Tài liệu tập huấn kỹ thuật PCR chuẩn đoán bệnh trên tôm cá potx

Vi n Nghiên C u Và Nuôi Tr ng Th y S n II ệ ứ ồ ủ ả Trung Tâm Qu c Gia Quan Tr c, C nh Báo Môi Tr ngố ắ ả ườ Và Phòng Ng a D ch B nh Th y S n Khu V c Nam Bừ ị ệ ủ ả ự ộ TÀI LIỆU TẬP HUẤN KỸ THUẬT PCR CHẨN ĐOÁN BỆNH TRÊN TÔM CÁ L u hành n i bư ộ ộ Tp. H Chí Minh 2007ồ 1 CH NG I: ƯƠ LÝ THUY T PHÒNG THÍ NGHI MẾ Ệ I. AN TOÀN PHÒNG THÍ NGHI MỆ Luôn m c qu n áo b o h trong khi làm vi c t i phòng thí nghi m.ặ ầ ả ộ ệ ạ ệ 1. Hóa ch tấ Hóa ch t s d ng trong phòng thí nghi m sinh h c phân t ph n l n là nh ng ch t đ cấ ử ụ ệ ọ ử ầ ớ ữ ấ ộ h i vì th , luôn xem k tên hóa ch t tr c khi s d ng và c n ghi chú rõ ràng bên ngoàiạ ế ỹ ấ ướ ử ụ ầ bao bì m i lo i hóa ch t. ỗ ạ ấ Tr c khi s d ng m t lo i hóa ch t m i, c n ph i tham kh o thông tin c a chúng tướ ử ụ ộ ạ ấ ớ ầ ả ả ủ ừ các tài li u c a nhà s n xu t. Ví d :ệ ủ ả ấ ụ Phenol – r t d gây cháy ấ ễ Acrylamide – tác đ ng đ c lên h th n kinh ộ ộ ệ ầ Ethidium bromide – tác nhân gây ung thư Luôn đeo găng tay khi làm vi c v i các hóa ch t và không bao gi đ c hút chúng b ngệ ớ ấ ờ ượ ằ mi ng. N u ti p xúc tr c ti p v i nh ng ch t đ c này ph i nhanh chóng r a vùng ti pệ ế ế ự ế ớ ữ ấ ộ ả ử ế xúc d i vòi n c và tuân theo ch d n c a ng i h ng d n. ướ ướ ỉ ẫ ủ ườ ướ ẫ Các hóa ch t c n ph i đ c b o qu n đúng nhi t đ quy đ nh: nhi t đ phòng, trong tấ ầ ả ượ ả ả ệ ộ ị ệ ộ ủ mát (4 0 C) ho c t l nh âm (-20ặ ủ ạ 0 C) và đ c ghi nhãnượ c n th nẩ ậ . 2. Đèn t ngo i (UV)ử ạ Ti p xúc tr c ti p v i tia UV có th gây h i m t. Luôn luôn đeo kính b o v khi sế ụ ế ớ ể ạ ắ ả ệ ử d ng đèn UVụ . 3. Ngu n đi nồ ệ Đi n th s d ng trong quá trình đi n di có th gây gi t đi n. Đ y n p b n đi n diệ ế ử ụ ệ ể ậ ệ ậ ắ ồ ệ trong su t quá trình đi n di đ tránh b đi n gi t. Luôn t t ngu n đi n tr c khi l yố ệ ể ị ệ ậ ắ ồ ệ ướ ấ b n gel ra kh i b n đi n di.ả ỏ ồ ệ 4. Các v t d ngậ ụ V t d ng th y tinh và nh a dùng trong sinh h c phân t ph i s ch và vô trùng. ngậ ụ ủ ự ọ ử ả ạ Ố nghi m b n nh nhi m khu n ho c dính các ch t t y đ u có th c ch ph n ngệ ẩ ư ễ ẩ ặ ấ ẩ ề ể ứ ế ả ứ ho c làm h ng v t li u di truy n (nucleicacid).ặ ỏ ậ ệ ề V t d ng th y tinh ( ng nghi m, bình tam giác…) t t nh t c n đ c r a b ng n cậ ụ ủ ố ệ ố ấ ầ ượ ử ằ ướ c t, h p thanh trùng ho c s y 150ấ ấ ặ ấ 0 C trong vòng 1 gi . Đ i v i thí nghi m liên quanờ ố ớ ệ RNA, v t d ng th y tinh c n đ c x lý b ng diethyl-pyrocarbonate đ c ch enzymeậ ụ ủ ầ ượ ử ằ ể ứ ế RNases là m t lo i enzyme r t b n đ i v i vi c h p thanh trùng. V t d ng nh a (pipetsộ ạ ấ ề ố ớ ệ ấ ậ ụ ự và ng nuôi c y, ng nghi m nh …) c n đ c thanh trùng tr c khi s d ng.ố ấ ố ệ ỏ ầ ượ ướ ử ụ 2 5. Rác th i và hóa ch t th aả ấ ừ Ethidium bromide là m t tác nhân gây ung th vì th khi thao tác v i nh ng v t d ng cóộ ư ế ớ ữ ậ ụ dính ch t này c n ph i đeo găng tay b o h . Gel agarose có ch a Ethidium bromide c nấ ầ ả ả ộ ứ ầ ph i đ c v t b trong m t túi riêng có đánh d u.