Nghiên cứu tạo cây đậu xanh chuyển gen có khả năng kháng mọt

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận 1.1 Khả kháng mọt giống đậu xanh đánh giá thông qua tiêu khối lượng hạt hao hụt, tỷ lệ nhiễm mọt, hệ số gia tăng quần thể Giống đậu xanh Tằm TH có khả kháng mọt tốt nhất, số mẫn cảm với mọt C chinensis 634,63; giống đậu xanh ĐX22 có khả kháng mọt nhất, số mẫn cảm với mọt 1058,72 cao giống Tằm TH 1,67 lần 1.2 Gen VrPDF1 phân lập từ đậu xanh gồm 356 bp, có cấu trúc phân đoạn, gồm hai exon intron Đoạn mã hóa gen VrPDF1 có kích thước 228 bp, mã hóa 75 amino acid 1.3 Vector chuyển gen thực vật pBetaPhaso-VrPDF1 biểu hạt thiết kế thành công hoạt động tốt thuốc Gen chuyển VrPDF1 hợp vào hệ gen thuốc chuyển gen di truyền từ hệ T0 sang hệ T1 Protein tái tổ hợp VrPDF1 có kích thước khoảng 10 kDa biểu hạt thuốc có khả ức chế -amylase ruột ấu trùng mọt 1.4 Biến nạp thành công cấu trúc pBetaPhaso-VrPDF1 tạo dòng đậu xanh chuyển gen hệ T1 từ giống đậu xanh ĐX22 Xác định protein tái tổ hợp VrPDF1 biểu hai dòng đậu xanh chuyển gen hệ T1 (DX1-3 DX1-7) có kích thước khoảng 10 kDa Hiệu suất chuyển gen giống đậu xanh ĐX22 đạt 0,32% Protein tái tổ hợp VrPDF1 biểu ức chế -amylase ấu trùng mọt, hiệu suất ức chế -amylase hai dòng đậu xanh chuyển gen DX1-3 DX1-7 hệ T1 tăng 166,40 % 178,19% so với không chuyển gen Đề nghị Tiếp tục theo dõi, đánh giá hai dòng đậu xanh DX1-3 DX1-7 hệ tiếp theo, thử nghiệm khả kháng mọt thông qua lây nhiễm nhân tạo nhằm chọn tạo dòng đậu xanh chuyển gen ổn định khả kháng mọt cao Tai Lieu Chat Luong 24 MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Đậu xanh ba đậu đỗ nhóm đậu ăn hạt, đứng sau đậu tương lạc Hạt đậu xanh nguồn thực phẩm giàu đạm Hạt đậu xanh vừa cung cấp protein cho người, vừa có giá trị y học, có giá trị cải tạo đất Việt Nam quốc gia có điều kiện tốt để phát triển sản xuất nông nghiệp, nhiên yếu tố thuận lợi cho sâu hại phát sinh, phát triển gây tổn thất nghiêm trọng tới suất phẩm chất nông sản Theo ước tính, tổn thất sau thu hoạch khoảng từ 10% - 30% sản lượng trồng nông nghiệp Điều có nghĩa khoảng 10% - 30% lượng lương thực không sử dụng tỷ lệ tổn thất cơng sức tài đầu tư sản xuất nơng nghiệp Do đó, việc đánh giá hạn chế tổn thất sau thu hoạch cơng tác có ý nghĩa việc đảm bảo lương thực điều kiện hạn chế diện tích trồng trọt dân số gia tăng Đối với nhóm nơng sản hạt nguyên nhân gây tổn thất đến số lượng chất lượng hạt côn trùng mà chủ yếu số thuộc Bộ cánh cứng (thường gọi mọt) Các loài mọt gây hại chủ yếu cho đậu đỗ là: mọt đậu xanh (Callosobruchus chinensis L.), mọt đậu đỏ (Callosobruchus maculatus F.), mọt đậu nành (Ancanthoscelides obtectus)… Trong đó, mọt đậu xanh Callosobruchus chinensis L thuộc họ Bruchid, Coleoptera loài gây hại chủ yếu cho hạt đậu xanh Sự tổn hại mọt gây lớn, cơng tác phịng trừ mọt đậu nói chung mọt đậu xanh nói riêng vấn đề cần quan tâm nghiên cứu Hiện nay, có số nghiên cứu bước đầu đánh giá khả kháng mọt, kháng nấm, kháng virus … số loại trồng có đậu xanh Theo nghiên cứu cơng bố, đặc tính kháng mọt hại hạt trồng phức tạp liên quan đến hoạt động protein defensin Defensin thực vật nhóm chuỗi peptide nhỏ đặc trưng cấu trúc gấp cuộn ba chiều qua cầu nối disulfide cystein Defensin thực vật hoạt động mạnh tổng hợp protein ức chế, ảnh hưởng đến kênh trao đổi ion, tác động đến hoạt động α-amylase trypsin, làm suy yếu vi sinh vật… Cơ chế gây độc defensin mọt đậu xanh cản trở hoạt động phân giải tinh DX1-3, DX1-7 bảng 3.10 cho thấy hiệu suất hoạt động -amylase từ ấu trùng mọt đậu xanh dịch protein chiết từ chuyển gen giảm so với dịch protein chiết từ không chuyển gen, 33,60% (DX1-3) 21,81% (DX1-7) Như thấy nghiên cứu này, protein tái tổ hợp rVrPDF1 hai dòng đậu xanh chuyển gen T1 ức chế hoạt động amylase ấu trùng mọt đậu xanh So với không chuyển gen, hiệu suất ức chế -amylase từ ấu trùng mọt đậu xanh rVrPDF1 dòng đậu xanh chuyển gen DX1-3 tăng 166,40% 178,19% dòng DX1-7 (Hình 3.24) Defensin hạt đậu xanh có khả ức chế -amylase mọt đậu xanh Gen VrPDF1 (gen nội tại) mã hóa protein defensin đậu xanh có kích thước 356 bp, gen chuyển VrPDF1 có kích thước 