Phân lập các hợp chất có khả năng gây độc tố tế bào ung thư tuyến tuỵ panc i và psn 1 từ keo ong dú trigona minor ở bến tre việt nam

ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆTHÀNH ĐỒN TP HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO NGHIỆM THU - -1 ThS NGUYỄN XUÂN HẢI CƠ QUAN CHỦ TRÌ: TRUNG TÂM PHÁT TRIỂN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRẺ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 09/2014 SỞ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH THÀNH ĐỒN TP HỒ CHÍ MINH CHƢƠNG TRÌNH VƢỜN ƢƠM SÁNG TẠO KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRẺ * BÁO CÁO NGHIỆM THU (Đã chỉnh sửa theo góp ý Hội đồng nghiệm thu ngày 27/09/2014) PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT CÓ KHẢ NĂNG GÂY ĐỘC TẾ -1 TỪ KEO ONG DÚ (TRIGONA MINOR Thủ trƣởng Cơ quan chủ trì đề tài (Họ tên, chữ ký, đóng dấu) Chủ nhiệm đề tài (Họ tên chữ ký) Giám đốc Sở Khoa học Công nghệ Chủ tịch Hội đồng nghiệm thu Phân lập 10 hợp chất tinh khiết từ keo ong Trigona minor 2-5 Hợp chất có khả tế bào ung thư PSN-1 50< 100 µM Phân lập 10 hợp chất tinh khiế Hợp chất có khả tế bào ung thư 50< 100 µM 1B -1 1B , ĐHQG-HCM MỤC LỤC MỤC LỤC i .iv DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT vi TỔNG QUAN TỔNG QUAN VỀ LỒI ONG KHƠNG NGÕI ĐỐT 1.1 Giới thiệu loài ong mật 1.2 Các chi lồi ong khơng ngịi đốt 1.2.1 Chi Trigona 1.2.2 Chi Melipona 1.3 Sản phẩm lồi ong khơng ngòi đốt 1.4 Thành phần hóa học keo ong số lồi ong khơng ngịi đốt 1.4.1 Thành phần hóa học keo ong lồi Trigona spinipes Brazil 1.4.2 Thành phần hóa học keo ong lồi Tetragonula carbonaria Ưc 1.4.3 Thành phần hóa học keo ong loài Melipona subnitida Brazil 1.4.4 Thành phần hóa học keo ong lồi Melipona interrupta Brazil 1.4.5 Thành phần hóa học keo ong loài Melipona beecheii Mexico 1.5 Hoạt tính sinh học keo ong số lồi ong khơng ngịi đốt .7 1.5.1 Hoạt tính kháng ung thư keo ong loài Trigona laeviceps Thái Lan 1.5.2 Hoạt tính kháng khuẩn keo ong lồi Trigona sp Ấn Độ 1.5.3 Hoạt tính kháng khuẩn keo ong số lồi thuộc chi Melipona 1.5.4 Hoạt tính kháng tăng trưởng dòng tế bào ung thư keo ong khơng ngịi đốt lồi Melipona scutellaris Brazil 1.5.5 Một số hoạt tính sinh học keo ong loài Melipona orbignyi Brazil TỔNG QUAN VỀ UNG THƯ TUYẾN TỤY 2.1 Giới thiệu ung thư tuyến tụy 2.1.1 Tụy ung thư tuyến tụy 2.1.2 Phân loại ung thư tuyến tụy 10 2.1.3 Các phương pháp điều trị ung thư tuyến tụy 11 2.1.3.1 Hóa trị 11 i 2.1.3.2 Xạ trị 11 2.1.3.3 Phẫu thuật 11 2.1.3.4 Phương pháp hỗ trợ điều trị 12 2.1.4 Một số dòng tế bào ung thư tuyến tụy 12 2.2 Một số hợp chất phân lập từ tự nhiên có khả kháng ung thư tuyến tụy dòng tế bào PANC-1 -1 13 2.2.1 13 2.2.2 14 2.2.3 15 2.3 Phương pháp thử hoạt tính kháng ung thư tuyến tụy 17 2.3.1 Nguyên tắc 17 2.3.2 Đánh giá khả gây độc tế bào ung thư .18 2.3.2.1 Khả gây độc tế bào ung thư 18 2.3.2.2 Giá trị PC50 