HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM TRẦN THỊ THU THIỆP KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI XÁC ĐỊNH ĐIỀU KIỆN TÁCH CHIẾT POLYPHENOL TỪ BÃ THỊT QUẢ TRÁM ĐEN S[.]
VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu
Trám đen được thu mua tại Bắc Giang vào tháng 7/ 2022 Qủa được chọn phải là những quả chín, đồng đều về màu sắc, kích thước, không bị hư hỏng và sâu bệnh. Trám sau khi đem về sẽ được loại bỏ phần hạt, tiến hành sấy đông khô rồi nghiền nhỏ đến kích thước 0,2 – 0,3mm Sau khi nghiền nhỏ thịt quả sẽ được đem tách chiết lấy dầu theo điều kiện: Dung môi ethyl acetate, tỷ lệ nguyên liệu/dung môi là 1/10, nhiệt độ 40 o C, chiết động 2 lần Lần đầu trong thời gian 30 phút, lần thứ hai trong thời gian
15 phút (Lại Thị Ngọc Hà & cs., 2023).
Kết thúc quá tách chiết ta thu được dịch chiết dầu và phần bã trám, phần bã này sẽ được thu lại để tiến hành nghiên cứu tách chiết polyphenol Bã trám được làm khô ở nhiệt độ phòng rồi cho vào trong lọ nhựa đậy kín cất vào tủ đông nhằm bảo quản mẫu để dùng cho các thí nghiệm tách chiết lấy polyphenol.
Một số hóa chất cơ bản và thiết bị sử dụng được liệt kê trong bảng 3.1:
Bảng 3.1 Một số hóa chất sử dụng trong nghiên cứu
STT Hóa chất Nguồn gốc
1 Ethanol thực phẩm 96% Việt Nam
Bảng 3.2 Một số thiết bị sử dụng trong nghiên cứu
STT Thiết bị Nguồn gốc
1 Bể ổn nhiệt Hoa kỳ
2 Cân phân tích TOLEDO Hoa Kỳ
3 Máy ly tâm lạnh HETTICH Đức
4 Máy ly tâm lạnh Z400K Đức
5 Máy quang phổ UV-VIS Trung Quốc
Một số dụng cụ khác: cốc đong, pipet thủy tinh, bình định mức, ống falcon 50, ống falcon 15, ống eppendorf,…
3.1.2 Địa điểm và thời gian thực hiện nghiên cứu
- Địa điểm: Bộ môn hóa sinh - Khoa Công nghệ thực phẩm, Học viện Nông nghiệp Việt Nam, Trâu Qùy, Gia Lâm, Hà Nội
- Thời gian thực hiện nghiên cứu: Tháng 04/2023 – tháng 08/2023
3.2.1 Sàng lọc các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết polyphenol từ bã trám đen
Tiến hành nghiên cứu sự ảnh hưởng của 4 yếu tố: Nồng độ ethanol, tỷ lệ nguyên liệu/dung môi, nhiệt độ và thời gian đến quá trình tách chiết polyphenol.
Sử dụng phần mềm Design Expert 12 và phương pháp Placket-Burman để tiến hành thực nghiệm.
3.2.2 Mô hình hóa và tối ưu hóa quá trình tách chiết polyphenol từ bã trám đen bằng phương pháp bề mặt đáp ứng
Kết thúc sàng lọc ta tìm được 3 yếu tố ảnh hưởng lớn đến quá trình trích ly polyphenol: Nồng độ ethanol, tỷ lệ nguyên liệu/dung môi và nhiệt độ.
Sử dụng phần mềm Design Expert 12 và phương pháp bề mặt đáp ứng RSM (Response Surface Methodology) để xây dựng ma trận thực nghiệm mô hình hóa với 3 yếu tố ảnh hưởng: Nồng độ ethanol, tỷ lệ nguyên liệu/dung môi và nhiệt độ.
Tiến hành tối ưu hóa bằng phương pháp bề mặt đáp ứng RSM (Response Surface Methodology)
Các yếu tố thí nghiệm:
X2: Tỷ lệ nguyên liệu/dung môi (w/v)
Phương trình mô hình có dạng:
- Y: Hàm lượng polyphenol (mg GAE/g CK)
- b12, b13, b23: Hệ số tương tác đôi
3.2.3 Xác định định tính các nhóm chất trong dịch chiết thu được ở điều kiện tối ưu
Tiến hành tách chiết mẫu ở điều kiện tối ưu thu lấy dịch trong Dịch chiết được đem đi xác định định tính các nhóm chất trong dịch chiết như: tanin, alkaloid, polyphenol, saponin, glucoside, flavonoid, anthraquinone, terpenoid & steroid và khả năng kháng oxy hóa.
3.2.4 Xác định khả năng kháng oxy hóa của dịch chiết thu được ở điều kiện tối ưu
Xác định khả năng kháng oxy hóa được xác định dựa trên đường chuẩn mô tả mối tương quan giữa nồng độ trolox và phần trăm kỡm hóm, được biểu diễn bằng àmol TE/ml.
