Nghiên cứu xử lý kháng khuẩn, kháng nấm cho da lợn thuộc sử dụng nano bạc tổng hợp bằng dịch chiết từ thực vật

Nghiên cứu xử lý kháng khuẩn, kháng nấm cho da lợn thuộc sử dụng nano bạc tổng hợp bằng dịch chiết từ thực vật.Nghiên cứu xử lý kháng khuẩn, kháng nấm cho da lợn thuộc sử dụng nano bạc tổng hợp bằng dịch chiết từ thực vật.Nghiên cứu xử lý kháng khuẩn, kháng nấm cho da lợn thuộc sử dụng nano bạc tổng hợp bằng dịch chiết từ thực vật.Nghiên cứu xử lý kháng khuẩn, kháng nấm cho da lợn thuộc sử dụng nano bạc tổng hợp bằng dịch chiết từ thực vật.Nghiên cứu xử lý kháng khuẩn, kháng nấm cho da lợn thuộc sử dụng nano bạc tổng hợp bằng dịch chiết từ thực vật.Nghiên cứu xử lý kháng khuẩn, kháng nấm cho da lợn thuộc sử dụng nano bạc tổng hợp bằng dịch chiết từ thực vật.Nghiên cứu xử lý kháng khuẩn, kháng nấm cho da lợn thuộc sử dụng nano bạc tổng hợp bằng dịch chiết từ thực vật.Nghiên cứu xử lý kháng khuẩn, kháng nấm cho da lợn thuộc sử dụng nano bạc tổng hợp bằng dịch chiết từ thực vật.Nghiên cứu xử lý kháng khuẩn, kháng nấm cho da lợn thuộc sử dụng nano bạc tổng hợp bằng dịch chiết từ thực vật.Nghiên cứu xử lý kháng khuẩn, kháng nấm cho da lợn thuộc sử dụng nano bạc tổng hợp bằng dịch chiết từ thực vật.Nghiên cứu xử lý kháng khuẩn, kháng nấm cho da lợn thuộc sử dụng nano bạc tổng hợp bằng dịch chiết từ thực vật.Nghiên cứu xử lý kháng khuẩn, kháng nấm cho da lợn thuộc sử dụng nano bạc tổng hợp bằng dịch chiết từ thực vật.Nghiên cứu xử lý kháng khuẩn, kháng nấm cho da lợn thuộc sử dụng nano bạc tổng hợp bằng dịch chiết từ thực vật.Nghiên cứu xử lý kháng khuẩn, kháng nấm cho da lợn thuộc sử dụng nano bạc tổng hợp bằng dịch chiết từ thực vật.Nghiên cứu xử lý kháng khuẩn, kháng nấm cho da lợn thuộc sử dụng nano bạc tổng hợp bằng dịch chiết từ thực vật.Nghiên cứu xử lý kháng khuẩn, kháng nấm cho da lợn thuộc sử dụng nano bạc tổng hợp bằng dịch chiết từ thực vật.Nghiên cứu xử lý kháng khuẩn, kháng nấm cho da lợn thuộc sử dụng nano bạc tổng hợp bằng dịch chiết từ thực vật.Nghiên cứu xử lý kháng khuẩn, kháng nấm cho da lợn thuộc sử dụng nano bạc tổng hợp bằng dịch chiết từ thực vật.Nghiên cứu xử lý kháng khuẩn, kháng nấm cho da lợn thuộc sử dụng nano bạc tổng hợp bằng dịch chiết từ thực vật.Nghiên cứu xử lý kháng khuẩn, kháng nấm cho da lợn thuộc sử dụng nano bạc tổng hợp bằng dịch chiết từ thực vật.Nghiên cứu xử lý kháng khuẩn, kháng nấm cho da lợn thuộc sử dụng nano bạc tổng hợp bằng dịch chiết từ thực vật.Nghiên cứu xử lý kháng khuẩn, kháng nấm cho da lợn thuộc sử dụng nano bạc tổng hợp bằng dịch chiết từ thực vật.Nghiên cứu xử lý kháng khuẩn, kháng nấm cho da lợn thuộc sử dụng nano bạc tổng hợp bằng dịch chiết từ thực vật.Nghiên cứu xử lý kháng khuẩn, kháng nấm cho da lợn thuộc sử dụng nano bạc tổng hợp bằng dịch chiết từ thực vật.Nghiên cứu xử lý kháng khuẩn, kháng nấm cho da lợn thuộc sử dụng nano bạc tổng hợp bằng dịch chiết từ thực vật.

NGHIÊN CỨU TỔNG QUAN

Tổng quan về da thuộc và xử lý kháng khuẩn, kháng nấm vật liệu da

1.1.1 Tổng quan về da thuộc

1.1.1.1 Cấu trúc da nguyên liệu

Nguyên liệu để sản xuất da thuộc là các bộ da của động vật, trong đó da bê, da bò chiếm khoảng 70%, da cừu 13%, da dê 11%, da lợn 7%, da các loài động vật khác chiếm khoảng 1% [1] Động vật càng non, độ dày của da càng mỏng và diện tích càng nhỏ, mặt da phẳng, mịn và có ít khuyết tật hơn so với da động vật già Da của động vật cái có bề mặt mịn hơn (fine grain) so với da động vật đực, ở vùng bụng, nách và cổ có cấu trúc xơ lỏng hơn, do vậy da thành phẩm được làm từ da của động vật cái sẽ có độ bai giãn và độ mềm xốp cao hơn [5].

Bộ da động vật nói chung được cấu tạo từ các lớp như: Lớp biểu bì, lớp bì và lớp thịt dưới da (hình 1.1) và lớp lông phủ, các tuyến mồ hôi và tuyến mỡ Trong da phân bố các dây thần kinh và các đầu dây thần kinh, có các mạch máu và có thể có các cơ [2].

Hình 1.1 Mặt cắt da nguyên liệu [5].

Trong sản xuất da thuộc người ta chỉ sử dụng lớp bì, còn trong sản xuất da lông thì sử dụng cả lớp biểu bì và lớp lông [5].

Lớp biểu bì: Biểu bì là lớp bề mặt phân bố trực tiếp dưới lớp lông phủ và cấu tạo từ một số dãy tế bào biểu mô (tế bào sừng) Tuỳ thuộc vào mức độ phát triển của biểu bì, mà khi quan sát bằng kính hiển vi có thể thấy từ hai đến sáu lớp Biểu bì không có ranh giới rõ ràng với lớp bì Ở một số chỗ, đặc biệt là gần chân lông, biểu bì đi sâu vào lớp bì và đến lượt mình lớp bì lại ăn sâu vào biểu bì bởi các lớp nhú [3, 5].

Hình 1.2 Cấu tạo lớp biểu bì 1 lớp mầm bì;

2 lớp sừng; 3 đầu dây thần kinh [5].

Hình 1.3 Các thành phần của bì phu 1) sợi collagen; 2) sợi đàn hồi 3) tế bào kết nối [5].

Lớp bì: Là lớp chính của con da nằm ngay dưới lớp biểu bì Độ dày của lớp này chiếm khoảng 85 – 88% độ dày của da Lớp này rất dai và chắc Nó được tạo thành bởi sự đan xen phức tạp của các sợi collagen, và các protit không có cấu trúc xơ (chúng được bỏ đi khỏi lớp bì trong các công đoạn chuẩn bị thuộc) Lớp bì của hầu hết các loại da đều có cấu tạo chung và được phân chia khá rõ ràng thành hai lớp: Lớp nhú (papillary layer) và lớp lưới (reticular layer) [5, 10].

Lớp nhú: Là lớp tiếp giáp với biểu bì, bề mặt của lớp này được tạo bởi các bó xơ mịn và được kết chặt với nhau, tạo nên bề mặt da nhẵn phẳng và được gọi là lớp cật (grain) Trong lớp này có chứa lượng lớn các túi chân lông, các tuyến mồ hôi, tuyến mỡ, các chùm sợi collagen mảnh [1, 5].

Lớp lưới: Được cấu tạo từ số lượng lớn các chùm sợi collagen đan bện với nhau và là lớp chặt chẽ và bền chắc nhất xác định độ bền của toàn bộ da và da lông thành phẩm Độ dày của lớp lưới tăng đáng kể theo độ tuổi của động vật.

Tỷ lệ độ dày các lớp của lớp bì dao động tuỳ thuộc vào loại động vật, các phần giải phẫu trên cơ thể động vật (vùng da), điều kiện nuôi dưỡng và thời gian giết mổ Da nguyên liệu từ các động vật khác nhau được đặc trưng bởi sự đan bện các chùm sợi collagen, có nghĩa là góc nghiêng và mật độ đan xen của chúng, đặc trưng này cũng thay đổi ở các vùng khác nhau của con da.

Lớp mỡ (bạc nhạc) dưới da: Lớp mỡ dưới da phân bố trực tiếp dưới lớp bì và cấu tạo từ các sợi collagen dày xốp phân bố nằm ngang và các sợi đàn hồi, giữa chúng có nhiều mạch máu [5].

1.1.1.2 Cấu tạo hóa học và tính chất của collagen

 Thành phần hóa học của da nguyên liệu [1, 2, 3, 4, 5, 10]: Da gồm có 4 thành phần chính là: Nước, các chất khoáng, các chất béo và protein.

Nước: Hàm lượng nước trong da khá lớn và phụ thuộc vào hàm lượng chất béo, tuổi, loài động vật và nhiều yếu tố khác Khi hàm lượng chất béo trong da cao thì hàm lượng nước giảm Da động vật ít tuổi chứa nhiều nước hơn da động vật nhiều tuổi Trong da bò lượng nước chiếm khoảng 60% Trong da, nước tập trung chủ yếu ở lớp bì Lớp biểu bì và bạc nhạc chứa ít hơn Nước trong da chia thành 2 loại:

- Nước tự do: Nằm giữa các khoảng trống của các sợi collagen Nước tự do chiếm 60% toàn bộ lượng nước có trong da Phần nước này dễ dàng bị tách ra trong quá trình bảo quản và ép nước.

- Nước tham gia liên kết: Chiếm 40% toàn bộ lượng nước chứa trong da Chúng liên kết chặt chẽ với sợi collagen tạo thành một hệ keo nên người ta còn gọi là “nước keo” Ngoài ra nước còn liên kết bằng nhiều mối liên kết khác rất bền vững, muốn tách ra phải dùng phương pháp hóa học và sấy khô.

Các khoáng chất: Các chất khoáng chiếm một lượng nhỏ, khoảng 0,5% khối lượng da Chúng tồn tại dạng các muối vô cơ của các kim loại khác nhau như: Mn, Cu, Fe, Al, Si, Mg… Các khoáng chất này hầu như không ảnh hưởng gì đến quá trình thuộc da.

Các chất béo: Các chất béo trong da bao gồm các este, sáp, rượu bậc cao (10 - 35 chức) Hàm lượng chất béo có trong da liên quan chặt chẽ đến hàm lượng nước, phụ thuộc vào chế độ chăn nuôi, khí hậu… Các chất béo là những chất quan trọng trong da động vật Thông thường các chất béo chứa trong lớp bì và lớp bạc nhạc. Protein: Bằng kính hiển vi điện tử, người ta đã quan sát thấy protein của da gồm 2 phần: Phần có cấu trúc xơ và phần không có cấu trúc xơ.

