Nghiên cứu tổng hợp nano chitosan và đánh giá khả năng kháng nấm trên thực vật

N QU N L KHU N NG NGHI P TRUN T MN N ỨU V P NG NGH T TR ỂN N N N O TP HCM ỆP N N Ệ O BÁO CÁO NGHIỆM THU NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP NANO CHITOSAN V Đ N K Ả NĂN K N NẤM TRÊN THỰC VẬT CN Nguyễn Thị Hiếu Trang Th nh ph H Ch inh, h ng 01/2017 BAN QU N LÝ KHU NÔNG NGHI P CÔNG NGH CAO TRUNG TÂM NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO BÁO CÁO NGHIỆM THU (Đã chỉnh sửa theo góp ý Hội đ ng nghiệm thu) NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP NANO CHITOSAN V Đ N K Ả NĂN K Ơ QU N Ủ TRÌ (Ký tên, đóng dấu xác nhận) Th nh ph H Ch N NẤM TRÊN THỰC VẬT CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI (Ký tên) inh, h ng 01/2017 TÓM TẮT Nghiên cứu đề cập đến số đặc tính hạt nanochitosan tổng hợp phương pháp tạo gel ion với tác chất tripolyphosphte (TPP) chất bảo vệ polyvinyl pyrrolidone – K30 (PVP) Các hạt nanochitosan hình thành có kích thước dao động khoảng từ 40 – 300 nm điều kiện pH 4,5 tỷ lệ khối lượng CTS/ TPP 6:1 ác đặc tính hóa lý hạt nanochitosan đánh giá thơng qua kỹ thuật phân tích hóa lý khác FT-IR, XRD, FE – SEM, TEM DLS Hiệu kháng nấm Corticium salmonicola Berk Cercospara sp dung dịch nanochitosan nồng độ 150 ppm 97% 76% Phanerochaete salminicolor sau ngày xử lý Sau tuần, phun nanochitosan xử lý nấm Cercospora sp gây bệnh đốm lan Dendrobium sonia nồng độ 150 ppm tần suất phun lần/tuần với tỷ lệ nhiễm bệnh 20,33% ABSTRACT This study is concerned with certain properties of chitosan nanoparticles synthesized by ionic gelation method of chitosan and tripolyphosphate (TPP) and protective polyvinyl pyrrolidone – K30 (PVP) CTS/TPP weight ratio, solution pH and stabilizers were investigated These synthesized nanoparticles have an average diameter flutatuation form 40 – 300 nm in solution pH 4.5 and CTS/ TPP weight ratio (6:1) Their physicochemical properties were tested by different chemical and physical analysis techniques such as FT-IR, XRD, FE – SEM, TEM and DLS Antifungal effect of nanochitosan (150 ppm) against Corticium salmonicola Berk and Cercospara sp were found over 97% and over 76% with Phanerochaete salminicolor after days of incubation Dendrobium sonia were treated with nanochitosan at 150 ppm and times/ week that was able to inhibit the growth of Cercospora sp cause leaf spot disease with infection rate is 20,33% after weeks BM20-QT.QLKH Trang MỤC LỤC Trang Trang phụ bìa i Tóm tắt đề tài ii Mục lục iii Danh mục ký hiệu, chữ viết tắt vi Danh mục bảng vii Danh mục hình vẽ, đồ thị viii TH NG TIN ĐỀ TÀI MỞ ĐẦU hương – TỔNG QUAN TÀI LI U 1.1 Tổng quan chitosan 1.1.1 Công thức cấu tạo chitosan 1.1.2 Một số ứng dụng chitosan 4 1.3 Tổng quan Nanochitosan 1.3.1 Nanochitosan ưu điểm vượt trội 1.3.2 ác phương pháp chế tạo nanochitosan 7 1.3.2.1 Phương pháp tạo gel ion 1.3.2.2 Phương pháp khâu mạch nhũ tương 1.3.2.3 Phương pháp giọt tụ/ kết tủa 1.3.2.4 Phương pháp hợp giọt nhũ tương 1.3.2.5 Phương pháp mixen đảo 10 1.4 chế kháng ệnh hại trồng nanochitosan chitosan 10 1.4.1 chế tạo hoạt t nh tr c tiếp chống lại mầm ệnh BM20-QT.QLKH Trang 1.4.2 chế tạo hàng rào cách ly quanh vị tr xâm nhập mầm ệnh 10 1.4.3 chế tạo chelate với inh ng khoáng chất 1.4.4 chế tạo chất t ng cư ng làm lành vết thương 11 1.4.5 K ch th ch chế ph ng vệ trồng 11 1.5 Giới thiệu nấm bệnh th c vật 11 1.5.1 Nấm gây bệnh lan Dendrobium sonia 11 1.5.2 Nấm gây bệnh thân gỗ 1.6 Tình hình nghiên cứu ngồi nước 1.6.1 Ngoài nước: 12 12 1.6.2 Trong nước hương – NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 14 2.1.Th i gian địa điểm nghiên cứu 14 2.2 Vật liệu nghiên cứu 16 2.2.1 Đối tượng nghiên cứu 2.2.2 Hóa chất thí nghiệm 2.2.3 Thiết bị thí nghiệm 2.3 Nội dung nghiên cứu 17 17 20 2.3.1 Nội dung 1: Khảo sát đặc điểm nguyên liệu chitosan 2.3.2 Nội dung 2: Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến trình tổng 23 hợp nanochitosan 23 2.3.2.