228 bp hoạt động phiên mã dịch mã tổng hợp protein defensin VrPDF1 protein VrPDF1 ức chế hoạt động -amylase ấu trùng mọt đậu xanh Kết so sánh hiệu suất ức chế -amylase từ ấu trùng mọt đậu xanh rVrPDF1 dòng đậu xanh chuyển gen DX1-3 tăng 166,40% 178,19% dịng DX1-7 so với khơng chuyển gen chứng minh tăng cường biểu defensin hạt ứng ứng dụng kỹ thuật chuyển gen biện pháp nâng cao khả kháng mọt hại hạt đậu xanh 23 % bột -amylase ruột mọt ngăn chặn tiêu hoá tinh bột mọt, ức chế sinh trưởng phát triển mọt Defensin hạt đậu xanh có hàm lượng thấp khác giống, để tăng hiệu ức chế α-amylase ruột ấu trùng mọt, việc ứng dụng công nghệ gen nhằm tăng cường biểu hiện, nâng cao hàm lượng defensin hạt quan tâm nghiên cứu Xuất phát từ sở trên, lựa chọn đề tài cho luận án là: “Nghiên cứu tạo đậu xanh chuyển gen có khả kháng mọt” Mục tiêu nghiên cứu (i) Phân tích đặc điểm gen defensin (VrPDF1) phân lập từ giống đậu xanh Việt Nam có khả kháng mọt khác (ii) Biểu gen defensin thuốc chuyển gen (iii) Tạo đậu xanh chuyển gen chứa gen liên quan đến tính kháng mọt Callosobruchus chinensis L Nội dung nghiên cứu 3.1 Nghiên cứu đánh giá khả kháng mọt số giống đậu xanh trồng phổ biến miền Bắc Việt Nam 3.2 Nghiên cứu thông tin, tách dịng xác định trình tự gen VrPDF1 phân lập từ đậu xanh Phân tích đặc điểm trình tự nucleotide, trình tự amino acid suy diễn gen VrPDF1 phân lập từ giống đậu xanh có khả kháng mọt tốt giống đậu xanh kháng mọt 3.3 Thiết kế vector chuyển gen thực vật mang gen VrPDF1 phân tích hoạt động vector chuyển gen thuốc chuyển gen hệ T0 T1 3.4 Nghiên cứu chuyển cấu trúc chứa gen VrPDF1 tạo đậu xanh chuyển gen Phân tích biểu protein tái tổ hợp rVrPDF1 đậu xanh chuyển gen hệ T1 Những đóng góp luận án Luận án cơng trình Việt Nam nghiên cứu có hệ thống từ đánh giá phân nhóm giống đậu xanh có khả kháng mọt khác nhau; phân lập, tách dòng gen VrPDF1 đến thiết kế vector chuyển gen, tạo chuyển gen phân tích biểu gen chuyển VrPDF1, cụ thể là: 1) Đã phân lập gen VrPDF1 từ DNA hệ gen hai giống đậu xanh có khả kháng mọt khác biệt Gen VrPDF1 có kích thước 356 bp gồm 200,0 180,0 160,0 140,0 120,0 100,0 80,0 60,0 40,0 20,0 0,0 178,19 166,40 100 100 33,60 21,81 Hiệu suất hoạt động alphaHiệu suất ức chế alphaamylase dòng chuyển amylase dòng chuyển gen giảm so với WT gen tăng so với WT WT ĐX1-3 ĐX1-7 Hình 3.24 Biểu đồ so sánh hiệu suất hoạt động -amylase hiệu suất ức chế -amylase protein defensin hỗn hợp -amylase từ ấu trùng mọt đậu xanh dịch protein chiết từ chuyển gen, không chuyển gen Phân tích định tính hoạt độ -amylase từ ấu trùng mọt phân giải chất tinh bột thể hình 3.23 Hình 3.23 Hình ảnh phân tích định tính khả ức chế α-amylase ấu trùng mọt đậu xanh protein tái tổ hợp rVrDEF1 từ hạt đậu xanh chuyển gen ĐX22 hệ T1 hạt đậu xanh ĐX22 đối chứng không chuyển gen 3.3.5 Thảo luận kết tăng cường biểu protein VrPDF1 đậu xanh chuyển gen Gen chuyển biểu chuyển gen kiểm tra dựa kết phân tích hoạt động phiên mã dịch mã gen chuyển sử dụng kỹ thuật RT-PCR, Real time RT-PCR, Western blot Tương tự phân tích biểu gen nghiên cứu trước đây, kết nghiên cứu chúng tôi, protein tái tổ hợp VrPDF1 biểu mơ hình chuyển gen với kích thước khoảng 10 kDa Khác với nghiên cứu trên, phân tích protein tái tổ hợp chuyển gen sử dụng kỹ thuật ELISA để so sánh mức độ biểu protein tái tổ hợp dịng chuyển gen Theo đó, kết phân tích ELISA dòng đậu xanh chuyển gen DX1-3 DX1-7 xác định hàm lượng protein tái tổ hợp VrPDF1 dịng DX1-7 cao dịng DX1-3 (Hình 3.22) Như vậy, theo hướng tiếp cận khả kháng mọt tương quan với hàm lượng protein defensin VrPDF1 kết phân ELISA dự đốn hệ đậu xanh chuyển gen T1 dòng DX1-7 có khả kháng mọt cao dịng DX1-3 Tuy nhiên, điều cần kiểm chứng thực nghiệm phân tích hoạt động ức chế amylase protein tái tổ hợp VrPDF1 so sánh khả kháng mọt dòng đậu xanh chuyển gen dòng chuyển gen đối chứng không chuyển gen Trong kết đánh giá hoạt động ức chế -amylase từ ấu trùng mọt đậu xanh protein tái tổ hợp rVrPDF1 hai dòng đậu xanh 22 intron (128 bp) xen exon (228 bp); cDNA gen VrPDF1 có 228bp, mã hóa 75 amino acid 2) Protein tái tổ hợp rVrPDF1 biểu thuốc chuyển gen dịch