- Phần protein có cấu trúc xơ: Là thành phần cơ bản của da, trong đó gồm có collagen, reticular và elastin.

- Phần protein không có cấu trúc xơ gồm albumin tan tốt trong nước và globumin không tan trong nước và tan trong kiềm Phần protein này nằm giữa khoảng trống của collagen.

Hàm lượng của protit trong da tươi là 30 - 32%, hàm lượng collagen trong da sau khi sấy khô là 80%. Khi tăng nhiệt độ, xơ collagen co lại Nếu bị đun nóng, xơ collagen trương nở rồi tan vào trong nước tạo hệ gelatin.

 Cấu tạo hóa học của collagen:

Tổng quan về nano bạc

Nano bạc (AgNPs) là những hạt bạc có kích thước nanomet (1nm = 10 -9 ), khoảng từ 1 - 100 nm, gần với kích thước của phân tử bạc Các hạt nano bạc có diện tích mặt rất lớn và có nhiều hình dạng khác nhau như hình cầu, lục giác, hình bát giác và dạng tấm mỏng gần với kích thước của phân tử bạc, có hiệu ứng bề mặt vô cùng lớn [42], và là một loại vật liệu nano có diện tích bề mặt riêng lớn với những đặc tính độc đáo như [42]:

- Tính khử khuẩn, chống nấm, khử mùi nhanh chóng, có khả năng phát xạ tia hồng ngoại đi xa, chống tĩnh điện.

- Không độc, không kích ứng, không dị ứng và không gây hại cho sức khỏe của con người với liều lượng tương đối cao.

- Có khả năng phân tán ổn định trong các loại dung môi khác nhau (trong cả các dung môi phân cực và không phân cực).

- Có độ bền hóa học cao, không bị biến đổi dưới tác dụng của ánh sáng và các tác nhân oxy hóa khử thông thường Ngoài ra, nano bạc còn có độ ổn định nhiệt độ cao [42].

Chính vì những đặc tính độc đáo trên mà nano bạc được ứng dụng rộng rãi trong các sản phẩm chăm sóc sức khỏe, tiêu dùng, y tế, điện tử, gia dụng, da giầy, dệt may…

Bạc có cấu trúc tinh thể lập phương tâm mặt (hình 1.20) với các thông số ô mạng cơ sở a = b = c = 4,08 Å 8 nguyên tử được bố trí tại 8 đỉnh của hình lập phương tương ứng với các tọa độ (000), (100), (110), (010),

(001), (101), (111), (011) 6 nguyên tử bố trí ở tâm của 6 mặt của ô cơ sở tương ứng có tọa độ nguyên tử bố trí ở tâm của 6 mặt của ô cơ sở tương ứng có tọa độ (1/2 0 1/2), (1 1/2 1/2), (1/2 1 1/2), (0 1/2 1/2), (1/2 1/2 0), (1/2 1/2 1) [43].

Hình 1.21 Cấu trúc tinh thể của bạc [43].

Hạt bạc được sắp xếp theo nhiều kiểu khác nhau và có nhiều hình dạng khác nhau tùy theo điều kiện chế tạo của hạt bạc như: hình cầu, hình lập phương, hình tứ diện, hình tám mặt, hình tam giác, hình đĩa (hình 1.21). Đường kính nguyên tử bạc là 0,288 nm [43,144].

Hình 1.21 Hình dạng, kích thước và đường cong phổ UV-Vis của hạt nano bạc [144].

Bạc là một nguyên tố có hoạt tính kháng khuẩn tự nhiên mạnh nhất được tìm thấy trên trái đất Ở dạng nano hoạt tính này còn tăng lên nhiều lần, vì vậy khi công nghệ nano được phát triển các nhà khoa học đã sớm tìm đến hướng nghiên cứu chế tạo nano bạc phục vụ cho mục đích khử trùng [36].

Gần đây, các nhà khoa học có quan tâm đến độc tính phát sinh từ sự tích tụ sinh học của bạc trong cơ thể người như trong gan và lá lách, và có thể gây rối loạn hoạt động của các cơ quan này [36].

H ệ số q ua ng H ệ số q ua ng H ệ số q ua ng H ệ số q ua ng H ệ số q ua ng H ệ số q ua ng

Các hạt nano bạc có tính quang học bắt nguồn từ hiện tượng cộng hưởng plasmon bề mặt (SPR: surface plasmon resonance) do điện tử tự do trong AgNPs hấp thụ ánh sáng [44] Khi kích thước hạt nano bạc tăng thì cường độ hấp thụ cực đại tăng và dịch chuyển về phía bước sóng dài với đỉnh hấp thụ cực đại của phổ UV-Vis của dung dịch nano bạc dao động trong khoảng bước sóng từ 400 – 700 nm [44] Kích thước của hạt nano bạc phụ thuộc vào các yếu tố trong quá trình chế tạo và tổng hợp nano bạc Với cùng một điều kiện phản ứng như thời gian, nhiệt độ hoặc nồng độ chất tham gia phản ứng, nhưng phương pháp tổng hợp khác nhau thì kích thước hạt nano bạc thu được cũng khác nhau nên đỉnh hấp thụ cực đại của phổ UV-Vis của dung dịch nano bạc tạo ra cũng khác nhau (hình 1.22) [44] và ngược lại Các hạt nano bạc có hiện tượng cộng hưởng plasmon bề mặt tạo nên màu sắc từ vàng nhạt đến nâu đỏ cho các dung dịch có chứa nano bạc Màu sắc này phụ thuộc vào nồng độ và kích thước hạt nano [44].

Hình 1.22 Phổ UV-Vis và màu sắc của AgNPs có đường kính từ 5 - 100 nm [44].

Nhiệt độ nóng chảy của vật liệu phụ thuộc vào mức độ liên kết giữa các nguyên tử trong mạng tinh thể. Trong tinh thể, mỗi một nguyên tử có một số các nguyên tử lân cận có liên kết mạnh gọi là số phối vị Các nguyên tử trên bề mặt có số phối vị nhỏ hơn số phối vị của các nguyên tử bên trong vật liệu nên chúng dễ dàng tái sắp xếp để ở trạng thái khác hơn [7].

Do đó, khi kích thước hạt nano giảm đi, thì nhiệt độ nóng chảy cũng sẽ giảm Khi bạc ở dạng khối thì nhiệt độ nóng chảy của nó là 961,78°C nhưng khi chúng ở kích thước nano thì nhiệt độ nóng chảy của nó chỉ dao động khoảng 200°C tùy thuộc vào kích thước hạt [7].

Bạc là một nguyên tố có tính kháng khuẩn tự nhiên, có phổ rộng tiêu diệt các loài vi sinh vật gây bệnh, đồng thời là một chất thân thiện với môi trường, không gây hiệu ứng độc hại đối với cơ thể con người và động vật khi được sử dụng với liều lượng vừa đủ [43] Hiện nay một số quan điểm giải thích cơ chế diệt khuẩn của bạc được nhiều người ủng hộ, chủ yếu dựa trên [36]: Sự tương tác tĩnh điện giữa ion bạc mang điện tích dương và bề mặt tế bào vi khuẩn mang điện tích âm [45]; Sự vô hiệu hóa nhóm ion trong men vận chuyển ôxy; Sự tương tác của ion bạc với DNA dẫn đến sự điện hóa pyridin và cản trở quá trình sao chép DNA của tế bào vi khuẩn [46].

Các nhà khoa học thuộc hãng Inovation, Hàn Quốc [6] cho rằng bạc tác dụng lên màng bảo vệ của tế bào vi khuẩn Màng này là một cấu trúc gồm các glycoprotein được liên kết với nhau bằng cầu nối axit amin để tạo độ cứng cho màng Các ion bạc tương tác với các nhóm peptidoglican và ức chế khả năng vận chuyển oxy của chúng vào bên trong tế bào, dẫn đến vi khuẩn bị tê liệt Nếu các ion bạc được lấy ra khỏi tế bào ngay sau đó, khả năng hoạt động của vi khuẩn có thể lại được phục hồi Các tế bào động vật cấp cao có lớp màng bảo vệ hoàn toàn khác so với tế bào vi sinh vật Chúng có hai lớp lipoprotein giàu liên kết đôi có khả năng cho điện tử do đó không cho phép các ion bạc xâm nhập, vì vậy chúng không bị tổn thương khi tiếp xúc với các ion này.

Cơ chế tác động của các ion bạc lên vi khuẩn được các nhà khoa học Trung Quốc làm việc trong hãng ANSON mô tả như sau: khi ion Ag + tác dụng với lớp màng của tế bào vi khuẩn gây bệnh nó sẽ phản ứng với nhóm sunphohydril –SH của phân tử men chuyển hóa oxy và vô hiệu hóa men này dẫn đến ức chế quá trình hô hấp của tế bào vi khuẩn [6].

Ngoài ra, các ion bạc còn có khả năng ức chế quá trình phát triển của vi khuẩn bằng cách sản sinh ra oxy nguyên tử siêu hoạt tính trên bề mặt của hạt bạc [36]:

Các phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm của nano bạc

Để đánh giá khả năng kháng khuẩn của hợp chất chiết xuất, nano bạc có thể sử dụng nhiều phương pháp, trong đó các phương pháp khuếch tán đĩa thạch và phương pháp pha loãng canh trường hoặc nuôi cấy trên đĩa thạch được sử dụng nhiều nhất.

1.3.1 Phương pháp bán định lượng

1.3.1.1 Phương pháp khuếch tán đĩa thạch Đây là phương pháp được sử dụng để kiểm tra độ nhạy của chất kháng khuẩn Theo hướng dẫn của

Viện Tiêu chuẩn lâm sàng và xét nghiệm Hoa Kỳ (CLSI: Clinical and Laboratory Standards Institute) [119], phương pháp này được thực hiện như sau: các đĩa thạch được cấy với các chủng vi khuẩn thử nghiệm theo tiêu chuẩn Sau đó, mẫu giấy lọc có đường kính khoảng 6 mm chứa hợp chất thử nghiệm ở nồng độ yêu cầu được đặt trên bề mặt đĩa thạch Các đĩa petri được nuôi trong các điều kiện thích hợp, chất kháng khuẩn khuếch tán vào thạch và ức chế sự sinh sản và phát triển của vi sinh vật thử nghiệm Đánh giá kết quả bằng cách đo đường kính vùng kháng khuẩn trên đĩa thạch Theo hướng dẫn của CLSI, môi trường nuôi cấy, nhiệt độ, thời gian nuôi và mật độ vi khuẩn theo phương pháp khuếch tán đĩa thạch được thể hiện trong bảng 1.5 Phương pháp này đơn giản, chi phí thấp, khả năng kiểm tra số lượng vi sinh vật và chất kháng khuẩn rất lớn, kết quả trực quan.

Bảng 1.5 Điều kiện thử nghiệm kháng khuẩn theo CLSI [119].