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát tỷ lệ khối lượng CTS/TPP ảnh hưởng 23 đến q trình tổng hợp nanochitosan 2.3.2.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng pH đến trình tổng hợp nanochitosan 2.3.2.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ TPP đến 23 24 24 trình tổng hợp nanochitosan 2.3.2.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát tỷ lệ nanochitosan tác nhân ổn BM20-QT.QLKH 25 Trang định trình tổng hợp nanochitosan 2.3.3 Nội dung 3: Khảo sát khả n ng kháng nấm gây bệnh th c vật in vitro 2.3.4 Nội dung 4: Khảo sát khả n ng kháng ệnh đốm lan 25 25 25 26 Dendrobium sonia 2.4 Phương pháp theo õi tiêu 27 28 2.4.1 Phân tích FE-SEM (Field Emission Scanning Electron Microscopy 29 2.4.2 Phân tích TEM (Transmission Electron Micrograph) 31 2.4.3 Phân tích DLS (Dynamic Light Scattering) 34 2.4.4 Phương pháp nhiễu xạ tia X 2.4.5 Phương pháp xác định hiệu kháng nấm 34 2.4.6 Phương pháp xác định tỷ lệ lan Dendrobium sonia nhiễm bệnh 34 2.4.7 Phương pháp đo chiều dài cành hoa 34 2.4.8 Phương pháp đo độ dày cánh hoa 35 2.4.9 Phương pháp đo đư ng kính hoa 35 2.4.10 Phương pháp đo số lượng hoa cành 35 2.4.11 Phương pháp xác định tỷ lệ hoa 36 2.4.12 Phương pháp lây ệnh cho lan Dendrobium sonia 36 2.4.13 Phương pháp xử lý thống kê 36 hương - KẾT QU VÀ TH O LUẬN 37 3.1 Đặc điểm nguyên liệu chitosan 37 3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình tổng hợp nanochitosan 37 BM20-QT.QLKH Trang 3.2.1 Tỷ lệ khối lượng CTS/TPP ảnh hưởng đến trình tổng hợp nanochitosan 3.2.2 nh hưởng pH đến trình tổng hợp nanochitosan 3.2.3 nh hưởng nồng độ TPP đến trình tổng hợp 37 38 38 40 nanochitosan 3.2.4 Tỷ lệ khối lượng nanochitosan tác nhân ổn định trình tổng hợp nanochitosan 3.3 Quy trình tổng hợp nanochitosan phương pháp tạo gel ion 40 42 43 3.4 Hiệu kháng nấm bệnh in vitro nanochitosan nh hưởng nồng độ xử lý nanochitosan đến hiệu kháng 45 nấm Cercospora sp gây bệnh đốm tiêu chất lượng 49 3.5 lan Dendrobium sonia 52 3.6 nh hưởng tần suất xử lý nanochitosan đến hiệu kháng nấm Cercospora sp gây bệnh đốm tiêu chất lượng 54 lan Dendrobium sonia hương – KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 60 4.1 Kết luận 65 4.2 Kiến nghị 65 TÀI LI U THAM KH O 65 PHỤ LỤC BM20-QT.QLKH Trang DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT Viết tắt Thuật ngữ tiếng viết ASM Acibenzolar-S-Methyl CTS Chitosan COS Chitooligosaccharides COD Chemical Oxygen Demand (Nhu cầu oxy hóa) DLS Dynamic Light Scattering (Tán xạ ánh sáng động học) DPPH FE – SEM 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl Field Emission Scanning Electron Microscopy ( nh kính hiển vi điện tử quét phát xạ trư ng) FT – IR Fourier Transformation Infrared Spectroscopy (Quang phổ hồng ngoại) GPC Gel permeation chromatography Phương pháp sắc ký thẩm thấu gel) KLPT Khối lượng phân tử PAA g – poly (axit acrylic) PDA Potato dextrose agar môi trư ng cấy nấm) PDI Chỉ số polydispersity BM20-QT.QLKH Trang PPO Polyphenol oxidase (Hoạt động enzyme oxidase polyphenol) PVA Polyvinyl alcohol PVP Polyvinyl pyrrolidone ROS Reactive oxygen species (Các gốc t oxy hóa) RT Room temperature (Nhiệt độ phòng) TEM Transmission Electron Micrograph ( nh kính hiển vi điện tử truyền qua) TNOD Tác nhân ổn định TPP Tripolyphosphate XRD X-ray diffraction (Nhiễu xạ tia X) BM20-QT.QLKH Trang DANH SÁCH BẢNG Số Tên bảng số liệu Trang 2.1 Các thơng số hóa lý chitosan 23 2.2 Khảo sát tỷ lệ khối lượng CTS/TPP ảnh hưởng đến 26 trình tổng hợp nanochitosan 2.3 Khảo sát ảnh hưởng pH đến trình tổng hợp 27 nanochitosan 2.4 Khảo sát nồng độ TPP ảnh hưởng trình tổng hợp 28 nanochitosan 2.5 Khảo sát nồng độ nanochitosan kháng nấm gây ệnh 30 th c vật 2.6 Bảng bố trí thí nghiệm ảnh hưởng nồng độ 31 nanochitosan đến khả n ng kháng nấm gây bệnh lan Dendrobium sonia in vivo 2.7 Bảng bố trí thí nghiệm ảnh hưởng tần suất