉ lệ (% n Tỉ lệ (%) Da Xuất huyết 100 16 100 Thận Xuất huyết Sung huyết Hoại tử điểm Viêm dính Loét cúc áo Không biểu 0 42,8 14,3 0 14,3 28,6 2 12,5 12,5 18,75 6,25 50 Ruột già Xuất huyết Loét cúc áo Không biểu 57,1 14,3 28,6 10 31,25 6,25 62,5 Hạch màng treo ruột Xuất huyết Sưng Sưng + xuất huyết Sưng + tụ huyết Không biểu 3 42,8 42,8 14,3 1 11 18,75 6,25 6,25 68,75 Bàng quang Xuất huyết Không biểu 42,8 57,9 15 6,25 93,75 Lách Xuất huyết Nhồi huyết Nhồi huyết + xuất huyết Sưng+XH Sưng+NH Không biểu 0 14,3 71,4 14,3 0 1 25 56,25 6,25 6,25 6,25 Van hồi manh tràng Xuất huyết Không biểu 57,9 42,1 14 12,5 87,5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 33 Từ kết bảng 4.6 cho thấy mẫu dương tính với RT-PCR có biểu bệnh tích xuất huyết hầu hết quan (> 42%) so với bệnh tích khác, nhiên lách biểu bệnh tích nhồi huyết chiếm tỉ lệ cao (71,4%) Đồng thời mẫu RT-PCR âm tính biểu bệnh tích nhồi huyết lách chiếm tỉ lệ cao 56,25% bệnh tích khác rải rác chiếm tỉ lệ khơng cao Vì vậy, chúng tơi nhận xét bệnh DTH thường biểu bệnh tích xuất huyết hầu hết quan, kết hợp với nhồi huyết lách với biểu bệnh tích khơng sưng, sung huyết, loét cúc áo… quan Thông thường, độ chuẩn cao virus quan sát lách, xương, hạch bạch huyết nội tạng cấu trúc dạng bạch huyết màng treo ruột non (Artois ctv, 2002) Theo quan sát làm thí nghiệm hầu hết mẫu bệnh phẩm dương tính mẫu lách có nhồi huyết quanh rìa lách Vì vậy, chúng tơi cho mẫu lách thích hợp dùng làm mẫu bệnh phẩm chẩn đốn DTH Ngồi ra, từ bảng 4.6 cho thấy hạch màng treo ruột biểu xuất huyết tỉ lệ cao (85,6%) mẫu chẩn đốn dương tính; mẫu âm tính tỉ lệ thấp (25%) Do đó, chúng tơi nhận xét ngồi mẫu lách hạch màng treo ruột xem mẫu thích hợp dùng chuẩn đốn bệnh DTH Chú thích: L: Thang chuẩn (100 bp) C: Đối chứng (+) (cung cấp Trung tâm Thú y vùng thành phố Hồ Chí Minh) 1, 2, 3, 4: Các mẫu có virus DTH Hình 3: Kết sản phẩm RT-PCR mẫu bệnh phẩm LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 34 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN (1) Xác định quy trình tách chiết RNA thích hợp từ mẫu lách Nồng độ LiCl 2,5 M cho tủa RNA với độ tinh chất lượng sản phẩm khuếch đại cao (2) Đưa quy trình RT-PCR bước phát gen NS5B virus DTH với nồng độ Taq giảm từ 2,5 UI xuống UI chất lượng sản phẩm khuếch đại không thay đổi (3) Mức tỉ số OD ELISA mẫu lớn cho kết RT-PCR dương tính cao (4) Kết hợp đặc điểm bệnh tích thường gặp heo nhiễm bệnh DTH thông qua kết chẩn đốn RT-PCR dương tính(bệnh tích xuất huyết hầu hết quan kết hợp với nhồi huyết lách với số biểu bệnh tích khác) 5.2 ĐỀ NGHỊ (1) Thực thêm nhiều thử nghiệm q trình ly trích phản ứng RT-PCR phát virus nhằm tạo quy trình chẩn đốn tối ưu ứng dụng thực tiễn chẩn đốn bệnh DTH nhanh, tốn (2) Tiến hành xác định trình tự nucleotide sản phẩm khuếch khẳng định xác virus DTH Đồng thời so sánh trình tự virus phân lập với trình tự chủng virus phân lập có liệu NCBI nhằm định chủng virus DTH nước ta LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Bùi Chí Bửu Nguyễn Thị Lang, 1999 Di truyền phân tử - Những nguyên tắc chọn giống trồng Nhà xuất Nông Nghiệp, trang 195 – 209 Bùi Nghĩa Vượng, Ken Inui, Hồ Thu Hương, Nguyễn Tiến Dũng Chuẩn đoán bệnh dịch tả heo phương pháp RT-PCR với mẫu máu lấy giấy thấm Báo cáo khoa học Chăn nuôi Thú y 2002-2003 Hồ Huỳnh Thuỳ Dương, 2002 Sinh Học Phân Tử (Khái niệm – Phương pháp - Ứng dụng) Tái lần 2, NXB Giáo Dục, Thành Phố Hồ Chí Minh Hồ Thu Hương , Ken Inui, Bùi Trọng Nghĩa, Đào Thanh Vân, Nguyễn Thuý Duyên, Kenji Kawashima Nguyễn Tiến Dũng, 2004 So sánh phương pháp chuẩn đoán virut dịch tả