Phương pháp Vi sinh vật Môi trường Mật độ vi khuẩn

(CFU/ml) Nhiệt độ nuôi ( )℃) Thời gian nuôi (giờ)

Khuếch tán đĩa thạch Vi khuẩn Mueller

Phương pháp này không định lượng được lượng chất kháng khuẩn khuếch tán vào môi trường thạch, không phân biệt tác nhân diệt khuẩn hay kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn, không thích hợp để xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) Do vậy, phương pháp này được sử dụng phổ biến để đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các chất chiết xuất từ thực vật, tinh dầu và các tác nhân khác [119].

Trong nghiên cứu [93], đã đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của AC@AgNP tổng hợp bằng dịch chiết từ rễ cây thủy xương bồ Tác giả sử dụng bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch với ba chủng vi khuẩn

Bacillus subtilis, Bacillus cereus và Staphylococcus aureus Các mẫu giấy lọc Whatman vô trùng có đường kớnh 5 mm được xử lý 20 àg/ml nano bạc và đặt lờn trờn cỏc đĩa thạch dinh dưỡng đó được nuụi cấy vi khuẩn.

Sau đó các đĩa thạch được ủ ở 37 ºC trong 24 giờ và đo vùng ức chế Trong thí nghiệm này chất đối chứng dương được sử dụng là kháng sinh streptomycin tiêu chuẩn.

Trong nghiên cứu [94], đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của AgNPs tổng hợp hóa học xanh sử dụng dịch chiết cây nha đam làm chất khủ Nano bạc sau tổng hợp đã được thử nghiệm trên 2 chủng vi khuẩn gram âm P aeruginosa và vi khuẩn gram dương S cholermidis (hình 1.40), sử dụng phương pháp khuếch tán giếng thạch Hai chủng vi khuẩn được nuôi cấy trong môi trường dinh dưỡng ở 37 ◦C và được ủ qua đêm Sau đó trang vi sinh vật lên trên bề mặt đĩa thạch dinh dưỡng tương ứng (1×10 8 CFU/ml) Các mẫu chứa AgNPs sau đó được đặt lên trên bề mặt thạch đã được cấy và ủ ở 37 ◦C trong 24 giờ Kết quả được xác định bằng cách đo đường kính của vùng ức chế Các thí nghiệm đã được thực hiện lặp lại ba lần.

1.3.1.2 Phương pháp khuếch tán giếng thạch

Phương pháp này được sử dụng nhiều để đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của thực vật hoặc chất kháng khuẩn khuếch tán khác [120].

S epidermidis P aeruginosa Hình 1.40 Hoạt tính kháng khuẩn của

AgNPs đối với S epidermidis và P. aeruginosa [94].

Tương tự như quy trình được sử dụng trong phương pháp khuếch tán đĩa thạch, bề mặt đĩa thạch được cấy bằng cách trang một lượng vi sinh vật lên toàn bộ bề mặt thạch Sau đó, sử dụng đục vô trùng có đường kính từ

6 đến 8 mm đục cỏc giếng và nhỏ một thể tớch (20 - 100 àl) chất khỏng khuẩn được đưa vào giếng Cỏc đĩa thạch sau đó được nuôi trong các điều kiện thích hợp tùy thuộc vào vi sinh vật thử nghiệm Chất kháng khuẩn khuếch tán trong môi trường thạch và ức chế sự phát triển của chủng vi sinh vật thử nghiệm (hình 1.41).

Hình 1.41 Minh hoạ phương pháp khuếch tán giếng thạch [120].

Kasi Murugan cùng các cộng sự [86] đã sử dụng phương pháp khuếch tán giếng thạch để xác định hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết cây kéo trắng (A leucophloea) và nano bạc tổng hợp được sử dụng dịch chiết cây kéo trắng làm chất khử và chất ổn định Các đĩa thạch được trang 1 ml (đơn vị hình thành khuẩn lạc1×10 7 ), Sau đó sử dụng đục vô trùng tạo các giếng có đường kính 5 mm trên các đĩa thạch Tiếp theo tiến hành nhỏ 50 àl dịch chiết xuất từ cõy kộo trắng (25-100 àl/0,1 mg/ml -1 ) và AgNPs tại cỏc nồng độ khỏc nhau (25 àl, 50 àl, 75 àl và 100 àl) vào cỏc giếng, sau đú cỏc đĩa thạch được ủ ở 37 °C trong 24 giờ Khỏng sinh được sử dụng làm mẫu đối chứng, sau khi ủ, đo đường kính vùng ức chế Các thử nghiệm được thực hiện lặp lại ba lần.

Các tác giả nghiên cứu [92] đã đánh giá khả năng kháng khuẩn của nano bạc tổng hợp hóa học xanh trên các vi khuẩn E coli, P aeruginosa, Klebsiella và Enterococcus faecalis bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch Phương pháp này đã sử dụng môi trường Luria bertani (LB) (pH 7,4) được sử dụng để nuôi cấy vi khuẩn Sau đó các vi khuẩn được trang lên trên đĩa thạch bằng cách sử dụng tăm bông vô trùng Sử dụng đục vô trùng để đục các giếng với đường kính 7 mm trên bề mặt đĩa thạch Nhỏ 100 àl dung dịch nano bạc với cỏc nồng độ khỏc nhau (20 àg/ml, 40 àg/ml, 60 àg/ml, 80 àg/ml và 100 àg/ml) vào cỏc giếng Sau đú cỏc đĩa thạch được ủ ở 37 ͦ C và đo kết quả vựng ức chế sau 48 giờ.

1.3.2 Phương pháp định lượng Đây là phương pháp thích hợp để xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC - Minimum Inhibitory Concentration) Phương pháp này ước tính được nồng độ của chất kháng khuẩn được thử nghiệm trong thạch (pha loãng thạch) hoặc pha loãng canh trường (canh thang) [119, 121] Đây cũng là phương pháp định lượng để xác định hiệu quả kháng khuẩn cũng như kháng nấm Giá trị MIC được xác định là nồng độ thấp nhất của chất kháng khuẩn được thử nghiệm ức chế sự phát triển của vi sinh vật được thử nghiệm và nó thường được biểu thị bằng g/ml hoặc mg/l.

Phương pháp này thường được thực hiện trong ống nghiệm hay trong khay vi phiến [122] Chất kháng khuẩn thường được pha loãng theo gấp đôi nối tiếp trong môi trường lỏng chứa vi khuẩn Sau khi nuôi ở điều kiện quy định (35  2 , 18 giờ), đo độ đục hoặc quan sát bằng mắt thường để xác định nồng độ ức chế tối℃) thiểu.

1.3.2.2 Pha loãng trong môi trường thạch

Phương pháp này kết hợp các nồng độ của chất kháng khuẩn vào môi trường thạch, thường sử dụng dãy pha loãng gấp đôi nối tiếp và cấy vi sinh vật đã xác định lên bề mặt đĩa thạch Giá trị MIC được ghi nhận là nồng độ chất kháng khuẩn thấp nhất ức chế hoàn toàn sự phát triển trong điều kiện nuôi thích hợp Kỹ thuật này phù hợp để kiểm tra kháng khuẩn và kháng nấm [119, 121] Ngoài ra còn có thêm các phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn khác:

Yixia Zhang và các cộng sự [155] đã đánh giá khả năng kháng khuẩn của nano bạc được tổng hợp từ dịch chiết cây nha đam làm chất khử, sử dụng vi khuẩn E coli Vi khuẩn E coli được nuôi trong môi trường

Các phương pháp và kỹ thuật đánh giá khả năng kháng khuẩn và kháng nấm của vật liệu da thuộc 47 1 Phương pháp định lượng

Cho đến nay, chưa có nhiều tiêu chuẩn và phương pháp thử nghiệm vi sinh cho sản phẩm da Hiện nay mới có phương pháp đánh giá định lượng khả năng kháng khuẩn theo tiêu chuẩn quốc gia TCVN 10944:2015 (ISO 16187:2013) [122].

Nhìn chung, khi đánh giá các hoạt hoạt tính kháng khuẩn và nấm đối với vật liệu da thuộc thường sử dụng các tiêu chuẩn của ngành dệt may Các phương pháp này liên quan đến việc đo lường sự phát triển của vi khuẩn trong phòng thí nghiệm bằng phương pháp định lượng hoặc định tính quần thể vi sinh vật như AATCC 90 – 2011, AATCC-TM30, ASTM E 2149-2001.

Các phương pháp thử nghiệm để xác định hoạt tính kháng khuẩn được chia thành hai loại: bán định lượng và định lượng Cả hai phương pháp đều thử nghiệm đối với các chủng S aureus (gram dương) và E. coli hoặc K pneumoniae (gram âm) và một số chủng vi khuẩn khác tương ứng.

1.4.1.1 TCVN 10944:2015 (ISO 16187:2013), Phép thử yêu cầu tĩnh [122]:

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp định lượng để đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của giầy dép và các chi tiết của giầy dép Tiêu chuẩn này có thể áp dụng cho tất cả các loại giầy dép và các chi tiết có sử dụng phương pháp xử lý kháng khuẩn không khuếch tán.

Mẫu thử phải có diện tích khoảng 500 mm 2 , độ dày nhỏ hơn 2,0 mm Diện tích và khối lượng mẫu thử phải được ghi trong báo cáo thử nghiệm Nếu sử dụng mẫu thử lớn hơn thì lượng huyền phù vi khuẩn phải tăng lên cân xứng.

 Cách tiến hành: Đặt từng mẫu trong sáu mẫu thử và sáu mẫu đối chứng vào các bình miệng rộng được khử trùng riêng rẽ Dùng pipet lấy (1,0 ± 0,1) ml chất cấy được chuẩn bị trong cho vào từng mẫu thử và đậy chặt nắp có ren Số lượng mẫu da sử dụng phụ thuộc vào loại mẫu.

 Rửa giải sau khi cấy (thời gian zero):

Thêm 20 ml môi trường trung tính (SCDLP) vào từng mẫu trong ba mẫu thử cấy và mẫu đối chứng (nếu có) Đậy chặt nắp và lắc theo một cung tròn khoảng 30 cm trong 30s, hoặc trộn trong 5s x 5 chu kỳ bằng cách dùng máy trộn vortex để rửa giải các vi khuẩn vào trong môi trường này.

 Môi trường nuôi cấy: Nuôi cấy ba mẫu và mẫu đối chứng ở (37 ± 2) °C trong (24 ± 1) giờ.

 Rửa giải sau khi nuôi cấy (thời gian 24 giờ)

 Xác định số lượng vi khuẩn có thể sống - Nuôi cấy bề mặt:

Lấy 1 ml dung dịch rửa giải hoặc dung dịch rửa giải bằng pipet đã khử trùng và cho vào ống thử cùng với (9,0 ± 0,1) ml muối sinh lý và lắc đều Pha loãng dung dịch rửa giải với muối sinh lý để có được các dung dịch pha loãng 10 lần.

Cấy 100 ml của từng dung dịch pha loãng lên thạch agar dinh dưỡng (NA) hai lần, lật thạch quay ngược xuống dưới và nuôi cấy từ 24 giờ đến 48 giờ.

Sau khi nuôi cấy, đếm số lượng khuẩn lạc trong đĩa petri có chứa từ 30 đến 300 khuẩn lạc Nếu số lượng khuẩn lạc tối thiểu nhỏ hơn 30 thì đếm và ghi lại số lượng khuẩn lạc trong các đĩa này Nếu không thu được khuẩn lạc ở trong đĩa, ghi lại số lượng khuẩn lạc là < 1.