phun 33 nanochitosan đến khả n ng kháng nấm gây bệnh lan Dendrobium sonia in vivo 3.1 3.2 Hiệu kháng nấm nanochitosan nghiệm thức nh hưởng nồng độ xử lý nanochitosan đến tỷ lệ nhiễm 52 56 bệnh lan Dendrobium sonia 3.3 nh hưởng nồng độ xử lý nanochitosan đến chất lượng 59 hoa lan Dendrobium sonia 3.4 nh hưởng tần suất xử lý nanochitosan đến tỷ lệ nhiễm BM20-QT.QLKH 61 Trang 10 NT4 23 ,231304 ,0101374 4,38271% ,22 ,24 ,02 -,551815 NT5 19 ,209474 ,0102598 4,89789% ,2 ,22 ,02 ,204054 Total 92 ,21913 ,0147992 6,75359% ,2 ,24 ,04 ,272137 untitled.sflan.Group Stnd kurtosis NT1 -,192527 NT2 -1,81159 NT3 -,520725 NT4 -2,06848 NT5 -1,98887 Total -2,24945 ANOVA Table for DDCH by untitled.sflan.Group Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups ,0093084 ,0023271 19,06 0, 0000 Within groups ,010622 87 ,000122092 Total (Corr.) ,0199304 91 Table of Means for DDCH by untitled.sflan.Group with 95,0 percent LSD intervals Stnd error Level Count Mean (pooled s) Lower limit Upper limit NT1 14 ,211429 ,00295311 ,207278 ,215579 NT2 16 ,20875 ,00276239 ,204868 ,212632 NT3 20 ,228 ,00247075 ,224527 ,231473 NT4 23 ,231304 ,00230399 ,228066 ,234542 NT5 19 ,209474 ,00253494 ,205911 ,213036 Total 92 ,21913 Multiple Range Tests for DDCH by untitled.sflan.Group Method: 95,0 percent LSD Level Count Mean Homogeneous Groups NT2 16 ,20875 X NT5 19 ,209474 X NT1 14 ,211429 X NT3 20 ,228 X NT4 23 ,231304 X Contrast Sig NT1 - NT2 Difference +/- Limits ,00267857 ,00803734 NT1 - NT3 * -,0165714 ,00765308 NT1 - NT4 * -,0198758 ,00744473 ,00195489 ,00773556 NT1 - NT5 NT2 - NT3 * -,01925 ,00736635 NT2 - NT4 * -,0225543 ,00714964 NT2 - NT5 -,000723684 ,007452 NT3 - NT4 -,00330435 ,00671477 NT3 - NT5 * ,0185263 ,00703585 NT4 - NT5 * ,0218307 ,00680863 * denotes a statistically significant difference Variance Check Levene's Test P-Value ,216301 ,928718 Kruskal-Wallis Test for DDCH by untitled.sflan.Group untitled.sflan.Group Sample Size Average Rank NT1 14 33,5714 NT2 16 29,0938 NT3 20 61,4 NT4 23 66,8696 NT5 19 30,3421 Test statistic = 42,4164 P-Value = 1,36745E-8 Mood's Median Test for DDCH by untitled.sflan.Group Total n = 92 Grand median = ,22 untitled.sflan.Group Sample Size n Median 95,0% lower CL 95,0% upper CL NT1 14 13 ,21 ,2 ,22 NT2 16 16 ,2 ,2 ,22 NT3 20 11 ,22 ,22 ,24 NT4 23 10 13 ,24 ,22 ,24 NT5 19 19 ,2 ,2 ,22 Test statistic = 30,5027 P-Value = ,00000386646 Bài báo khoa học (soạn thảo) TỔNG HỢP VÀ ĐẶC TÍNH HĨA HIỆU QUẢ ỨC CHẾ NẤM CỦA NANOCHITOSAN Nanochitosan: Preparation, characterizatic and antifungal study Nguyễn Thị Hiếu Trang1, Lê Sĩ Ngọc1, Nguyễn Hoàng Thảo Ly1, Phạm Thị Hà Vân1 Trung Tâm Nghiên Cứu Phát Triển Nơng Nghiệp Cơng Nghệ Cao Tóm tắt Hạt nanochitosan tổng hợp phương pháp tạo gel ion với tác chất tripolyphosphte (TPP) chất bảo vệ polyvinyl pyrrolidone K-30 (PVP) Các hạt nanochitosan h nh thành có k ch thước ao động khoảng từ 40 – 300 nm điều kiện pH 4,5 tỷ lệ khối lượng CTS/ TPP 6:1 ác đặc tính hóa lý hạt nanochitosan đánh giá thông qua quang phổ hồng ngoại (FT-IR), nhiễu xạ tia X (XRD), ảnh kính hiển vi điện tử quét phát xạ trư ng (FE – SEM), ảnh kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) tán xạ laser động học (DLS) Kết cho thấy hiệu ức chế nấm nanochitosan cao 97% chủng nấm Cercospora sp Corticium salmonicola Berk thấp Phanerochaete salminicolor (76,9%) nồng độ 150 ppm Từ khóa: Nanochitosan, TPP, Cercospora sp., Corticium salmonicola Berk., Phanerochaete salminicolor Abstract Nanochitosan particles were synthesized by ionic gelation method using tripolyphosphate (TPP) and protective polyvinyl pyrrolidone K-30 (PVP) The prepared nanoparticles have an average diameters ranging from 40 – 300 nm in solution pH 4.5 and CTS/ TPP weight ratio (6:1) Their physicochemical properties were tested by Fourier transform infrared spectroscopy (FT-IR), X-Ray Diffraction (XRD), Field Emission Scanning Electron Microscopy (FE – SEM), TEM and dynamic Light Scattering (DLS) The results show that the high antifungal activiy of nanochitosan against Cercospora sp., and Corticium salmonicola Berk (> 97%) and lower with Phanerochaete salminicolor (76,9%) at 150 ppm Key word: Nanochitosan, TPP, Cercospora sp., Corticium salmonicola Berk., Phanerochaete salminicolor Giới thiệu Chitosan oligochitosan polyme có nguồn gốc thiên nhiên ứng dụng nhiều lĩnh v c khác đ i sống h ng dùng làm chất kháng khuẩn, chất chống oxi hóa, chất kháng khối u, chất gây hiệu ứng t ng cư ng miễn dịch, chất kích kháng bệnh th c đẩy t ng trưởng cho trồng, chất mang ược phẩm Hiện giới có khuynh hướng t m kiếm chất có nguồn gốc t nhiên có hoạt t nh chống oxi hóa pepti e, car ohy rate…, đặc iệt chitosan, chitooligosacchari es OS n xuất ch ng thu h t nhiều nhà khoa học nghiên cứu giới với hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm hitosan sử dụng làm nguyên liệu điều chế hạt nanochitosan n m gần v tính chất ưu việt k ch thước nano Với nhiều t nh n ng t nh tương thích sinh học, phân hủy sinh học, bám nh màng không độc hại, trở thành nguyên liệu cho nhiều ứng dụng ược sinh học Nanochitosan có k ch thước siêu nhỏ (từ 10 đến 1000nm) nên dễ àng qua màng tế bào, đưa vào thể qua nhiều đư ng khác ùng a, ùng qua đư ng miệng, qua mũi (Fuchs, 2010) Chitosan có khả n ng kìm hãm s phát triển in vitro số lượng lớn loại nấm bệnh Nhóm tác giả Nguyen cộng s n m 2014, thử nghiệm thành cơng hoạt tính kháng nấm phức hợp nanochitosan – tinh dầu nghệ k ch thước 100 nm) C.albicans, T mentagrophyte, F oxysporum P.italicum Ngoài việc tạo nên lớp màng thấm khí, chitosan cịn có chức n ng kép Chúng vừa tr c tiếp cơng đến q trình phát triển nấm, vừa hoạt hóa số tr nh đáp ứng miễn dịch, t ng khả n ng đề kháng ác chế t ng cư ng sức đề kháng gồm có s t ch lũy chitinase, tổng hợp nhân tố kìm hãm protease, s hóa gỗ cảm ứng tổng hợp chất sừng (El Ghaouth, 1992) Hiện nay, hướng nghiên cứu sử dụng nano để phòng trừ sâu bệnh hại phát triển sâu rộng nhiều lĩnh v c khác Nanochitosan vừa có đặc tính kháng nấm khuẩn, kháng oxi hố chitosan vừa kế thừa đặc tính bật cơng nghệ nano Do đó, ứng dụng nanochitosan phịng trừ nấm bệnh hướng nghiên cứu đ ng phù hợp với nước nông nghiệp Việt Nam Phương pháp nghiên cứu 2.1 Phương pháp tạo gel ion chế phương pháp d a tương tác tĩnh điện chitosan t ch điện ương polyanion tripolyphosphate Kỹ thuật có ưu điểm giai đoạn chuẩn bị đơn giản th c mơi trư ng nước Đầu tiên chitosan hịa tan vào dung dịch axit acetic Sau chitosan trộn l n với polyanion để tạo hạt nanochitosan ưới điều kiện khuấy liên tục nhiệt độ ph ng K ch thước điện tích bề mặt kiểm soát cách sử dụng tỷ lệ chitosan polyanion khác 2.2 Phương pháp phân tích mẫu 2.2.1 Phân tích m u Dung dịch nanochitosan phân tích tiêu sắc ký thẩm thấu gel GPC vàquang phổ FT – IR Trung Tâm Hạt Nhân Thành Phố Hồ Chí Minh; ảnh kính hiển vi điện tử quét phát xạ trư ng (FESEM)(máy S-4800-Hitachi Japan Trung Tâm Nghiên Cứu Triển Khai, Khu Công Nghệ Cao Thành Phố Hồ Chí Minh); nh kính hiển vi điện tử truyền qua(máy JEM – 1400 Phịng Thí Nghiệm Trọng Điểm Quốc Gia Polymer & Composite, Đại Học Bách Khoa, Thành Phố Hồ Chí Minh); nhiễu xạ tia X (máy D8 Advance, Bruker – Germany Phịng Phân Tích Hóa Lý, Viện Khoa Học Vật Liệu Ứng Dụng, Thành Phố Hồ Chí Minh) 2.2.2 Khảo sát khả n ng kháng nấm in vitro Dùng micropitte hút 100 µl dung dịch nanochitosan phối vào 20 ml môi trư ng PDA theo nồng độ 50, 100, 150 ppm đổ đĩa petri (Sahab cộng s , 2015) Chủng nấm kiểm định (Cercospora sp., Phanerochaete salminicolor, Corticium salmonicola Berk.) cấy chấm điểm trung tâm đĩa mơi trư ng que cấy móc, đĩa đối chứng cấy chấm điểm nấm môi trư ng PDA ủ đĩa thạch 250C ± 2oC Sau 72 gi , quan sát đư ng kính vòng phát triển tơ nấm 2.2.3 Phương pháp xác định hiệu kháng nấm (Trần Ngọc Hùng cộng s , 2014) H = (Dđc – Dtn)/ Dđc x 100 (%) (1) Trong đó: Dđc : Đư ng