chiết chứa protein rVrPDF1 từ dịng thuốc chuyển gen T1 có khả ức chế -amylase ruột ấu trùng mọt 3) Tạo đậu xanh giống ĐX22 mang gen chuyển VrPDF1 hệ T1 biểu thành công protein tái tổ hợp rVrPDF1 Chứng minh dịch chiết chứa protein tái tổ hợp rVrPDF1 biểu ức chế -amylase ấu trùng mọt, hiệu suất ức chế -amylase hai dòng chuyển gen DX1-3 DX17 tăng 166,40 % 178,19% so với không chuyển gen Ý nghĩa khoa học thực tiễn 5.1 Về mặt khoa học Kết nghiên cứu góp phần làm sáng tỏ đặc điểm cấu trúc gen VrPDF1 phân lập từ giống đậu xanh Việt Nam có khả kháng mọt khác Sự tăng cường biểu protein tái tổ hợp rVrPDF biểu khả ức chế -amylase ruột ấu trùng mọt protein từ chuyển gen sở khoa học để khẳng định hiệu việc ứng dụng công nghệ gen nhằm nâng cao khả kháng mọt đậu xanh nói riêng trồng thu hạt nói chung 5.2 Về mặt thực tiễn Các trình tự gen VrPDF1 phân lập được, cấu trúc vector chuyển gen thực vật mang gen VrPDF1, dòng chuyển gen T1, dịch chiết chứa rVrPDF1 có khả ức chế -amylase ruột ấu trùng mọt góp phần giải vấn đề cụ thể việc ứng dụng kỹ thuật chuyển gen cải thiện khả kháng mọt đậu xanh, mở triển vọng ứng dụng công nghệ sinh học đại vào thực tiễn chọn giống trồng thu hạt Việt Nam Cấu trúc luận án: Luận án có 119 trang (kể tài liệu tham khảo) chia thành chương, phần: Mở đầu (4 trang), Chương 1: Tổng quan tài liệu (31 trang); Chương 2: Vật liệu phương pháp nghiên cứu (22 trang); Chương 3: Kết thảo luận (42 trang); Kết luận đề nghị (1 trang); Các cơng trình cơng bố liên quan đến luận án (1 trang); Tài liệu tham khảo (18 trang) Luận án có 21 bảng, 31 hình tham khảo 158 tài liệu Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU Luận án tham khảo tổng kết 158 tài liệu, có 27 tài liệu tiếng Việt, 126 tài liệu tiếng Anh địa trang web vấn đề liên quan, như: (1) Đặc điểm mọt hại đậu xanh thiệt hại mọt gây cho đậu xanh; (2) Defensin thực vật; (3) Ứng dụng kỹ thuật chuyển gen biểu gen defensin thực vật số loài thuộc chi Vigna Đậu xanh thực phẩm ngắn ngày giá trị kinh tế cao, dễ canh tác, nguồn thực phẩm chứa đầy thành phần dinh dưỡng cho người vật ni Hiện nay, đậu xanh đóng vai trị quan trọng sau đậu tương lạc, nhóm trồng ưu tiên khuyến khích sản xuất Nhằm nâng cao suất, sản lượng đậu xanh, nhiều cơng trình tập trung nghiên cứu, chọn tạo đưa giống có chất lượng, chống chịu điều kiện bất lợi phù hợp với vùng đất canh tác Sâu bệnh nguyên nhân trực tiếp ảnh hưởng tới suất bảo quản sau thu hoạch loài lấy hạt đậu xanh, đậu tương,…, làm giảm chất lượng giá trị thương phẩm sản phẩm, có mọt hại đậu xanh Mọt gây hại đậu xanh (Callosobruchus chinensis L.) gây hại kho dự trữ mà chúng lan truyền gây hại đồng ruộng Mọt đậu xanh gây hại loại đậu: đậu xanh, đậu tằm, đậu đũa, đậu Hà Lan, đậu đen hại nặng đậu xanh với tỷ lệ hại 100% (Bùi Công Hiển, 1995) Sự thiệt hại chúng gây lớn, cơng tác phịng trừ sâu mọt đậu nói chung mọt đậu xanh nói riêng vấn đề cấp thiết cần quan tâm nghiên cứu Trong năm qua có nhiều cơng trình nghiên cứu chọn tạo loại trồng có khả kháng loại trùng, nấm virus Các nghiên cứu thống đặc tính kháng mọt hại hạt trồng phức tạp liên quan đến hoạt động protein defensin Defensin thực vật nhóm chuỗi peptide nhỏ đặc trưng cấu trúc gấp cuộn ba chiều qua tám cầu nối disulfide cystein Defensin thực vật hoạt động mạnh tổng hợp protein ức chế, ảnh hưởng đến chức kênh ion, tác động đến hoạt động α-amylase trypsin, làm suy yếu vi sinh vật (Cavalho et al., 2011) Cơ chế gây độc defensin côn trùng hạt đậu xanh mô tả cản trở enzyme phân giải tinh bột, làm cho 3.3.4 Kiểm tra hoạt động ức chế -amylase từ ấu trùng mọt protein tái tổ hợp rVrPDF1 hệ T1 Dịch chiết protein từ hạt đậu xanh hai dòng chuyển gen DX1-3, DX1-7 hệ T1 kiểm tra biểu protein defensin tái tổ hợp Western blot ELISA dịch chiết protein từ hạt không chuyển gen WT sử dụng thử nghiệm kiểm tra khả ức chế -amylase ấu trùng mọt đậu xanh Kết thể bảng 3.10 Bảng 3.10 Hoạt độ -amylase từ ấu trùng mọt đậu xanh mẫu ủ với dịch chiết protein từ hạt dòng đậu xanh chuyển gen T1 từ hạt khơng chuyển gen Mẫu Chỉ có amylase từ ấu trùng mọt ĐC Hoạt độ αamylase (ĐVHĐ/mg) 9,47 ± 0,29 6,19 ± 0,09 Hỗn hợp -amylase