Nghiên cứu phơi nhiễm asen trước sinh và những biến đổi nhiễm sắc thể, đa hình một số gen trên trẻ sơ sinh ở hà nam

VIỆN HÀM LÂM KHOA HỌC CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CƠNG NGHỆ SINH HỌC TẠ THỊ BÌNH NGHIÊN CỨU PHƠI NHIỄM ASEN TRƢỚC SINH VÀ NHỮNG BIẾN ĐỔI NHIỄM SẮC THỂ, ĐA HÌNH MỘT SỐ GEN TRÊN TRẺ SƠ SINH Ở HÀ NAM Chuyên ngành: Hóa sinh học Mã số: 62 42 01 16 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Tai Lieu Chat Luong Hà Nội – 2017 Cơng trình hồn thành Viện Sức khỏe nghề nghiệp Môi trường, Bộ Y tế Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học-Công nghệ Việt Nam Viện Nghiên cứu Hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học-Công nghệ Việt Nam Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS TS Nguyễn Khắc Hải Viện Sức khỏe nghề nghiệp Mơi trường PGS TS Nguyễn Huy Hồng Viện Nghiên cứu Hệ gen, VAST Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án tiến sỹ phiên thức tại: Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Cơng nghệ Việt Nam, 18 Hồng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội Vào hồi … ngày … tháng … năm 20 Có thể tìm hiểu luận án tại:  Thư viện Quốc gia Việt Nam  Viện Công nghệ sinh học  Trang web Bộ GDĐT -1MỞ ĐẦU Ô nhiễm asen (As) nước giếng khoan, nguồn nước tự nhiên, gây vấn đề nghiêm trọng sức khỏe cộng đồng quy mơ tồn cầu, đặc biệt nước phát triển nơi mà thiếu nước mặt an toàn sử dụng cho ăn uống sinh hoạt Những năm gần đây, người ta ước tính rằng, giới có khoảng 150 triệu người có nguy phơi nhiễm với asen qua nước ngầm Ở khu vực này, hàm lượng asen vượt khuyến cáo WHO (10 µg/L) cho nước ăn uống sinh hoạt (Ravenscroft, 2009) Việt Nam nước nằm đồ ô nhiễm asen nước ngầm giới (Andrew, 2003) Asen cho hóa chất gây ung thư người Các tổn thương liên quan đến sử dụng nước ô nhiễm asen để ăn uống chủ yếu là: biến đổi sắc tố da, dày sừng, ung thư da, ung thư bàng quang, bệnh thần kinh, thai sản…Các tổn thương bệnh lý xuất sớm hay muộn phụ thuộc chủ yếu vào lượng asen vào thể hàng ngày Các bà mẹ có thai trẻ em xem nhóm người dễ bị tổn thương Khi bà mẹ phơi nhiễm asen vô cơ, dù với lượng nhỏ, chất hóa học nhanh chóng đưa đến bào thai qua đường thai làm tăng nguy xảy thai, sinh non tử vong sơ sinh gây giảm cân trẻ sơ sinh (Concha, 1998; Hopenhayn, 2003; Rahman, 2009) Gần đây, nghiên cứu dịch tễ học cho thấy có khác biệt lớn có tính chất cá thể nhiễm độc asen (Pierce, 2012) Điều cho thấy, yếu tố di truyền có vai trị tạo khác biệt đáp ứng nhiễm độc asen Một số nghiên cứu cho thấy vai trị đa hình di truyền đến nhiễm độc asen liên quan đến gen mã hóa enzyme chuyển hóa asen khử độc bao gồm enzyme AS3MT (asen (III) methyltransferase), GST (glutathione S-transferase) MTHFR (methylenetetrahydrofolate reductase) (Schlawicke, 2007; Chung, 2009; Valenzuela, 2009) Những kết rằng, đa hình di truyền gen AS3MT, GST có liên quan đến khả methyl hóa, chuyển hóa asen tạo khác biệt thành phần asen thể liên quan tình hình bệnh tật, qua dự báo khả phát sinh bệnh liên quan đến asen sau Những dấu hiệu sớm ảnh hưởng phơi nhiễm asen bào thai trẻ sơ sinh bao gồm thay đổi gen nhiễm sắc thể biến đổi DNA, gây lệch bội, hình thành vi