Tính số lượng vi khuẩn có thể sống: Đối với từng mẫu thử, xác định số lượng vi khuẩn có thể sống thu được theo công thức (1.1):

M là số lượng vi khuẩn có thể sống của từng mẫu thử;

Z là số lượng vi khuẩn có thể sống trung bình trong hai đĩa petri; B là tỷ lệ pha loãng;

20 là thể tích dung dịch rửa giải, tính bằng (ml). Đánh giá hiệu quả phép thử: Giá trị chênh lệch cực lớn của ba mẫu đối chứng sau khi cấy và nuôi cấy phải có ∆ (IgC) ≤ 1 Số trung bình các khuẩn lạc của các mẫu đối chứng ngay sau khi cấy phải tối thiểu 1 x 10 5 CFU Trong phương pháp đếm đĩa, tính giá trị tăng vi khuẩn (F) theo công thức (1.2), và F phải ≥ 0.

F : Là giá trị tăng vi khuẩn của mẫu đối chứng;

Ct : Là số trung bình các khuẩn lạc của ba mẫu đối chứng ngay sau khi nuôi cấy, tính bằng CFU/ml;

C0: Là số trung bình các khuẩn lạc của ba mẫu đối chứng ngay sau khi cấy, tính bằng CFU/ml. Nếu các điều kiện trên được thỏa mãn, phép thử được cho là có giá trị Nếu các điều kiện trên không được thỏa mãn, phép thử không có giá trị và phải thử lại các mẫu.

Tính tỷ lệ hoạt tính kháng khuẩn: Tính năng kháng khuẩn của giầy dép hoặc các chi tiết của giầy dép phải được ghi lại riêng rẽ dựa trên tỷ lệ hoạt tính kháng khuẩn.

Tính tỷ lệ hoạt tính kháng khuẩn (R) theo công thức (1.3)

Ct là số trung bình các khuẩn lạc của ba mẫu đối chứng sau 24 giờ hoặc sau khoảng thời gian nuôi cấy quy định, tính bằng CFU/ml;

Tt là số trung bình các khuẩn lạc của ba mẫu thử sau 24 giờ hoặc sau khoảng thời gian nuôi cấy quy định, tính bằng CFU/ml.

Tiêu chuẩn này được thực hiện theo nguyên lý lắc động để đảm bảo mẫu thử được tiếp xúc tốt với dung dịch vi khuẩn trong suốt quá trình thử [152].

 Quy trình thử nghiệm: Vi khuẩn E coli sau khi hoạt hóa trong môi trường Tryptic Soy Broth đạt mật độ 1,5 - 310 8 CFU/ml được pha loãng với dung dịch đệm vô trùng đạt nồng độ thử nghiệm là 1,5 - 310 5 CFU/ml Các mẫu thử được cắt nhỏ để đảm bảo tiếp xúc tốt với vi khuẩn và được lắc với tốc độ cao Sau các khoảng thời gian tiếp xúc thì thực hiện các chuỗi pha loãng và trang lên đĩa thạch Các đĩa petri được nuôi ở 35

 2 , 24 giờ Đếm khuẩn lạc xuất hiện trên đĩa petri và tính tỷ lệ phần trăm vi khuẩn suy giảm sau các℃) khoảng thời gian tiếp xúc theo công thức (1.4).

A0: Số lượng vi khuẩn theo quy định tiếp xúc với mẫu đã xử lý kháng khuẩn At: Số lượng vi khuẩn có trên mẫu sau thời gian tiếp xúc t.

Trong phương pháp này có ưu điểm như đảm bảo được sự tiếp xúc của mẫu thử với dung dịch vi khuẩn trong suốt quá trình thử, cho phép đánh giá chính xác khả năng kháng khuẩn của mẫu thử với các chủng vi khuẩn thử nghiệm Tuy nhiên, phương pháp này tốn nhiều hóa chất, mất thời gian và người làm thí nghiệm đòi hỏi phải có kỹ năng thực hiện.

Kết luận chương 1

1) Da thuộc được làm từ lớp bì của các bộ da động vật Da thuộc khá đa dạng, phong phú theo loại da nguyên liệu, theo dạng thuộc, dạng hoàn tất và theo mục đích sử dụng Cấu trúc lưới collagen của vật liệu da là một môi trường lý tưởng cho sự phát triển nhanh chóng của vi khuẩn và nấm, đặc biệt là trong môi trường khí hậu nóng ẩm của nước ta Sự phát triển của vi sinh vật dẫn đến suy giảm chất lượng và tổn thất vật liệu đôi khi không thể khắc phục Để chống lại sự tăng trưởng vi sinh vật, các nhà nghiên cứu đã tạo ra các vật liệu kháng khuẩn có hoạt tính sinh học như chiết xuất thực vật, tinh dầu và chitosan.

2) Bạc là chất kháng khuẩn mạnh, tự nhiên và an toàn Bạc ở kích thước nano cho khả năng kháng khuẩn, kháng nấm mạnh hơn nhiều nên đã và đang được quan tâm nghiên cứu và ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau, trong đó có xử lý kháng khuẩn cho da thuộc Nano bạc được tổng hợp bằng các phương pháp khác nhau Để tránh hoặc giảm thiểu ảnh hưởng của các tác chất độc hại sử dụng trong các phương pháp hóa học chế tạo nano bạc, gần đây các nhà khoa học đã bắt đầu áp dụng định hướng của hóa học xanh trong việc điều chế nano bạc Trong số các phương pháp hóa học xanh, phương pháp điều chế nano bạc từ phản ứng giữa tiền chất bạc với các vi chất hữu cơ hoặc chiết xuất từ thực vật đang ngày càng cho thấy nhiều tiềm năng và ưu thế.

3) Nano bạc được tổng hợp bằng nhiều phương pháp khác nhau như phương pháp vật lý, hóa học, sinh học. Trong đó, phương pháp sinh học (phương pháp hóa học xanh) sử dụng dịch chiết từ thực vật làm chất khử có nhiều ưu điểm hơn so với các phương pháp khác như; quy trình đơn giản, thân thiện môi trường, chi phí thấp, nguồn nguyên liệu dễ tái sinh, nano bạc thu được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực Tuy nhiên, phương pháp hóa học xanh vẫn còn những hạn chế như; khó kiểm soát điều kiện phản ứng Trên thế giới và trong nước đã có nhiều nhà khoa học nghiên cứu sử dụng dịch chiết của nhiều loại thực vật như cây nha đam, hoa cúc, quả bầu nâu, lá trầu không, quả chanh dây tím, lá bàng để tổng hợp nano bạc Các nghiên cứu đã chỉ ra một số loại thực vật có chứa các hợp chất như; flavonoid, saponin, anthocyanin, eugenol/chavibetol, metyl chavibetol, polyphenol, axit ascobic, protein có thể khử ion bạc để tạo thành nano bạc Trong đó dịch chiết từ cây nha đam, hoa cúc, quả bầu nâu, lá trầu không đã được sử dụng trong tổng hợp nano bạc để xử lý kháng khuẩn cho da thuộc Để đánh giá các đặc tính sinh học cũng như ứng dụng của hạt nano bạc tổng hợp được cần sử dụng các phương pháp và kỹ thuật như UV-Vis, TEM, FTIR, HPLC/MS, XRD, SEM, TGA

4) Có nhiều phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm của tác nhân kháng khuẩn như phương pháp khuếch tán, phương pháp pha loãng hoặc nuôi cấy trên đĩa thạch Nano bạc là tác nhân kháng khuẩn, kháng nấm theo cơ chế khuếch tán, đã có nhiều nghiên cứu đánh giá khả năng kháng khuẩn, kháng nấm theo phương pháp khuếch tán giếng thạch và khuếch tán đĩa thạch Phương pháp này dễ thực hiện, cho kết quả nhanh và trực quan Để đánh giá hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm của vật liệu da thuộc thường sử dụng các phương pháp bán định lượng (theo tiêu chuẩn AATCC 90 - 2011) và phương pháp định lượng TCVN 10944:2015.

5) Cho đến nay, chưa có công trình nào công bố về nghiên cứu xử lý kháng khuẩn, kháng nấm cho da lợn thuộc làm lớp lót cho sản phẩm da bằng nano bạc tổng hợp bằng dịch chiết từ thực vật Ở nước ta chưa có công trình nào công bố về việc sử dụng nano bạc trong xử lý kháng khuẩn, kháng nấm cho da thuộc làm sản phẩm da, đặc biệt là AgNPs được tổng hợp hóa học xanh có sử dụng dịch chiết từ thực vật.

HƯỚNG NGHIÊN CỨU CỦA LUẬN ÁN:

Từ kết quả khảo cứu các tài liệu, các công trình nghiên cứu trên thế giới và trong nước về lĩnh vực xử lý kháng khuẩn, kháng nấm cho da thuộc, luận án định hướng nội dung nghiên cứu như sau:

1 Nghiên cứu tổng hợp AgNPs bằng phương pháp hóa học xanh sử dụng dịch chiết lá dâu tằm, lá trầu không

Tổng hợp nano bạc có thể thực hiện bằng nhiều phương pháp khác nhau Hiện nay đã có các sản phẩm nano bạc thương mại hóa để ứng dụng xử lý kháng khuẩn cho các loại vật liệu khác nhau Phương pháp hóa học xanh tổng hợp nano bạc sử dụng dịch chiết thực vật có các ưu điểm là thân thiện với môi trường nên đã và đang được quan tâm nghiên cứu Sản phẩm da thuộc thường được sử dụng trực tiếp trên cơ thể người nên có yêu cầu cao về tính an toàn sinh thái Do vậy, luận án định hướng sử dụng các loại thực vật phổ biến tại Việt Nam để tổng hợp nano bạc cho xử lý kháng khuẩn và kháng nấm da thuộc Ở nước ta, nhiều loài thực vật có thể sử dụng làm chất khử để tổng hợp nano bạc Trong số đó, dâu tằm và trầu không là các loài thực vật dễ trồng, dễ chăm sóc, được trồng phổ biến, có thể trồng với quy mô lớn và đã được chứng minh có khả năng sử dụng trong tổng hợp nano bạc Các nghiên cứu cho thấy dịch chiết lá dâu tằm chứa các hợp chất flavon, flavon glycozit, flavonoid, rutin, quercetin, izoquercitin và quercetin-3-triglucozit, trong đó flavon và flavon glycozit là thành phần chính của lá dâu tằm, dịch chiết từ lá trầu không chứa các hợp chất chavibetol, metyl chavibetol, chavibetol acetate, eugenol, allylpyrocatechol, safrole, allylpyrocatechol điaxetat, Các hợp chất này đều có khả năng khử ion bạc để tạo thành nano bạc.

Do vậy, luận án định hướng sử dụng dịch chiết từ 2 loại thực vật này để tổng hợp xanh nano bạc.