từ ấu trùng mọt đậu xanh dịch protein chiết từ dòng chuyển gen DX1-3 DX1-7 2,08 ± 0,06 1,35 ± 0,05 Bảng 3.10 cho thấy hoạt độ -amylase thí nghiệm có amylase từ ấu trùng mọt chất tinh bột 9,47 (ĐVHĐ/mg), khó hoạt độ -amylase hỗn hợp -amylase từ ấu trùng mọt đậu xanh dịch protein chiết từ không chuyển gen 6,19 (ĐVHĐ/mg) Đối với hai dòng chuyển gen, hoạt độ -amylase hỗn hợp -amylase từ ấu trùng mọt đậu xanh dịch protein chiết từ dòng chuyển gen DX1-3 2,08 (ĐVHĐ/mg), từ dòng DX1-7 1,35 (ĐVHĐ/mg) Như thấy, dịch chiết protein từ chuyển gen không chuyển gen có tượng làm giảm hoạt độ -amylase so với thí nghiệm có -amylase từ ấu trùng mọt chất tinh bột Kêt phân tích cho thấy hỗn hợp -amylase từ ấu trùng mọt đậu xanh dịch protein chiết từ hai dòng chuyển gen (DX1-3 DX1-7) có hoạt độ -amylase thấp không chuyển gen Điều cho thấy protein tái tổ hợp rVrPDF1 hai dòng đậu xanh chuyển gen hệ T1 có khả ức chế -amylase từ ấu trùng mọt 21 WT không xuất băng protein Kết phân tích Western blot chứng minh protein tái tổ hợp rVrPDF1 biểu thành cơng hai dịng đậu xanh chuyển gen DX1-3 DX1-7 có nguồn gốc từ giống đậu xanh ĐX22 Như nhận xét rằng, gen chuyển VrPDF1 di truyền qua sinh sản hữu tính từ hệ T0 sang T1, hoạt động ổn định biểu hai hệ chuyển gen Hình 3.21 Kết phân tích Western blot từ dòng đậu xanh chuyển gen hệ T1 đối chứng không chuyển gen Hàm lượng protein tái tổ hợp rVrPDF1 hạt hai dòng DX1-3 DX1-7 hệ T1 phân tích ELISA, kết thể hình 3.22 Biểu đồ cho thấy hai dòng đậu xanh chuyển gen tổng hợp rVrPDF1 với hàm lượng protein dao động từ 6,23 µg/mg đến 9,26 µg/mg Dịng DX1-7 hàm lượng protein rVrPDF1 cao protein rVrPDF1 dòng DX1-3 Kết chứng minh hai dòng đậu xanh chuyển gen, protein VrPDF1 tăng cường biểu mọt tồn Khi mọt ăn hạt đậu xanh, defensin ức chế hoạt động α-amylase, ngăn chặn tiêu hóa tinh bột, kìm hãm sinh trưởng, phát triển dần mọt chết (Henrik et al., 2009; Liu et al., 2006) Trong năm gần có số nghiên cứu cấu trúc hoạt tính sinh học defensin thực vật, đề xuất ứng dụng công nghệ sinh học nghiên cứu chức gen defensin nâng cao khả kháng mọt đậu xanh (Cavalho et al., 2009, 2011; Dos et al., 2010; Henrik et al., 2009; Tavars et al, 2008) Defensin thực vật biểu nhiều quan khác tạo tuyến phòng vệ trước đối tượng sâu bệnh Mặc dù tác động defensin thực vật nhiều đối tượng sâu bệnh chưa hiểu rõ, defensin sử dụng để tạo trồng biến đổi gen, giúp cải thiện khả chống chịu mọt Chuyển gen defensin đậu xanh biện pháp công nghệ làm tăng hàm lượng defensin nhằm tăng cường khả ức chế α-amylase ấu trùng mọt, từ nâng cao khả kháng mọt đậu xanh Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Hình 3.22 Kết phân tích ELISA xác định hàm lượng protein tái tổ hợp VrPDF1 ba dòng đậu xanh chuyển gen (DX1-3, DX1-4, DX1-7) đối chứng không chuyển gen (WT) 2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU Sử dụng hạt giống đậu xanh, giống (Tằm TH, ĐX11, ĐX22, ĐXVN5, ĐXVN6, ĐX14) Trung tâm nghiên cứu phát triển đậu đỗ, Viện Cây Lương thực Thực phẩm, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam cung cấp, hai giống (ĐX17, V123) Viện nghiên cứu Ngô Đan Phượng cung cấp Giống thuốc K326 Phịng Cơng nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học công nghệ Việt Nam cung cấp Các chủng vi khuẩn E coli DH5α A tumefaciens CV58 phịng Cơng nghệ tế bào thực vật Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam cung cấp Các loại vector: Vector tách dòng pBT, vector pBeta-Phaseolin vector pDON201-SLHEP Phòng Công nghệ ADN ứng dụng, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam cung cấp 2.2 HOÁ CHẤT, THIẾT BỊ VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 20 Hoá chất, KIT mua hãng tiếng Thế giới Bio-Neer, Fermentas, Invitrogen ; Thí nghiệm đánh giá khả kháng mọt giống đậu xanh nghiên cứu thực phịng thí nghiệm Trung tâm Cơng nghệ sinh học, Trường Đại học Nông Lâm Bắc Giang Các thí nghiệm phân lập gen, thiết kế vector chuyển gen vào thuốc phân tích chuyển gen tiến hành phịng Cơng nghệ ADN ứng dụng, phịng Cơng nghệ Tế bào thực vật - Viện Cơng nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học Cơng nghệ Việt Nam