Tạp chí Khoa học Đại học Huế: Khoa học Tự nhiên Tập 128, Số 1C, 69–76, 2019 pISSN 1859-1388 eISSN 2615-9678 TỔNG HỢP VẬT LIỆU NANO BẠC VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG NẤM PYRICULARIA ORYZAE GÂY BỆNH ĐẠO ÔN TRÊN CÂY LÚA Nguyễn Thị Thanh Hải1*, Tôn Nữ Mỹ Phương1, Nguyễn Thị Thu Thủy2, Trần Thái Hịa1 Khoa Hóa, Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế, 77 Nguyễn Huệ, Huế, Việt Nam Khoa Nông học, Trường Đại học Nông lâm, Đại học Huế, 102 Phùng Hưng, Huế, Việt Nam * Tác giả liên hệ Nguyễn Thị Thanh Hải (Ngày nhận bài: 04-04-2019; Ngày chấp nhận đăng: 11-11-2019) Tóm tắt Trong nghiên cứu này, vật liệu nano bạc (AgNPs) tổng hợp phương pháp khử hóa học với chất khử natri citrate chất bảo vệ alginate Các thông số ảnh hưởng tới trình tổng hợp nano bạc gồm nồng độ natri citrate, nồng độ bạc nitrate, nồng độ alginate nhiệt độ hệ phản ứng nghiên cứu Sự hình thành AgNPs, hình thái cấu trúc vật liệu sau tổng hợp phân tích quang phổ hấp thụ phân tử, hiển vi điện tử quét, hiển vi điện tử truyền qua nhiễu xạ tia X AgNPs có hiệu lực ức chế cao nấm Pyricularia oryzae gây bệnh đạo ôn lúa Từ khóa: alginate, hạt nano bạc, natri citrate, phương pháp khử hóa học, Pyricularia oryzae Synthesis of silver nanoparticles and their fungal resistance against Pyricularia oryzae causing blast disease in rice cultivation Nguyen Thi Thanh Hai1*, Ton Nu My Phuong1, Nguyen Thi Thu Thuy2, Tran Thai Hoa1 Khoa Hóa, Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế, 77 Nguyễn Huệ, Huế, Việt Nam Khoa Nông học, Trường Đại học Nông lâm, Đại học Huế, 102 Phùng Hưng, Huế, Việt Nam * Coresspondence to Nguyen Thi Thanh Hai (Received: 04 April 2019; Accepted: 11 November 2019) Abstract In this study, silver nanoparticles (AgNPs) were synthesized using the chemical reduction method with sodium citrate as a reducing agent and alginate as a protecting agent The parameters affecting the synthesis of silver nanoparticles, namely silver nitrate concentration, alginate concentration, sodium citrate concentration, and temperature of the reaction, were studied The formation of AgNPs, morphology, and structure of the synthesized materials were analyzed using UV-Vis spectroscopy, scanning electron microscopy, transmission electron microscopy, high-resolution transmission microscopy, and X-ray diffraction AgNPs products have a high inhibitory effect on Pyricularia oryeza, causing rice blast Keywords: alginate, chemical reduction method, sodium citrate, silver nanoparticles, Pyricularia oryzae DOI: 10.26459/hueuni-jns.v128i1C.5181 69 Nguyễn Thị Thanh Hải CS Mở đầu chất [20] Ion Ag+ tương tác mạnh với nhóm –SH phân tử sinh học để làm bất Ngày nay, với tiến công nghệ hoạt vi khuẩn [21] Các tương tác nano, số lượng lớn vật liệu nano xuất màng tế bào ngăn chặn chép DNA dẫn với tính chất độc đáo mở nhiều đến chết vi khuẩn [22] ứng dụng hội nghiên cứu [1] Vật liệu nano bạc (AgNPs) có