Nghiên cứu chế tạo oligochitosan bằng phương pháp chiếu xạ kết hợp xử lý hydrogen peroxit và đánh giá khả năng kháng nấm colletotrichum sp in vitro

UẢ N MN U T HCM N Ứ P ỂN N N N P N N O BÁO CÁO NGHI M THU NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO OLIGOCHITOSAN BẰN P ƢƠN PHÁP CHIẾU XẠ KẾT HỢP XỬ LÝ HYDROGEN PEROXIT VÀ Đ N K Ả NĂN K N NẤM Colletotrichum sp IN VITRO ThS Đào Thị Kim Đính KS Lê Thành Hưng Thành ph H hí Minh, h ng 12/2015 UẢ N MN U T HCM N Ứ P ỂN N N N P N N O BÁO CÁO NGHI M THU NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO OLIGOCHITOSAN BẰN P ƢƠN PHÁP CHIẾU XẠ KẾT HỢP XỬ LÝ HYDROGEN PEROXIT VÀ Đ N K Ả NĂN K N NẤM Colletotrichum sp IN VITRO ThS Đào Thị Kim Đính KS Lê Thành Hưng Thành ph H hí Minh, h ng 12/2015 TÓM TẮT Đề tài “Nghiên cứu chế tạo oligochitosan phƣơng pháp chiếu xạ kết hợp xử lý hydrogen peroxit đánh giá khả kháng nấm Colletotrichum sp in vitro” đƣợc tiến hành Trung tâm Nghiên cứu Phát triển Nông nghiệp Công nghệ cao từ tháng 03/2015 đến tháng 12/2015 Đề tài đƣợc thực với mục tiêu chế tạo phân đoạn oligochitosan từ chitosan phƣơng pháp chiếu xạ kết hợp xử lý hydrogen peroxit đồng thời xác định đặc trƣng cấu trúc phân đoạn oligochitosan chế tạo đƣợc nhƣ đánh giá hoạt tính kháng nấm Collectotrichum sp điều kiện in vitro chúng nồng độ khác nhằm phát triển ứng dụng hiệu chế phẩm việc phòng trừ điều trị bệnh hại nấm Collectotrichum sp gây Kết đạt đƣợc qua trình nghiên cứu đƣợc trình bày tóm tắt nhƣ sau: Đã chế tạo đƣợc oligochitosan có khối lƣợng phân tử Mw từ ÷ 30 kDa phƣơng pháp chiếu xạ dung dịch chitosan 5% 0,5% acid acetic có bổ sung 1% H2O2 dải liều ÷ 25 kGy Hiệu suất cắt mạch xạ gia tăng đáng kể có mặt H2O2 dung dịch chiếu xạ Hay nói khác việc ứng dụng hiệu ứng đồng vận (synergic) để cắt mạch chitosan chế tạo oligochitosan làm giảm đáng kể liều xạ (~7,5 lần) Kết phân tích phổ hồng ngoại (FTIR) phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (NMR) cho thấy sản phẩm chitosan chiếu xạ dãi liều ÷ 25 kGy kết hợp xử lý 1% H2O2 có độ deacetyl nhƣ cấu trúc hầu nhƣ không thay đổi so với chitosan ban đầu Hoạt tính kháng nấm mơi trƣờng lỏng cao thử nghiệm môi trƣờng rắn Cụ thể, môi trƣờng PDA, hoạt lực kháng nấm Collectotrichum capsia cao nồng độ 1% phân đoạn có Mw > 30 kDa đạt 68,92%; khả kháng nấm Collectotrichum gloeosporioides cao nồng độ 1% phân đoạn có Mw > 30 kDa đạt 82,82% Trong môi trƣờng PDB, khả kháng nấm Collectotrichum gloeosporioides cao nồng độ 0,75% phân đoạn có Mw > 30 kDa đạt 98,54% ii ABSTRACT The study "Research on manufacturing Oligochitosan by irradiation combined with hydrogen peroxide treatment and assessing resistance capacity to Colletotrichum sp in vitro" was conducted at the Research and Development Center for High Technology Agriculture from March 2015 to December 2015 This study was aimed at making Oligochitosan segments from chitosan by irradiation combined with hydrogen peroxide treatment, determining the structural characteristics of Oligochitosan segments fabricated and evaluating antifungal activity towards Collectotrichum sp in vitro at different concentrations in order to develop probiotics for treatment of diseases caused by Collectotrichum sp The results achieved during the study are summarized as follows: Having