kính khuẩn lạc nấm đĩa đối chứng Dtn : Đư ng kính khuẩn lạc nấm đĩa thử nghiệm 2.2.3 Phương pháp xử lý thống kê Số liệu xử lý phần mềm Stagraphic 7.0 mức ý nghĩa 95% Kết thảo luận 3.1 Khảo sát đặc điểm nguyên liệu chitosan Nguyên liệu chitosan đánh giá ằng phương pháp sắc ký thẩm thấu gel GP H nh 3.1 , phương pháp chụp ảnh FE – SEM, phương pháp đo phổ hồng ngoại FT – IR phương pháp nhiễu xạ tia X Theo kết GP h nh 3.1 xác định phân tử lượng trung nh số Mn = 155 kDa, phân tử lượng trung nh khối Mw = 573 kDa, phân tử lượng trung nh nhớt Mv = 573 kDa 1656,85 cm-1 đặc trưng cho ao động nhóm ONH2 đỉnh hấp thụ 1597,06 cm-1 tương ứng với ao động nhóm NH2 Đỉnh hấp thụ 1080,14 cm-1 đặc trưng với ao động nhóm -O-C (Lê Hồ Khánh Hỷ cộng s , 2015; Vijayalakshmi cộng s , 2014; Huỳnh Thị ẩm Quyên, 2013 Hình 24 nh FE-SEM chitosan chưa tạo nối a Hình 23 Kết sắc ký thẩm thấu gel GPC hỉ số đa phân tán: DI = Mw/Mn = 573/155 = 3,69; DI > Kết nhận cho thấy m u nguyên liệu chitosan có độ phân tán cao Phân tử lượng chitosan ảnh hưởng lớn đến k ch thước hạt Thông thư ng, phân tử lượng chitosan lớn th k ch thước hạt nanochitosan tạo thành lớn Dương Thị Ánh Tuyết, 2015; Nguyễn nh Dzũng, 2011 nh FE-SEM H nh 3.2 chitosan chưa tạo cầu nối cho thấy h nh ạng nguyên liệu chitosan an đầu lớp polymer với k ch thước hạt lớn Ở h nh 3.3a kết phổ FT – IR chitosan, có đỉnh hấp thụ nằm 3367,71 cm-1 tương ứng với ao động nhóm NH2 -OH chitosan Tương t , đỉnh hấp thụ 2914,44 cm-1 chitosan đặc trưng cho ao động hóa trị ất đối xứng đối xứng nhóm -CH, đỉnh hấp thụ b Hình 25 Phổ FT – IR a phổ nhiễu xạ tia X chitosan tinh khiết Đối với h nh 3.3 , iểu thị phổ nhiễu xạ tia X có hai đỉnh đặc trưng 2 = 10,3o 19,8o Giản đồ nhiễu xạ tia X chitosan khảo sát cho thấy phù hợp với công tr nh công ố trước tác giả Qi Xu (2004) 10,4 21,8o; Yen cộng s (2009) 2 = 9,1 – 9,2o 19,1 – 19,2 o; El-Sawy cộng s (2010) 10,4 19,8o Vijayalakshmi cộng s 2014 khoảng 10 22o ác kết ùng để so sánh đánh giá khả n ng tạo cầu nối chitosan TPP tr nh chế tạo hạt nanochitosan 3.2 Khảo sát yếu tố ảnh hƣởng đến trình tổng hợp nanochitosan 3.2.1 Khảo sát tỷ lệ khối ƣợng CTS/TPP ảnh hƣởng đến trình tổng hợp nanochitosan Tiến hành điều chế nanochitosan phương pháp gel ion (tạo nối ngang ion), sử dụng tác chất tripolyphosphate (TPP) với mục đ ch tạo hạt nanochitosan có kích thước nhỏ ổn định Hạt nanochitosan điều chế đạt k ch thước nhỏ, đồng qua nhiều thí nghiệm tiến hành với th i gian khảo sát cố định gi , nồng độ CTS 0,5% (w/v) Nhỏ từ từ TPP vào dung dịch chitosan điều kiện khuấy từ với tốc độ mạnh 1500 vòng/ phút, th c ngược lại có tượng lợn cợn, tách lớp Nhận thấy dung dịch trở nên sệt ung ịch có màu trắng đục Điều chứng tỏ có phản ứng xảy chitosan tác chất tạo nối Tiến hành ly tâm thu toàn hạt nano với tốc độ 10000 vòng/ phút 15 phút, giữ lại phần kết tủa rửa với nước cất nhiều lần đạt pH 6.5 – để loại bỏ acid acetic Qua khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ khối lượng TS/ TPP đến k ch thước s phân bố hạt nanochitosan 4:1, 5:1, 6:1 tỷ lệ khối lượng CTS/ TPP nhân tố quan trọng ảnh hưởng đến k ch thước hạt Theo quan sát, nhỏ từ từ dung dịch TPP vào dung dịch chitosan, dung dịch huyền phù nanochitosan trở nên lúc trắng đục tỷ lệ khối lượng TS/ TPP t ng 4:1 đến 6:1 (Hình 3.3) Kết từ hình 3.4 cho thấy tỷ lệ khối lượng CTS/ TPP 6: 1, hạt thu có dạng hình cầu, k ch thước hạt nhỏ tương đối đồng So sánh với nghiên cứu trước tác giả Lê Hồ Khánh Hỷ cộng s (2015) sử dụng tỷ lệ theo khối lượng TPP: TS 3:2 để tổng hợp sản phẩm nanochitosan với k ch thước hạt trung bình siêu nhỏ 12 nm Hình 26.M u nanochitosan sau điều chế ằng phương pháp tạo gel ion Ngoài ra, nghiên cứu tác giả Nguyen cộng s 2014 tổng hợp nanochitosan với tỷ lệ khối lượng TPP: chitosan 1:5; theo kết nghiên cứu hattopa hyay Inam ar 2012 sử ụng tỷ lệ khối lượng TS: TPP 1: 0,15; Đỗ Trư ng Thiện cộng s 2010 tỷ lệ 1: TPP: chitosan, tác