nhiều đặc điểm bật khiến chúng ứng dụng rộng rãi lĩnh vực khác như: y sinh [2], dẫn thuốc [3], xử lý nước [4], nông nghiệp [5]… AgNPs áp dụng mực in, chất kết dính, thiết bị điện tử, bột nhão… độ dẫn cao [6] AgNPs thường tổng hợp kỹ thuật hóa lý như: khử hóa học [7], xạ tia gamma [8], vi nhũ tương [9], điện hóa [10], laser [11], thủy nhiệt [12], vi sóng [13] khử quang hóa [14] Bệnh đạo ơn, nấm Pyricularia oryzae gây ra, nguyên nhân làm giảm suất lúa nghiêm trọng toàn giới [23] Sử dụng thuốc bảo vệ thực vật để phịng trừ bệnh đạo ơn thường khơng thành cơng khơng mang lại hiệu kinh tế loại nấm thường có khả biến dị cao trở nên kháng thuốc [24] Ngày nay, suất chất lượng nơng sản cải thiện cơng nghệ đại, vừa đáp ứng nhu cầu lương thực ngày tăng giới, đồng thời vừa thân thiện với môi Trong thời gian gần đây, nano bạc nhận trường [25] Ứng dụng công nghệ nano sản ý lớn nhà nghiên cứu xuất nông nghiệp giải pháp khả phòng vệ đặc biệt chúng chống lại nghiên cứu áp dụng thành công nhiều nước nhiều loại vi sinh vật xuất giới [26] thuốc chống lại loại kháng sinh thường sử dụng [1] Bạc biết đến với đặc tính kháng khuẩn sử dụng nhiều năm lĩnh vực y tế cho ứng dụng kháng khuẩn chí cho thấy ngăn chặn liên kết HIV với tế bào chủ [15] Ngoài ra, bạc sử dụng lọc nước khơng khí để loại bỏ vi sinh vật [16, 17] Trong phạm vi nghiên cứu này, tổng hợp dung dịch keo nano bạc phương pháp khử hóa học Quá trình thực phản ứng khử AgNO3 dung môi nước với chất khử natri citrate chất bảo vệ alginate Phương pháp có ưu điểm phản ứng diễn nhanh, dễ thực dễ dàng điều chỉnh kích thước hình dạng hạt nano bạc Kích thước hạt nano Cơ chế tác dụng diệt khuẩn AgNPs bạc điều chỉnh thông số nhiệt độ, Ag+ chưa hiểu biết cách đầy đủ nồng độ chất khử hàm lượng alginate Vật liệu Một số nghiên cứu cho AgNPs bám vào AgNPs tổng hợp sử dụng để đánh giá khả bề mặt màng tế bào vi sinh vật làm xáo trộn kháng nấm Pyricularia oryzae gây bệnh đạo ôn chức thẩm thấu hô hấp tế bào [18] Các lúa hạt AgNPs kích thước nhỏ có diện tích bề mặt lớn mang lại hiệu diệt khuẩn cao hạt AgNPs có kích thước lớn [18] Ngồi ra, AgNPs khơng tương tác với bề mặt màng, mà cịn xâm nhập vào bên vi khuẩn [19] Trong số nghiên cứu khác, phá hủy tế bào tương tác AgNPs với hợp chất chứa phốt lưu huỳnh DNA bạc có xu hướng có lực cao với hợp 70 Phương pháp 2.1 Hóa chất vật liệu Bạc nitrate tinh thể (AgNO3, 100%), natri citrate (C6H5Na3O7.2H2O, 99,5%) có nguồn gốc từ hãng Merck (Đức), alginate hãng Kimica (Nhật Bản), hóa chất dùng làm mơi trường ni cấy vi pISSN 1859-1388 eISSN 2615-9678 Tạp chí Khoa học Đại học Huế: Khoa học Tự nhiên Tập 128, Số 1C, 69–76, 2019 khuẩn: agar, peptone cao thịt hãng Angel cm) chứa môi trường, nuôi cấy 28 °C Theo dõi (Hàn Quốc), nước cất lần đường kính tản nấm P oryzea sau ngày nuôi cấy Nguồn Pyricularia oryzae phân lập từ lúa bị bệnh đạo ôn Thừa Thiên Huế [28] Khả kháng nấm AgNps xác định sau: bảo quản phịng nghiên cứu