Kết quả hoạt tính kháng oxy hóa của cao chiết ở điều kiện tối ưu được diễn đạt bằng giá trị IC50 Nồng độ ức chế 50% được xây dựng trên tỷ lệ phần trăm ức chế so với nồng độ thử nghiệm.
Phương pháp nghiên cứu
Tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi
Hình 3.1 Quy trình nghiên cứu trích ly polyphenol (Trần Thị Thu An, 2021)
Thuyết minh quy trình tách chiết
Sử dụng cân phân tích, cân chính xác khối lượng cân của các mẫu vào các ống falcon 50 Chuẩn bị dung môi ethanol theo các nồng độ nghiên cứu, cho 5ml dung môi vào từng ống falcon 50 theo nồng độ ethanol của từng mẫu Đem mẫu đi vortex để dung môi ngấm đều vào mẫu rồi cho các ống falcon 50 vào bể ổn nhiệt theo nhiệt độ và thời gian của từng mẫu.
Mẫu sau khi lấy ra khỏi bể ổn nhiệt ta đem vortex lại một lần nữa rồi đem đi ly tâm ở nhiệt độ 4 o C, tốc độ quay 6000 vòng/phút và thời gian 8 phút ( đặt 3 ống vào máy sao cho các ống cân nhau).
Kết thúc ly tâm thu lấy dịch trong chắt sang các ống falcon 15 và để lắng Nếu dịch chiết còn cặn thì hút dịch chiết từ ống falcon 15 vào các ống eppendorf rồi đem đi ly tâm lại một lần nữa với nhiệt độ 8 o C, tốc độ quay 10.000 vòng/phút và thời gian 10 phút.
Sau khi ly tâm đem dịch chiết chắt sang các ống eppendorf khác Đây là dịch chiết thô dùng để xác định hàm lượng polyphenol tổng số.
3.3.2 Sàng lọc các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết polyphenol từ bã trám đen
Sử dụng phần mềm Design Expert 12 và phương pháp Placket-Burman để xây dựng mô hình thực nghiệm để tiến hành sàng lọc các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết polyphenol Các yếu tố thực nghiệm và ngưỡng biến đổi được thể hiện trong bảng 3.2.
Bảng 3.3 Các yếu tố thực nghiệm và ngưỡng biến đổi trong thực nghiệm sàng lọc
Stt Yếu tố thí nghiệm Mức dưới Mức trên
Dùng phần mềm Design Expert 12 xây dựng ma trận thực nghiệm sàng lọc theo các yếu tố và khoảng biến đổi trong bảng 3.2, ta thu được ma trận thực nghiệm sàng lọc thể hiện trong bảng 3.3.
Bảng 3.4 Ma trận thực nghiệm sàng lọc
Tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu (v/w)
Tiến hành thực nghiệm theo ma trận thực nghiệm trong bảng 3.3 ta thu được dịch chiết thô của từng mẫu, đem dịch chiết đi phân tích để xác định hàm lượng polyphenol tổng số của từng mẫu Sử dụng phần mềm Design Expert 12 để xác định các yếu tố ảnh hưởng có ý nghĩa đối với quá trình trích ly polyphenol Kết thúc sàng lọc ta xác định được 3 yếu tố có ảnh hưởng lớn đến quá trình tách chiết polyphenol: Nồng độ ethanol, tỷ lệ nguyên liệu/dung môi và nhiệt độ với thời gian cố định là 30 phút.
Các yếu tố này sẽ được đưa vào để xây dựng mô hình thực nghiệm mô hình hóa.
3.3.3 Tối ưu hóa quá trình tách chiết polyphenol từ bã trám đen bằng phương pháp bề mặt đáp ứng
Phương pháp bề mặt đáp ứng RSM (Response Surface Methodology) được lựa chọn để tối ưu hóa điều kiện trích ly polyphenol từ bã trám đen Sử dụng các yếu tố đã xác định được từ quá trình sàng lọc để đưa vào xây dựng mô hình hóa bằng phương pháp bề mặt đáp ứng với 3 yếu tố đã được xác định ở thí nghiệm trước: Nồng độ ethanol, tỷ lệ nguyên liệu/dung môi và nhiệt độ Với ngưỡng biến đổi của các yếu tố sử dụng trong thực nghiệm mô hình hóa được thể hiện trong bảng 3.4.
Bảng 3.5 Các yếu tố và ngưỡng biến đổi trong thực nghiệm mô hình hóa
Các yếu tố Mức dưới Mức trên Khoảng biến đổi
Sử dụng phần mềm Design Expert 12 và phương pháp bề mặt đáp ứng RSM(Response Surface Methodology) để xây dựng ma trận thực nghiệm mô hình hóa với các yếu tố và ngưỡng biến đổi được thể hiện trong bảng 3.4, ta thu được ma trận thực nghiệm mô hình hóa thể hiện trong bảng 3.5.