2 Nghiên cứu xử lý kháng khuẩn, kháng nấm cho da lợn thuộc bằng nano bạc tổng hợp xanh theo các phương pháp ngấm ép, ngâm tẩm và phun để làm sản phẩm da

Da thuộc là vật liệu truyền thống và phù hợp để làm nhiều loại sản phẩm như quần áo, giầy dép, găng tay, túi cặp, dây lưng, đồ nội thất Da thuộc được sử dụng làm lớp chi tiết bên ngoài và lớp chi tiết lót của sản phẩm (quần áo, giầy dép, găng tay…) Trong đó, da thuộc làm lớp lót yêu cầu có tính vệ sinh cao hơn vì lớp vật liệu này tiếp xúc với cơ thể người sử dụng, chịu tác động mài mòn, tác động của mồ hôi, hơi ẩm, vi khuẩn… từ cơ thể người mặc Sản phẩm từ da thuộc có khả năng hút nước, hút ẩm tốt, ít hoặc không được giặt nên là môi trường tốt cho sự phát triển của vi khuẩn, nấm mốc Do vậy, luận án định hướng vào xử lý cho da lợn thuộc làm lớp lót cho các sản phẩm da Trong số các loại sản phẩm da (quần áo, giầy dép, găng tay…), lớp lót cho giầy dép có yêu cầu cao nhất về các tính chất cơ lý và tính vệ sinh Do vậy, luận án này sẽ sử dụng các tiêu chí, tiêu chuẩn của vật liệu làm lớp lót giầy để đánh giá chất lượng da lợn thuộc trước và sau xử lý kháng khuẩn, kháng nấm.

ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

- Nano bạc được tổng hợp bằng phương pháp hóa học xanh sử dụng dịch chiết lá dâu tằm, lá trầu không.

- Da lợn thuộc được xử lý kháng khuẩn, kháng nấm bằng nano bạc tổng hợp xanh.

Từ kết quả nghiên cứu tổng quan và thí nghiệm khảo sát, luận án tập trung nghiên cứu các yếu tố có ảnh hưởng lớn nhất đến kết quả tổng hợp nano bạc từ dịch chiết lá dâu tằm, lá trầu không đó là thời gian phản ứng và nồng độ bạc nitrat Các yếu tố này được nghiên cứu khảo sát để nhận được điều kiện phù hợp để tổng hợp bạc nano phù hợp cho mục đích xử lý kháng khuẩn, kháng nấm cho da lợn thuộc.

Lựa chọn nano bạc tổng hợp từ dịch chiết của một nguồn thực vật có ưu điểm về điều kiện tổng hợp và hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm để xử lý kháng khuẩn, kháng nấm cho da lợn thuộc.

Trong nghiên cứu này, da lợn thuộc được lựa chọn nghiên cứu xử lý kháng khuẩn, kháng nấm vì đây là loại da được sử dụng phổ biến để làm lớp lót cho sản phẩm da.

Với cả 3 phương pháp công nghệ xử lý kháng khuẩn, kháng nấm cho da lợn thuộc (ngâm tẩm, ngấm ép và phun), luận án nghiên cứu ảnh hưởng của lượng dung dịch và nồng độ nano bạc trong dung dịch xử lý đến khả năng kháng khuẩn, kháng nấm của da lợn thuộc sau xử lý Đây là cơ sở để nghiên cứu tối ưu hóa công nghệ xử lý kháng khuẩn, kháng nấm cho các loại da thuộc sử dụng vào các mục đích khác nhau trong hướng nghiên cứu tiếp theo.

2.1.3 Vật liệu, hóa chất sử dụng

2.1.3.1 Lá dâu tằm và lá trầu không:

Lá dâu tằm (Mulberry) tươi được thu hoạch từ tháng 4 – 5 (hình 2.1a) Lá trầu không (Piper betle l) tươi được thu hoạch vào tháng 6- 7 (hình 2.1b) tại khu vực tỉnh Hải Dương, không dập úng, không bị sâu [54, 111].

Hình 2.1 Hình ảnh lá dâu tằm (a) và lá trầu không (b)

- Lá dâu tằm và lá trầu không được thu hoạch cùng một ngày, được chọn lựa đồng đều, được rửa sạch và sấy khô ở 60 trong 24 giờ [54, 111] Khi sấy ở nhiệt độ 60°C có thể được coi là một nhiệt độ thấp, giúp giữ℃) được dưỡng chất và thành

Vùng da sử dụng phần hóa học quan trọng trong lá, có thể giúp ngăn chặn sự phá hủy nhanh và đảm bảo lá không bị cháy, mất chất hay thay đổi tính chất quá nhiều Sau đó, lá được cắt nhỏ khoảng 5×5 mm và bảo quản trong túi nhựa kín để sử dụng dần trong quá trình nghiên cứu.

Da lợn thuộc, do có các lỗ chân lông xuyên xuốt độ dày của da và thể hiện trên bề mặt, nên có tính thẩm mỹ kém, ít được dùng làm lớp chi tiết bên ngoài của sản phẩm da (quần áo, giầy, túi xách, găng tay…) Da lợn thuộc có độ bền, bền mài mòn và có độ thông hơi, khả năng hút ẩm và thải ẩm tốt nên được sử dụng nhiều để làm lớp vật liệu lót cho sản phẩm da Cấu trúc da lợn khá thống nhất, lớp bề mặt xốp và sần xùi, các bó xơ nhỏ, mịn, chặt chẽ, các xơ mịn được sắp xếp và đan bện với nhau tạo thành các xơ và chùm xơ, xác định tính chất cơ học của lớp bì và của da thuộc, xơ mịn chứa khoảng 700 - 800 phân tử colagen, còn đường kính của nó khoảng 100 nm Khoảng 30 – 300 xơ thành phần liên kết lại thành các xơ collagel có đường kính khoảng 500 nm Các xơ đan bện với nhau tạo nên lớp bì của da nguyên liệu và mỗi phân tử colagen chứa 3 mạch peptit và mỗi mạch peptit chứa 1.052 gốc axit amino Nano bạc với kớch thước à vẫn cú thể phõn tỏn vào trong da, nờn với kịch thước dưới 100 nm thì dễ dàng ngấm vào trong các xơ da và phân tán tốt.

Do vậy trong nghiên cứu này đã lựa chọn da lợn thuộc để nghiên cứu Da lợn thuộc được cung cấp bởi Công ty TNHH Huynh đệ thuộc da Hưng Thái – Thành phố Hồ Chí Minh, có các đặc trưng thể hiện trong bảng 2.1.

Bảng 2.1 Các đặc trưng của da lợn thuộc được sử dụng.

Da nguyên liệu Chất thuộc Độ dày, mm

Diện tích tấm, bia vuông

Phương pháp hoàn thiện Đặc điểm bề mặt

Da lợn Crôm 1,0 ± 0,1 12,6 Mộc Mặt cật

B là điểm gốc của phần đuôi

AD là đường thẳng vuông góc với BC Đường GH và JK song song với BC AC = 2AB

Hình 2.2 Vùng da lợn thuộc được sử dụng để xử lý nano bạc theo TCVN 7117:2007.

Các tấm da lợn thuộc được bào mỏng đều trên máy bào da Model DS818-420L tại Khoa Công nghệThời trang - Trường Cao đẳng Công Thương Thành phố Hồ Chí Minh, để đảm bảo có độ dày đồng đều là1,0 ± 0,1mm Các vùng khác nhau trên con da có đặc trưng cấu trúc và các chỉ tiêu tính chất cơ lý khác nhau Do vậy vùng da được sử dụng để xử lý kháng khuẩn, kháng nấm trong nghiên cứu này được lấy theo tiêu chuẩn TCVN 7117:2007 – Vị trí lấy mẫu da, như thể hiện trên hình 2.2.

2.1.3.3 Dung môi và hóa chất:

Dung môi được sử dụng để chiết tách dịch chiết từ lá dâu tằm và lá trầu không là nước cất, được cất hai lần tại Trung tâm Thí nghiệm Vật liệu Dệt may - Da giầy của và Thời trang, Đại học Bách Khoa Hà Nội Để tổng hợp nano bạc, luận án sử dụng dung dịch bạc nitrat (99,99%)được cung cấp bởi Công ty Aladdin, Thượng Hải, Trung Quốc (bảng 2.2).

Bảng 2.2 Bạc nitrat được sử dụng.

Tên hóa chất CTPT CAS Điểm sôi (°C) Độ tinh khiết, %

2.1.4 Các chủng vi khuẩn sử dụng Để đánh giá hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm của AgNPs tổng hợp được và da lợn thuộc sau khi xử lý kháng khuẩn, kháng nấm Luận án đã tiến hành thử nghiệm với các chủng vi khuẩn gây bệnh gram âm, gram dương, nấm men và nấm mốc theo các tiêu chuẩn quốc tế được trình bày trong bảng 2.3 Các chủng vi khuẩn và nấm này được cung cấp bởi khoa Công nghệ Sinh học – Trường Đại học Quốc tế, Viện Kỹ thuật công nghệ cao NTT - Trường Đại học Nguyễn Tất Thành và Phòng Vi sinh – Viện Sinh học Nhiệt đới.

Bảng 2.3 Các chủng vi khuẩn và nấm được sử dụng trong nghiên cứu

Vi khuẩn gram âm Vi khuẩn gram dương Nấm

Nấm men (Candida albicans - ATCC 10231)

Pseudomonas aeruginosa (P aeruginosa, ATCC 9027) Micrococcus luteus (M luteus,

2.1.5 Dụng cụ và thiết bị Để thực hiện các nội dung nghiên cứu, luận án đã sử dụng nhiều loại trang thiết bị và dụng cụ nghiên cứu, thể hiện trên hình 2.3 (Phụ lục 2).

Các trang thiết bị và dụng cụ được sử dụng để: 1) Chiết tách dung dịch từ lá dâu tằm và lá trầu không; 2) Tổng hợp nano bạc, xử lý hoàn tất da thuộc (thiết bị ngấm ép, thiết bị ngâm tẩm, thiết bị phun, tủ sấy, cân điện tử, bể ổn nhiệt, máy ly tâm, bể dung siêu âm…); 3) Phân tích mẫu thí nghiệm (thiết bị đo UV-Vis, sắc ký ghép khối phổ HPLC/MS), kính hiển vi quang học, kính hiển vi điện tử quét, kính hiển vi điện tử truyền qua, máy quang phổ hồng ngoại, máy phân tích nhiệt vi sai TGA, thiết bị nhiễu xạ tia X, thiết bị phân tích AAS, thiết bị đo màu, các thiết bị đánh giá tính chất cơ lý của da thuộc); 4) Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm củaAgNPs và các mẫu da lợn thuộc sau khi xử lý (nồi hấp tiệt trùng, tủ cấy an toàn sinh học cấp 2, máy so màu, tủ nuôi lắc, máy votex, máy đo pH, máy đếm khuẩn lạc) Chi tiết về các trang thiết bị và công cụ được sử dụng trong nghiên cứu này được thể hiện trong phụ lục 2.

Hình 2.3 Các thiết bị và dụng cụ được sử dụng trong nghiên cứu

Nội dung nghiên cứu

Luận án thực hiện 2 nội dung chính như được mô tả trên hình 2.4.

Hình 2.4 Sơ đồ các nội dung nghiên cứu của luận án.