bệnh cây, Bộ mơn Bảo vệ thực vật, Trường đại học Nông Lâm, Đại học Huế 2.2 Đặc trưng vật liệu HLUC (%) = (𝐷−𝑑) 𝐷 × 100 HLUC hiệu lực ức chế; D (mm) đường kính khuẩn lạc nấm môi trường PDA (Potato Dextro Agar) không bổ sung AgNPs (đối Phổ UV-Vis xác định đỉnh hấp thụ cực đại chứng); d đường kính khuẩn lạc nấm mơi Từ đỉnh hấp thụ đặc trưng khẳng định dung trường PDA có bổ sung AgNPs với nồng độ dịch điều chế dung dịch nano bạc Từ độ khác dịch chuyển đỉnh hấp thụ cực đại, dự đốn tăng giảm kích thước hạt Kết thảo luận 3.1 thể nano bạc thu Ảnh SEM, TEM Các yếu tố ảnh hưởng đến trình tổng hợp vật liệu AgNps HRTEM xác định hình thái cấu trúc kích thước Hình kết UV-Vis keo nano bạc nano bạc dung dịch sau trình tổng hợp [27] Giản đồ nhiễu xạ XRD xác định cấu trúc tinh vật liệu sau 75 phút phản ứng thay đổi thông số: 2.3 nồng độ natri citrate (a), nồng độ bạc nitrate (b), Tổng hợp vật liệu Cân 0,3 g alginate cho vào bình tam giác chứa 50 mL nước cất Hỗn hợp khuấy đồng máy khuấy từ gia nhiệt Sau đó, thêm dung dịch 0,5 mL AgNO3 50 mM vào dung dịch alginate để tạo hỗn hợp Gia nhiệt khuấy từ mạnh hỗn hợp đến nhiệt độ phản ứng, sau nồng độ alginate (c) nhiệt độ (d) Hình cho thấy phổ có bước sóng hấp thụ cực đại nằm khoảng từ 420 nm đến 440 nm, bước sóng hấp thụ đặc trưng dung dịch nano bạc Điều chứng tỏ có tạo thành nano bạc dung dịch phản ứng [29] nhỏ từ từ 0,5 mL dung dịch natri citrate để thực Sau 75 phút phản ứng, thấy phổ phản ứng Khi phản ứng kết thúc, nhận biết UV-Vis mẫu có nồng độ natri citrate mM tạo thành dung dịch keo nano bạc thu có (Hình 1a) nồng độ bạc nitrate mM (Hình 1b) màu nâu đặc trưng kiểm chứng quang có cực đại hấp thụ lớn đồng thời peak hấp thụ phổ hấp thụ phân tử UV-Vis giản đồ nhiễu xạ nhọn đỉnh hấp thụ nằm bước sóng ngắn XRD so với mẫu khác Điều có nghĩa 2.4 Đánh giá khả kháng nấm Chúng đánh giá khả kháng nấm cách nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ AgNPs đến sinh trưởng nấm Pyricularia oryzae hạt nano bạc tạo mẫu có kích thước nhỏ đồng so với mẫu khác [27] Từ chúng tơi kết luận nồng độ natri citrate mM nồng độ bạc nitrate mM nồng độ tối ưu Tương tự, Hình 1c 1d cho thấy nồng độ alginate 0,3% nhiệt độ 90 °C điều kiện phản ứng tối Môi trường Potato Dextro Agar (PDA) có bổ ưu Trong phản ứng tổng hợp AgNPs sung dung dịch AgNPs với nồng độ 50, 70 alginate đóng vai trị chất bảo vệ Nếu nồng độ 100 ppm Các khoanh nấm ngày tuổi có đường alginate nhỏ khơng đủ bọc hạt AgNPs kính mm cấy vào trung tâm đĩa Petri (Ø = tạo thành, chúng có xu hướng kết tụ lại DOI: 10.26459/hueuni-jns.v128i1C.5181 71 Nguyễn Thị Thanh Hải CS Hình Phổ UV-Vis keo nano bạc sau 75 phút phản ứng thay đổi thông số: (a) nồng độ natri citrate: 0,25–1,25 mM (nồng độ bạc nitrate: mM; nồng độ alginate: 0,6%; nhiệt độ: 100 °C ), (b) nồng độ bạc nitrate: 0,8– 1,6 mM (nồng độ natri citrate: mM; nồng độ alginate: 0,6%; nhiệt độ: 100 °C), (c) nồng độ alginate (nồng độ natri