(Luận văn) thiết kế vector tet – on điều khiển tính trạng giới tính trên muỗi aedes aegypti

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM o0o NGUYỄN MINH THÀNH Tên đề tài: a lu n THIẾT KẾ VECTOR TET – ON ĐIỀU KHIỂN TÍNH TRẠNG va n GIỚI TÍNH TRÊN MUỖI AEDES AEGYPTI p ie gh tn to KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC d oa nl w a lu nv Hệ đào tạo : Chính quy Cơng nghệ sinh học f an Chuyên ngành: Khóa học : CNSH - CNTP : 2012 – 2016 oi lm ul Khoa at nh z z om l.c gm @ an Lu Thái Nguyên, năm 2016 n va ac th si ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM o0o NGUYỄN MINH THÀNH Tên đề tài: a lu n THIẾT KẾ VECTOR TET – ON ĐIỀU KHIỂN TÍNH TRẠNG va n GIỚI TÍNH TRÊN MUỖI AEDES AEGYPTI p ie gh tn to KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC : Chính quy Cơng nghệ sinh học Chun ngành: : K44 - CNSH Khoa : CNSH - CNTP Khóa học : 2012 – 2016 a lu Lớp nv d oa nl w Hệ đào tạo f an ul oi lm Giảng viên hƣớng dẫn:1 TS Nguyễn Văn Hạnh ThS Vi Đại Lâm at nh Viện CNSH – Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam z z Khoa CNSH – CNTP – Trƣờng ĐH Nông Lâm Thái Nguyên om l.c gm @ an Lu Thái Nguyên, năm 2016 n va ac th si i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, cố gắng nỗ lực thân, nhận nhiều quan tâm giúp đỡ nhiệt tình thầy cô giáo, bạn bè người thân Trước hết xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban giám hiệu Trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên, Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ Sinh học Cơng nghệ Thực phẩm, tập thể cán Phịng Cơng nghệ phôi – Viện Công nghệ Sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam a lu tồn thể thầy, giáo truyền đạt cho kiến thức, kĩ n quý báu suốt thời gian học tập rèn luyện trường Đại học n va Nông lâm Thái Nguyên tn to Tôi xin chân thành cảm ơn thầy TS Nguyễn Văn Hạnh – Phịng Cơng p ie gh nghệ phôi – Viện Công nghệ Sinh học, ThS Vi Đại Lâm Khoa Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm hướng dẫn trực tiếp đề tài, thầy tài d oa nl w tận tình bảo, giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho tơi hồn thành tốt đề nv a lu Tơi xin cảm ơn nghiên cứu sinh Đỗ Trung Kiên, anh, f an chị bạn sinh viên tham gia nghiên cứu – Phịng Cơng nghệ phôi – oi lm ul Viện Công nghệ Sinh học Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến bố mẹ, thầy cô, bạn bè z Tôi xin chân thành cảm ơn! at nh ủng hộ mặt vật chất tinh thần giúp tơi hồn thành tốt đề tài z Thái nguyên, tháng năm 2016 gm @ Sinh viên om l.c Nguyễn Minh Thành an Lu n va ac th si ii DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT ARN Acid ribonucleic – Một hại loại acid nucleic CTAB Cetyltrimethyl Amonium Bromide DNA Deoxyribonucleic Acid – Một loại nucleic acid DOX Doxycycline Double strand RNA – RNA sợi đôi dsRNA E.coli Escherichia coli LB Lauria Broth a lu Multiplex Ligation Dependent Probe Amplification n MLPA va (khuếch đại phụ thuộc mẫu dò) n Polymerase Chain Reaction: phản ứng chuỗi tổng hợp p ie gh tn to chuỗi polymer (Phản ứng khuếch đại DNA ống PCR nghiệm) Microlit ( µl = 10-3 ml) oa nl w µl PCMV IE Promoter encephalomyocarditis virus internal ribosome d entry site Posttranscriptional gene silencing ( làm bất hoạt gene sau nv phiên mã) f an Vector pTet – DualON oi lm ul TeT-on a lu PTGS Tetracycline -responsive RNAi RNA interference SiRNA Small interfeing RNA at nh TRE z z RNA) an Lu Ribonucleoprotein om l.c Internal ribosome entry site RNP RNA-induced silencing complex ( phức hợp làm câm lặng gm IRES2 @ RISC n va ac th si 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 iii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1:Danh mục thiết bị sử dụng đề tài 19 Bảng 3.2: Thành phần phản ứng cắt pJET1.2-1 24 Bảng 3.3: Thành phần phản ứng cắt PJET1.2-2 24 Bảng 3.4: Thành phần phản ứng nối 26 Bảng 3.5: Thành phần phản ứng cắt 27 Bảng 3.6: Thành phần phản ứng cắt 27 a lu Bảng 3.7: Thành phần phản ứng nối 28 n Bảng 3.8: Thành phần phản ứng PCR 29 n va Bảng 3.9: Thành phần phản ứng cắt 29 tn to Bảng 3.10: Thành phần phản ứng cắt 30 p ie gh Bảng 3.11: Thành phần phản ứng nối 31 d oa nl w f an nv a lu oi lm ul at nh z z om l.c gm @ an Lu n va ac th 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 si 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 iv DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 2.1: Cấu trúc vector Tet- On 10 Hình 2.2: Cơ chế hoạt động vector Tet-On 12 Hình 2.3: Cấu tạo vector pTRE-Tight-BI [7] 13 Hình 