Thí nghiệm chuyển gen vào đậu xanh tiến hành phịng thí nghiệm Cơng nghệ tế bào thực vật, Khoa Sinh học, trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1 Phương pháp đánh giá kháng mọt giống đậu xanh nghiên cứu Phương pháp lây nhiễm mọt nhân tạo theo Tomooka cs (1992), Hà Quang Hùng (2005) 2.3.2 Phương pháp phân lập, tách dòng xác định trình tự nucleotide Kỹ thuật tách dịng gen thực theo Sammbrook cs (2001) Trình tự nucleotide gen VrPDF1 xác định máy đọc trình tự nucleotide tự động ABI PRISM@ 3100 Advant Genetic Analyzer (Applied Biosystem) sử dụng hoá chất sinh chuẩn BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing 2.3.3 Thiết kế vector chuyển gen (1) Tạo cấu trúc độc lập mang gen chuyển pDON201-SLHEP-VrPDF1; (2) Gắn cấu trúc mang gen chuyển VrPDF1 vào vector chuyển gen thực vật pBetaphaso-VrPDF1 2.3.4 Phương pháp tạo chuyển gen nhờ vi khuẩn A tumefaciens Tạo thuốc chuyển gen: Phương pháp chuyển gen gián tiếp thông qua A tumefaciens tiến hành theo phương pháp Topping (1998) Tạo đậu xanh chuyển gen: Phương pháp chuyển gen thông qua nách mầm nhờ A tumefaciens tiến hành dựa nghiên cứu Sonia cs (2007) tham khảo hệ thống tái sinh phục vụ chuyển gen vào đậu xanh Nguyễn Thị Luyện (2009), Chu Hoàng Mậu (2010) Nguyễn Vũ Thanh Thanh (2012) Hiệu suất chuyển gen VrPDF1 giai đoạn xác định đạt 0,79% (5/630 =0,79%) Sử dụng Southern blot kiểm tra kết gắn gen chuyển VrPDF1 vào hệ gen tế bào chủ Năm dòng đậu xanh chuyển gen T0 dương tính với PCR DX0-1, DX0-3, DX0-4, DX0-7, DX0-8 đối chứng không chuyển gen WT sử dụng để phân tích Southern blot, kết thể hình 3.20 19 Kb M (+) WT 10,0 7,0 5,0 4,0 3,0 2,0 1,5 Hình 3.20 Kết phân tích Southern blot DNA tổng số đậu xanh chuyển gen VrPDF1 với đoạn dò nptII đánh dấu biotin M: Marker 1kb, (-): đậu xanh ĐX22 không chuyển gen; DX0-1, DX0-3, DX0-4, DX0-7 DX0-8: dịng đậu xanh chuyển gen T0 dương tính với PCR Như vậy, chứng có mặt dung hợp gen chuyển hệ gen chuyển gen hệ T0 PCR Southern blot kết bước đầu tạo sở cho thành cơng quy trình chuyển gen VrPDF1 vào đậu xanh Các dòng đậu xanh chuyển gen chăm sóc ưu tiên phát triển phục vụ phân tích khả hoạt động biểu mạnh gen chuyển VrPDF1 chuyển gen 3.3.3 Phân tích biểu gen chuyển VrPDF1 dòng đậu xanh chuyển gen T1 Kết lai Western phân tích biểu protein tái tổ hợp từ hạt dòng đậu xanh chuyển gen WT hình 3.21 cho thấy, màng lai xuất băng màu vị trí kích thước khoảng gần 10 kDa dòng đậu xanh chuyển gen (DX1-3, DX1-7) hệ T1 Dòng chuyển gen DX1-4 Bảng 3.9 Kết biến nạp cấu trúc pPhaso-dest-VrPDF1 vào giống đậu xanh ĐX22 Đối chứng thí nghiệm ĐC0* ĐC1* Tổng Số mẫu số mẫu tạo chồi 30 30 630 Số chồi kéo dài 45 107 30 247 Số chồi rễ 25 46 Số sống giá thể 10 35 Số sống sót nhà lưới 10 23 2.3.5 Nhóm phương pháp phân tích chuyển gen Kiểm tra có mặt gen chuyển kỹ thuật PCR Phân tích đậu xanh chuyển gen Southern blot hệ T0 thực theo Southern EM (1975) Phân tích biểu protein tái tổ hợp VrPDF1 hạt chuyển gen hệ T1 phương pháp điện di protein theo Laemmli (1970) Western blot Định lượng protein VrPDF1 tái tổ hợp kỹ thuật ELISA theo phương pháp Sun cs (2006) lần Ghi chú: ĐC0* mầm đậu xanh không chuyển gen cấy mơi trường tái sinh có bổ sung kháng sinh; ĐC1* mầm đậu xanh không chuyển gen cấy môi trường tái sinh không bổ sung kháng sinh Thí nghiệm 3.3.2 Xác định có mặt dung hợp gen chuyển VrPDF1 hệ gen đậu xanh chuyển gen Để kiểm tra có mặt gen chuyển VrPDF1 hệ gen dòng đậu xanh chuyển gen, thực phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu, kết thể hình 3.19 M (+) (-) Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG MỌT VÀ PHÂN LẬP GEN VrPDF1 CỦA CÂY ĐẬU XANH 3.1.1 Khả kháng mọt giống đậu xanh nghiên cứu Chỉ số mẫn cảm mọt xác định thông qua tiêu: khối lượng đậu xanh hao hụt, tỷ lệ nhiễm mọt hệ số gia tăng quần thể mọt Giống có số mẫn cảm mọt nhỏ khả kháng mọt cao ngược lại Kết thể qua bảng 3.1 Bảng 3.1 Kết đánh giá khả kháng mọt giống đậu xanh qua thời gian nhiễm mọt 0,5 kb  0,25 kb   ~ 0,35 kb  ~ 0,25 kb Giống Tằm TH ĐX11 Hình 3.19 Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân gen VrPDF1 từ dòng đậu xanh chuyển gen hệ T0 cặp mồi