citrate: mM; nồng độ bạc nitrate: mM; nhiệt độ: 100 °C) (d) nhiệt độ (nồng độ natri citrate: mM; nồng độ bạc nitrate: mM; nồng độ alginate: 0,6%) với tạo thành hạt có kích thước lớn Ngược lại, nồng độ alginate lớn làm độ nhớt dung dịch phản ứng lớn, làm cản trở phản ứng khử Ag+ thành AgNPs Từ kết thu trình khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến q trình tổng hợp keo bạc nano chúng tơi rút điều kiện tối ưu để tổng hợp vật liệu AgNPs (Bảng 1) Bảng Điều kiện lựa chọn để tổng hợp vật liệu AgNPs Thông số 72 Điều kiện tối ưu 3.2 Đặc trưng vật liệu Hình trình bày giản đồ nhiễu xạ XRD vật liệu AgNPs Chúng nhận thấy đo XRD góc rộng (20÷80°), xuất peak tinh thể góc 2θ = 38,1° (dhkl = 2,360 Å); 44,2° (dhkl = 2,044 Å); 64,2° (dhkl = 1,444 Å) 77,2° (dhkl = 1,232 Å), tương ứng với mặt (111), (200), (220) (311) cấu trúc lập phương tâm mặt (FCC) kim loại Ag (JCPDSCardnumber, 4-783) [30] Điều cho phép khẳng có hình thành tinh thể bạc dung dịch sau phản ứng Ngoài ra, xuất peak tù khoảng 2θ = 20÷30°; Nồng độ bạc nitrate mM Nồng độ alginate 0,3% Nồng độ natri citrate mM hạt AgNPs có kích thước đồng Nhiệt độ phản ứng 90 °C khoảng 20–40 nm peak alginate vơ định hình Kết SEM TEM Hình cho thấy pISSN 1859-1388 eISSN 2615-9678 Tạp chí Khoa học Đại học Huế: Khoa học Tự nhiên Tập 128, Số 1C, 69–76, 2019 Hình Giản đồ nhiễu xạ XRD vật liệu AgNPs Hình Ảnh HR-TEM vật liệu AgNps 3.3 Đánh giá ảnh hưởng nồng độ AgNPs đến sinh trưởng nấm Pyricularia oryzae Ảnh hưởng nồng độ AgNPs đến đường kính tản nấm thí nghiệm trình bày Bảng Kết cho thấy nồng độ AgNPs khác nhau, khả sinh trưởng phát triển sợi nấm Pyricularia oryzae khác Kích thước Hình Ảnh SEM ảnh TEM vật liệu AgNPs tản nấm giảm dần theo chiều tăng nồng độ AgNPs Đường kính hệ sợi nấm ngày sau cấy dao động Ảnh HR-TEM Hình cho thấy hạt từ đến 80 mm; công thức có khác có kích thước khoảng 30 nm có sứa song mức có ý nghĩa thống kê Trong đó, cơng thức đối song, chứng tỏ tinh thể Khoảng cách chứng có đường kính tản nấm lớn cơng sứa trung bình d = 0,23 nm tương ứng với thức nồng độ 100 ppm có đường kính tản nấm nhỏ mặt (111) tinh thể Ag, xấp xỉ với dhkl = 2,360 Å Như thấy, AgNPs có khả ức góc 2θ = 38,1° giản đồ XRD vật liệu chế phát triển nấm P oryzae Khả ức AgNPs, chứng tỏ hạt tinh thể chế thể tốt mơi trường PDA có bổ sung tinh thể Ag 100 ppm AgNPs DOI: 10.26459/hueuni-jns.v128i1C.5181 73 Nguyễn Thị Thanh Hải CS Bảng Hiệu lực ức chế AgNPs đến sinh trưởng nấm P oryzae nuôi cấy môi trường PDA sau ngày cấy Nồng độ AgNps (ppm) Đường kính tản nấm (mm) Hiệu lực ức chế (%) 80,0 0,00 50 36,5 54,38 70 29,3 63,38 100 17,9 77,63 Hình Ảnh hưởng AgNPs đến sinh trưởng P oryzae sau ngày nuôi cấy môi trường PDA Kết luận nhiễu xạ XRD phổ UV-Vis cho thấy hạt nano bạc tạo có kích thước khác cho đỉnh hấp Chúng tổng hợp dung dịch keo thu cực đại khác từ 420 đến 440 nm Hạt nano nano bạc với chất khử natri citrate chất bảo vệ bạc tổng hợp với thơng số