nhân, tổn thương nhiễm sắc thể, đột biến đoạn, trao đổi nhiễm sắc tử chị em gây liên kết chéo DNA-protein Những thay đổi vật chất di truyền này, nặng gây suy thai, dị tật… nhẹ ảnh hưởng tới phát triển thể chất tâm thần trình lớn lên trẻ Do vậy, phơi nhiễm asen bà mẹ, trẻ em đặc biệt trẻ sơ sinh yếu tố gây suy thoái hệ sau -2Cho đến nghiên cứu tình trạng sức khỏe người dân sử dụng nguồn nước ngầm ô nhiễm asen Việt Nam chủ yếu khảo sát tình trạng nhiễm asen biểu triệu chứng nhiễm độc asen Gần đây, Agusa cộng năm 2009, 2010 có nghiên cứu đánh giá đa hình gen AS3MT GST cộng đồng người Việt Nam sinh sống đồng sông Hồng Đây nghiên cứu kết hợp yếu tố di truyền với trình trao đổi chất asen người Việt Nam Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu đánh giá khả phơi nhiễm asen trước sinh tác hại việc phơi nhiễm asen lên vật chất di truyền trẻ sơ sinh mối liên quan yếu tố di truyền trẻ sơ sinh với phơi nhiễm asen trước sinh Chính vậy, việc tiến hành đề tài “Nghiên cứu phơi nhiễm asen trước sinh biến đổi nhiễm sắc thể, đa hình số gen trẻ sơ sinh Hà Nam” nhằm đánh giá thực trạng phơi nhiễm asen trước sinh mối liên quan đa hình gen, số biến đổi nhiễm sắc thể cần thiết Mục tiêu đề tài: Đánh giá thực trạng phơi nhiễm asen phụ nữ mang thai trẻ sơ sinh tỉnh Hà Nam Xác định đa hình gen AS3MT, GSTO1, biển đổi gen CXCL1, tổn thương nhiễm sắc thể trẻ sơ sinh mối liên quan với số phơi nhiễm asen trước sinh Đóng góp đề tài: Đây nghiên cứu đánh giá phơi nhiễm asen từ nguồn nước ăn uống sinh hoạt phụ nữ trình mang thai khả phơi nhiễm asen trước sinh trẻ sơ sinh Việt Nam Lần Việt Nam nghiên cứu xác định đa hình gen trẻ sơ sinh liên quan đến chuyển hóa asen vơ cơ, số biến đổi nhiễm sắc thể tế bào máu cuống rốn trẻ sơ sinh bị phơi nhiễm asen trước sinh mối liên quan với số phơi nhiễm asen Các số liệu, kết nghiên cứu đề tài sở khoa học cho nghiên cứu lĩnh vực sử dụng làm tài liệu tham khảo cho công tác đào tạo, giảng dạy Cấu trúc luận án Luận án gồm 142 trang chia thành phần: Mở đầu trang; Chương 1: Tổng quan tài liệu 35 trang; Chương 2: Vật liệu phương pháp 15 trang; Chương 3: Kết 34 trang; Chương 4: Thảo luận 25 trang; Kết luận kiến nghị: trang; Các cơng trình cơng bố tác giả trang; Tài liệu tham khảo 22 trang; Tóm tắt luận án tiếng anh trang; Phụ lục 25 trang Luận án có 30 bảng số liệu, 22 hình 181 tài liệu tham khảo tiếng Việt tiếng Anh -3NỘI DUNG LUẬN ÁN CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Ô nhiễm asen nguồn nƣớc Việt Nam Ô nhiễm asen nước ngầm mối quan tâm lớn nhiều nước giới Hàng triệu người bị phơi nhiễm với asen thông qua nguồn nước bị ô nhiễm asen Việt Nam nước nằm vùng có nhiễm asen nguồn nước ngầm đồ giới Cho đến có nhiều nghiên cứu đánh giá mức độ ô nhiễm asen nguồn nước ngầm Việt Nam, đặc biệt vùng đồng sông Hồng Trầm trọng tỉnh: Hà Nam, Nam Định, Hà Tây (cũ), An Giang, Đồng Tháp Ở Hà Nam có tới 110/111 xã có 10% giếng có nồng độ asen vượt tiêu chuẩn cho phép (TCCP), 77 xã có 10% giếng có nồng độ As >50g/L, đặc biệt có 50 xã có 10% giếng có nồng độ As >100g/L, điển hình xã huyện Bình Lục, Lý Nhân, Duy Tiên (UNICEF, 2004) 1.2 Chuyển hóa asen thể Các dạng asen vơ hịa tan nước được hấp