Bảng 3.6 Ma trận thực nghiệm mô hình hóa
Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu (v/w)
Tiến hành thực nghiệm theo ma trận thực nghiệm trong bảng 3.5, ta thu được dịch chiết thô của từng mẫu, đem dịch chiết đi phân tích để xác định hàm lượng polyphenol tổng số của từng mẫu Sử dụng phần mềm Design Expert 12, ta xác định được điều kiện tối ưu để tách chiết polyphenol.
Sau khi tìm được điều kiện tối ưu ( nồng độ ethanol, tỷ lệ nguyên liệu/dung môi và nhiệt độ), ta làm thêm 1 thực nghiệm ở điều kiện này để xác định tính chính xác của mô hình.
3.3.4 Xác định hàm lượng chất khô tổng số bằng phương pháp sấy khô đến khối lượng không đổi
Nguyên tắc: Xác định hàm lượng chất khô bằng phương pháp sấy đến khối lượng không đổi ở nhiệt độ 105 o C Tác dụng của nhiệt độ sấy sẽ làm bay hơi ẩm tự do và liên kết có trong mẫu Độ ẩm của mẫu được tính dựa vào khối lượng giảm đi của mẫu trong quá trình sấy (theo TCVN 10696:2015).
Cách tiến hành: Cân khối lượng bì (m0), cân 0,5g mẫu đã trừ bì cho vào cốc (m1) Sấy ở 105 o C trong 2 giờ 30 phút rồi đặt vào trong bình hút ẩm, cân khối lượng cốc – mẫu sau sấy Tiếp tục sấy mẫu ở nhiệt độ 105 o C trong vòng 1 giờ rồi lại đem cho vào bình hút ẩm và cân lại cho đến khi khối lượng mẫu không đổi (m2).
Hàm lượng chất khô được xác định theo công thức:
Trong đó: m0: Khối lượng mẫu trước sấy (g) m1: Khối lượng bì (g) m2: Khối lượng bì + mẫu sau sấy(g)
3.3.5 Xác định hàm lượng polyphenol tổng số bằng phương pháp Folin-Ciocalteu
Nguyên tắc: Các polyphenol trong dịch chiết sẽ được xác định bằng Folin- Ciocalteu Thuốc thử này chứa chất oxy hóa là acid phospho-vonframic, trong quá trình khử, các nhóm hydroxy phenol dễ bị oxy hóa, các chất oxy hóa này sinh ra màu xanh do có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 760 nm Phản ứng này là do sự hình thành màu xanh của vonfarm và molypden Hàm lượng polyphenol có trong mẫu tỷ lệ thuận với cường độ mẫu (Singleton & cs, 1965).
Chuẩn bị dung dịch Folin-Ciocalteu reagent: Pha loãng dung dịch 10 lần (chuẩn bị trong ngày, pha ngay trước khi phân tích).
Chuẩn bị dung dịch natri cacbonat (10%): Cân 7,5g Na2CO3 hòa tan hoàn toàn bằng nước cất rồi cho vào bình định mức 100ml rồi thêm nước cất đến vạch định mức. Cho 0,5ml dung dịch chiết đã pha loãng 50 lần vào ống nghiệm, thêm 2,5mlFolin 1N rồi đem đi vortex cho đồng nhất, đợi 5 phút rồi thêm 2ml Na2CO3 7,5% rồi tiếp tục đem đi vortex Đặt ống nghiệm trong tối ở phòng điều hòa 30 phút, đo độ hấp thụ quang ở bước sóng 760nm Gallic acid được chọn là chất chuẩn Mỗi dịch chiết được phân tích 2 lần Kết quả được biểu thị bằng miligam đương lượng gallic acid/g chất khô (mgGAE/gCK; GAE: viết tắt của gallic acid equivalent, CK: chất khô).
Trong đó: TPC: Hàm lượng polyphenol tổng số (mgGAE/gCK)
C: Nồng độ acid gallic xác định theo đường chuẩn (mg/ml)
V: Thể tích dịch trích ly được sử dụng (ml)
F: Hệ số pha loãng m: Khối lượng mẫu thí nghiệm (g)
CK: Độ ẩm của mẫu (%)
Hình 3.2 đường chuẩn galic acid 3.3.6 Xác định khả năng kháng oxy hóa bằng phương pháp DPPH
Nguyên tắc: Xác định hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết trám đen đông khô dựa trên sự khử DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) bơi một chất có khả năng nhường nguyên tử hydro Khi dung dịch DPPH được trộn với dung dịch của chất có khả năng nhường nguyên tử hydro thì độ hấp thụ của hỗn hợp giảm Nguyên nhân là do sự thay đổi màu sắc từ màu tía sang màu vàng nhạt khi gốc tự do bị “thu gom”) bởi các chất chống oxy hóa thông qua việc nhường nguyên tử hydro để tạo thành dạng DPPH-H bền (Zhu & cs., 2002).