2.2.1 Tổng hợp nano bạc bằng phương pháp hóa học xanh từ lá dâu tằm, lá trầu không

2.2.1.1 Nghiên cứu chiết tách và phân tích dịch chiết từ lá dâu tằm, lá trầu không Việt Nam:

Dựa vào các tài liệu nghiên cứu đã công bố trong và ngoài nước về việc tổng hợp nano bạc bằng phương pháp hóa học xanh sử dụng các hoạt chất có trong dịch chiết từ các loài thực vật như [34, 46, 54, 91, 108, 116, 117,118] đã nghiên cứu tổng hợp nano bạc với các nguồn nguyên liệu khác nhau, điệu kiện khác nhau; tỷ lệ thực vật/nước cất, thời gian đun sôi, thay đổi nồng độ bạc nitrat, thời gian phản ứng, điều kiện ly tâm và kết quả thí nghiệm khảo sát ban đầu, trong nghiên cứu này tác giả sử dụng dung môi là nước cất để chiết tách các hoạt chất có trong lá dâu tằm, lá trầu không Dung dịch chiết được sử dụng để khử ion bạc nitrat về dạng nano bạc.

Sử dụng phương pháp FT-IR, HPLC/MS để phân tích dịch chiết từ lá dâu tằm, lá trầu không nhằm xác định các tác nhân khử AgNO3 thành nano bạc.

2.2.1.2 Nghiên cứu tổng hợp nano bạc sử dụng dịch chiết lá dâu tằm, lá trầu không:

Kết quả thí nghiệm sơ bộ đánh giá các yếu tố chính ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp nano bạc sử dụng dịch chiết lá dâu tằm, lá trầu không cho thấy nồng độ AgNO3 và thời gian phản ứng là 2 yếu tố có ảnh hưởng lớn nhất đến kết quả tổng hợp nano bạc Do vậy hai yếu tố này được lựa chọn để nghiên cứu nhằm tổng hợp được nano bạc phù hợp cho xử lý kháng khuẩn, kháng nấm cho da lợn thuộc. Để khảo sát và tìm điều kiện tổng hợp phù hợp, sử dụng phương pháp đo phổ hấp thụ phân tử UV-Vis.

Sử dụng các phương pháp đo UV-Vis, TEM, SEM, EDS, XRD, FT-IR để nghiên cứu đặc tính của hạt nano bạc Xác định hiệu suất của quá trình tổng hợp nano bạc thông qua phương pháp phân tích TGA. Đánh giá khả năng kháng khuẩn, kháng nấm của nano bạc sau tổng hợp theo các phương pháp thử tiêu chuẩn với các chủng vi khuẩn gram âm, gram dương, nấm nem và nấm mốc.

2.2.2 Nghiên cứu xử lý kháng khuẩn, kháng nấm cho da lợn thuộc làm lớp lót sản phẩm da bằng nano bạc

Sau khi tổng hợp và đánh giá khả năng kháng khuẩn, kháng nấm của nano bạc sử dụng dịch chiết từ lá dâu tằm, lá trầu không, luận án lựa chọn sử dụng nano bạc được tổng hợp sử dụng dịch chiết từ lá trầu không để xử lý kháng khuẩn, kháng nấm cho da lợn thuộc.

Sử dụng các phương pháp ngấm ép, ngâm tẩm, phun phủ để đưa nano bạc lên da lợn thuộc.

Trước tiên, thực hiện ngấm ép da lợn thuộc với các mức ép khác nhau (70, 80 và 90%) và đánh giá khả năng kháng khuẩn của các mẫu da lợn thuộc sau xử lý để xác định mức ép phù hợp (mức ép 80%) cho nghiên cứu tiếp theo.

Với mức ép 80% tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ nano bạc trong dung dịch xử lý đến khả năng kháng khuẩn, kháng nấm của da lợn thuộc được xử lý theo các phương pháp ngấm ép, ngâm tẩm, phun phủ.

Phân tích bề mặt da lợn thuộc (SEM), đồng thời phân tích thành phần hóa học của các hạt nano bạc trên bề mặt da lợn thuộc sau khi xử lý (EDX)… Sử dụng phương pháp phân tích AAS để xác định hàm lượng bạc trên da lợn thuộc sau xử lý Đánh giá khả năng kháng khuẩn, kháng nấm của nano bạc nhận được theo các phương pháp thử tiêu chuẩn với các chủng vi khuẩn gram âm, gram dương và nấm. Đánh giá sự thay đổi mầu sắc và các tính chất cơ lý của da lợn thuộc sau xử lý nhằm xác định sự phù hợp của da lợn thuộc sau xử lý để làm lớp lót cho sản phẩm da.

So sánh các phương pháp xử lý để lựa chọn được phương pháp phù hợp xử lý kháng khuẩn, kháng nấm cho da lợn thuộc bằng nano bạc tổng hợp hóa học xanh.

Kết quả nghiên cứu là cơ sở để đề xuất cơ chế liên kết nano bạc với da thuộc.

Trong luận án này, tác giả sử dụng phương pháp khảo cứu các bài báo khoa học, các tài liệu, các công trình nghiên cứu của các nhà khoa học trong và ngoài nước liên quan đến nội dung nghiên cứu Cụ thể là các công bố về da thuộc và xử lý kháng khuẩn, kháng nấm vật liệu da thuộc; về nano bạc và phương pháp tổng hợp; về các phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm của nano bạc và vật liệu da thuộc Đây là cơ sở để định hướng nội dung và phương pháp nghiên cứu thực nghiệm của luận án.

2.3.2 Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

Từ kết quả khảo cứu tài liệu [46, 108, 109, 110], kết quả nghiên cứu khảo sát, trong luận án này đã tiến hành chiết tách dịch chiết từ lá dâu tằm, lá trầu không theo sơ đồ như trên các (hình 2.5 và 2.6).

2.3.2.1 Phương pháp chiết tách dịch chiết từ lá dâu tằm

Lá dâu tằm, sau khi sấy lá khô và bảo quản trong túi nylon, được cắt nhỏ thành các miếng có kích thước khoảng 5×5 mm Cân xác định khối lượng lá đã cắt (5g) và tiến hành chiết tách với nước cất theo dung tỷ 1:20 (g lá khô/ml nước cất) (100 ml) trong điều kiện nhiệt độ sôi t 0 = 100 0 C, thời gian t phút, sử dụng bể ổn nhiệt (BATHS HH-S6) của PTN Công nghệ Hóa dệt, Đại học Bách khoa Hà Nội.

Sau thời gian chiết tách, dịch chiết được để nguội ở nhiệt độ phòng, sau đó tiến hành phân tách phần dung dịch và phần lá sau khi chiết Với phần dịch chiết thu được tiến hành lọc 2 lần qua giấy lọc Whatman No.1.Phần dịch chiết lá dâu tằm thu được, một phần được sấy cô đặc để xác định các nhóm chức có trong dịch chiết,một phần được pha loãng 10 lần bằng nước cất, sau đó được sử dụng để tổng hợp nano bạc cũng như được bảo quản ở 4°C để phân tích thêm Phần lá sau chiết được sấy ở 60°C cho tới khi khô hoàn toàn Sơ đồ quy trình chiết tách lá dâu tằm bằng phương pháp hóa học xanh được minh họa trên hình 2.5.

Hình 2.5 Sơ đồ quy trình chiết tách chất khử từ lá dâu tằm.

2.3.2.2 Phương pháp chiết tách dịch chiết từ lá trầu không

Trên cơ sở khảo cứu tài liệu, trong luận án này để chiết tách dịch lá trầu không đã sử dụng nước cất làm dung môi để chiết tách Từ việc nghiên cứu các tài liệu và các công trình đã công bố [34, 54, 91, 111, 116, 117], kết quả nghiên cứu khảo sát, luận án đã lựa chọn điều kiện chiết tách các hoạt chất có trong lá trầu không là: nhiệt độ sôi của nước: t 0 = 100°C; thời gian: t = 15 phút; dung tỷ: R=1:40 (g lá trầu khô/ml nước cất) Sơ đồ quy trình chiết tách được thể hiện trên hình 2.6.

Hình 2.6 Sơ đồ quy trình chiết tách chất khử từ lá trầu không.

Lá trầu không, sau khi sấy lá khô, được cắt nhỏ thành các miếng có kích thước khoảng 5×5 mm Cân xác định khối lượng lá trầu không đã cắt (2,5g) và tiến hành chiết tách với nước cất theo dung tỷ 1:40 (g lá khô/ml nước cất) (100 ml) trong điều kiện nhiệt độ sôi t 0 = 100 0 C, thời gian t phút, sử dụng bể ổn nhiệt (BATHSHH- S6) của Phòng thí nghiệm Công nghệ Hóa dệt, Đại học Bách khoa Hà Nội.

Mul, PBL AgNP@Mul AgNP@PBL AgNP Mul AgNP PBL

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Kết quả tổng hợp nano bạc sử dụng dịch chiết từ lá dâu tằm, lá trầu không

3.1.1 Kết quả tổng hợp nano bạc sử dụng dịch chiết từ lá dâu tằm

3.1.1.1 Sự biến đổi màu của dung dịch trong quá trình tổng hợp nano bạc

Trong nghiên cứu này, theo phương pháp nghiên cứu đã xây dựng, đã chiết xuất được dịch chiết lá dâu tằm (Mul) và sử dụng dịch chiết này để tổng hợp nano bạc theo quy trình được trình bày trên sơ đồ (hình 2.5 và 2.7).

Màu của các ống nghiệm thể hiện trên hình 3.1 cho thấy, sau khi thêm dung dịch AgNO 3 vào dịch chiết lá dâu tằm, màu vàng nhạt của dịch chiết lá dâu tằm chuyển thành màu vàng sẫm do kích thích cộng hưởng plasmon bề mặt (SPR: Surface plasmon resonance) của các AgNPs được tạo ra [5, 121] Điều này khẳng định sự hiện diện của các chất khử có trong dung dịch chiết lá dâu tằm có tác dụng khử ion bạc thành nano bạc.

Cụ thể, dịch chiết lá dâu tằm có màu vàng sẫm được pha loãng 10 lần trước khi cho phản ứng với bạc nitrat không màu Ở thời gian đầu của phản ứng với AgNO3 gần như không có sự biến đổi về màu sắc của dung dịch Sau khoảng thời gian 6 giờ phản ứng ở nhiệt độ phòng, dung dịch nano bạc thu được có màu nâu đỏ Hỗn hợp nano bạc sau phản ứng được ly tâm 2 lần để loại bỏ các tạp chất và sử dụng máy rung siêu âm 2 lần để phân tán lại các hạt nano bạc và thu được nano bạc sạch các tạp chất Sau khi ly tâm lần thứ nhất, dung dịch có màu gần giống với màu dịch chiết trước khi cho ly tâm, chứng tỏ vẫn còn dịch chiết trong ống ly tâm. Tuy nhiên, sau khi loại bỏ phần dung dịch, thêm nước cất vào và ly tâm lần 2 thì dung dịch sau khi ly tâm không có màu Điều này cũng chứng tỏ rằng sau ly tâm lần 2 đã thu được nano bạc sạch tạp chất và đã loại bỏ các chất phản ứng Sản phẩm thu được cuối cùng có màu nâu đỏ đặc trưng của nano bạc hình 3.1.