cách xác định giá trị PC50 18 MỤC TIÊU ĐỀ TÀI THỰC NGHIỆM HÓA CHẤT, DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ 19 3.1 Hóa chất 19 3.2 Dụng cụ 19 3.3 Thiết bị 20 QUY TRÌNH THỬ HOẠT TÍNH KHÁNG UNG THƯ TUYẾN TỤY 20 4.1 Chuẩn bị hóa chất 20 4.2 Nuôi cấy tế bào .21 4.3 Quy trình thử hoạt tính 21 PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÖC CÁC HOẠT CHẤT TỪ CAO HEXANE CỦA KEO ONG LOÀI TRIGONA MINOR 21 5.1 Nguyên liệu 21 5.2 Ly trích điều chế cao thơ 21 5.3 Phân lập hoạt chất từ phân đoạn cao hexane 22 5.3.1 Phân đoạn B 24 5.3.2 Phân đoạn D 24 ii 5.3.3 Phân đoạn H 24 5.3.4 Phân đoạn I 28 5.3.5 Phân đoạn J 30 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN BIỆN LUẬN CẤU TRÖC CÁC HỢP CHẤT PHÂN LẬP ĐƯỢC 33 6.1 Cấu trúc hợp chất phân lập 33 6.2 Hợp chất .34 6.3 Hợp chất .36 6.4 Hợp chất .39 6.5 Hợp chất .41 6.6 Hợp chất .43 6.7 Hợp chất .47 6.8 Hợp chất .49 6.9 Hợp chất .53 6.10 Hợp chất .55 6.11 Hợp chất 10 59 KẾT QUẢ THỬ HOẠT TÍNH KHÁNG UNG THƯ TUYẾN TỤY 61 7.1 Kết thử hoạt tính mẫu cao 61 7.2 Kết thử hoạt tính hợp chất phân lập 62 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN 63 KIẾN NGHỊ 64 TÀI LIỆU THAM KHẢO 65 70 iii ốt loài Trigona minor , có ba hợp chất mớ A (5), trigonone A (7) trigonol B (9 trigonol , với hợp chấ (1), mangiferolicacid (2), 23-hydroxymangiferonicacid(3), 23-hydroxymangiferolicacid(4), 27-hydroxymangiferonicacid(6), 27- hydroxymangiferolicacid (8), 27-hydroxyisomangiferolicacid (10 Các hợp chất h thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư tuyến tụy dòng PANC-1 3, 5, 7-10 hoạt tính mạnh, với giá trị PC50 32.3, 52.8, 25.3, 52.1, 31.8 31.0 µM 1, 2, 100µM - -1 Từ khóa: Trigona minor, keo ong, triterpene khung cycloartane, PANC-1, PSN-1 iv ABSTRACT From the ethanolic extract of the propolis of Trigona minor, three new cycloartane-type triterpenes named trigonol A (5),trigonone A (7), and trigonol B (9), together with seven known cycloartane-type triterpenes, including mangiferonic acid (1), mangiferolicacid hydroxymangiferolicacid(4), (2), 23-hydroxymangiferonicacid(3), 27-hydroxymangiferonicacid(6), 2327- hydroxymangiferolicacid (8), and 27-hydroxyisomangiferolicacid (10) have been isolated Their chemical structures were determined by extensive NMR spectroscopic analysis All compounds were tested for preferential cytotoxicity against PANC-1 human pancreatic cell line in the nutrient starvation condition (NDM) Among them, compounds 3, 5, 7-10 showed potent preferentially cytotoxic candidates with PC50 values of 32.3, 52.8, 25.3, 52.1, 31.8 and 31.0 µM, respectively However, compounds 1, 2, and 6displayed weak cytotoxicityagainst both PANC-1 and PSN-1 cells at a concentration of 100 µM Keywords: Trigona minor, propolis, cycloartane-type triterpenes, PANC-1, PSN1 v DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT MeOH : methanol EtOH : ethanol EtOAc : ethyl acetate MeCN : acetonitrile CDCl3 : deuterated chloroform DMSO-d6 : deuterated dimetylsufoside NMR : Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy (phổ cộng hưởng từ hạt nhân) H-NMR 13 : phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H C-NMR : phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C DEPT : Distortionless Enhancement by Polarization Transfer COSY : COrrelation SpectroscopY (phổ tương quan 1H-1H) HSQC : Heteronuclear Single Quantum Correlation spectroscopy (phổ tương quan 1H-13C qua nối) HMBC : Heteronuclear Multiple Bond Correlation spectroscopy (phổ tương quan 1H-13C qua 2, nối) NOESY : Nuclear Overhause Effect Spectroscopy (phổ tương quan 1H-1H bán kính 5Å) HR-MS : High Resolution Mass Spectroscopy (phổ khối lượ ) δH, δC : độ dịch chuyển hóa học 1H, 13C s : singlet (mũi đơn) d : doublet (mũi đôi) dd : doublet of doublets (mũi đôi - đôi) vi t : triplet (mũi ba) m : multiplet (mũi đa) br : broad (mũi bầu) J : số ghép Hz, MHz : hertz, megahertz ppm : part per million EC50 : Effective Concentration (nồng độ ức chế 50 % vi khuẩn) IC50 : Inhibitory Concentration (nồng độ ức chế 50 % enzyme) PC50 : Preferential Cytotoxicity (nồng độ gây độc 50 % tế bào ung thư) PC100 : Preferential Cytotoxicity (nồng độ gây độc 100 % tế bào ung thư) PTLC : Preparative Thin Layer Chromatography (sắc ký mỏng điều chế) CCNP : Column Chromatography Normal Phase (sắc ký cột pha thường) DNA : DeoxyriboNucleic Acid MTT : 3-(4,5-diMethyl-2-Thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-Tetrazolium bromide DMEM : Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (mơi trường ni cấy tế bào có dinh dưỡng) NDM : Nutrient Deprived Medium (môi trường nuôi cấy thiếu dinh dưỡng) FBS : Fetal Bovine Serum (huyết bào thai bò) PBS : Phophates Buffer Saline (đệm phosphate) HEPES : 4-(2-HydroxyEthyl)-1-PiperazinEthanSulfonic acid MEM : MinimumEssentialMedium (môi trường cần thiết tối thiểu) MIC : Minimum Inhibitory Concentration (nồng độ chất ứcchế tối thiểu) MBC : Minimum Bactericidal Concentration (nồng độ diệt khuẩntốithiểu) MFC : Minimum Fungicidal Concentration (nồng độ diệt nấm tối thiểu) TGI : Total Growth Inhibition(tổng nồng độ ức chế tăng trưởng) vii Phụ lục 6b Phổ 13C-NMR hợp chất (CDCl3) Phụ lục 6c Phổ DEPT hợp chất (CDCl3) 83 Phụ lục 7a Phổ 1H-NMR hợp chất (CDCl3) Phụ lục 7b Phổ 13C-NMR hợp chất (CDCl3) 84 Phụ lục 7c Phổ DEPT hợp chất (CDCl3) Phụ lục 7d Phổ COSY hợp chất (CDCl3) 85 Phụ lục 7e Phổ HSQC hợp chất (CDCl3) Phụ lục 7f Phổ HMBC hợp chất (CDCl3) 86 Phụ lục 7g Phổ NOESY hợp chất (CDCl3) Phụ lục 7h Phổ MS hợp chất 87 Phụ lục 8a Phổ 1H-NMR hợp chất (CDCl3) Phụ lục 8b Phổ 13C-NMR hợp chất (CDCl3) 88 Phụ lục 8c Phổ DEPT hợp chất (CDCl3) Phụ lục 9a Phổ 1H-NMR hợp chất (CDCl3) 89 Phụ lục 9b Phổ 13C-NMR hợp chất (CDCl3) Phụ lục 9c Phổ DEPT hợp chất (CDCl3) 90 Phụ lục 9d Phổ COSY hợp chất (CDCl3) Phụ lục 9e Phổ HSQC hợp chất (CDCl3) 91 Phụ lục 9f Phổ HMBC hợp chất (CDCl3) Phụ lục 9g Phổ NOESY hợp chất (CDCl3) 92 Phụ lục 9h Phổ MS hợp chất Phụ lục 10a Phổ 1H-NMR hợp chất 10 (CDCl3) 93 Phụ lục 10b Phổ 13C-NMR hợp chất 10 (CDCl3) 94 ONG LOÀI TRIGONA MINOR ẠT TÍNH GÂY ĐỘC UNG THƢ TUYẾN TỤY TRÊN DỊNG TẾ BÀO PANC-1 , Đỗ Văn Nhật Trường, Nguyễn Thị Thanh Mai, Nguyễn Trung Nhân Khoa Hóa Học - Đại học Khoa Học Tự Nhiên - ĐHQG Tp HCM ốt lồi Trigona minor , có ba hợp chất mớ trigonol A (5), trigonone A (7) trigonol B (9 , với hợp chấ mangiferonic acid (1), mangiferolicacid (2), 23-hydroxymangiferonicacid(3), 23hydroxymangiferolicacid(4), 27-hydroxymangiferonicacid(6), 27-hydroxymangiferolicacid (8), 27-hydroxyisomangiferolicacid (10 Các hợp chất thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư tuyến tụy dòng PANC-1 Trong đó, 3, 5, 7-10 hoạt tính mạnh, với giá trị PC50 32.3, 52.8, 25.3, 52.1, 31.8 31.0 µM Từ khóa: Trigona minor, keo ong, triterpene khung cycloartane, PANC-1 Tóm tắt: CYCLOARTANE-TYPE TRITERPENES FROM THE PROPOLIS OF TRIGONA MINOR AND THEIR PREFERENTIAL CYTOTOXICITY AGAINST PANC-1 HUMAN PANCREATIC CANCER CELL LINE Nguyen Xuan Hai, Do Van Nhat Truong, Nguyen Thi Thanh Mai, Nguyen Trung Nhan Faculty of Chemistry - University of Science - VNU HCMC Abstract: From the ethanolic extract of the propolis of Trigona minor, three new cycloartane-type triterpenes named trigonol A (5),trigonone A (7), and trigonol B (9), together with seven known cycloartane-type triterpenes, including mangiferonic acid (1), mangiferolicacid (2), 23-hydroxymangiferonicacid(3), 23-hydroxymangiferolicacid(4), 27hydroxymangiferonicacid(6), 27-hydroxymangiferolicacid (8), and 27hydroxyisomangiferolicacid (10) have been isolated Their chemical structures were determined by extensive NMR spectroscopic analysis All compounds were tested for preferential cytotoxicity against PANC-1 human pancreatic cell line in the nutrient starvation condition (NDM) Among them, compounds 3, 5, 7-10 showed potent preferentially cytotoxic candidates with PC50 values of 32.3, 52.8, 25.3, 52.1, 31.8 and 31.0 µM, respectively Keywords: Trigona minor, propolis, cycloartane-type triterpenes, PANC-1 95 ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ĐỖ VĂN NHẬT TRƢỜNG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HĨA HỌC VÀ HOẠT TÍNH KHÁNG UNG THƢ TUYẾN TỤY TỪ CAO HEXAN CỦA KEO ONGLỒITRIGONAMINOR KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS NGUYỄN XUÂN HẢI THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH -2013 96 ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN  ɷ ɷ  TRẦN THANH DUY NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HĨA HỌC VÀ HOẠT TÍNH KHÁNG UNG THƢ TUYẾN TỤY CỦA KEO ONG LOÀITRIGONAMINOR TIỂU LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS NGUYỄN XUÂN HẢI Thành phố Hồ Chí Minh - 2014 97