ả ượ ứ ỏ ộ ấ Quy đ nh túi rác cho t ng khu v c, t ng công đo nị ừ ự ừ ạ Hóa ch t nguy hi m c n có túi đ riêngấ ể ầ ể II. PHA CH DUNG D CHẾ Ị N ng đ mole, % và dung d ch m "X"ồ ộ ị ẹ . N ng đ moleồ ộ Dung d ch có n ng đ mole 1 M là m t dung d ch có th tích 1 lít vàị ồ ộ ộ ị ể ch a s gram hóa ch t t ng đ ng v i trong l ng phân t c a ch t đó. ứ ố ấ ươ ươ ớ ượ ử ủ ấ Ví d : Chu n b 100ml dung d ch NaCl 5M (tr ng l ng phân t : 58.456 đvc)ụ ẩ ị ị ọ ượ ử Cân 29.29 g NaCl (cách tính: 58.456 g/mol x 5 moles/lít x 0.1 lít) Pha trong 100ml n c c t ho c dung dung môi.ướ ấ ặ N ng đ ph n trăm: ồ ộ ầ N ng đ ph n trăm (trong l ng/th tích) = tr ng l ng ch t tanồ ộ ầ ượ ể ọ ượ ấ (g) pha trong 100 ml n c c t ho c dung dung môi. ướ ấ ặ Ví d : Chu n b dung d ch agarose 0.7% trong đ m đi n di TBEụ ẩ ị ị ệ ệ Cân 0.7 g agarose Thêm dung d ch TBE 1X sao cho th tích cu i cùng là 100ml. ị ể ố Dung d ch m "X".ị ẹ Nhi u lo i hóa ch t, dung d ch c n đ c chu n b n ng đ caoề ạ ấ ị ầ ượ ẩ ị ở ồ ộ (dung d ch m ) 5 l n (5X) ho c m i l n (10X) so v i n ng đ c n thi t khi s d ng.ị ẹ ầ ặ ườ ầ ớ ồ ộ ầ ế ử ụ Tr c khi s d ng chúng s đ c pha loãng thích h p đ đ a v n ng đ c n thi tướ ử ụ ẽ ượ ợ ể ư ề ồ ộ ầ ế (1X c a dung d ch làm vi c). ủ ị ệ Ví d : Chu n b dung d ch đi n di TBE 1X: ụ ẩ ị ị ệ 100ml dung d ch TBE 10X ị Thêm 900ml n c c t đ th tích cu i cùng là 1000 ml dung d ch TBE 1X.ướ ấ ể ể ố ị Chu n b dung d ch làm vi c t dung d ch mẩ ị ị ệ ừ ị ẹ Nhi u dung d ch trong nghiên c u và ng d ng sinh h c phân t đòi h i s d ng cùngề ị ứ ứ ụ ọ ử ỏ ử ụ m t thành ph n hóa ch t nh ng l i khác nhau v n ng đ . Vì th đ tránh ph i ph cộ ầ ấ ư ạ ề ồ ộ ế ể ả ứ t p khi pha ch riêng r các hóa ch t này chúng ta t t nh t nên chu n b s n m t vàiạ ế ẽ ấ ố ấ ẩ ị ẵ ộ dung d ch g c đ d dàng pha loãng chúng khi c n thi t.ị ố ể ễ ầ ế Ví d : có th pha đ m TBE (10 mM Tris, 1 mM EDTA) b ng cách ph i h p 1ml dungụ ể ệ ằ ố ợ d ch Tris 1M và 2 ml dung d ch EDTA 0.5 M c ng v i 98.8 ml n c c t vô trùng. ị ị ộ ớ ướ ấ Công th c chung dùng đ tính toán n ng đ c n thi t nh sau:ứ ể ồ ộ ầ ế ư 3 Ci x Vi = Cf x Vf C i = n ng đ ban đ u, ho c n ng đ c a ồ ộ ầ ặ ồ ộ ủ dung d ch mị ẹ; V i = th tích ban đ u, ho c l ng dung d ch m c n thi t, ể ầ ặ ượ ị ẹ ầ ế C f = n ng đ cu i, ho c n ng đ mong mu n sau khi pha; ồ ộ ố ặ ồ ộ ố V f = th tích cu i, ho c th tích mong mu n sau khi pha ể ố ặ ể ố III. S D NG THI T BỬ Ụ Ế Ị Yêu c u h c viên gi gìn các v t d ng trong phòng thí nghi m c n th n. ầ ọ ữ ậ ụ ệ ẩ ậ Không đ c t ý s d ng các thi t b khi ch a đ c s đ ng ý ho c ch a đ c h ngượ ự ử ụ ế ị ư ượ ự ồ ặ ư ượ ướ d n s d ng c a ng i h ng d n. ẫ ử ụ ủ ườ ướ ẫ Không di d i d ng c , thi t b t khu v c này đ n khu v c khác mà ch a có ý ki n c aờ ụ ụ ế ị ừ ự ế ự ư ế ủ ng i h ng d nườ ướ ẫ Thông báo ngay b t kỳ h ng hóc c a thi t b . ấ ỏ ủ ế ị Máy ly tâm Khi ly tâm, c n ph i cân b ng rotor tr c khi ly tâm. ầ ả ằ ướ Lau chùi rotor c a máy ly tâm sau khi s d ng n u b v y b nủ ử ụ ế ị ấ ẩ Đ y n p máy ly tâm khi s d ng xong.