Hình 3.1 Sự biến đổi màu sắc của dung dịch trong quá trình tổng hợp nano bạc. Để xác định đặc tính của hạt nano bạc thu được, luận án đã sử dụng phương pháp đo phổ hấp thụ UV- Vis Kết quả đo thể hiện trên hình 3.2 cho thấy trong khoảng bước sóng từ 300 - 700 nm, đường cong phổ hấp thụ UV-Vis của dịch chiết lá dâu tằm (Mul) không thấy có sự xuất hiện của các đỉnh lạ, chỉ có duy nhất một đỉnh xuất hiện ở bước sóng khoảng 340 nm Trong khi đó, trên phổ hấp thụ UV–Vis của AgNP Mul xuất hiện đỉnh có bước sóng hấp thụ cực đại tại 453 nm đặc trưng của hạt bạc, chứng tỏ nano bạc đã được tổng hợp [46,

Hình 3.2 Kết quả đo UV-Vis của dịch chiết từ lá dâu tằm (Mul) và nano bạc (AgNP Mul ) với nồng độ AgNO 3 12 mM.

3.1.1.2 Ảnh hưởng của thời gian phản ứng tới quá trình tổng hợp nano bạc

Kết quả thí nghiệm sơ bộ đánh giá các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp nano bạc sử dụng dịch chiết lá dâu tằm cho thấy nồng độ AgNO3 và thời gian phản ứng là 2 yếu tố có ảnh hưởng lớn nhất đến kết quả tổng hợp nano bạc Do vậy hai yếu tố này được lựa chọn để tiến hành nghiên cứu tiếp theo nhằm tổng hợp được nano bạc phù hợp xử lý kháng khuẩn, kháng nấm cho da lợn thuộc.

Sự biến đổi mầu sắc của dung dịch trong quá trình tổng hợp nano bạc theo thời gian được thể hiện trên hình 3.3.

Hình 3.3 Kết quả phổ UV-Vis của dung dịch Mul khi thay đổi thời gian phản ứng

Phổ hấp thụ UV-Vis của AgNPMul được tổng hợp với nồng độ AgNO3 12 mM, thời gian phản ứng lần lượt là 2, 4, 6 và 8 giờ, thể hiện trên hình 3.3 cho thấy giá trị hấp thụ cực đại tăng dần khi kéo dài thời gian phản ứng, tức là lượng nano bạc tăng dần Sau 2 giờ phản ứng xuất hiện đỉnh hấp thụ cực đại tại bước sóng 435 nm. Khi

C ư ờ n g đ ộ h ấp t h ụ C ư ờ n g đ ộ h ấp t h ụ tăng thời gian phản ứng lên đến 6 giờ, đỉnh hấp thụ cực đại hẹp hơn và cường độ đỉnh tăng dần Cường độ đỉnh đạt giá trị cực đại sau 6 giờ phản ứng tại bước sóng 453 nm Điều này chứng tỏ với điều kiện tổng hợp như trên, thời gian khử càng lâu, hiệu quả khử càng tăng, lượng nano bạc tạo ra càng nhiều Tuy nhiên, sau 6 giờ phản ứng, sự tăng giá trị hấp thụ cực đại có xu hướng chậm lại Mặt khác, càng kéo dài thời gian phản ứng thì bước sóng tại đỉnh hấp thụ cực đại (λmax) cũng tăng dần và bước sóng hấp thụ cực đại dịch chuyển về phía có bước sóng dài hơn 456 nm tại thời gian phản ứng 8 giờ Bước sóng tăng được giải thích là do kích thước hạt AgNPMul tăng lên Thực nghiệm cho thấy nano bạc được tổng hợp với thời gian càng lâu thì kích thước của các hạt nano bạc tăng lên và có hiện tượng sa lắng khi lưu trữ sau vài ngày Hiện tượng này có thể được giải thích do kích thước hạt AgNPMul lớn hơn làm giảm sự ổn định của hệ phân tán, các hạt AgNPMul dễ sa lắng hơn Điều này có ảnh hưởng không tốt tới khả năng kháng khuẩn, kháng nấm của hạt nano bạc Do vậy, từ kết quả phân tích này, luận án đã lựa chọn thời gian phản ứng là 6 giờ thích hợp để tổng hợp hạt nano bạc ở nhiệt độ phòng.

3.1.1.3 Ảnh hưởng của nồng độ AgNO 3 tới quá trình tổng hợp nano bạc

Hình 3.4 Kết quả phổ UV-Vis của dung dịch Mul khi thay đổi nồng độ AgNO 3

Kết quả đo phổ hấp thụ UV-Vis của dung dịch nano bạc được tổng hợp trong 6 giờ với các nồng độ AgNO3 ban đầu lần lượt là 4,0; 8,0; 12,0 và 16,0 mM được thể hiện trên hình 3.4 cho thấy giá trị hấp thụ cực đại tăng dần theo sự gia tăng của nồng độ dung dịch AgNO 3 phản ứng, chứng tỏ lượng AgNPMul hình thành tăng Khi nồng độ AgNO3 tăng thì giá trị độ hấp thụ cực đại tăng lên Khi tăng nồng độ AgNO3 đến 12 mM cường độ đỉnh hấp thụ đạt giá trị cực đại tại bước sóng 453 nm Tuy nhiên khi tiếp tục tăng nồng độ AgNO 3 lên 16 mM thì cường độ đỉnh hấp thụ tăng chậm lại, đỉnh hấp thụ rộng hơn và dịch chuyển về phía có bước sóng dài hơn 457 nm Điều này là do khi tăng nồng độ AgNO 3 làm cho tốc độ phản ứng nhanh, kích thước hạt nano bạc tăng lên, thể hiện qua sự tăng của bước sóng hấp thụ cực đại (λmax) [145] Khi đỉnh hấp thụ cực đại càng nhọn thì sự phân bố kích thước hạt càng tập trung, các hạt nano bạc có kích thước càng đồng đều Do vậy, trong phạm vi nghiên cứu này, sử dụng nồng độ AgNO 3 12 mM và thời gian phản ứng là 6 giờ là phù hợp để tổng hợp nano bạc sử dụng dịch chiết lá dâu tằm.

3.1.1.4 Hình thái và cấu trúc của hạt nano bạc Để xác định đặc tính hình dạng, kích thước của hạt nano bạc, luận án đã tiến hành tổng hợp nano bạc tại điều kiện nồng độ AgNO3 là 12 mM và thời gian phản ứng là 6 giờ và khảo sát đặc tính của hạt nano bạc bằng kính hiển vi điện tử truyền qua mức độ phân giải cao HR-TEM Kết quả đo HR-TEM của nano bạc ở mức độ phóng đại 100.000 lần (hình 3.5 a) cho thấy các hạt nano bạc tổng hợp được có dạng hình cầu với đường kính hạt dao động trong khoảng 15 – 40 nm và sự phân bố kích thước tương đối đồng đều Như vậy, các hợp chất hữu cơ có trong dịch chiết từ lá dâu tằm không những đóng vai trò chất khử trong phản ứng tổng hợp AgNPMul mà còn đóng vai trò là chất ổn định, ngăn cản sự kết tụ của các hạt AgNPMul Nếu không có chất ổn định, các hạt nano bạc năng lượng cao có xu hướng kết tụ với nhau để hình thành các hạt có kích thước lớn hơn, năng lượng thấp, ổn định hơn Quan sát hạt nano bạc ở mức độ phóng đại lớn hơn 200.000 lần (hình 3.5 b) thấy rằng đa số các hạt nano bạc tồn tại ở dạng đơn phân tán, hình cầu Kết quả phân tích này phù hợp với nhận định trong phân tích phổ hấp thụ phân tử UV-Vis và các tài liệu đã được công bố [46, 143] Bên cạnh đó, trên bề mặt của các hạt nano bạc có lớp phủ mờ Đây là các hợp chất hữu cơ có trong dịch chiết lá dâu tằm có tác dụng ổn định, tránh các hạt nano bạc kết tụ lại với nhau Như vậy các hợp chất hữu cơ có trong dịch chiết lá dâu tằm không chỉ đóng vai trò chất khử mà còn đóng vai trò là chất ổn định trong phản ứng tổng hợp nano bạc.

Hình 3.5 Kết quả đo HR-TEM của AgNP Mul ở các độ phóng đại khác nhau (a) x 100.000 lần, (b) x

3.1.1.5 Kết quả phân tích FT-IR AgNP Mul

Như đã trình bày trong phần tổng quan, trong lá dâu tằm chứa nhiều hợp chất hữu cơ có thể đóng vai trò là chất khử và chất ổn định trong phản ứng tổng hợp AgNPMul từ muối bạc nitrat Để chứng minh các hợp chất có trong dịch chiết lá dâu tằm tham gia vào phản ứng khử ion bạc để tạo nano bạc, đồng thời đóng vai trò là chất ổn định trong phản ứng tổng hợp nano bạc từ muối bạc nitrat Trong đó các hợp chất hữu cơ chứa các nhóm chức amin, cacboxyl, cacbonyl, hydroxyl có tác dụng khử ion bạc có trong dung dịch bạc nitrat về dạng nano bạc Các hợp chất steroit, carotenoit,…đóng vai trò như chất ổn định nano bạc do có cấu tạo như chất hoạt động bề mặt.

Trong luận án này đã thực hiện phân tích phổ FT-IR của các hợp chất có trong dịch chiết lá dâu tằm cho biết các nhóm chức của các chất có trong dung dịch và nano bạc tổng hợp được Kết quả phân tích phổ FT-IR được thể hiện trên (hình 3.6) cho thấy, sau quá trình phản ứng tổng hợp và tinh chế nano bạc, có sự tồn tại của các hợp chất hữu cơ trên bề mặt của hạt AgNP Mul Điều này được thể hiện bởi các đỉnh hấp thụ đặc trưng trên phổ FT-IR của AgNPMul tại các số sóng 3424,08 (cm-1) đặc trưng cho liên kết hydroxyl (O-H) và amin (N- H); 1629,03 (cm -1 ) đặc trưng cho liên kết cacbonyl (C=O) trong nhóm chức este và xeton; các đỉnh tại số sóng 1405,47 (cm -1 ) và 1053,30 (cm -1 ) tương ứng với các liên kết C-O và C-H trong các nhóm peptit, axit amin…. Tuy nhiên, sự dịch chuyển vị trí của các đỉnh tại số sóng 3424,08 (cm -1 ); 1629,03 (cm-1); 1405,47 (cm-1) và 1053,30 (cm-1) của AgNPMul so với Mul có thể là do sự hình thành liên kết bạc - cacboxylat tương tác với mạch hydrocarbon thông qua lực kỵ nước Cường độ của đỉnh 1053,30 (cm -1 ) giảm rõ rệt thể hiện nhóm C-O trong hợp chất của nhóm flavonoid (rutin, quercetin 3-β-D-glucoside…) tham gia phản ứng khử ion bạc thành nano bạc Sự tồn tại của các liên kết này trên AgNPMul có thể chứng minh các hợp chất có trong dịch chiết lá dâu tằm đã đóng vai trò là chất khử và chất ổn định trong quá trình tổng hợp nano bạc bằng phương pháp hóa học xanh Kết quả này là phù hợp với các công trình nghiên cứu đã công bố về phân tích FT-IR của dịch chiết lá dâu tằm và dung dịch nano bac [46, 143] Điều này cũng có thể quan sát thấy trên ảnh đo HR-TEM của AgNPMul (hình 3.5).

