Thông tin tài liệu
BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ Hồ Thị Thƣơng NGHIÊN CỨU TẠO KHÁNG NGUYÊN S CỦA VIRUS GÂY BỆNH TIÊU CHẢY CẤP Ở LỢN (PEDV) TRÊN CÂY THUỐC LÁ NICOTIANA BENTHAMIANA CĨ TÍNH SINH MIỄN DỊCH ĐỊNH HƢỚNG TẠO VACXIN THẾ HỆ MỚI LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Hà Nội – 2023 iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii DANH MỤC VIẾT TẮT vii DANH MỤC BẢNG xi DANH MỤC HÌNH xii MỞ ĐẦU Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Bệnh tiêu chảy cấp lợn 1.1.1 Tình hình dịch bệnh PED giới 1.1.2 Tình hình dịch bệnh PED Việt Nam 1.2 Tác nhân gây bệnh PED 1.2.1 Phân loại PEDV 1.2.2 Đặc điểm hình thái PEDV 1.2.3 Đặc điểm cấu trúc hệ gen chức protein PEDV 1.2.4 Protein S PEDV 1.2.5 Dịch tễ học phân tử chủng PEDV giới 10 1.2.6 Dịch tễ học phân tử chủng PEDV Việt Nam 12 1.3 Vacxin phòng PEDV .14 1.3.1 Vacxin bất hoạt vacxin nhược độc 15 1.3.2 Vacxin tiểu đơn vị 18 1.3.3 Vacxin axit nucleic 20 1.3.4 Các vấn đề tồn phát triển vacxin phòng PEDV 21 1.4 Vacxin tiểu đơn vị có nguồn gốc từ thực vật 23 1.4.1 Hệ thống biểu tạm thời thực vật 23 1.4.2 Vacxin tiểu đơn vị có nguồn gốc từ thực vật phòng PEDV giới 24 1.4.3 Motif GCN4-pII motif IgM .26 1.4.4 Vacxin tiểu đơn vị có nguồn gốc từ thực vật phịng bệnh động vật Việt Nam 29 Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP .30 iv 2.1 Vật liệu 30 2.1.1 Chủng vi sinh vật, tế bào plasmid 30 2.1.2 Mồi 31 2.1.3 Nguồn vật liệu thực vật 32 2.1.4 Nguồn vật liệu động vật .32 2.1.5 Hóa chất 32 2.1.6 Thiết bị vật tư 34 2.2 Phƣơng pháp .35 2.2.1 Thu thập thơng tin, tách dịng, tối ưu mã biểu tổng hợp nhân tạo đoạn gen mã hóa protein S 36 2.2.2 Thiết kế vector biểu mang gen mã hóa kháng nguyên tái tổ hợp .37 2.2.3 Biểu kháng nguyên tái tổ hợp tạm thời thuốc N benthamiana .39 2.2.4 Phân tích mức độ biểu kháng nguyên tái tổ hợp SDS-PAGE Western blot .40 2.2.5 Tinh phân tích đặc điểm oligomer kháng nguyên tái tổ hợp 41 2.2.6 Nhân nuôi tinh PEDV từ tế bào nuôi cấy 43 2.2.7 Gây đáp ứng miễn dịch chuột 43 2.2.8 Phân tích đáp ứng sinh kháng thể IgG, IgA, IgM đặc hiệu PEDV huyết chuột ELISA 44 2.2.9 Phân tích đáp ứng sinh kháng thể IgG đặc hiệu PEDV huyết chuột Western blot 45 2.2.10 Phân tích khả kích thích sinh cytokine huyết chuột 45 2.2.11 Phân tích khả trung hịa PEDV huyết chuột 45 2.2.12 Gây đáp ứng miễn dịch lợn mẹ công cường độc lợn 46 2.2.13 Gây đáp ứng miễn dịch lợn với kháng nguyên COES1D/G2a-pII .46 2.2.14 Phân tích đáp ứng sinh kháng thể IgG IgA đặc hiệu PEDV huyết lợn ELISA .47 2.2.15 Phân tích đáp ứng sinh kháng thể IgG đặc hiệu PEDV huyết lợn Western blot 47 v 2.2.16 Phân tích khả kích thích sinh cytokine huyết lợn 48 2.2.17 Phân tích khả trung hòa PEDV huyết lợn .48 2.2.18 Phương pháp xử lý thống kê 48 Chƣơng KẾT QUẢ 49 3.1 Tạo đánh giá tính sinh miễn dịch kháng nguyên COE/G1apII tái tổ hợp từ chủng PEDV thuộc nhóm G1a 49 3.1.1 Thiết kế cấu trúc vector biểu mang gen mã hóa kháng nguyên COE/G1a-pII tạo chủng A tumefaciens mang vector tương ứng 49 3.1.2 Biểu kháng nguyên COE/G1a-pII tạm thời thuốc N benthamiana .51 3.1.3 Tinh phân tích đặc điểm oligomer kháng nguyên COE/G1a-pII 52 3.1.4 Đánh giá tính sinh miễn dịch kháng nguyên COE/G1a-pII tái tổ hợp chuột 54 3.2 