ậ ắ ử ụ Micropipettors M i pipette đ u có gi i h n th tích do v y c n ph i ki m tra gi i h n th c aỗ ề ớ ạ ể ậ ầ ả ể ớ ạ ể ủ t ng pipette tr c khi s d ng. Không đ c đi u ch nh pipette quá m c gi i h n.ừ ướ ử ụ ượ ề ỉ ứ ớ ạ Không đ r i pipette xu ng đ t.ể ơ ố ấ IV. NGUYÊN T C PH N NG PCR TRONG CH N ĐOÁNẮ Ả Ứ Ẩ PCR là ph n ng nhân t o t ng h p vàả ứ ạ ổ ợ khu ch đ i m t đo n DNA n m gi a haiế ạ ộ ạ ằ ữ trình t g i là ự ọ m iồ (primer). M i (primer)ồ là nh ng đo n DNA ng nữ ạ ắ (oligonucleotides) có kh năng b t c p bả ắ ặ ổ sung chính xác v i trình t đích (trình tớ ự ự DNA ho c cDNA) c a đ i t ng c n xácặ ủ ố ươ ầ đ nh (ví d nh DNA c a WSSV ho cị ụ ư ủ ặ cDNA c a YHV). Sau khi m i (primer)ủ ồ b t c p vào trình t đích, m t enzyme cóắ ặ ự ộ tên DNA polymerase s ti n đ n đ u 3’ẽ ế ế ầ c a m i m i (primer) đ th c hi n ti nủ ỗ ồ ể ự ệ ế trình sinh t ng h p đo n DNA c n thi t. ổ ợ ạ ầ ế Thành ph n c b n c a Master Mix cho ph n ng PCR:ầ ơ ả ủ ả ứ 4 - D ch trích DNA m uị ẫ - Dung d ch đ m c a ph n ng PCR (PCR buffer ho c Taq buffer)ị ệ ủ ả ứ ặ - Ion Mg 2+ (MgCl2 ) - Deoxy nucleotide triphosphate (dNTP’s: dATP, dCTP, dGTP, dTTP) - Các m i (m i xuôi: F và m i ng c : R)ồ ồ ồ ượ - Enzym Taq polymerase Ph n ng PCR g m có ba ả ứ ồ quá trình trong m t ộ chu kỳ khu ch đ i: ế ạ Bi n tínhế , b t c pắ ặ và kéo dài , chúng đ c l p l i nhi u l n đ khuy ch đ i trình t DNA mong mu n.ượ ặ ạ ề ầ ể ế ạ ự ố Sau m i ỗ chu kỳ khu ch đ i s l ngế ạ ố ượ phân t DNA đích đ c nhân lên g p đôi:ử ượ ấ t 1 phân t lên 2, lên 4 lên 8, lên 16 phânừ ử t … 2ử n . Chi ti t ba quá trình trên trong m i chu kỳế ỗ khu ch đ i nh sau:ế ạ ư Bi n tínhế : Phân t DNA s i đôi đ cử ợ ượ hình thành b i m i liên k t hydro gi a haiở ố ế ữ m ch đ n. Trong quá trình bi n tính,ạ ơ ế nhi t đ ph n ng gia tăng lên nhanhệ ộ ả ứ chóng đ n 95ế o C và gi nhi t đ nàyữ ở ệ ộ trong kho ng 15-50 giây. nhi t đ này m i liên k t hydro gi a hai m ch đ n c aả Ở ệ ộ ố ế ữ ạ ơ ủ phân tử DNA s i đôiợ b phá v . Trong giai đo n ị ỡ ạ b t c pắ ặ ti p theoế , nhi t đ ph n ngệ ộ ả ứ gi m nhanh chóng làm cho m i liên k t hydro ban đ u không hình thành l i đ c k tả ố ế ầ ạ ượ ế qu làm t o thành hai phân t DNA m ch đ n.ả ạ ử ạ ơ B t c pắ ặ : Trong giai đo n b t c p, nhi t đ lai th ng duy trì kho ng 50- 60ạ ắ ặ ệ ộ ườ ả 0 C, trong th i gian 15-60 giây. Quá trình này giúp cho các m i (primer) tìm ki m và b t c p bờ ồ ế ắ ặ ổ sung đ c hi u v i trình t đích (DNA ho c cDNA) t i v trí mong mu n. Nhi t đ b tặ ệ ớ ự ặ ạ ị ố ệ ộ ắ c p ph thu c vào s l ng G,C có trong m i (primer).