giả Nguyễn nh Dzũng cộng s 2011 sử ụng tỷ lệ TPP: chitosan 1:6 để tạo hạt có k ch thước tương ứng 100 nm; 110, 74 nm; 150 nm 80 nm Theo kết nghiên cứu nhóm Gan cộng s 2005 , tỷ lệ TS/TPP t ng th k ch thước hạt t ng K ch thước hạt điều chế khoảng từ 100 – 250nm Trong đó, nghiên cứu Hu cộng s (2008) lại đưa kết luận ngược lại, t ng tỷ lệ TS/TPP th k ch thước hạt giảm a)CTS/TPP 4:1 c)CTS/TPP 6:1 b)CTS/TPP 5:1 Hình 27 nh FE-SEM m u nanochitosan sau điều chế ằng phương pháp tạo gel ion 3.2.2 Khảo sát ảnh hƣởng pH đến trình tổng hợp nanochitosan Chọn tỷ lệ khối lượng CTS/ TPP 6:1 để khảo sát pH, giá trị pH khảo sát 4,0; 4,5; 5,0; 5,5; 6,0 Khi t ng ần pH từ 4,0 đến 6,0 màu dung dịch sau tổng hợp đục dần đồng nghĩa với kích thước hạt t ng ần (Hình 3.6) huyền phù bắt đầu tách lớp t ng pH từ 5,0 đến 6,0, cho thấy pH cao ảnh hưởng đến s hình thành kích thước hạt nano Tuy nhiên, s tách lớp dung dịch khơng tìm thấy m u nanochitosan có pH 4,0 4,5 Kết FE – SEM nanochitosan h nh 3.7 cho thấy pH t ảnh hưởng đến tr nh tổng hợp nanochitosan khoảng từ 4,0 đến 5,0 Tuy nhiên, k ch thước hạt trung nh nanochitosan ưới 50 nm khoảng phân ố k ch thước hạt tương đối nhỏ, đồng pH 4,5 H nh 3.7 So sánh với kết nghiên cứu trước th tương đối phù hợp với kết nghiên cứu tác giả Dương Thị Ánh Tuyết cộng s 2011 thu k ch thước hạt nhỏ 48,70 nm điều kiện pH 4,0 Nguyễn nh Dzũng cộng s 2011 tổng hợp nanochitosan với k ch thước hạt 80 nm pH 5,5 a) pH = 4,0 b) pH = 4,5 Hình 29 nh hưởng pH đến k ch thước hạt nanochitosan 3.2.3 Khảo sát ảnh hƣởng nồng độ TPP đến trình tổng hợp nanochitosan Hình 28 nh chụp ung ịch huyền phù nanochitosan điều chế ởnhững điều kiện pH từ 4,0 đến 6,0 Sau ngày bảo quản tủ lạnh (ToC = 18oC ± 2oC), dung dịch Khi nhỏ từ từ TPP vào dung dịch chitosan điều kiện khuấy từ tốc độ 1500 vòng/ phút nhiệt độ phòng gi , nhận thấy dung dịch trở nên sệt màu sắc có s thay đổi so với dung dịch an đầu Dung dịch chitosan từ suốt chuyển sang màu trắng đục, điều chứng tỏ có phản ứng xảy chitosan chất tạo nối nh chụp dung dịch huyền phù nanochitosan H nh 3.8 tổng hợp nồng độ TPP khác (Từ trái qua phải là: 0.05; 0,1; 0,15; 0,2; 0,25%) Khi nồng độ TPP t ng th màu dung dịch huyền phù đục cho thấy k ch thước hạt t ng ần xuất tình trạng kết tụ hạt lắng đọng đáy Ở nồng độ TPP 0,15 % tương ứng với m u ND hình 3.8 chưa thấy tượng keo tụ hạt bảo quản dung dịch tủ lạnh (ToC = 18oC ± 2oC) sau 03 ngày (Chú thích: ND nồng độ TPP khác từ trái qua phải là: 0.05; 0,1; 0,15; 0,2; 0,25%) Hình 3.30 nh hưởng nồng độ TPP đến tr nh tổng hợp nanochitosan Hình 31 nh FE – SEM ung ịch huyền phù nanochitosan tổng hợp nồng độ TPP 0,15% Kết ảnh FE – SEM cho thấy nồng độ TPP 0,15%, k ch thước hạt nhỏ, phân ố tập trung ưới 70 nm H nh 3.9 Điều kết luận TPP nồng độ 0,15% th ch hợp cho s h nh thành hạt nanochitosan Kết so sánh với nghiên cứu trước, Nguyễn nh Dzũng cộng s 2011 sử ụng TPP 0,5% ung ịch chitosan 0,2% w/v thu nanochitosan có k ch thước ao động từ 80 nm đến 108 nm Trong đó, tác giả Dương Thị Ánh Tuyết cộng s (2011) tổng hợp nanochitosan có k ch thước hạt trung nh 68,89 nm từ ung ịch chitosan có nồng độ 0,5% w/v TPP 0,25% (w/ v) 3.2.4 Khảo sát tỷ lệ khối ƣợng nanochitosan tác nhân ổn định trình tổng hợp nanochitosan Dung dịch nanochitosan sau phản ứng ly tâm thu tồn hạt nano với tốc độ 10000 vịng/ phút 15 phút, giữ lại phần kết tủa rửa với nước cất nhiều lần đạt pH 6.5 – để loại bỏ acid acetic Phần kết tủa sấy khô để xác định hiệu suất thu hồi nhiệt độ 55oC sau 24 gi Theo kết thống kê khối lượng trung bình nanochitosan thu 0,195 ± 0,0057g hiệu suất thu hồi hạt nanochitosan sau phản ứng đạt 78% Tiến hành phân tán hạt nannochitosan sau phản ứng nước khử ion so sánh với hệ phân tán có chứa PVP PVA tỷ lệ 1:1 Sau ngày bảo quản lạnh (ToC = 18oC ± 2oC) m u phân tán nước khử ion hạt nanochitosan kết tụ lại lắng xuống đáy Đối với hệ phân tán chứa PVP PVA có tượng lắng đọng tương