thụ qua đường tiêu hóa phân phối đến mơ Asen vơ vào máu vài sau hấp thụ qua nước uống đưa đến trước hết gan, thận, tụy, phổi, ruột da Vì cấu trúc tương tự glycerol, AsIII di chuyển vào tế bào thông qua cầu nối glycerol vận chuyển hợp chất hữu nhỏ glycerol ure AsV tồn giống gốc phosphate mang oxy âm H2AsO2- HAsO2- pH -7 hồn tồn vào tế bào thông qua vận chuyển phosphat Tại gan asen vơ (iAs) chuyển hóa thành monomethylated arsenic (MMA) tiếp tục thành dimethylated arsenic (DMA) thông qua q trình methyl hóa khử liên tục đào thải nước tiểu dạng methyl asen hóa trị 5, phần tích lũy mơ giàu keratin tóc, móng (Maki-Paakkanen, 1998) Asen đào thải chủ yếu qua nước tiểu với thời gian bán hủy khoảng ngày người (WHO, 2000; NRC, 2001) Sự phức tạp chuyển hóa asen hạn chế hiểu biết cách khoa học độc tính asen Ở người, asen xác định mẫu sinh học, đặc biệt nước tiểu dạng AsIII, AsV, MMAV, DMAV, dạng monomethylated arsonous (MMAIII) tìm thấy nước tiểu Cơ chế gây độc asen phức tạp liên quan đến chất chuyển hóa tất chất có khả gây độc (AsIII, AsV, MMAV, MMAIII, DMAV) -41.3 Ảnh hƣởng ô nhiễm As nguồn nƣớc lên sức khỏe tổn thƣơng vật chất di truyền ngƣời bị phơi nhiễm 1.3.1 Tác động asen vật chất di truyền Nhiều quan sát thực nghiệm cho độc tính gây đột biến asen chủ yếu liên quan đến tạo gốc tự (Reactive Oxygen Species-ROS) q trình chuyển hóa sinh học Sản phẩm ROS có khả làm đứt gãy DNA, liên kết chéo tổn thương nhiễm sắc thể Cơ chế tổn thường di truyền asen thông qua chế oxy hóa (Hình 1.1) Ức chế q trình sửa chữa DNA coi chế gây độc gen asen Hình 1.1 Sơ đồ tác động gây độc với vật chất di truyền asen 1.3.2 Nghiên cứu biến đổi NST liên quan đến phơi nhiễm asen Asen, chất gây ung thư, coi hóa chất nguy hiểm giới Phơi nhiễm lâu dài (như 5-10 năm) với asen từ nước uống thức ăn dẫn đến nhiễm độc asen, bệnh liên quan bao gồm rối loạn sắc tố da, ung thư da, ung thư bàng quang, thận phổi, bệnh mạch máu chân bàn chân, mắc bệnh tiểu đường, tăng huyết áp, ảnh hưởng đến sinh sản (WHO, 2001; Santra, 2013) Trong nửa kỷ qua, người ta nhận thấy phơi nhiễm asen tác động đến sức khỏe người phức tạp nhiều so với dự đoán ban đầu Nhiều nghiên cứu chứng tổn thương di truyền tế bào người phơi nhiễm với asen Đánh giá tổn thương DNA tế bào lympho máu ngoại vi cá thể nhạy cảm với độc tính asen tiến hành sử dụng kỹ thuật phân tích tổn thương nhiễm sắc thể Karen Harrington cs (1999) nghiên cứu ảnh hưởng phơi nhiễm asen lên nhiễm sắc thể tế bào bạch cầu máu ngoại vi người làm việc Antofagasta, Chile Kết cho thấy người làm việc lâu năm bị phơi nhiễm asen cao có tần số biến đổi nhiễm sắc thể lớn có ý nghĩa so với người làm việc bị phơi nhiễm asen thấp (p10µg/L, hàm lượng asen niệu >60 µg/L): 100 bà mẹ trẻ sơ sinh họ Thời gian nghiên cứu: tháng 12/2012- 6/2014 Cỡ mẫu nghiên cứu: theo cơng thức tính cỡ mẫu nghiên cứu cắt ngang ⁄ -7Các số nghiên cứu - Nồng độ asen nước dùng sinh hoạt, ăn uống gia đình bà mẹ (nước giếng khoan sau lọc bể cát sỏi) - Hàm lượng asen toàn phần nước tiểu mẹ - Hàm lượng asen thành phần nước tiểu mẹ (AsV, AsIII , MMA, DMA, AB) - Hàm lượng asen tồn phần tóc mẹ - Hàm lượng asen toàn phần máu cuống rốn (máu con) - Hàm lượng