ặ ụ ộ ố ượ ồ Kéo dài: Sau khi m i (primer) tìm ki m và b t c p b sung v i trình t đích, nhi t đồ ế ắ ặ ổ ớ ự ệ ộ c a ph n ng l i nhanh chóng chuy n v nhi t đ thích h p v i ho t đ ng c a enzymeủ ả ứ ạ ể ề ệ ộ ợ ớ ạ ộ ủ DNA polymerase th ng là 72ườ 0 C và gi nhi t đ này 30 giây đ n 2 phút tùy theoữ ở ệ ộ ế chi u dài c a đo n DNA đích c n t ng h p. Trong quá trình t ng h p ề ủ ạ ầ ổ ợ ổ ợ DNA polymerase 5 s l y ẽ ấ nucleotide (A,T,G,C) t môi tr ng ph n ng đ g n vào đ u 3’ c a m iừ ườ ả ứ ể ắ ầ ủ ồ (primer) theo nguyên t c b sung v i trình t trên phân t DNA ho c cDNA đích. Năngắ ổ ớ ự ử ặ l ng dùng trong quá trình g n k t này là ATP cũng có trong môi tr ng ph n ng. K tượ ắ ế ườ ả ứ ế qu quá trình này ph n ng PCR đã t o ra hai phân t DNA m ch đôi m i t m t phânả ả ứ ạ ử ạ ớ ừ ộ t DNA m ch đôi ban đ u.ử ạ ầ Nh v y sau nhi u chu kỳ kh ch đ i (th ng t 30-40 chu kỳ) t m t phân t đích banư ậ ề ế ạ ườ ừ ừ ộ ử đ u ph n ng PCR đã t o ra vô s ầ ả ứ ạ ố phân tử b n saoả có kích th c xác đ nhướ ị mong mu n. ố Cu i cùng s n ph m PCR đ c nhu m v i Ehididum bromide và đem quan sát s phátố ả ẩ ượ ộ ớ ự quang d i tia UV sau khi phân tách s n ph m PCR trên gel agarose theo kích th c.ướ ả ẩ ướ Các y u t nh h ng đ n k thu t PCRế ố ả ưở ế ỹ ậ K thu t PCR có đ nh y r t cao, tuy nhiên, ph ng pháp này cũng có m t s h n chỹ ậ ộ ạ ấ ươ ộ ố ạ ế sau: S ngo i nhi mự ạ ễ : ng i ta đã ch ng minh đ c r ng vi c m n p ng nghi m sauườ ứ ượ ằ ệ ở ắ ố ệ m i l n khu ch đ i trong kho ng không gian kín nh phòng thí nghi m s làm cho 1ỗ ầ ế ạ ả ư ệ ẽ ph n các phân t DNA đ c khu ch đ i vào không khí và nhi m vào các ph n ng sauầ ử ượ ế ạ ễ ả ứ làm cho ph n ng PCR v sau có nh ng s n ph m khu ch đ i không mong mu n. ả ứ ề ữ ả ẩ ế ạ ố 6 Các sai sót gây ra do Taq polymerase: S sao chép b i Taq DNA polymerase cho t lự ở ỉ ệ sai khá cao trung bình 104 Nucleotide thì enzyme g n sai m t nucleotide. Tuy nhiên đ cắ ộ ặ tính này không nghiêm tr ng n u ta không c n xác đ nh chính xác trình t c a DNA.ọ ế ầ ị ự ủ VI. PHÂN TÍCH S N PH M PCR B NG ĐI N DI GEL AGAROSEẢ Ẩ Ằ Ệ Đi n di aệ garose th ng đ c s d ng đ xác đ nh s n ph m PCR d a trên kh năngườ ượ ử ụ ể ị ả ẩ ự ả phân tách các đo n DNA có kích th c khác nhau khi s n ph m PCR di chuy n quaạ ướ ả ẩ ể mang l i các vi l có trong gel agarose. ướ ỗ Do phân t DNA tích đi n âm cao. Khi phân tử ệ ử DNA đ c đ t d i m t đi n tr ng xácượ ặ ướ ộ ệ ườ đ nh, nh ng phân t DNA tích đi n âm này sị ữ ử ệ ẽ di chuy n v phía c c d ng c a đi n tr ng,ể ề ự ươ ủ ệ ườ trong tr ng h p đi n di agarose chúng s diườ ợ ệ ẽ chuy n qua gel agarose đ c đ t trong dungể ượ ặ d ch ị đ m đi n diệ ệ . Các phân t càng nh cóử ỏ kh năng di chuy n càng nhanh trong gel agarose v phía c c d ng so v i các phân tả ể ề ự ươ ớ ử DNA l n h n. Nguyên tác này cho phép k thu t đi n di phân tách các đo n DNA cóớ ơ ỹ ậ ệ ạ kích th c khác nhau.