t lớp hạt kết tụ đáy mỏng so với m u không sử dụng TNOD (Hình 3.9) ước đầu cho thấy có s tương tác TNOD hạt nanochitosan Qua khảo sát cho thấy PVP tương tác tốt với hạt nanochitosan, đồng th i có tác dụng bảo vệ ng n ngừa s kết tụ lắng đọng (agglomeration and precipitation) hạt nanochitosan Khi sử dụng tỷ lệ nanochitosan: TNOD 1: (w/w) nghiệm thức sử dụng PVA sau ngày thấy tượng hạt lắng đọng đáy H nh 3.10 ho thấy PV không tương th ch hệ phân tán hạt nanochitosan, nên tạo s kết cụm hạt nanochitosan t ng k ch thước hạt Khi t ng ần tỷ lệ từ 1:3 đến 1:5 dung dịch nanochitosan có tượng kết cụm ơng tuyết lắng đọng xuống đáy PVP PVA (Hình 3.12) Chứng tỏ t ng tỷ lệ nanochitosan TNOD (w/w) có phản ứng ngược lại hình thành hạt nanochitosan có k ch thước lớn nanochitosan lần đánh giá thông qua kết phân t ch TEM h nh 3.13 , cho thấy số hạt có k ch thước 50 nm Kết chưa thật s trùng khớp với kết khảo sát ảnh FE – SEM Theo kết phân ố k ch thước hạt nanochitosan phân t ch ằng phương pháp DLS H nh 3.14 cho thấy k ch thước hạt ao động từ 40 – 300 nm Hình 33.Hạt nanochitosan phân tán hệ chứa TNOD PVP PV tỷ lệ 1:2 w/w Chú thích: TL3, TL4 TL5 tương ứng tỷ lệ NCTS: PVP 1:3, 1:4, 1:5; TL8, TL9, TL10 ứng với tỷ lệ NCTS: PVA 1:3, 1:4, 1:5 Hình 34 nh chụp ung ịch nanochitosan tổng hợp tỷ lệ nanochitosan TNOD khác a Hình 32 nh chụp ung ịch nanochitosan phân tán PVP, PVA 1:1 nước khử ion Kết ảnh FE –SEM (Hình 3.13 a cho thấy tỷ lệ khối lượng theo khối lượng nanochitosan PVP 1:2 , k ch thước hạt nhỏ ưới 50 nm , đồng phân ố tập trung K ch thước hạt b Hình 35 nh FE – SEM (a) TEM (b) m u ung ịch nanochitosan với PVP (1:2 w/w) Phổ nhiễu xạ tia X nanochitosan có đỉnh rộng 2 = 27o hình 3.15, so sánh kết XRD nanochitosan với chitosan tinh khiết thấy có s thay đổi đáng kể hình ảnh nhiễu xạ S xuất đỉnh rộng m u nanochitosan s gia t ng liên kết ngang ion TPP chuỗi chitosan làm biến dạng vùng tinh thể để tạo thành nanochitosan Kết phổ XRD nanochitosan sau tổng hợp tương t kết nghiên cứu nhóm tác giả Vijayalakshmi cộng s 2014 đánh giá thông qua phổ nhiễu xạ tia đo khoảng 2 từ đến 80oC cho thấy kết phù hợp với công tr nh nghiên cứu tác giả Lê Hồ Khánh Hỷ 2015 , Dương Thị Ánh Tuyết 2011 Qi Xu (2004) Hình 36 nh TEM m u ung ịch nanochitosan với PVP 1:2 w/w nanochitosan có k ch thước lớn Thế nhưng, suốt trình khảo sát, k ch thước hạt dao dộng khoảng 40 – 300 nm Quá trình khuấy từ hỗn hợp TS TPP gi p ẻ g y phân tử chitosan Các phân tử chitosan dài dễ bị vướng mắc vào chịu ảnh hưởng l c cắt mạnh hơn, h nh thành hạt nhỏ Hiệu kháng nấm gây bệnh th c vật nanochitosan in vitro nồng độ khác thể rõ Hình 3.16 Khi nồng độ nanochitosan t ng, khả n ng kháng nấm t ng, thể đư ng kính phát triển tơ nấm Trong đó, nồng độ 50 ppm đư ng kính phát triển tơ nấm Cercospora sp 67,6 mm so với m u đối chứng, đư ng k nh tơ nấm phát triển sau 72 gi 68,4 mm (Hình 3.16 Tuy nhiên, đư ng kính phát triển tơ nấm giảm đáng kể nồng độ 100 150 ppm 9,9 1,5 mm (Bảng 3.1) Bảng 6: Hiệu kháng nấm Cercospora sp in vitro nanochitosan Hình 37 Phổ nhiễu xạ tia X nanochitosan Kết khảo sát gây s bất ng sử dụng nguyên liệu chitosan có phân tử lượng lớn (573kDa), theo d t nh an đầu hạt Nồng độ (ppm) Cercospora sp (mm) Hiệu kháng nấm (%) 50 67,6c±1,5 1,2 100 9,9b±1,0 85,5 150 1,5a±0.4 97,8 DC 68,4c±1,9 - P ** A2 B2 C2 Ghi chú: * khác biệt có ý nghĩa mức α = 0,05); ** khác biệt có ý nghĩa (mức α = 0,01 ; ns: khơng có ý nghĩa Bảng 7: Hiệu kháng nấm Phanerochaete salminicolor in vitro nanochitosan Phanerochaete salminicolor (mm) Hiệu kháng nấm (%) 50 71,9c±2,3 7,2 100 45,2b±5,4 41,7 150 17,9a±0,5 76,9 DC 77,5d±4,0 - Nồng độ (ppm) P ** Ghi chú: * khác biệt có ý nghĩa mức α = 0,05); ** khác biệt có ý nghĩa (mức α = 0,01 ; ns: khơng có ý nghĩa Cercospor a sp A1 Phanerochaet Corticium e salmonicola salminicolor Berk B1 C1 A3 A4 B3 B4 C3 C4 Ghi chú: ― , , ‖ chủng nấm kiểm định Cercospora sp., Phanerochaete