asen tồn phần tóc - Hàm lượng creatinine niệu - Mối liên quan phơi nhiễm asen mẹ ô nhiễm asen nguồn nước sử dụng - Mối liên quan phơi nhiễm asen trẻ sơ sinh với phơi nhiễm asen mẹ - Biến đổi NST mối liên quan với phơi nhiễm asen - Đa hình gen AS3MT, GSTO1, đột biến gen CXCL1 mối liên quan đến phơi nhiễm asen 2.3 Các phƣơng pháp sử dụng nghiên cứu Hóa chất - Các loại axit HNO3, H2SO4, HClO4, HCl đặc, H2O2, NaOH, NaBH4, KI, Amonioxxalat, axit ascorbic, dung dịch chuẩn As (Merck) dùng cho phân tích - Các hóa chất thông dụng dùng sinh học phân tử thuộc hãng Sigma, Merck, Fermentas, New England Biolabs Các kỹ thuật sử dụng nghiên cứu Kỹ thuật lấy mẫu bảo quản mẫu Mẫu nước: Các mẫu nước giếng sau lọc chứa chai nhựa 500 ml để phân tích asen Các mẫu nước bảo quản 4-8oC phân tích Mẫu tóc: Cắt 0,5 -1g từ chân tóc bà mẹ mang thai Tóc trẻ sơ sinh lấy sinh sau sinh 1- tháng Bảo quản túi có khóa kéo nhiệt độ phịng phân tích Mẫu nước tiểu: ml nước tiểu lấy vào có chứa sẵn 8µmol DDDC để xác định chất chuyển hóa nước tiểu 30ml nước tiểu để phân tích hàm lượng asen tổng số Bảo quản lạnh vận chuyển lưu mẫu tủ -20oC Mẫu máu cuống rốn: Lấy mẫu máu cuống rốn sau chuyển trẻ sinh trước sổ vòng – phút Kỹ thuật phân tích - Kỹ thuật phân tích asen tổng số nước, asen tổng số nước tiểu, asen tóc (mẹ, con) Quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) -8- Kỹ thuật phân tích asen thành phần nước tiểu hệ thống Khối phổ plasma cảm ứng kết nối sắc ký lỏng hiệu cao (ICP/MS-HPLC) - Kỹ thuật phân tích asen máu cuống rốn hệ thống Khối phổ plasma cảm ứng (ICP-MS) - Kỹ thuật phân tích nhiễm sắc thể phương pháp nhuộm giemsa tế bào máu - Kỹ thuật xác định đa hình gen Đa hình độ dài đoạn giới hạn (PCR-RFLP) - Kỹ thuật phân tích giải trình tự gen 2.4 Phƣơng pháp xử lý phân tích số liệu - Nhập số liệu phần mềm EpiData - Xử lý, phân tích số liệu phần mềm SPSS - Các giá trị thống kê: Trung bình, độ lệch chuẩn, trung vị, tỷ lệ phần trăm - Các kiểm định thống kê: Test bình phương, t- test, One way ANOVA, so sánh nhiều giá trị trung bình, phân tích hồi quy đơn biến - Kết đọc trình tự phân tích so sánh với trình tự gen ngân hàng gen (ENSEMBL: ENSG00000160882) phần mềm BioEdit4.7 2.5 Vấn đề đạo đức nghiên cứu - Tất đối tượng giải thích rõ mục đích, ý nghĩa nghiên cứu - Tất đối tượng nghiên cứu có cam kết tình nguyện tham gia nghiên cứu, đồng ý để họ tham gia nghiên cứu họ rút lui khỏi nghiên cứu lúc họ muốn - Nghiên cứu chấp thuận lãnh đạo địa phương, trung tâm y tế dự phòng tỉnh, huyện, trạm y tế xã chọn vào nghiên cứu - Thông tin thu đối tượng nghiên cứu giữ bí mật sử dụng cho mục đích nghiên cứu - 11 kê với p0,05 As máu (µg/L) 78 7,06 2,55 22 5,92 2,37 >0,05 > 50,0 µg/L P n: số đối tượng; M: trung bình; SD: độ lệch chuẩn Kết cho thấy hàm lượng asen trung bình tóc máu cuống rốn hai nhóm phơi nhiễm khơng có khác biệt Bảng 3.6 Hàm lƣợng asen máu cuống rốn tóc trẻ sơ sinh phân bố theo mức độ phơi nhiễm asen nƣớc tiểu mẹ Chỉ số Nhóm nước tiểu Nhóm chứng As tóc (μg/g) 50 SD Độ tin cậy 95% a 0,34 0,20 - 0,39 b 0,49 0,40 - 0,68 M 0,30 Nhóm NC1 50 0,54 Nhóm NC2 50 0,48 0,37 0,38 - 0,59 Tổng 150 0,44 0,42 0,37-0,51 a 1,88 3,08 - 4,15 b P