ướ S n ph m PCR đ c tr n v i ả ẩ ượ ộ ớ dung d ch đ t m u (loading gel)ị ặ ẫ vào chuy n vào cácể gi ng trên gel agarose đ th c hi n phân tách d i tác đ ng c a đi n tr ng. Gelế ể ự ệ ướ ộ ủ ệ ườ agarose có ch a s n ứ ẵ Ethidium bromide vì th khi DNA di chuy n trong gel agarose sế ể ẽ t o liên k t v i Ethidium bromide ạ ế ớ Dung d ch đ t m u (loading gel)ị ặ ẫ ch a ch t có t tr ng n ng (nh đ ng sucrose ho cứ ấ ỷ ọ ặ ư ườ ặ glycerol) đ lôi cu n DNA xu ng đáy gi ng trên b n gel agarose và ngăn c n không choể ố ố ế ả ả DNA khu ch tán vào dung d ch đ m đi n di. Ngoài ra, trong dung dich đ t m u cònế ị ệ ệ ặ ẫ ch a ch t ch th tích đi n âm. Ch t ch th di chuy n cùng v i DNA giúp cho d dàngứ ấ ỉ ị ệ ấ ỉ ị ể ớ ễ c l ng s di chuy n c a DNA trong b n gel. Ch t ch th th ng dùng là ướ ượ ự ể ủ ả ấ ỉ ị ườ Xylene cyanol và Bromophenol blue, chúng di chuy n cùng v i nh ng phân t DNA có chi u dàiể ớ ữ ử ề t ng ng l n l t là 5000 bp and 300 bpươ ứ ầ ượ Đ m di n di: ệ ệ Đ m đi n di giúp n đ nh các đi u ki n môi tr ng cho phép quá trình diệ ệ ổ ị ề ệ ườ chuy n c a DNA đ c n đ nh trong su t quá trình đi n di. Có m t vài lo i đ m đi nể ủ ượ ổ ị ố ệ ộ ạ ệ ệ di th ng dùng trong phân tích đi n di agarose: Tris acetate ườ ệ EDTA (TAE), Tris/Borate/EDTA (TBE). Kh năng đ m c a dung d ch đ m TAE th p h n so v i TBE.ả ệ ủ ị ệ ấ ơ ớ Tuy nhiên, TAE l i cho phép phân tách t t đ i v i nh ng đo n DNA l n h n. Đi u nàyạ ố ố ớ ữ ạ ớ ơ ề đ ng nghĩa v i vi c ph i dùng đi n th th p h n và m t th i gian đi n di nhi u h n.ồ ớ ệ ả ệ ế ấ ơ ấ ờ ệ ề ơ K t thúc quá trình đi n di b n gel s đ c đ t d i tác đ ng c a tia UV, các đo nế ệ ả ẽ ượ ặ ướ ộ ủ ạ DNA s n ph m PCR sau khi phân tách theo kích th c s đ c hi n th d i d ngả ẩ ướ ẽ ượ ể ị ướ ạ băng v ch màu vàng sáng t i nh ng v trí khác nhau t ng ng v i kích th c chi u dàiạ ạ ữ ị ươ ứ ớ ướ ề c a chúng. ủ 7 Ethidium bromide có s n trong b n gel s chèn vào gi a các baz nit c a phân t DNAẵ ả ẽ ữ ơ ơ ủ ử d n đ n chúng bám vào ph n trung tâm c a phân t DNA. S phát sáng là do ph c h pẫ ế ầ ủ ử ự ứ ợ DNA-Ethidiun bromide phát ra khi ch u tác đ ng c a tia UV.ị ộ ủ Ghi chú: 1. Khu thao tác tách chi t v t li u di truy n, khu pha ch hoá ch t và khu đi n di s nế ậ ệ ề ế ấ ệ ả ph m PCR ph i tách bi t, tránh tr ng h p DNA t khu tách chi t và khu đi n di ngo iẩ ả ệ ườ ợ ừ ế ệ ạ nhi m vào trong hoá ch t tr c khi đem ph n ng.ễ ấ ướ ả ứ 2. T thao tác g n đèn c c tím dùng cho pha ch hoá ch t cho ph n ng PCR.ủ ắ ự ế ấ ả ứ 3. Gel agarose ch y đi n di ph i đ c chu n b trong m t t hút khí đ c.ạ ệ ả ượ ẩ ị ộ ủ ộ 8 CH NG ƯƠ 2: THI T B VÀ HÓA CH TẾ Ị Ấ I. Thi t b và D ng c ế ị ụ ụ 1. Tinh s ch và tách chi t v t li u di truy nạ ế ậ ệ ề 1. T l nh hai ngăn: 4ủ ạ 0 C và –21 0 C 2. Máy ly tâm 14.000 RPM (làm RT-PCR thì c n có thêm máy ly tâm l nh14.000ầ ạ RPM) 3. Máy cách th y (water bath) hay block nhi t khô (dry heat block)ủ ệ 4. Máy tr n m u (Vortex)ộ ẫ 5. Micropipette các lo i: 0,5 - 10 ạ µl; 10 -100 µl; 40 -200 µl; 200 -1000 µl; đ u tipầ micropipette các lo i: 0,5-10ạ µl, 20µl, 200µl, 1000µl 6. Eppendorf các lo i: 