Hình 3.6 Kết quả đo phổ FT-IR dung dịch Mul và AgNP Mul

3.1.1.6 Hiệu suất của quá trình tổng hợp nano bạc Để xác định hiệu suất quá trình tổng hợp AgNPMul tại điều kiện phản ứng đã đề xuất, luận án sử dụng phương pháp phân tích nhiệt trọng lượng (TGA) và phân tích nhiệt vi sai (DTA) Các mẫu nano bạc được tổng hợp ở điều kiện trong phạm vi nghiên cứu của luận án, được ly tâm và rung siêu âm để loại bỏ các hoạt chất tham gia phản ứng còn dư Sau đó được sấy khô hoàn toàn ở 70°C và phân tích nhiệt trọng.

Phân tích nhiệt TGA/DTA của AgNPMul được thực hiện trong môi trường khí N2, nhiệt độ phân tích là từ 0 - 800°C, tốc độ nâng nhiệt là 5°C/phút Kết quả phân tích thể hiện trên hình 3.7 cho thấy trên đường màu xanh lá (TG) có sự giảm khối lượng

Cường độ (a.u) ở khoảng nhiệt độ trước 200°C, điều này là do sự hóa hơi nước Sự giảm khối lượng ở khoảng nhiệt độ 200 - 550°C là do sự phân hủy của các chất phản ứng còn dư, các tạp chất sau quá trình phản ứng tổng hợp AgNPMul còn xót lại Sự giảm khối lượng của mẫu ở khoảng 550 – 800°C có thể là do sự bốc bay của nano bạc Theo các tài liệu đã công bố [7], hạt nano bạc có nhiệt độ nóng chảy khoảng từ 200 0 C và bắt đầu bốc bay ở khoảng 600 0 C Từ kết quả này cho thấy sự tồn tại của các chất hữu cơ trên bề mặt nano bạc sau quá trình tinh chế, chứng tỏ vai trò của chúng trong việc ổn định các hạt AgNP Mul trong dung dịch phản ứng Từ đường phân tích nhiệt vi sai (DTA) trên hình 3.7 cho thấy có sự thay đổi khối lượng tại 572,7°C tương ứng với hàm lượng nano bạc tổng hợp được trong hàm lượng rắn thu được sau khi tổng hợp là vào khoảng 88%.

Hình 3.7 Kết quả phân tích nhiệt TGA/DTA của AgNP Mul

Từ kết quả phân tích nhiệt TGA, tính toán lượng nano bạc tinh khiết theo công thức (2.1) đã được trình bày ở chương 2:

Trong đó: %mTG = 88%; mAgNP = ms - mt = 7,1415 – 7,1369 = 0,0046(g) = 4,6 (mg).

Lượng bạc tổng hợp ban đầu là: mAg = nAg × MAg = CM × V × MAg = (12×10-3) × (1×10-3) × 108 × 4 = 0,0052 (g)

Như vậy, hiệu suất của quá trình tổng hợp là 77,84 %.

3.1.2 Kết quả tổng hợp nano bạc sử dụng dịch chiết từ lá trầu không

3.1.2.1 Sự biến đổi màu của dung dịch trong quá trình tổng hợp nano bạc

Theo phương pháp xây dựng được, luận án đã thu được dịch chiết lá trầu không và sử dụng dịch chiết này để tổng hợp nano bạc theo quy trình được trình bày trên sơ đồ quy trình như hình 3.8.

PBL AgNP@PBL AgNP PBL

Kết luận chương 3

Các kết quả đạt được trong chương 3:

- Đã tổng hợp được AgNPs bằng phương pháp hóa học xanh sử dụng dịch chiết từ lá dâu tằm và lá trầu không làm chất khử.

- Bằng các phương pháp phân tích UV-Vis, TEM, FTIR, XRD, TGA đã xác định được cả 2 loại AgNPs tổng hợp được đều có dạng hình cầu, kích thước trung bình nhỏ hơn 40 nm, có khả năng kháng khuẩn, kháng nấm tốt phù hợp để xử lý kháng khuẩn, kháng nấm cho da lợn thuộc.

- Đã xác định được điều kiện phù hợp để xử lý kháng khuẩn, kháng nấm cho da lợn thuộc sử dụng AgNPs bằng các phương pháp ngấm ép, ngâm tẩm và phun phủ Kết quả đánh giá khả năng kháng khuẩn, kháng nấm của các mẫu da lợn thuộc sau xử lý đều cho thấy nồng độ nano bạc trong dung dịch có ảnh hưởng lớn đến khả năng kháng khuẩn, kháng nấm của da lợn thuộc Dung dịch có nồng độ nano bạc 160 g/ml là phù hợp để xử lý kháng khuẩn, kháng nấm cho da lợn thuộc bằng các phương pháp khác nhau cho hiệu quả kháng khuẩn, kháng nấm tốt (hiệu suất kháng khuẩn lên đến 99,99%).

- Bằng các phương pháp phân tích SEM, EDX, FTIR, AAS cho thấy AgNPs đã được đưa lên da lợn thuộc thành công Đây là cơ sở để đề xuất cơ chế liên kết của nano bạc tổng hợp hóa học xanh với các xơ collagen của da lợn thuộc.

- Hàm lượng nano bạc trên da lợn thuộc có ảnh hưởng đến sự thay đổi màu sắc của da lợn thuộc sau xử lý Các mẫu da lợn thuộc trước và sau xử lý nano bạc đều đáp ứng yêu cầu để làm lớp lót cho sản phẩm da. Nhìn chung các phương pháp xử lý không ảnh hưởng đáng kể đến các tính chất của mẫu da lợn thuộc được sử dụng trong nghiên cứu này.

- Phương pháp phun phù hợp để xử lý da lợn thuộc thành phẩm, có thể áp dụng cho các cơ sở sử dụng da thuộc; các phương pháp ngấm ép và ngâm tẩm phù hợp với các cơ sở sản xuất thuộc da, được thực hiện ở công đoạn hoàn tất ướt.

KẾT LUẬN VÀ HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP CỦA LUẬN ÁN KẾT

Luận án đã đạt được các kết quả sau:

1 Đã tổng hợp được nano bạc bằng phương pháp hoá học xanh sử dụng dịch chiết lá dâu tằm (AgNP Mul ) và lá trầu không (AgNPPBL) làm chất khử và chất bảo vệ.

+ Điều kiện tổng hợp AgNP Mul : Nồng độ AgNO3 12 mM, tỷ lệ thể tích dung dịch AgNO3 và dịch chiết dâu tằm là 1:10, thời gian phản ứng 6 giờ, nhiệt độ phòng; Đặc tính của AgNP Mul : cấu trúc tinh thể lập phương tâm mặt, hình cầu, λmax = 453 nm, kích thước 20 – 40 nm, có khả năng kháng khuẩn tốt với 2 chủng gram âm là E coli, P aeruginosa và 2 chủng gram dương S aureu, M luteus, kháng nấm tốt với chủng nấm men Candida albicans.

+ Điều kiện tổng hợp AgNP PBL: Nồng độ AgNO3 10 mM, tỷ lệ thể tích dung dịch AgNO3 và dịch chiết trầu không là 1:10, thời gian phản ứng 4 giờ, nhiệt độ phòng; Đặc tính của AgNP PB : cấu trúc tinh thể lập phương tâm mặt, hình cầu, λmax = 442 nm, kích thước 10 – 20 nm, có khả năng kháng khuẩn tốt với 2 chủng gram âm là E coli, P aeruginosa và 2 chủng gram dương S aureu, M luteus, kháng nấm tốt với chủng nấm men Candida albicans và chủng nấm mốc Aspergillus niger.

2 Đã thiết lập được quy trình xử lý kháng khuẩn, kháng nấm cho da lợn thuộc sử dụng nano bạc AgNP PBL , bằng các phương pháp ngấm ép, ngâm tẩm, phun tại điều kiện xử lý: lượng dung dịch AgNPPBL có nồng độ ban đầu 160 àg/ml được đưa lờn da lợn thuộc tương đương 80% khối lượng da lợn thuộc ban đầu.

+ Các mẫu da lợn thuộc sau xử lý đáp ứng được các yêu cầu về khả năng kháng khuẩn, kháng nấm cũng như các chỉ tiêu cơ lý của vật liệu để làm lót sản phẩm da.

+ Phương pháp phun phù hợp để xử lý da lợn thuộc thành phẩm, có thể áp dụng cho các cơ sở sử dụng da thuộc; các phương pháp ngấm ép và ngâm tẩm phù hợp với các cơ sở sản xuất da thuộc, được thực hiện ở công đoạn hoàn tất ướt.

3 Đã đề xuất được cơ chế liên kết giữa nano bạc tổng hợp bằng phương pháp hóa học xanh với da lợn thuộc.

4 Đã đánh giá được sự thay đổi mầu sắc, các tính chất cơ lý của các mẫu da lợn thuộc sau xử lý kháng khuẩn, kháng nấm bằng dung dịch AgNPPBL Các phương pháp xử lý trên không ảnh hưởng xấu đến các tính chất cơ lý của da lợn thuộc.

HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO

Luận án có thể phát triển theo một số hướng nghiên cứu sau:

- Hoàn thiện quy trình xử lý kháng khuẩn, kháng nấm cho da thuộc bằng AgNPs.

- Nghiên cứu tổng hợp nano bạc bằng phương pháp hóa học xanh và ứng dụng để xử lý kháng khuẩn, kháng nấm cho các loại da thuộc theo các mục đích sử dụng khác nhau.

- Nghiên cứu ứng dụng trên sản phẩm da sử dụng da lợn thuộc xử lý bằng dung dịch AgNPs tổng hợp hóa học xanh làm lớp lót và đánh giá độ bền kháng khuẩn, kháng nấm.

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU CỦA LUẬN ÁN

1 Nguyễn Ngọc Thắng, Phạm Thị Ngọc, Vũ Tiến Hiếu, Bùi Văn Huấn (2018), “Tổng hợp và phân tích tổ hợp nano bạc thu được bằng phương pháp khử ion bạc trong dịch chiết từ lá dâu tằm”, Tạp chí Khoa học &

Công nghệ các trường Đại học kỹ thuật, số 129, tr 63-68 (ISSN 2354 - 1083).

2 Vũ Tiến Hiếu, Nguyễn Ngọc Thắng, Bùi Văn Huấn (2019), “Green synthesis, characterisation and antimicrobial activity of silver nanoparticles using vietnam piper betle l Leave extract”, The 13th South East

Asian Technical University Consortium Symposium (SEATUC 2019), March 14-15, 2019, Hanoi University of Science and Technology (HUST), Ha Noi, Viet Nam.

3 Vũ Tiến Hiếu, Nguyễn Ngọc Thắng, Bùi Văn Huấn (2021), “Antibacterial Properties of Silver

Nanoparticles Synthesized Using Piper betle l Leaf Extract”, Materials Science Forum, 1020, pp 236-242