heo từ mẫu bảo quản điều kiện khác Báo cáo khoa học CNTY, Bộ NN & PTNT, 13-16 Kim Văn Phúc, Đặng Hùng, Phạm Thị Vui, Chris Morrissy, Nguyễn Thị Lam Hương, Nguyễn Thị Thu Hồng, Trần Đình Từ, 2004 Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật RT-PCR để phát virus dịch tả heo Báo cáo khoa học Chăn nuôi Thú y, Bộ NN & PTNT, 360-367 Nguyễn Thế Vinh, Ken Inui, Hồ Thu Hương Nguyễn Tiến Dũng, 2004 Phân tích di truyền virus dịch tả lợn Việt Nam Báo cáo khoa học Chăn nuôi Thú y, Bộ NN& PTNT, 10-13 Nguyễn Thị Phương Duyên, Đỗ Văn Khuyên, Dư Đình Quân, 2001 Khảo sát hội chứng sốt, táo bón, bỏ ăn đến chết đàn lợn sinh sản đàn lợn tỉnh Khánh Hoà Quảng Ngãi Báo cáo khoa học CNTY, Bộ NN & PTNT, 10-12/4/2001 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 36 Nguyễn Tiến Dũng, 1999 Dịch tả lợn cổ điển vấn đề thời sự: Tình hình bệnh đáng sợ Tạp chí khoa học kỹ thuật Thú y, tập 4, 2:1999 Nguyễn Tiến Dũng, Nguyễn Văn Quang, Hồ Thu Hương, Ngơ Thanh Long, Đào Thanh Vân Tình hình nhiễm bệnh virut đàn trâu bò Việt Nam Báo cáo khoa học Chăn nuôi Thú y 2002-2003 10 Phan Cự Nhân, 2001 Di truyền học động vật Nhà xuất Khoa Học Kỹ Thuật Hà Nội Tài liệu tiếng Anh 11 Akemi Kamakawa, Ho Thi Viet Thu, Shunji Yamada, Masanori Kubo, Seishi Yamasaki Toshiaki Taniguchi, 2003 Classical swine fever among pig herds and its control in Cantho province, Mekong delta Department of Veterinary Medicine, Faculty of Agriculture, Can Tho University 12 Artois M., K.R Depner, V Guberti, J Hars S Rossi, 2002 Classical swine fever (hog cholera) in wild boar in Europe Rev sci tech Off Int Epiz., 2002, 21 (2), 287-303 13 Brett D Lindenbach, Heinz-Jurgen Thiel Charles M R, 2007 Flaviviridae: The viruses and their replication Fields Virology, 5th Edition D M Knipe and P M Howley, Eds Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia (2007) 14 Chomczynski and Sacchi, 1987 Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate - phenol - chloroform extraction Analytical Biochemistry 162: 156-159 15 EU diagnostic manual for classical swine fever (CSF) diagnosis: Technical Part, 3/2002 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 37 16 Harding M., 1994 Reverse transcriptase-PCR assay for detection of hog cholera virus Jounal of Clinical Biology, 32(10): 2600-2602 17 Joseph Sambrook David W Russell, 2001 Molecular cloning Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York 18 Paton D J, A McGoldrick, S Belak, C Mittelholzer, F Koenen, H Biagetti, G M De Mia, T Stadejek, M A Hofmann, B Thuer, 2000 Classical swine fever virus: a ring test to evaluate RT-PCR detection methods Veterinary Microbiology 73 (2000) 159-174 19 Paton D J., McGoldrick, A., Greiser-Wilke, I., Parchariyanon, S., Song, J., Liou, P P., Stadejek, T., Lowings, J P., Bjorklund, H., and Belak, S., 2000 Genetic typing of classical swine fever virus Veterinary Microbiology 73: 137-157 20 Pereda J A., 2005 Phylogenetic analysis of classical swine fever virus (CSFV) field isolates from outbreaks in South and Central America Virus Research 110: 111-118 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com PHỤ LỤC Kết phân tích thống kê thí nghiệm  Kết phân tích tỉ số OD One-Way Analysis of Variance -Data: ODM.OD Level codes: ODM.T Labels: Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD Analysis of variance -Source of variation Sum of Squares d.f Mean square F-ratio Sig level -Between groups 9123689 3041230 1.576 2342 Within groups 3.0882848 16 1930178 -Total (corrected) 4.0006538 19 missing value(s) have been excluded Analysis of Variance for ODM.OD - Type III Sums of Squares -Source of variation Sum of Squares d.f Mean square F-ratio Sig level -MAIN EFFECTS A:ODM.T 9123689 3041230 1.576 2342 RESIDUAL 3.0882848 16 1930178 -TOTAL (CORRECTED) 4.0006538 19 -0 missing values have been excluded All F-ratios are based on the residual mean square error Table of Least Squares Means for ODM.OD -95% Confidence Level Count Average Stnd Error for mean -GRAND MEAN 20 2.1042500 0982389 1.8959411 2.3125589 A:ODM.T 1.8902000 1964779 1.4735822 2.3068178 1.5 1.9896000 1964779 1.5729822 2.4062178 2.0822000 1964779 1.6655822 2.4988178 2.5 2.4550000 1964779 2.0383822 2.8716178 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Multiple range analysis for ODM.OD by ODM.T -Method: 95 Percent LSD Level Count LS Mean Homogeneous Groups -1 1.8902000 X 1.5 1.9896000 X 2.0822000 X 2.5 2.4550000 X -contrast difference +/limits - 1.5 -0.09940 0.58919 - -0.19200 0.58919 - 2.5 -0.56480 0.58919 1.5 - -0.09260 0.58919 1.5 - 2.5 -0.46540 0.58919 - 2.5 -0.37280 0.58919 * denotes a statistically significant difference  Kết phân tích hàm lƣợng RNA One-Way Analysis of Variance -Data: HLR.RNA4 Level codes: HLR.N Labels: Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD Analysis of variance -Source of variation Sum of Squares d.f Mean square F-ratio Sig level -Between groups 7887456 2629152 1.654 2168 Within groups 2.5438976 16 1589936 -Total (corrected) 3.3326432 19 missing value(s) have been excluded Analysis of Variance for HLR.RNA4 - Type III Sums of Squares -Source of variation Sum of Squares d.f Mean square F-ratio Sig level -MAIN EFFECTS A:HLR.N 7887456 2629152 1.654 2168 RESIDUAL 2.5438976 16 1589936 -TOTAL (CORRECTED) 3.3326432 19 -0 missing values have been excluded All F-ratios are based on the residual mean square error LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Table of Least Squares Means for HLR.RNA4 -95% Confidence Level Count Average Stnd Error for mean -GRAND MEAN 20 1.3588000 0891610 1.1697403 1.5478597 A:HLR.N 1.4512000 1783220 1.0730806 1.8293194 1.5 1.6144000 1783220 1.2362806 1.9925194 1.2928000 1783220 9146806 1.6709194 2.5 1.0768000 1783220 6986806 1.4549194 -Multiple range analysis for HLR.RNA4 by HLR.N -Method: 95 Percent LSD Level Count LS Mean Homogeneous Groups -2.5 1.0768000 X 1.2928000 XX 1.4512000 XX 1.5 1.6144000 X -contrast difference +/limits - 1.5 -0.16320 0.53474 - 0.15840 0.53474 - 2.5 0.37440 0.53474 1.5 - 0.32160 0.53474 1.5 - 2.5 0.53760 0.53474 * - 2.5 0.21600 0.53474 -* denotes a statistically significant difference Kết phân tích khảo sát Summary Statistics for Contingency Tables (Page 1) Chi-square D.F Significance 8.18015 0.0167380 WARNING: Expected values in cells < and cells < With rows With columns Statistic Symmetric dependent dependent Lambda 0.36842 0.33333 0.42857 Uncertainty Coeff 0.21425 0.17003 0.28957 Somer's D -0.51613 -0.64286 -0.43114 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com ... đoạn gen khác NS5B, 5’NTR virus phân lập từ ổ dịch Gen NS5B gen gen virus DTH sử dụng nhiều nghiên cứu xác định chủng, phân loại di truyền virus Vì việc thực đề tài ? ?Phát virus DTH dựa đoạn gen. .. SINH HỌC  KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP PHÁT HIỆN VIRUS BỆNH DỊCH TẢ HEO DỰA TRÊN ĐOẠN GEN NS5B Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: PGS.TS TRẦN THỊ DÂN NGÔ THỊ THU NGÂN KS VƢƠNG... phát virus DTH dựa đoạn gen NS5B 1.2.2 Yêu cầu Xác định triệu chứng bệnh tích heo bệnh, thu nhận mẫu bệnh phẩm Ly trích RNA tổng số Chạy RT-PCR theo dẫn liệu Paton cộng (2000) để nhân vùng gen NS5B