0,2ml; 0,5 ml và 1,5 ml (chuyên dùng cho PCR)ạ ; Giá ngố nghi m cho Eppendorf ệ 7. Giá ng nghi m cho lo i tube PCR 0,2ml và 0,5mlố ệ ạ 8. H p đ ng n c đáộ ự ướ 9. D ng c bào đá b ng tayụ ụ ằ 10. Bình đ ng c n ự ồ 11. H p đ ng gi y th m lau tayộ ự ấ ấ 12. Các b kéo, panh vô trùngộ 13. H p nh a có n p đ ng v t li u dộ ự ắ ự ậ ệ ơ 14. Box vô trùng 15. Máy c t n c 2 l nấ ướ ầ 16. T s y d ng c (hot box oven)ủ ấ ụ ụ 17. V t li u khác: Các l s ch đ đ ng m u, c n 95% đ c đ nh và b o qu nậ ệ ọ ạ ể ự ẫ ồ ể ố ị ả ả m u, găng tay, gi y lau, bút lông d u, kim tiêm vô trùngẫ ấ ầ 2. Khu ch đ i nucleic acidế ạ Máy luân nhi t (thermocycler)ệ B gi đi n UBS: lo i online, công su t 2000 wộ ữ ệ ạ ấ 3. Phân tích k t q aế ủ 1. B đi n di g m ngu n và b n đi n di, bàn đ c k t qu v i tia UV, máy nhộ ệ ồ ồ ồ ệ ọ ế ả ớ ả dùng đ ch p l i k t quể ụ ạ ế ả 2. Khay đ gel (b n gel kích th c 7 x 10 cm ho c 10 x 15cm), l c t o gi ngổ ả ướ ặ ượ ạ ế v i dung tích ch a m u 10 - 20ớ ứ ẫ µl 3. Micropipette 5 - 50µl 4. B p đi n ho c lò vi ba dùng đ đun agaroseế ệ ặ ể 5. Cân k thu t đ chính xác 0,1gr hay 0,01grỹ ậ ộ 6. ng đong 100ml và 500ml hay 1000mlỐ 7. Chai th y tinh ch u nhi t có n p, dung tích 250ml đ đun Agaroseủ ị ệ ắ ể 8. T đ gel (có h th ng hút h i Ethidium bromide)ủ ổ ệ ố ơ 9. H p nh a có n p đ y ch a rác th iộ ự ắ ậ ứ ả 10. V t li u khác: Găng tay, gi y lau tay, Gi y paraffin, H p đ u tip 10 -200ậ ệ ấ ấ ộ ầ µl 9 II. Hoá ch t tách chi t acid nucleicấ ế 1. Hoá ch t tách chi t thô DNAấ ế Dung d ch 0,5 N NaOHị : Cân 1 g NaOH cho vào ng đ nh m c ( ng falcon) 50ml thêmố ị ứ ố n c c t 2 l n vô trùng cho t i m c 50 ml c a ng. Ta có đ c dung d ch 0,5N NaOH.ướ ấ ầ ớ ứ ủ ố ượ ị Dung d ch 0,25% SDSị : Cân 0,125 g SDS cho vào ng falcon 50 ml thêm n c c t 2 l nố ướ ấ ầ vô trùng cho t i m c 50 ml. Ta có đ c dung d ch 0,25 % (W/V) SDS.ớ ứ ượ ị Dung d ch NaOH 0,25% - SDS 0,125%ị : 5ml NaOH 0,5N 5ml SDS 0,25% H 2 O đ 100mlủ B o qu n l nh 4ả ả ạ o C 2. Hoá ch t tinh s ch DNAấ ạ TE ( Tris-EDTA): pha100 ml (1 ml 1M Tris, 0.2ml 0.5M EDTA và cho n c đ 100 ml)ướ ủ h p kh trùng 121ấ ử o C trong 15 phút (autoclave) sau đó b o qu n 4ả ả ở 0 C. Dung d ch 0.5M EDTAị (Ethylene Diamine TetraAcetic ): cân 18,61 g trong 70ml n cướ c t. Sau đó cho 15-20 h t NaOH đ chu n cho pH = 8. sau đó thêm n c c t đ 100 mlấ ạ ể ẩ ướ ấ ủ và đem đi h p autoclave. B o qu n 4ấ ả ả ở 0 C Phenol pH 8: Cân kho ng 100 g phenol tinh th , đ tan 68ả ể ể ở 0 C . Thêm vào m t th tíchộ ể 100 ml dung d ch Tris HCl 0,5M (pH = 8). Khu y t trong 15 phút , đ yên dung d ch choị ấ ừ ể ị đ n khi th y hai pha rõ r t, hút b pha bên trên. Ti p t c cho thêm m t th tích Trisế ấ ệ ỏ ế ụ ộ ể HCL 0,1M (pH = 8). L p l i thao tác nh trên cho đ n khi đo đ c dung d ch phenol pHặ ạ ư ế ượ ị = 8. Phenol pH 4: Cân kho ng 100 g phenoltinh th , đ tan 68ả ể ể ở 0 C . Thêm vào m t th tíchộ ể 100 ml n c c t hai l n h p