VrPDF1-HinIIIF/VrPDF1-SalI-R M: thang DNA chuẩn kb; (+): đối chứng dương plasmid pBT-VrPDF1; (-) sản phẩm PCR nhân gen VrPDF1 đậu xanh khơng chuyển gen; 1-8: dịng đậu xanh chuyển gen VrPDF1 Chỉ số mẫn cảm mọt 634,63 ĐX22 828,89 1058,71 ĐXVN5 ĐXVN6 ĐX14 ĐX17 760,35 V123 792,55 961,54 902,88 687,76 Kết rằng, hệ gen đậu xanh chuyển gen tương ứng với điện di số 1, 3, 4, 7, có mặt gen chuyển VrPDF1 Trong 630 mẫu biến nạp thu đậu xanh T0 dương tính với PCR dịng đậu xanh chuyển gen T0 ký hiệu DX0-1; DX0-3, DX0-4, DX0-7, DX0-8 Bảng 3.1 cho thấy, giống đậu xanh Tằm TH có số mẫn cảm mọt thấp (634,63) giống ĐX22 có số mẫn cảm mọt cao (1058,72) Kết hợp các kết phân tích nhận thấy giống đậu xanh Tằm TH có khả kháng mọt tốt giống ĐX22 kháng mọt Lựa chọn giống để tiếp tục phân lập, tách dòng gen 18 3.1.2 Khuếch đại tách dòng gen VrPDF1 từ giống đậu xanh Tằm TH ĐX22 Lựa chọn hạt giống Tằm TH (kháng mọt tốt nhất) giống ĐX22 (kháng mọt nhất) làm đối tượng để phân tích đặc điểm gen VrPDF1 RNA tổng số, DNA tổng số tách từ mầm hạt đậu xanh kiểm tra điện di gel agarose Kết thể hình 3.2 0,5 kb  cDNA  M 0,22 kb   Gen (DNA) M 3.3 TẠO CÂY ĐẬU XANH CHUYỂN GEN VÀ BIỂU HIỆN PROTEIN TÁI TỔ HỢP rVrPDF1 Ở GIỐNG ĐẬU XANH ĐX22 3.1.1 Chuyển cấu trúc pPhaso-dest-VrPDF1 tạo đậu xanh chuyển gen Chuyển cấu trúc pBetaPhaso-dest-VrPDF1 vào giống đậu xanh ĐX22 thực nhờ A.tumefaciens lây nhiễm qua nách mầm Kết thể hình 3.18 bảng 3.9 C A B F G H K L M D E I J  0,35 kb  0,25 kb Hình 3.2 Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân gen VrPDF1 hai giống đậu xanh Tằm TH ĐX22 (M: Thang DNA chuẩn kb plus; 1, 3: sản phẩm PCR nhân từ mRNA DNAhệ gen Tằm TH ; 2, 4: sản phẩm PCR nhân từ mRNA DNA hệ gen ĐX22 ) Hình 3.3 Kết điện di kiểm tra sản phẩm colony-PCR nhân gen VrPDF1 từ dòng khuẩn lạc E coli DH5 (M: Thang DNA chuẩn kb; 1, 2, 5, 6: dòng khuẩn lạc chứa vector mang cDNA DNA gen VrPDF1 giống Tằm TH; 3, 64, 7, 8: dòng khuẩn lạc chứa vector mang cDNA DNA VrPDF1 giống ĐX22) N O Hình 3.2 cho thấy, băng DNA có kích thước khoảng 0,25 kb 0,35 kb tính tốn lý thuyết kích thước cDNA kích thước gen VrPDF1 Sản phẩm PCR tách khỏi gel, tinh gắn trực tiếp vào vector tách dòng pBT, sau nhân dịng tế bào E coli DH5 Tiến hành chọn dòng phản ứng colony-PCR trực tiếp từ khuẩn lạc Kết điện di cho thấy sản phẩm colony-PCR xuất băng DNA có kích thước khoảng 0,22 kb 0,35 kb tính tốn lý thuyết (Hình 3.3) Kết hình 3.3 cho thấy kết chọn dịng thành cơng dịng khuẩn lạc dương tính với PCR sử dụng tách chiết plasmid tái tổ hợp phục vụ việc xác định trình tự nucleotide Hình 3.18 Hình ảnh trình biến nạp cấu trúc pBetaPhaso-VrPDF1 qua mô nách mầm tái sinh đậu xanh chuyển gen A: Hạt đậu xanh ĐX22; B: Khử trùng hạt khí clo; C: Gieo hạt môi trường GM; D: Nảy mầm hạt sau ngày; E: mầm nách mầm làm nguyên liệu biến nạp; F: Nhiễm khuẩn 30 phút; G: Đồng nuôi cấy CCM; H: Cảm ứng tạo chồi SIM 1; I: Sau tuần SIM 1; J: Cảm ứng tạo chồi tuần SIM 2; K: Chọn lọc kéo dài chồi SEM; L: Ra rễ; M: Cây giá thể; N-O: Cây trồng chậu điều kiện nhà lưới 17 10 8,57 5,69 5,35 3,57 0 WT T1-7 T1-8 T1-10 T1-11 Hình 3.16 Biểu đồ so sánh hàm lượng protein rVrPDF1 tái tổ hợp (g/mg protein tổng số) dòng thuốc chuyển gen WT: thuốc không chuyển gen, T1-7, T1-8, T1-10, T1-11: bốn dòng thuốc chuyển gen Các số liệu cột biểu đồ hàm lượng protein rVrPDF1 (g/mg protein tổng số) Thanh đứng 3.1.3 Đặc điểm gen VrPDF1 phân lập từ hai giống đậu xanh Tằm TH ĐX22 Đặc điểm đoạn mã hóa thuộc gen VrPDF1 phân lập từ mRNA Kết đọc trình tự nucleotide cho thấy: Đoạn cDNA gen VrPDF1 có 228 nucleotide BLAST NCBI cho thấy: So với trình tự gen PDF1 mang mã số AB020613.1 với gen VrPDF1 phân lập từ mRNA giống Tằm TH DX22 có độ tương đồng tương ứng 99% 96% (Hình 3.4) Trình tự nucleotide gen VrPDF1 (cDNA) phân lập từ mRNA hai giống đậu xanh Tằm TH ĐX22 đăng ký ngân hàng gen với mã số LN913082.1 LN913083.1 So với AB020613.1 gen VrPDF1 Tằm TH có vị trí nucleotide sai khác ĐX22 có vị trí nucleotide cột biểu đồ sai số chuẩn Thử nghiệm hoạt động ức chế -amylase protein tái tổ hợp rVrPDF1 Để phân tích chức sinh học protein tái tổ hợp rVrDEF1 hạt dòng