made Oligochitosan with the molecular from ÷ 30 kDa by irradiating 5% chitosan solution in 0.5% acetic acid supplemented with 1% H2O2 in the dose range ÷ 25 kGy Chain scission efficiency significantly increases in the presence of H2O2 in radiation solution In other words, the application of synergistic effects to chain scissor chitosan to fabricate Oligochitosan significantly reduced radiation dose (~ 7.5 times) Fourier transform infrared spectrometry (FTIR) analysis results and Nuclear magnetic resonane spectroscopy (NMR) showed that radiated chitosan products in the dose range ÷ 25 kGy combined with 1% H2O2 treatment had the unchanged structure and the same deacetyl compared to the original chitosan Antifungal percentage are higher in the liquid medium compared with solid medium Particularly, in the PDA environment, fungal resistance to Collectotrichum capsia was highest at the concentration of 1% and segment Mw > 30 kDa reached 68.92%; fungal resistance to Collectotrichum gloeosporioides was highest at the concentration of 1% and segment Mw > 30 kDa reached 82.82% In PDB environment, fungal resistance to Collectotrichum gloeosporioides was highest at the concentrations of 0.75% and segments Mw > 30 kDa reached 98.54% iii MỤC LỤC TÓM TẮT ii ABSTRACT iii MỤC LỤC iv DANH SÁCH BẢNG – ĐỒ THỊ vii DANH SÁCH HÌNH viii THƠNG TIN CHUNG VỀ ĐỀ TÀI x MỞ ĐẦU I MỞ ĐẦU II MỤ T ÊU ĐỀ TÀI ƢƠN – TỔNG QUAN TÀI LI U 1.1 TỔNG QUAN VỀ OLIGOCHITOSAN 1.1.1 Nguồn gốc oligochitosan 1.1.2 Hóa học xạ nƣớc dung dịch nƣớc 1.1.3 Hiệu ứng đồng vận cắt mạch chitosan 1.2 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU KHÁNG NẤM CỦA OLIGOCHITOSAN 1.3 NẤM Collectotrichum sp 1.3.1 Nghiên cứu nấm Collectotrichum gloeosporioides 1.3.1.1 Phân loại nấm C gloeosporioides 1.3.1.2 Sự phân bố phạm vi ký chủ nấm C gloeosporioides 10 1.3.1.3 Đặc điểm hình thái sinh học nấm C gloeosporioides 10 1.3.2 Nghiên cứu nấm Collectotrichum capsia 12 1.3.2.1 Phân bố phạm vi ký chủ nấm C capsia 12 1.3.2.2 Đặc điểm hình thái nấm C capsia 12 ƢƠN – VẬT LI P ƢƠN P PN N ỨU 14 2.1 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 14 2.1.1.Thời gian địa điểm 14 2.1.1.1 Thời gian 14 2.1.1.2 Địa điểm 14 iv 2.1.2 Nội dung nghiên cứu 14 2.2 NGUYÊN LI U, HÓA CHẤT VÀ DỤNG CỤ THIẾT BỊ NGHIÊN 14 CỨU 2.2.1 Nguyên liệu, hóa chất 14 2.2.2 Đối tƣợng, dụng cụ thiết bị 14 2.3 15 ƢƠ Á Ê ỨU 2.3.1 Nội dung 1: Chế tạo phân đoạn oligochitosan phƣơng pháp chiếu xạ kết hợp xử lý H2O2 xác định đặc trƣng cấu trúc phân 15 đoạn 2.3.1.1 Tạo vật liệu oligochitosan phƣơng pháp chiếu xạ chiếu xạ 15 kết hợp xử lý H2O2 2.3.1.2 Xác định đặc trƣng cấu trúc phân đoạn oligochitosan 16 2.3.2 Nội dung 2: Khảo sát khả kháng nấm Colletotrichum sp phân đoạn oligochitosan điều kiện in vitro 17 2.3.2.1 Thí nghiệm 1: Đánh giá ảnh hƣởng oligochitosan lên phát triển nấm Collectotrichum sp 17 2.3.2.2 Thí nghiệm 2: Đánh giá ảnh hƣởng oligochitosan lên phát 18 triển sinh khối nấm canh trƣờng 2.4 ƢƠ ƢƠN Á XỬ LÝ SỐ LI U 19 – KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 NGHIÊN CỨU CHẾ TẠ Á Â Đ ẠN OLIGOCHITOSAN 20 20 3.3.1 Nội dung 1: Chế tạo phân đoạn oligochitosan phƣơng pháp chiếu xạ kết hợp xử lý H2O2 xác định đặc trƣng cấu trúc phân 20 đoạn 3.3.1.1 Xác định liều chiếu xạ tạo vật liệu oligochitosan phƣơng pháp chiếu xạ chiếu xạ kết hợp xử lý H2O2 20 3.3.1.2 Xác định đặc trƣng cấu trúc phân đoạn oligochitosan 25 3.2 Nghiên cứu khả kháng nấm Collectotrichum sp phân đoạn 32 oligochitosan 3.2.1 Khả kháng nấm C capsia môi trƣờng PDA 33 3.2.2 Khả kháng nấm C gloeosporioides môi trƣờng PDA 37 v 3.2.3 Khả kháng nấm C gloeosporioides môi trƣờng PDB ƢƠN – KẾT LUẬN ĐỀ NGHỊ 40 44 4.1 KẾT LUẬN 44 4.2 ĐỀ NGHỊ 44 TÀI LI U THAM KHẢO 45 PHỤ LỤC 52 vi DANH SÁCH BẢNG – ĐỒ THỊ SỐ TÊN BẢNG TRANG 3.1 Khối lƣợng phân tử (Mw) theo liều xạ dung dịch chitosan 20 5% 3.2 Khối lƣợng phân tử theo liều xạ dung dịch chitosan 5% / 22 H2O2 1% 3.3 àm lƣợng phân đoạn mẫu oligochitosan chế tạo sử 25 dụng H2O2 1% 3.4 Độ deacetyl oligochitosan chế tạo đƣợc 28 3.5 Đƣờng kính tản nấm C capsia sau 10 ngày nuôi cấy môi 34 trƣờng PDA phân đoạn nồng độ oligochitosan khác 3.6 Khả ức chế phát triển (%) nấm C.capsia 34 phân đoạn oligochitosan khác 3.7 Đƣờng kính tản nấm C gloeosporioides sau 10 ngày nuôi cấy 38 môi trƣờng PDA phân đoạn nồng độ oligochitosan khác 3.8 Khả ức chế phát triển (%) nấm C gloeosporioides 38 phân đoạn nồng độ oligochitosan khác 3.9 Sinh khối nấm C gloeosporioides sau 10 ngày nuôi cấy 41 môi trƣờng PDB phân đoạn nồng độ oligochitosan khác 3.10 Khả ức chế phát triển (%) C gloeosporioides phân đoạn oligochitosan khác vii 41 DANH SÁCH HÌNH SỐ 1.1 TÊN HÌNH Cấu tạo chitin, chitosan oligochitosan TRANG 1.2 chế kích kháng thực vật chitosan, oligochitosan 1.3 chế bắt hydro gốc tự hydroxyl cắt mạch chitosan 3.1 Sự phụ thuộc khối lƣợng phân tử chitosan 5% theo liều xạ 20 3.2 Sự phụ thuộc khối lƣợng phân tử dung dịch chitosan 5% / 22 H2O2 1% theo liều xạ 3.3 Tỷ lệ phân đoạn mẫu oligochitosan chế tạo đƣợc 26 3.4 Phổ UV-Vis phân đoạn oligochitosan chế tạo 26 dung dịch chitosan 5% / H2O2 1% liều xạ 10 kGy 3.5 Phổ FT-IR phân đoạn oligochitosan chế tạo dung 27 dịch chitosan 5% / H2O2 1% liều xạ 10 kGy 3.6 Phổ 1H mẫu phân đoạn chitosan có Mw < kDa chế tạo 29 phƣơng pháp chiếu xạ 75 kGy dung dịch 5% chitosan 0,5% acid acetic 3.7 Phổ 1H mẫu phân đoạn chitosan có Mw < kDa chế tạo 30 phƣơng pháp chiếu xạ 10 kGy dung dịch 5% chitosan 0,5% acetic acid 1% H2O2 3.8 Phổ 13C mẫu phân đoạn chitosan có Mw < kDa chế tạo 30 phƣơng pháp chiếu xạ 75 kGy dung dịch 5% chitosan 0,5% acid acetic 3.9 Phổ 13C mẫu phân đoạn chitosan có Mw < kDa chế tạo 31 phƣơng pháp chiếu xạ 10 kGy dung dịch 5% chitosan 0,5% acetic acid 1% H2O2 3.10 Khả phát triển (%) nấm C.capsia môi trƣờng 33 PDA phân đoạn nồng độ oligochitosan khác 3.11 Đƣờng kính tản nấm C capsia nồng độ 1% khác sau 10 ngày viii 35 3.12 Khả phát triển (%) nấm C gloeosporioides môi 37 trƣờng PDA phân đoạn nồng độ oligochitosan khác 3.13 Đƣờng kính tản nấm C gloeosporioides nồng độ 1% sau 10 39 ngày 3.14 Khả phát triển (%) nấm C gloeosporioides môi 40 trƣờng PDA phân đoạn nồng độ oligochitosan khác 3.15 Sinh khối nấm C gloeosporioides nồng độ 0,75% sau 10 ngày ix 42 PHỤ LỤC 1.1 Khả ức chế nấm C capsia mơi trƣờng PDA 1.1.1 Oligochitosan có Mw < kDa KHA NANG UC CHE C.CAPSIA COS 20 11:08 Thursday, December 17, 2015 The ANOVA Procedure Dependent Variable: KETQUA Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 585.1000000 117.0200000 10.36 F 585.1000000 117.0200000 10.36 F Model 9.9000000 1.9800000 0.14 0.9798 Error 24 328.8000000 13.7000000 Corrected Total 29 338.7000000 R-Square Coeff Var Root MSE KETQUA Mean 0.029229 5.774339 3.701351 64.10000 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F 9.90000000 1.98000000 0.14 0.9798 NT KHA NANG UC CHE C.CAPSIA COS 16:00 Thursday, December 15, 2015 The ANOVA Procedure Duncan's Multiple Range Test for KETQUA NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate Alpha Error Degrees of Freedom Error Mean Square Number of Means Critical Range 4.831 5.074 0.05 24 13.7 5.231 5.341 5.423 Means with the same letter are not significantly different Duncan Grouping Mean N NT A A A A A A A A A A A 65.000 DC 64.600 A.A 64.000 0,25 64.000 0,5 63.800 0,75 63.200 1.1.4 Oligochitosan có Mw: 10÷30 kDa KHA NANG UC CHE C.CAPSIA COS 29 11:08 Thursday, December 17, 2015 54 The ANOVA Procedure Dependent Variable: KETQUA Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 3186.266667 637.253333 56.81 F 3186.266667 637.253333 56.81 F Model 799.3666667 159.8733333 Error 24 173.6000000 7.2333333 Corrected Total 29 972.9666667 R-Square Coeff Var Root MSE KETQUA Mean 0.821577 3.737127 2.689486 71.96667 Source 22.10 F DF Anova SS Mean Square F Value 799.3666667 159.8733333 22.10 NT KHA NANG UC CHE C.GLOEOSPORIOIDES COS 10:24 Thursday, December 16, 2015 The ANOVA Procedure Duncan's Multiple Range Test for KETQUA NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 24 Error Mean Square 7.233333 Number of Means Critical Range 3.511 3.687 3.801 3.881 Means with the same letter are not significantly different Duncan Grouping Mean N NT A 78.600 B B B B B 74.800 0,25 74.800 0,75 73.600 0,5 C C C 65.200 DC 64.800 A.A 57 3.940 1.2.2 Oligochitosan có Mw: 1÷3 kDa KHA NANG UC CHE C.GLOEOSPORIOIDES COS 11:08 Thursday, December 17, 2015 The ANOVA Procedure Dependent Variable: KETQUA Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 481.9000000 96.3800000 6.15 0.0008 Error 24 376.4000000 15.6833333 Corrected Total 29 858.3000000 R-Square Coeff Var Root MSE KETQUA Mean 0.561459 5.633313 3.960219 70.30000 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F 481.9000000 96.3800000 6.15 0.0008 NT KHA NANG UC CHE C.GLOEOSPORIOIDES COS 10:24 Thursday, December 16, 2015 The ANOVA Procedure Duncan's Multiple Range Test for KETQUA NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 24 Error Mean Square 15.68333 Number of Means Critical Range 5.169 5.429 5.596 5.714 5.802 Means with the same letter are not significantly different Duncan Grouping Mean N NT A A A A A A A 75.400 0,25 73.400 0,5 72.400 0,75 70.600 B B B 65.200 DC 64.800 A.A 58 1.2.3 Oligochitosan có Mw: 3÷10 kDa KHA NANG UC CHE C.GLOEOSPORIOIDES COS 11:08 Thursday, December 17, 2015 The ANOVA Procedure Dependent Variable: KETQUA Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 1872.966667 374.593333 40.28 F 1872.966667 374.593333 40.28 30 kDa KHA NANG UC CHE C.GLOEOSPORIOIDES COS 17 11:08 Thursday, December 17, 2015 The ANOVA Procedure Dependent Variable: KETQUA Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 13923.20000 2784.64000 642.61 F 13923.20000 2784.64000 642.61 F Model 0.53420932 0.13355233 141.42 F 0.53420932 0.13355233 141.42 F Model 0.41978512 0.10494628 121.79 F 0.41978512 0.10494628 121.79