tốt có kích alginate Chúng khảo khát yếu tố thước trung bình khoảng 20–40 nm Vật liệu ảnh hưởng gồm nồng độ natri citrate, nồng độ bạc AgNPs tổng hợp có khả ức chế phát nitrate, nồng độ alginate nhiệt độ để đưa triển nấm P Oryzae với nồng độ tối ưu điều kiện tối ưu phản ứng Cấu trúc FCC 100 ppm môi trường PDA dung dịch keo nano bạc, xác định giản đồ 74 pISSN 1859-1388 eISSN 2615-9678 Tạp chí Khoa học Đại học Huế: Khoa học Tự nhiên Tập 128, Số 1C, 69–76, 2019 Lời cám ơn Các kết báo nghiên cứu dựa tài trợ đề tài khoa học công nghệ cấp Đại học Huế (Mã số: 1992) Tác giả cảm ơn hỗ trợ phần kinh phí Quỹ Phát triển khoa học công nghệ Quốc gia (NAFOSTED) đề tài mã số 104.06-2017.311 Tài liệu tham khảo Sharma VK, Yngard RA, Lin Y Silver nanoparticles: Green synthesis and their antimicrobial activities Adv Colloid Interface Sci 2009;145(1-2):83-96 2 Chaloupka K, Malam Y, Seifalian AM Nanosilver as a new generation of nanoproduct in biomedical applications Trends Biotechnol 2010;28(11):580-588 3 Lin LL, Roberts MS, Butler M, Wurm EMT, Becker W, Prow TW, et al Nanoparticles and microparticles for skin drug delivery Adv Drug Deliv Rev 2011;63(6):470-91 4 Dankovich TA, Gray DG Bactericidal paper impregnated with silver nanoparticles for point-of-use water treatment Environ Sci Technol 2011;45(5):1992-8 5 Nair R, Yoshida Y, Kumar DS, Varghese SH, Nair BG, Maekawa T Nanoparticulate material delivery to plants Plant Sci 2010;179(3):154-163 Zhang W, Qiao X, Chen J Synthesis and characterization of silver nanoparticles in AOT microemulsion system Chem Phys 2006;330(3):495-500 10 Reicha FM, Sarhan A, Abdel-Hamid MI, ElSherbiny IM Preparation of silver nanoparticles in the presence of chitosan by electrochemical method Carbohydr Polym 2012;89(1):236-244 11 Abid JP, Wark AW, Brevet PF, Girault HH Preparation of silver nanoparticles in solution from a silver salt by laser irradiation Chem Commun 2002;7(7):792-793 12 Yang J, Pan J Hydrothermal synthesis of silver nanoparticles by sodium alginate and their applications in surface-enhanced Raman scattering and catalysis Acta Mater 2012;60(12):4753-4758 13 Khan A, El-Toni AM, Alrokayan S, Alsalhi M, Alhoshan M, Aldwayyan AS Microwaveassisted synthesis of silver nanoparticles using poly-N-isopropylacrylamide/acrylic acid microgel particles Colloids Surfaces A Physicochem Eng Asp 2011;377(1-3):356-360 14 Alarcon EI, Udekwu K, Skog M, Pacioni NL, Stamplecoskie KG, González-Béjar M, et al The biocompatibility and antibacterial properties of collagen-stabilized, photochemically prepared silver nanoparticles Biomaterials 2012;33(19):49474956 Park K, Seo D, Lee J Conductivity of silver paste prepared from nanoparticles Colloids Surfaces A Physicochem Eng Asp 2008;313– 314:351-354 15 Niđo-Martínez N, Martínez-Castón GA, Aragón-Piđa A, Martínez-Gutierrez F, Martínez-Mendoza JR, Ruiz F Characterization of silver nanoparticles synthesized on titanium dioxide fine particles Nanotechnology 2008;19(6):065711 Khan Z, Al-Thabaiti SA, Obaid AY, Al-Youbi AO Preparation and characterization of silver nanoparticles by chemical reduction method Colloids Surfaces B Biointerfaces 2011;82(2):513-317 16 Chou W-L, Yu D-G, Yang M-C The preparation and characterization of silverloading cellulose acetate hollow fiber membrane for water treatment Polym Adv Technol 2005;16(8):600-607 Chen P, Song L, Liu Y, Fang Y e Synthesis of silver nanoparticles by γ-ray irradiation in acetic water solution containing chitosan Radiat Phys Chem 2007;76(7):1165-1168 17 Chen Q, Yue L, Xie F, Zhou M, Fu Y, Zhang Y, et al Preferential Facet of Nanocrystalline Silver Embedded in Polyethylene Oxide DOI: 10.26459/hueuni-jns.v128i1C.5181 75 Nguyễn Thị Thanh Hải CS Nanocomposite and Its Antibiotic Behaviors J Phys Chem C 2008;112(27):10004-10007 18 Kvítek L, Panáček A, Soukupová J, Kolář M, Večeřová R, Prucek R, et al Effect of Surfactants and Polymers on Stability and Antibacterial Activity of Silver Nanoparticles (NPs) J Phys Chem C 2008;112(15):5825-5834 19 Morones JR, Elechiguerra JL, Camacho A, Holt K, Kouri JB, Ramírez JT, et al The bactericidal effect of silver nanoparticles Nanotechnology 2005;16(10):2346-2353 20 Basu S, Jana S, Pande S, Pal T Interaction of DNA bases with silver nanoparticles: Assembly quantified through SPRS and SERS J Colloid Interface Sci 2008;321(2):288-293 21 Gentile D Pathological Video-Game Use Among Youth Ages to 18 Psychol Sci 2009;20(5):594-602 22 Melaiye A, Sun Z, Hindi K, Milsted A, Ely D, Reneker DH, et al Silver(I)−Imidazole Cyclophane gem -Diol Complexes Encapsulated by Electrospun Tecophilic Nanofibers: Formation of Nanosilver Particles and Antimicrobial Activity J Am Chem Soc 2005;127(7):2285-2291 23 Oul SH Pathogen Variability 1980;(65) 24 Le MT, Arie T, Teraoka T Population dynamics and pathogenic races of rice blast 76 fungus, Magnaporthe oryzae in the Mekong Delta in Vietnam J Gen Plant Pathol 2010;76(3):177-82 25 Wheeler S Factors influencing agricultural professionals attitudes towards organic agriculture and biotechnology Progr Pap 2nd Natl Work ANU’s Econ Environ Netw 2005 26 Nanotechnology H Nanotechnology and Nanoscience applications : revolution in India and beyond Nanotechnology 27 Xu G, Huang CM, Tazawa M, Jin P, Chen DM Nano-Ag on vanadium dioxide II Thermal tuning of surface plasmon resonance J Appl Phys 2008;104(5):053102 28 Elamawi RMA, El-Shafey RAS Inhibition Effects of Silver Nanoparticles Against Rice Blast Disease Caused By Magnaporthe Grisea Egypt J Agric Res 2013;91(4) 29 Raffi M, Mehrwan S, Bhatti TM, Akhter JI, Hameed A, Yawar W, et al Investigations into the antibacterial behavior of copper nanoparticles against Escherichia coli Ann Microbiol 2010;60(1):75-80 30 Jiang, Zeng, Yu Thiol-Frozen Shape Evolution of Triangular Silver Nanoplates Langmuir 2007;23(4):2218-2223