thuốc chuyển gen hệ T1 Dịch chiết chứa enzyme -amylase ấu trùng mọt đậu xanh ủ với dịch chiết protein từ hạt dòng chuyển gen dịch chiết protein từ hạt đối chứng không chuyển gen để kiểm tra ảnh hưởng protein tái tổ hợp rVrDEF1 đến hoạt động -amylase phân giải tinh bột, kết trình bày hình 3.17 120 Hình 3.4 Trình tự nucleotide gen VrPDF1 (cDNA) hai giống đậu xanh Tằm TH, ĐX22 trình tự mang mã số AB020613 GenBank 100,00 100 80 60 32,12 40 29,40 19,24 20 27,95 Tiếp tục phân tích, so sánh trình tự amino acid suy diễn từ trình tự cDNA giống Tằm TH ĐX22 với protein suy diễn từ AB020613.1 Ngân hàng Gen, kết thể hình 3.5 WT T1-7 T1-8 T1-10 T1-11 Hoạt độ alpha-amylase từ ấu trùng mọt ủ với dịch chiết protein chuyển gen so với ủ với dịch chiết protein đối chứng Hình 3.17 Biểu đồ so sánh kết thử nghiệm hoạt động ức chế rVrPDF1 -amylase từ ấu trùng mọt đậu xanh Kết biểu gen thuốc mơ hình thành cơng sở để tiến hành chuyển cấu trúc vào đậu xanh Hình 3.5 Trình tự amino acid suy diễn từ gen VrPDF1 hai giống đậu xanh Tằm TH, ĐX22 đoạn trình tự mang mã số AB020613 16 Từ hình 3.5 cho thấy, protein VrPDF1 gồm 75 amino acid có độ tương đồng cao So với protein mang mã số AB020613 trình tự amino acid suy diễn giống Tằm TH có độ tương đồng 96%, mẫu ĐX22 có độ tương đồng 92%; cịn trình tự amino acid suy diễn VrPDF1 hai giống đậu xanh tương đồng 88% Trình tự gen VrPDF1 (cDNA) phân lập từ mRNA giống Tằm TH kháng mọt tốt sử dụng để thiết kế vector chuyển gen VrPDF1 nhằm mục đích nâng cao khả kháng mọt đậu xanh Đặc điểm gen VrPDF1 phân lập từ DNA tổng số Kết giải trình tự nucleotide gen VrPDF1 phân lập từ DNA tổng số giống đậu xanh Tằm TH ĐX22 cho thấy: Gen VrPDF1 có kích thước 356 nucleotide BLAST NCBI độ tương đồng gen VrPDF1 so với gen PDF1 mang mã số AB020613.1 GenBank từ 95% đến 99% Việc so sánh trình tự gen VrPDF1 phân lập từ DNA từ cDNA hai giống đậu xanh Tằm TH ĐX22 cho phép xác định đặc điểm cấu trúc gen vào thuốc gen chuyển VrPDF1 hợp vào hệ gen thuốc 3.2.4 Phân tích biểu protein VrPDF1 tái tổ hợp thuốc chuyển gen hệ T1 Trong dòng thuốc chuyển gen cho kết lai Southern có chuyển gen thu hạt Hạt T0 hệ chuyển gen T1 dòng thuốc chuyển gen T0 thu hạt ký hiệu T1-4, T1-7, T1-8, T1-10, T1-11 Sử dụng dòng thuốc chuyển gen T1 đối chứng khơng chuyển gen để phân tích biểu protein VrPDF1 tái tổ hợp hạt Kết thể qua hình 3.15 M WT T1-4 T1-7 T1-8 T1-10 T1-11 35 kDa  25 kDa  15 kDa  10 kDa   Kết so sánh trình tự nucleotide gen VrPDF1 phân lập từ DNA hệ gen gen VrPDF1 phân lập từ mRNA khẳng định gen VrPDF1 phân lập thành công từ hệ gen hai giống đậu xanh Tằm TH ĐX22 Hai trình tự gen VrPDF1 giống Tằm TH ĐX22 công bố Ngân hàng Gen với mã số LT797533, LT797534 3.1.4 Thảo luận cấu trúc protein defensin Hình 3.15 cho thấy, màng lai nitrocellulose xuất băng màu Kết so sánh vùng chức VrPDF1 giống đậu xanh kháng mọt tốt kháng mọt khơng thấy có thay đổi cầu nối disunfide cặp Cys vùng chức defeinsin (Hình 3.7) cấu trúc khơng gian hai protein VrPDF1 khơng có khác L1 L2 L3 Hình 3.15 Kết lai Western protein hạt từ số dòng thuốc chuyển gen hệ T1 với kháng thể cmyc M: thang protein chuẩn từ 10 đến 180 kDa; WT: protein thuốc đối chứng (không chuyển gen); T1-4, T17, T1-8, T1-10, T1-11: protein dòng thuốc chuyển gen dương tính với lai Southern L4 L5 L6 L7 vị trí kích thước khoảng gần 10 kDa dòng thuốc chuyển gen (T1-7, T1-8, T1-10, T1-11) hệ T1 Để đánh giá mức độ biểu protein tái tổ hơp sử dụng kỹ thuật ELISA, kết thể biểu đồ hình 3.16 Trên hình 3.16 dịng thuốc chuyển gen có hàm lượng protein rVrPDF1 dao động từ 3,57 Tam TH g/mg protein tổng số đến 8,57 g/mg protein tổng số dịng T1-10 có hàm DX22 a b c d Hình 3.7 Sơ đồ cầu nối disulfide cặp Cys vùng chức protein VrPDF1 Các cầu nối disulfide: a-Cys14 - Cys35; b-Cys20 - Cys41; c10 lượng protein VrPDF1 cao (8,57 g/mg protein tổng số) 15 tuần tiến hành thu để thực phản ứng PCR kiểm tra có mặt gen chuyển 3.2.3 Kết phân tích có mặt gen chuyển VrPDF1 dòng thuốc chuyển gen kỹ thuật PCR Southern blot Chọn 12 thuốc chuyển gen hệ T0 thuốc không chuyển gen (cây WT) để kiểm tra có mặt gen chuyển VrPDF1 chuyển gen kỹ thuật PCR Kết thể hình 3.13 (+) M WT 10 11 12 Cys24 - Cys43; d-Cys3 - Cys47 L1, L2, L3, L4, L5, L6, L7: Các vịng lặp cấu trúc khơng gian protein VrPDF1 Như vậy, có giả thuyết khác mức độ kháng mọt hai giống có liên quan đến hàm lượng defensin dự trữ hạt; giống đậu xanh có hàm lượng VrPDF1 hạt cao khả kháng mọt tốt ngược lại giống có hàm lượng VrPDF1 hạt thấp khả kháng mọt Chính vậy, ứng dụng kỹ thuật biểu gen để nâng cao hàm lượng defensin1 hạt biện pháp công nghệ nhằm tăng cường khả kháng mọt gây hại đậu xanh 3.2 THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN VrPDF1 VÀ PHÂN TÍCH HOẠT  0,25 kb Hình 3.13 Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân gen VrPDF1 từ dòng thuốc chuyển gen hệ T0 M: thang DNA kb; (+): đối chứng dương plasmid pBT-VrPDF1; WT: đối chứng không chuyển gen; 1-12: dòng thuốc chuyển gen VrPDF1 ký hiệu T0-1, T0-2, T0-3, T0-4, T0-5, T0-6, T0-7, T0-8, T0-9, T0-10, T0-11, T0-12 ĐỘNG CỦA VECTOR CHUYỂN GEN TRÊN CÂY THUỐC LÁ 3.2.1 Thiết kế vector biểu hạt thực vật mang gen VrPDF1 kỹ thuật Gateway Trình tự nucleotide gen VrPDF1 (cDNA) phân lập từ giống đậu xanh Tằm TH (kháng mọt tốt nhất) có kích thước 228 nucleotide, mã hóa 75 amino acid sử dụng để thiết kế vector chuyển gen thực vật, biểu hạt Kết thể hình 3.10 Để kiểm chứng gen chuyển VrPDF1 gắn vào hệ gen thuốc lá, kỹ thuật lai Southern sử dụng để xác định có mặt gen chuyển hệ gen thuốc chuyển gen Kết thể qua hình 3.14 M T0-1 T0-2 T0-4 T0-6 T0-7 T0-8 T0-10 T0-11 T0-12 A M Hình 3.14 Kết phân tích thuốc chuyển gen lai Southern dòng thuốc chuyển gen dương tính với PCR với đoạn dò VrPDF1 đánh dấu biotin M: thang DNA kb; T0-1, T0-2, T0-4, T0-6, T0-7, T0-8, T0-10, T0-11, T012: dòng thuốc chuyển gen hệ T0 1,0 kb   0,25 kb  B Southern blot thu dịng cho kết lai dương tính, dịng T0-4, T0-6, T0-7, T0-8, T0-10, T0-11, T0-12 Như vậy, khẳng định cấu trúc pPhaso-dest -VrPDF1 chuyển thành cơng Hình 3.10 Sơ đồ cấu trúc vector pDON201-SLHEP-VrPDF1 (A) kết điện di sản phẩm colony-PCR kiểm tra vector pDON201-SLHEP-VrPDF1 (B) M: 14 11 thang DNA kb; 1, 2, 3, 4, 5, 6: dòng khuẩn lạc kiểm tra colonyPCR Vector pBetaPhaso-dest chứa promoter Phaseolin điều khiển biểu protein tái tổ hợp hạt mang gen VrPDF1 tạo thành kỹ thuật Geteway Kết thể qua hình 3.11A Cấu trúc pBetaPhaso-destVrPDF1 nhân dịng E.coli DH5α mơi trường có chứa kanamycin chọn dòng phản ứng colony-PCR với cặp mồi đặc hiệu VrPDF1-F/VrPDF1-R, kết thể hình 3.11B dòng khuẩn lạc phản ứng colony-PCR cho thấy dòng (dòng số 1, 5, 6) cho sản phẩm PCR với kích thước gen chuyển VrPDF1 Các dịng sử dụng tách plasmid tái tổ hợp pBetaPhaso-dest-VrPDF1 Cấu trúc vector chuyển gen pBetaPhaso-dest-VrPDF1 biến nạp vào A tumefeciens CV58 kỹ thuật xung điện Vi khuẩn A tumefaciens nuôi cấy môi trường LB đặc bổ sung kháng sinh chọn lọc kanamycin, kiểm tra A tumefaciens tái tổ hợp colony -PCR, lưu giữ sử dụng chuyển gen 3.2.2 Tạo thuốc chuyển gen in vitro mang gen VrPDF1 Để đánh giá hoạt động cấu trúc mang gen chuyển VrPDF1 thiết kế làm sở tạo đậu xanh chuyển gen VrPDF1, cấu trúc pBetaPhaso-dest -VrPDF1 biến nạp vào thuốc mơ hình Kết giai đoạn biến nạp vào mô thuốc thể qua hình 3.12 B A C H G E D K Hình 3.12 Hình ảnh trình biến nạp cấu trúc pBetaPhaso-VrPDF1 vào mô thuốc giống K326 tái sinh thuốc chuyển gen Bảng 3.7 Kết biến nạp cấu trúc pPhaso-dest -VrPDF1 vào mô thuốc A M Đối chứng thí nghiệm 1,0 kb   0,25 kb 0,25 kb  ĐC0* ĐC1* Thí nghiệm lần Tổng số mảnh 30 30 130 Số mảnh sống sót sau tuần 30 114 Số mảnh cảm ứng tạo chồi 27 93 Số rễ môi trường chọn lọc 15 80 Số bầu Số sống sót nhà lưới 10 37 10 28 * B Ghi chú: ĐC0 mô thuốc không chuyển gen cấy mơi trường * Hình 3.11 A: Sơ đồ đoạn cấu trúc vector pPhaso-dest-VrPDF1(A); B: Kết điện di sản phẩm PCR kiểm tra vector chuyển gen pPhaso-dest-VrPDF1 M: thang DNA kb; 1, 2, 3, 4, 5, 6: dòng khuẩn lạc kiểm tra colony-PCR tái sinh có bổ sung kháng sinh; ĐC1 mơ thuốc không chuyển gen cấy môi trường tái sinh không bổ sung kháng sinh 12 13 Tổng số sống sót nhà lưới 28 với 10 đối chứng thu tiếp tục chăm só để phục vụ phân tích biểu gen Các dòng thuốc chuyển gen sau trồng nhà lưới khoảng 3-4