Tạo đánh giá tính sinh miễn dịch kháng nguyên COE/G2apII tái tổ hợp từ chủng PEDV thuộc nhóm G2a gây bệnh Việt Nam 59 3.2.1 Thu thập thơng tin, lựa chọn tách dịng gen mã hóa protein S chủng PEDV gây bệnh Việt Nam 59 3.2.2 Thiết kế cấu trúc vector biểu mang gen mã hóa kháng nguyên COE/G2a-pII tạo chủng A tumefaciens mang vector tương ứng 60 3.2.3 Biểu kháng nguyên COE/G2a-pII tạm thời thuốc N benthamiana .62 3.2.4 Tinh phân tích đặc điểm oligomer kháng nguyên COE/G2a-pII 66 3.2.4.2 Tinh phân tích đặc điểm oligomer kháng nguyên COE/G2a-pII SEC phản ứng liên kết chéo .68 3.2.5 Đánh giá tính sinh miễn dịch kháng nguyên COE/G2a-pII lợn 69 3.3 Tạo đánh giá tính sinh miễn dịch kháng nguyên COES1D/G2a-pII, COE/G2a-pII-tp S2/G2a-pII tái tổ hợp từ chủng PEDV thuộc nhóm G2a gây bệnh Việt Nam .78 vi 3.3.1 Thiết kế cấu trúc vector biểu mang gen mã hóa kháng nguyên COE-S1D/G2a-pII, COE/G2a-pII-tp, S2/G2a-pII tạo chủng A tumefaciens mang vector tương ứng 78 3.3.2 Biểu kháng nguyên tái tổ hợp COE-S1D/G2a-pII, COE/G2a-pII-tp S2/G2a-pII tạm thời thuốc N benthamiana .83 3.3.3 Tinh phân tích đặc điểm oligomer kháng nguyên COE-S1D/G2a-pII, COE/G2a-pII-tp S2/G2a-pII tái tổ hợp 87 3.3.4 Đánh giá tính sinh miễn dịch kháng nguyên tái tổ hợp COE-S1D/G2a-pII, COE/G2a-pII-tp S2/G2a-pII chuột 93 3.3.5 Đánh giá tính sinh miễn dịch kháng nguyên COE-S1D/G2a-pII lợn .101 Chƣơng THẢO LUẬN 112 4.1 Mức độ biểu khả thu hồi kháng nguyên tái tổ hợp từ thuốc N benthamiana 112 4.2 Tính sinh miễn dịch kháng nguyên COE/G1a-pII chuột 115 4.3 Tính sinh miễn dịch kháng nguyên COE/G2a pII lợn nái khả bảo hộ lợn chống lại chủng PEDV G2a độc lực cao 116 4.4 So sánh tính sinh miễn dịch kháng nguyên tái tổ hợp COES1D/G2a-pII, COE/G2a-pII-tp S2/G2a-pII với kháng nguyên COE/G2a-pII chuột 119 4.5 So sánh tính sinh miễn dịch kháng nguyên COE-S1D/G2a-pII với kháng nguyên COE/G2a-pII lợn 122 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 126 DANH MỤC CÔNG TRÌNH CƠNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 128 TÀI LIỆU THAM KHẢO 129 vii DANH MỤC VIẾT TẮT Tên viết tắt aa A tumefaciens Tên nguyên gốc tiếng anh amino acid Agrobacterium tumefaciens Tên tiếng việt axit amin Agrobacterium tumefaciens Act1-I Rice actin gene - I Gen mã hóa actin lúa 1-I bp Base pair Cặp base Bis[sulfosuccinimidyl] Bis[sulfosuccinimidyl] suberate suberate CaMV Cauliflower mosaic virus Virus khảm súp lơ Co1 M cell-targeting ligand COE CO-26K equivalent CO-26K tương đương CTB Cholera toxin B subunit Tiểu đơn vị độc tố tả B DAB Diaminobenzidine Diaminobenzidine DCpep Dendritic cell peptide Tín hiệu tế bào tua DNA Deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic BS3 dNTP Deoxyribo nucleotide triphosphate Phối tử nhắm mục tiêu tế bào M Deoxyribo nucleotit triphotphat E coli Escherichia coli Escherichia coli E Elute Dịch chứa protein tinh Enzyme-linked Xét nghiệm hấp thụ miễn dịch immunosorbent assay liên kết với enzyme ELP Elastin-like polypeptide Polypeptit giống Elastin Fc Fragment crystallizable Mảnh kết tinh ELISA Dịch chảy qua cột sau đưa FT Flow through hỗn hợp dịch chiết thô trộn Nisepharose lên cột HA Hemagglutinin Hemagglutinin HR1 Heptad repeat region Vùng lặp lại Heptad
Ngày đăng: 26/09/2023, 06:25
Xem thêm:
