Nghiên cứu ứng dụng công nghệ chỉnh sửa gen crispr cas9 trên cây dưa leo cucumis sativus l hướng đến tạo giống dưa leo có khả năng kháng virus

SỞ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN TRUNG TÂM CƠNG NGHỆ SINH HỌC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ NHIỆM VỤ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ CHỈNH SỬA GEN CRISPR/Cas9 TRÊN CÂY DƯA LEO (Cucumis sativus L.) HƯỚNG ĐẾN TẠO GIỐNG DƯA LEO CÓ KHẢ NĂNG KHÁNG VIRUS Cơ quan chủ trì nhiệm vụ: Trung tâm Cơng nghệ sinh học TP HCM Chủ nhiệm nhiệm vụ: TS Nguyễn Xuân Dũng Thành phố Hồ Chí Minh - 2022 SỞ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN TRUNG TÂM CÔNG NGHỆ SINH HỌC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH CỘNG HỊA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc Thành phố Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2022 BÁO CÁO THỐNG KÊ KẾT QUẢ THỰC HIỆN NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ I THÔNG TIN CHUNG Tên nhiệm vụ Nghiên cứu ứng dụng công nghệ chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 dưa leo (Cucumis sativus L.) hướng đến tạo giống dưa leo có khả kháng virus Thuộc: Chương trình/lĩnh vực: Chương trình mục tiêu phát triển giống cây, giống chất lượng cao địa bàn Thành phố Hồ Chí Minh (Quyết định số 4652/QĐ-UBND ngày 06/09/2016) Chủ nhiệm nhiệm vụ Họ tên: Nguyễn Xuân Dũng Ngày, tháng, năm sinh: 29/04/1979 Nam/ Nữ: Nam Học hàm, học vị: Tiến sĩ Chức danh khoa học: Nghiên cứu viên Chức vụ: Trưởng phòng CNSH Thực vật Điện thoại: 090 380 04 38 Tổ chức: (84-28)37 153 792 E-mail: nguyenxuandung294@gmail.com Tên tổ chức công tác: Trung tâm Công nghệ Sinh học TP HCM Địa tổ chức: Số 2374, QL 1, Kp.2, P Trung Mỹ Tây, Q.12, TP HCM Địa nhà riêng: 147/19/10, Nguyễn Thị Minh Khai, khu 9, P Phú Hồ, TP Thủ Dầu Một, Bình Dương Tổ chức chủ trì nhiệm vụ Tên tổ chức chủ trì nhiệm vụ: Trung tâm Cơng nghệ Sinh học Thành phố Hồ Chí Minh Điện thoại: 028 37 153 792 Fax: 028 38 91 69 97 E-mail: ttcnsh.snn@tphcm.gov.vn Website: http://hcmbiotech.com.vn Địa chỉ: Số 2374, QL 1, Kp.2, P.Trung Mỹ Tây, Q.12, TP Hồ Chí Minh Họ tên thủ trưởng tổ chức: Nguyễn Đăng Quân Số tài khoản: 371.3.0.1007645 Tại: Kho bạc Nhà nước TP Hồ Chí Minh Tên quan chủ quản đề tài: Sở Nông nghiệp Phát triển nơng thơn II TÌNH HÌNH THỰC HIỆN Thời gian thực nhiệm vụ - Theo Hợp đồng ký kết: từ tháng 01 năm 2018 đến tháng 12 năm 2021 - Thực tế thực hiện: từ tháng 01 năm 2018 đến tháng 12 năm 2021 - Được gia hạn: từ tháng 01 năm 2022 đến tháng 06 năm 2022 Kinh phí sử dụng kinh phí a) Tổng số kinh phí thực hiện: 1.200.000.000 VNĐ, đó: + Kính phí hỗ trợ từ ngân sách khoa học: 1.200.000.000 VNĐ + Kinh phí từ nguồn khác: VNĐ b) Tình hình cấp sử dụng kinh phí từ nguồn ngân sách khoa học: Số TT Theo kế hoạch Thời gian Kinh phí (Tháng, năm) (đ) 1/2018350.000.000 12/2018 1/2019250.000.000 12/2019 1/2020300.000.000 12/2020 1/2021300.000.000 12/2021 Thực tế đạt Thời gian Kinh phí (Tháng, năm) (đ) 1/2018347.307.800 12/2018 1/2019217.644.800 12/2019 1/2020299.836.180 12/2020 1/2021296.968.600 12/2021 Ghi (Số đề nghị toán) 347.307.800 217.644.800 299.836.180 296.968.600 c) Kết sử dụng kinh phí theo khoản chi: Số Nội dung TT khoản chi Đơn vị tính: Đồng Thực tế đạt Nguồn Tổng NSKH khác Theo kế hoạch Tổng Nguồn khác NSKH Trả công lao động (khoa học, 440.307.000 phổ thông) Nguyên, vật 732.741.000 liệu, lượng Thiết bị, máy móc Xây dựng, sửa chữa nhỏ Chi khác 26.952.000 Tổng cộng 1.200.000.000 440.307.000 440.190.800 440.190.800 732.741.000 699.802.760 699.802.760 26.952.000 1.200.000.000 21.763.820 21.763.820 1.161.757.380 1.161.757.380 - Lý thay đổi (nếu có): Các văn hành trình thực đề tài/dự án Số TT Số, thời gian ban hành văn Tên văn Quyết định việc thành lập Hội đồng Khoa 01/QĐ-CNSH ngày học xét duyệt đề cương chi tiết đề tài sở cấp 09/01/2018 Trung tâm năm 2018 12/QĐ-CNSH ngày Quyết định việc phê duyệt đề tài nghiên cứu 05/03/2018 khoa học cấp sở năm 2018 53/HĐGV-CNSH ngày 28/03/2018 Quyết định việc thành lập Hội đồng Khoa 86/QĐ-CNSH ngày học đánh giá tiến độ nghiệm thu khoa học 25/06/2019 công nghệ năm 2018 32/2019/HĐ-SNN ngày 09/12/2019 Hợp đồng thực nhiệm vụ khoa học công nghệ cấp sở “Nghiên cứu ứng dụng công nghệ chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 dưa leo (Cucumis sativus L.) hướng đến tạo giống dưa leo có khả kháng virus” 151/QĐ-CNSH ngày 10/06/2020 Quyết định việc thành lập Hội đồng Khoa học đánh giá tiến độ nghiệm thu khoa học công nghệ năm 2019 352/QĐ-SNN ngày Quyết định gia hạn thời gian thực nhiệm Hợp đồng giao việc thực đề tài cấp sở năm 2018 Ghi vụ khoa học công nghệ cấp sở 08/10/2021 260/QĐ-CNSH ngày 22/10/2021 Quyết định việc thành lập Hội đồng Khoa học đánh giá tiến độ nghiệm thu khoa học công nghệ năm 2021 Cá nhân tham gia thực nhiệm vụ Số TT Tên cá nhân đăng ký theo Thuyết minh TS Nguyễn Xuân Dũng ThS Bùi Thị Tuyết KS Nguyễn Thị Thanh Thảo Tên cá nhân tham gia thực Nội dung tham gia Sản phẩm chủ yếu đạt TS Nguyễn Xuân Dũng Chủ trì thực đề tài, thiết kế thí nghiệm, kiểm tra, đánh giá kết thực Thiết kế thí nghiệm kiểm tra kết thực nội dung nghiên cứu Đảm bảo đề tài triển khai theo kế hoạch TS Nguyễn Xuân Dũng Thiết kế vector chỉnh sửa gen dựa Vector mang cấu trúc chỉnh sửa công nghệ gen CRISPR/Cas9 Xác định thay KS Huỳnh đổi vùng gen Nguyễn chỉnh sửa Minh thử nghiệm TCR Nghĩa giải trình tự KS Phan Lê Trâm Anh Xây dựng quy trình chuyển gen KS Nguyễn Thị Thanh Chuyển vector chỉnh sửa gen vào mô thông qua Ghi chú* Xác định thay đổi vùng gen chỉnh sửa phương pháp giải trình tự Nhân bổ sung Quy trình chuyển sau gen vào mô ThS mầm dưa leo Bùi Thị Tuyết nghỉ việc Cây dưa leo mang cấu trúc chỉnh sửa gen phục vụ cho Thảo ThS Phan Thủy Quyên vi khuẩn kiểm tra hiệu Agrobacterium chỉnh sửa gen tumefaciens Tái sinh thu nhận chỉnh sửa gen phương pháp nuôi cấy mô - Kiểm tra diện cấu trúc KS Huỳnh KS Huỳnh chỉnh sửa gen Nguyễn Nguyễn hiệu chỉnh Minh Minh sửa gen Nghĩa Nghĩa phương pháp PCR giải trình tự Đánh giá khả kháng virus chuyển gen phương pháp lây nhiễm virus nhân tạo Xác định diện virus thông qua triệu chứng biểu phát gen virus RT-PCR ThS Phan Thủy Quyên KS Nguyễn Thị Thanh Thảo KS Nguyễn Thị Kim Thoa (từ 03/2022) Xác định diện cấu trúc chỉnh sửa gen mẫu chuyển gen - Phân lập giải trình tự gen eIF4E dưa leo phục vụ cho so sánh đối chứng với kết chỉnh sửa gen Thực việc lây nhiễm virus nhân tạo kiểm tra diện virus dưa leo lây nhiễm - Lý thay đổi: ThS Bùi Thị Tuyết nghỉ việc từ 07/2018 ThS Phan Thủy Quyên nghỉ việc từ 03/2022 Nhân bổ sung sau ThS Phan Thủy Quyên nghỉ việc Tóm tắt nội dung, công việc chủ yếu: (Nêu mục 15 thuyết minh, không bao gồm: Hội thảo khoa học, điều tra khảo sát nước nước ngoài) Số TT Các nội dung, công việc chủ yếu (Các mốc đánh giá chủ yếu) Thời gian (Bắt đầu, kết thúc - tháng … năm) Theo kế hoạch Thực tế đạt Thiết kế vector chỉnh sửa gen - Phân tích chọn lọc trình tự sgRNA phù hợp cho chỉnh sửa gen 01 – 03/2018 01 – 03/2018 TS Nguyễn Xn Dũng (phân tích tài liệu chọn trình tự gen cần chỉnh sửa, chuyển cho công ty Merk thiết kế) 03 06/2018 TS Nguyễn Xuân Dũng KS Huỳnh Nguyễn Minh Nghĩa 01 06/2018 TS Nguyễn Xuân Dũng KS Nguyễn Thị Thanh Thảo ThS Phan Thủy Quyên KS Phan Lê Trâm Anh - Gắn sgRNA vào vector chỉnh sửa gen Người, quan thực Tạo chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens mang vector chỉnh sửa gen - Tạo dòng tế bào vi khuẩn khả nạp biến nạp vector chỉnh sửa gen vào tế bào vi khuẩn 03 06/2018 - Kiểm tra hiệu biến nạp chọn dòng vi khuẩn có mang vector chỉnh sửa gen Xây dựng quy trình tái sinh sàng lọc in vitro cho dưa leo Xây dựng quy trình chuyển KS Nguyễn Thị 07/2018 - 07/2018 gen chuyển cấu trúc chỉnh Thanh Thảo 12/2020 12/2021 sửa gen vào dưa leo ThS Phan Thủy 01 06/2018 Quyên KS Phan Lê Trâm Anh - Xác định nồng độ chất cảm ứng AS thời gian đồng ni cấy thích hợp cho chuyển gen - Xác định nồng độ kháng sinh hygromycin thích hợp cho sàng lọc mơ chuyển gen - Xác định nồng độ kháng sinh cefotaxim thích hợp cho khử khuẩn mô chuyển gen - Chuyển cấu trúc chỉnh sửa gen vào mô dưa leo Kiểm tra diện cấu trúc chỉnh sửa gen phân tích hiệu chỉnh sửa gen 06 12/2021 TS Nguyễn Xuân Dũng KS Huỳnh Nguyễn Minh Nghĩa KS Nguyễn Thị Thanh Thảo 0106/2022 TS Nguyễn Xuân Dũng KS Nguyễn Thị Thanh Thảo KS Nguyễn Thị Kim Thoa - Kiểm tra phương pháp PCR - Kiểm tra phương pháp Southern blot 0106/2021 - Khuếch đại vùng gen chỉnh sửa - Kiểm tra thay đổi trình tự gen sau chỉnh sửa Đánh giá khả kháng virus chuyển gen 0106/2022 - Lây nhiễm virus nhân tạo - Kiểm tra diện virus sau lây nhiễm III SẢN PHẨM KH&CN CỦA NHIỆM VỤ Sản phẩm KH&CN tạo a) Sản phẩm Dạng I: Số TT Tên sản phẩm tiêu chất lượng chủ yếu Vector chỉnh sửa gen Đơn vị đo Số lượng vector 01 Theo kế hoạch Thực tế đạt 01 vector có mang Vector có mang trình tự sgRNA trình tự sgRNA Dịng dưa leo có khả kháng virus dịng 02 – 03 dịng có kiểu hình bình thường, biểu khả 02 - 03 kháng virus (đạt mức 50%) so với khơng chuyển gen 05 dịng dưa leo có gen eIF4E chỉnh sửa, phát triển bình thường điều kiện nuôi cấy in vitro b) Sản phẩm Dạng II: Số TT Tên sản phẩm Yêu cầu khoa học cần đạt Theo kế hoạch Quy trình bao gồm Quy trình chỉnh sửa bước thực chi tiết, gen dưa cụ thể; có khả áp leo công nghệ dụng cho nghiên cứu giảng dạy điều CRIPR/Cas9 kiện Việt Nam Thực tế đạt Ghi Quy trình chỉnh sửa gen eIF4E dưa leo, bao gồm bước cụ thể, áp dụng cho nghiên cứu giảng dạy c) Sản phẩm Dạng III: Số TT Tên sản phẩm Bài báo khoa học Yêu cầu khoa học cần đạt Theo kế hoạch Thực tế đạt Bài báo nằm danh mục quy định Hội đồng chức danh Nhà nước: 02 báo nằm “Thiết lập quy trình danh mục chuyển gen vào dưa leo quy định Hội (Cucumis sativus L.) đồng chức danh qua trung gian vi khuẩn Nhà nước Agrobacterium tumefaciens” Tái sinh chồi từ mầm dưa leo nếp ta (Cucumis sativus L.) Số lượng, nơi công bố 01, Tuyển tập báo cáo tồn văn Hội nghị Cơng nghệ Sinh học tồn quốc 2020 01, Tạp chí Khoa học công nghệ nông nghiệp Việt Nam, ISSN: 18591558 d) Kết đào tạo: Số TT Cấp đào tạo, Chuyên ngành đào tạo Thạc sĩ Số lượng Ghi Theo kế Thực tế đạt (Thời gian kết thúc) hoạch 01 02 Lý Triệu Minh (đã