salminicolor., Corticium salmonicola Berk ―1, 2, 3‖ lô nghiệm thức xử lý với nồng độ nanochitosan 50, 100, 150ppm đối tượng nấm ―4‖ lô nghiệm thức đối chứng Hình 3.16 Hiệu kháng nấm môi trư ng thạch PD nấm Cercospora sp Phanerochaete salminicolor Corticium salmonicola Berk 72h Tương t , nấm Phanerochaete salminicolor xử lý với nanochitosan môi trư ng thạch PDA nồng độ 50 ppm 71,9 mm (Hình 3.16 B1) so với m u đối chứng 77,5 mm Ở nồng độ 100 150 ppm đư ng k nh tơ nấm phát triển 45,2 17,9 mm (Bảng 3.2) Cuối cùng, chủng Corticium salmonicola Berk xử lý với nanochitosan nồng độ 50 ppm môi trư ng thạch PD có đư ng kính phát triển tơ nấm 43,3 mm (Hình 3.16 C1) sau 72 gi , giảm đáng kể 10,9 2,0 mm nồng độ 100 150 ppm (Bảng 3.3) Kết thử nghiệm chủng nấm kiểm định cho thấy t ng ần nồng độ nanochitosan 50, 100 150 ppm đư ng k nh tơ nấm giảm dần, điều có nghĩa t ng nồng độ nano khả n ng kháng nấm nanochitosan t ng lên Bảng 8: Hiệu kháng nấm Corticium salmonicola Berk in vitro nanochitosan Nồng độ (ppm) Corticium salmonicola Berk Hiệu kháng nấm (%) (mm) 50 43,3c±3,2 36,5 100 10,9b±0,7 84,0 150 2,0a±0,2 97,1 DC 68,2d±1,4 - Như vậy, hiệu kháng nấm nanochitosan Cercospora sp Corticium salmonicola Berk 97,8% 97,1%, thấp Phanerochaete salminicolor 76,9% nồng độ 150 ppm Tuy nhiên, Ở nồng độ nanochitosan thử nghiệm đư ng kính phát triển tơ nấm giảm so với lô đối chứng Kết luận Hạt nanochitosan – tripolyphosphate TPP tổng hợp phương pháp tạo gel ion với k ch thước hạt đo từ 50 – 300 nm điều kiện pH 4,5 tỷ lệ khối lượng TS/ TPP 6:1 ác đặc tính hóa lý hạt nanochitosan đánh giá nhiều phương pháp phân t ch khác FE – SEM, TEM, FT – IR DLS Hiệu kháng nấm nanochitosan chủng nấm Cercospora sp Corticium salmonicola Berk cao 97%, thấp Phanerochaete salminicolor 76,9% nồng độ 150 ppm Tài liệu tham khảo P ** Ghi chú: * khác biệt có ý nghĩa mức α = 0,05); ** khác biệt có ý nghĩa (mức α = 0,01 ; ns: khơng có ý nghĩa Fuchs, S Gelatin Nanoparticles as a modern platform for drug delivery Ludwig-MaximiliansUniversität München, (2010) El-Sawy, N.M., Abd El-Rehim, H.A., Elbarbary, A.M., Hegazy, E.A Radiation-induced degradation of chitosan for possible use as a growth promoter in agricultural purposes Carbohydr Polym 79, 555-562, (2010) Sahab, A F., Waly, A I., Sabbour, M M., Lubna, S N Synthesis, antifungal and insecticidal potential of Chitosan (CS)-g-poly (acrylic acid)(PAA) nanoparticles against some seed borne fungi and insects of soybean Synthesis, 8(2), 589-598, (2015) Tuyết, D T Á Khảo sát tr nh điều chế hạt nano chitosan–tripolyphosphat Tạp chí Đại học Thủ Dầu Một, (21), 105-110, (2015) Dzung, N A., Hà, N T N., Van, D T H., Phuong, N T L., Quynh, N T N., Hiep, D M., & Van Hiep, L Chitosan nanoparticle as a novel delivery system for A/H1n1 influenza vaccine: safe property and immunogenicity in mice World Academy of Science, Engineering and Technology, 60, 1839-1846, (2011) Nguyen, T.K.C.; Dzung, T.T.K.; Cuong, P.V (2014) Assessment of antifungal activity of turmeric essential oil-loaded chitosan nanoparticles J Chem Biol Phys, 4, 2347–2356 Vijayalakshmi K.,Gomathi T and Sudha P N Preparation and characterization of nanochitosan/sodium alginate/ microcrystalline cellulose beads Der Pharmacia Lettre, (4):6577, (2014) Chattopadhyay, D P., &Inamdar, M S Studies on synthesis, characterization and viscosity behaviour of nanochitosan Research Journal of Engineering Sciences ISSN, 2278, 9472, (2012) Yen, M.T., Yang, J.H., Mau, J.L Physical characterization of chitin and chitosan from crab shells Carbohydr Polym 75, 15-21, (2009) 10 Qi, L., Xu, Z Lead sorption from aqueous solutions on chitosan nanoparticles Colloids and Surfaces A: Physicochem Eng Aspects, 251, 183-190, (2004) Thông tin liên hệ tác giả: Họ tên: Nguyễn Thị Hiếu Trang Đơn vị: Trung Tâm Nghiên Cứu Phát Triển Nông Nghiệp Công Nghệ Cao Điện thoại: 09.6869.7172 Email:hieutrangbtiu08128@gmail.c om