kh trùng. Khu y t trong 15 phút, đ yên dung d ch choướ ấ ầ ấ ử ấ ừ ể ị đ n khi th y hai pha rõ r t, hút b pha bên trên. Ti p t c cho thêm m t th tích n cế ấ ệ ỏ ế ụ ộ ể ướ c t nh trên. L p l i thao tác nh trên cho đ n khi đo đ c dung d ch phenol pH = 4ấ ư ặ ạ ư ế ượ ị Phenol pH 8 : Chloroform : Isomyl alcolhol (25:24:1): Pha 100 ml dung d ch tách chi tị ế b ng cách dùng đ u tip tinh s ch hút 2ml Isoamyl alcolhol vào 50ml phenol pH = 8, l cằ ầ ạ ắ tr n đ u; sau đó thêm 48ml dung d ch cholroform vào tr n đ u.ộ ề ị ộ ề Sodium Acetate 3M (pH: 5.2): Cân 40,8g NaOAc*3H 2 O, hòa tan trong 80 ml H 2 O. Sau đó chu n pH 5.2 v i acid acetic. Thêm n c cho đ 100 ml.ẩ ớ ướ ủ C n 70%:ồ Đong 70 ml c n tuy t đ i cho vào 30 ml Hồ ệ ố 2 O c t vô trùng. Ta đ c 100 mlấ ượ c n 70%ồ C n tuy t đ iồ ệ ố (100%) H 2 O – DEPC : Hút 1ml DEPC (diethylpyrocarbonate) cho vào 1lít n c c t lo i Ion. ướ ấ ạ Ủ qua đêm và đem h p vô trùng.ấ Dung d ch TNị (20 mM Tris–HCl, 0.4 M NaCl, pH 7.4) 3. Hoá ch t tách chi t RNA (ấ ế Trizol) 10 [...]... 100V ́ 618 bp 317 bp Sản phẩm khuếch đại RT-nested PCR trên RNA GAV&LOV 8 Qui trình chẩn đốn bệnh SVCV trên cá chép và cá cảnh a Chn bị phan ứng RT -PCR ̉ ̉ Hút 25 µl AccessQuick TMMaster mix (Promega) 1 µl mơi SCVCF1 (50 pmol/µl) ̀ 1 µl mơi SCVCR2 (50 pmol/µl) ̀ 1 µl Enzyme reverse transcriptase M-MLV(Promega) 19 µl nước DEPC 2-5µl RNA SCVC (đã biên tinh trên may ln nhiêt 70 0C trong 10 phut, lam lanh... ̀ ́ ̣ Tất cả cho vào micro tube PCR 0.2 ml Sau đó, thực hiện phản ứng trên máy ln nhiệt b Thanh phân 50 µ l phan ứng Nested PCR bước 2 gơm: ̀ ̀ ̉ ̀ 25 µl PCR Master mix (Promega), 0.7µl mơi GAV1 (50pmol/µl) ̀ 0.7µl mơi GAV2 (50pmol/µl) ̀ 21.6 µl nước cât hai lân vơ trung ́ ̀ ̀ 2 µl sản phẩm khuếch đại bước 1 c Thực hiên phan ứng ̣ ̉ Phản ứng RT -PCR Thực hiên phan ứng trên may ln nhiêt theo cac chu kỳ... ̀ ́ ̣ Tất cả cho vào micro tube PCR 0.2 ml Sau đó, thực hiện phản ứng trên máy ln nhiệt b Thanh phân 50 µ l phan ứng Semi-Nested PCR gơm: ̀ ̀ ̉ ̀ 25 µl PCR Master mix (Promega), 1 µl mơi SCVCF1 (50pmol/µl) ̀ 23 1 µl mơi SCVCR4 (50pmol/µl) ̀ 21µl nước cât hai lân vơ trung ́ ̀ ̀ 2 µl sản phẩm khuếch đại bước 1 c Thực hiên phan ứng ̣ ̉ Phản ứng RT -PCR Thực hiên phan ứng trên may ln nhiêt theo cac chu kỳ... ́ ̣ Tất cả cho vào micro tube PCR 0.2 ml Sau đó, thực hiện phản ứng trên máy ln nhiệt b Thanh phân 50 µ l phan ứng Nested PCR bước 2 gơm: ̀ ̀ ̉ ̀ 25 µl PCR Master mix (Promega), 0.5µl mơi IMNVF2 (50pmol/µl) ̀ 0.5µl mơi IMNVR2 (50pmol/µl) ̀ 22 µl nước cât hai lân vơ trung ́ ̀ ̀ 2 µl sản phẩm khuếch đại bước 1 c Thực hiên phan ứng ̣ ̉ Phản ứng RT -PCR Thực hiên phan ứng trên may ln nhiêt theo cac chu... dịch trên tan đều 5 Đổ hỗn hợp Agarose trên vào khn bản gel có cài sẵn lược Để n khoảng 30 phút cho bản gel đơng lại 27 6 Khi bản gel đơng, nhẹ nhàng rút lược ra khỏi khn, khi đó trên bản gel xuất hiện các lỗ trống gọi là giếng 7 Đặt cả khn và bản gel vào bồn điện di Điện di sản phẩm 1 Dùng micropipette hút 10µl sản phẩn PCR của bước hai đem trộn đều với 2µl dung dịch nạp mẫu 6X 2 Hút 10µl hỗn hợp trên. .. transcriptase M-MLV(Promega) 19 µl nước DEPC 2-5µl RNA VNN (đã biên tinh trên may ln nhiêt 70 0C trong 10 phut, lam lanh nhanh ́ ́ ́ ̣ ́ ̀ ̣ 0 băng may ln nhiêt ở 4 C hoặc trong nước đá) ̀ ́ ̣ Tất cả cho vào micro tube PCR 0.2 ml Sau đó, thực hiện phản ứng trên máy ln nhiệt b Thanh phân 50 µ l phan ứng Nested PCR bước 2 gơm: ̀ ̀ ̉ ̀ 25 µl PCR Master mix (Promega), 0.5µl mơi VNF2 (40pmol/µl) ̀ 0.5µl mơi VNR2... kỳ 720C trong 7 phut ́ Giữ 40C cho đên khi phân tich ́ ́ d Xac đinh san phâm: Sử dung 10µl san phâm khch đai điên di trên gel agrose 1,5% ́ ̣ ̉ ̉ ̣ ̉ ̉ ́ ̣ ̣ thời gian 30-40 phut và ở 100V ́ Kêt quả điên di: ́ ̣ Sản phẩm RT -PCR trên RNA VNN Sản phẩm nested PCR 7 Qui trình RT-nested PCR chẩn đốn virus GAV & LOV (Walker P., 2000) Ngun tắc: Cặp mồi GAV5 và GAV6 được thiết kế để khuếch đại đoạn gen dòng... mang các loại động vật này (tổng lượng mẫu khơng qúa 200 microgram) II QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT VÀ TINH SẠCH VẬT LIỆU DI TRUYỀN 1 Tách chiết thơ DNA Ngun tắc: Phương pháp dựa trên ngun tắc phối hợp cơ học (nghiền), hóa học (NaOH-SDS) và sốc nhiệt để tách chiết DNA virus ra dịch chiết 1 Mẫu tơm được nghiền kỹ trong eppendorf với 600-800ml dịch tách chiết DNA (NaOH 0.25N, SDS 0,125%) 2 Đem biến tính bằng cách... biến tính và tủa các protein, chúng sẽ bị tập trung trong lớp phân cách giữa phase lỏng và phase PCI sau khi ly tâm DNA trong phase lỏng sẽ bị kết tủa bởi ethanol ở nồng độ muối cao 1 Trong eppendorf, cho vào 400µl dịch chiết thơ DNA bệnh phẩm (xem phương pháp 1), thêm 400µl PCI 2 Vortex mạnh trong 10 giây 3 Ly tâm 13,000RPM trong 2 phút 4 Hút chuyển khoảng 350µl phần phase lỏng ở trên chứa DNA vào... phần nước nổi bằng cách vừa hút cạn dần vừa cho đầu tip vào dọc thành ống đối diện với chỗ đóng cặn lóng DNA Rửa cặn lóng DNA với 1ml Ethanol 70%, khơng vortex mà chỉ úp ngửa vài lần 9 Ly tâm 13.000 rpm trong 5 phút, hút bỏ Ethanol, và làm khơ cặn lóng bằng cách đun cách thủy hay đun trong block nhiệt khơ ở nhiệt độ 50-560 C cho đến khi khơ hồn tồn (khơng còn thấy các giọt nước đọng trên thành ống) 10 . ắ ả ườ Và Phòng Ng a D ch B nh Th y S n Khu V c Nam Bừ ị ệ ủ ả ự ộ TÀI LIỆU TẬP HUẤN KỸ THUẬT PCR CHẨN ĐOÁN BỆNH TRÊN TÔM CÁ L u hành n i bư ộ ộ Tp. H Chí Minh 2007ồ 1 CH NG I: ƯƠ LÝ THUY T. b ng cách đun cách thu hay block nhi t. ằ ỷ ệ 14. Hòa c n RNA trong 50-100 µl H2O-DEPC. B o qu n -20ặ ả ả ở 0 C. III. QUI TRÌNH PCR CH N ĐOÁN VIRUS GÂY B NH TRÊN TÔMẨ Ệ 1. Qui trình ch n đoán. quang d i tia UV sau khi phân tách s n ph m PCR trên gel agarose theo kích th c.ướ ả ẩ ướ Các y u t nh h ng đ n k thu t PCR ố ả ưở ế ỹ ậ K thu t PCR có đ nh y r t cao, tuy nhiên, ph ng pháp