3.1: Cấu trúc vector pJET1.2 20 Hình 4.1: Hình ảnh vector pJET1.2-2 sau cắt enzyme HinIII Acc65I 32 a lu Hình 4.2: Hình ảnh vector pJET1.2-1 sau cắt enzyme HindIII n Acc65I 33 n va Hình 4.3: Hình ảnh đọc trình tự đoạn gene 34 tn to Hình 4.4: Kết so sánh với đoạn gene tra-2 34 p ie gh Hình 4.5: Hình ảnh vector pJET1.2-1 đoạn DNA trước nối T4 35 Hình 4.6: Hình ảnh đoạn DNA kẹp tóc Tra-2 RNAi cắt enzyme 2) oa nl w BamHI HinIII từ vector pJET1.2-1 – đoạn sau nối (Đường chạy 36 Hình 4.7: Hình ảnh đoạn DNA kẹp tóc Tra-2 RNAi cắt enzyme d nv a lu BamHI HinIII sau tinh (đường chạy 2) 37 f an Hình 4.8: Kết vector pTRE – Tight – BI tạo rỗng enzyme oi lm ul BamHI HindIII 38 Hình 4.9: Kết chèn đoạn DNA kẹp tóc Tra-2 RNAi vào pTRE – Tight – at nh BI cắt enzyme BamHI HinIII (đường chạy số 2) 39 z Hình 4.10: Kết cắt vector pTet – DualON enzyme NsiI XhoI z (Đường chạy số 2) 40 om l.c gm @ an Lu n va ac th 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 si 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 v MỤC LỤC Trang Phần 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu yêu cầu đề tài 1.2.1 Mục tiêu đề tài 1.2.2 Yêu cầu đề tài 1.3 Ý nghĩa đề tài a lu 1.3.1 Ý nghĩa khoa học n 1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn n va Phần 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU tn to 2.1 Cơ sở khoa học p ie gh 2.1.1 Muỗi biến đổi gene 2.1.2 Công nghệ RNAi oa nl w 2.1.3 Gene biểu tính trạng giới tính muỗi Aedes aegypti (Transformer-2 RNAi) d nv a lu 2.1.4 Vector Tet – On 10 f an 2.1.5 Vector pTRE-Tight-BI 13 oi lm ul 2.2 Tình hình nghiên cứu nước nước 15 2.2.1 Tình hình nghiên cứu giới 15 at nh 2.2.2 Tình hình nghiên cứu nước 16 z Phần 3: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 z 3.1 Đối tượng phạm vi nghiên cứu 17 @ gm 3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 17 om l.c 3.1.2 Phạm vi nghiên cứu 17 3.2 Địa điểm thời gian nghiên cứu 17 an Lu 3.2.1 Địa điểm nghiên cứu 17 n va ac th 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 si 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 vi 3.2.2 Thời gian tiến hành 17 3.3 Hóa chất, thiết bị vật liệu 17 3.3.1 Hóa chất 17 3.3.2 Thiết bị 19 3.3.3 Dụng cụ 19 3.3.4 Vật liệu 20 3.4 Nội dung nghiên cứu 20 3.5 Phương pháp nghiên cứu 21 a lu 3.5.1 Tạo đoạn DNA kẹp tóc Tra-2 RNAi quy định giới tính muỗi Aedes n aegypti 21 n va 3.5.2 Chuyển đoạn DNA kẹp tóc Tra-2 RNAi quy định tính trạng giới tính vào tn to vector pTRE – Tight – BI 26 p ie gh 3.5.3 Tạo vector Tet – On hoàn chỉnh 29 Phần 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 32 oa nl w 4.1 Kết tạo đoạn DNA kẹp tóc Tra-2 RNAi quy định giới tính muỗi Aedes aegypti 32 d nv a lu 4.1.1 Kết tạo đoạn DNA từ vector pJET1.2-2 32 f an 4.1.2 Kết tạo vector pJET1.2-1 rỗng 33 oi lm ul 4.2 Kết chuyển đoạn DNA kẹp tóc Tra-2 RNAi quy đinh tính trạng giới tính muỗi Aedes aegypti vào vector 35 at nh 4.2.1 Kết qủa cắt đoạn DNA kẹp tóc Tra-2 RNAi từ pJET1.2-1 sau nối z đoạn DNA 35 z 4.2.2 Kết vector pTRE – Tight – BI nhân với số lượng lớn, cắt @ gm enzyme nhằm tạo vector rỗng để nhận đoạn DNA kẹp tócTra-2 RNAi quy om l.c định tính trạng giới tính 37 4.2.3 Kết chèn đoạn DNA kẹp tóc quy định tính trạng giới tính muỗi an Lu Aedes aegypti vào vector pTRE – Tight - BI 38 n va ac th 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 si 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 vii 4.3 Kết tạo vector Tet – on hoàn chỉnh 40 4.3.1 Kết vector pTet – DualON nhân với số lượng lớn, cắt enzyme nhằm tạo vector rỗng để nhận đoạn lõi 40 Phần 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42 5.1 Kết luận 42 5.2 Kiến nghị 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO a lu n n va p ie gh tn to d oa nl w f an nv a lu oi lm ul at nh z z om l.c gm @ an Lu n va ac th 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 si 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 Phần MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Theo tổ chức y tế giới, ước tính hàng năm giới có khoảng 2,5 – tỷ người có nguy mắc bệnh muỗi truyền nhiễm sốt rét, sốt vàng da, sốt nhiệt đới (sốt dengue) Trong 50 – 100 triệu người mắc bệnh muỗi Aedes aegypti, khoảng 500.000 trường hợp mắc bệnh muỗi Aedes aegypti phải điều trị, 90% trẻ em 15 tuổi, tỉ lệ tử vong a lu muỗi Aedes aegypti 5% Bệnh lây lan 100 nước khu vực có khí hậu n nhiệt đới, cận nhiệt đới Châu Mỹ cao 42 nước, châu Phi 20 nước, khu n va vực Tây Thái Bình Dương 29 nước, Đơng Nam Á nước Địa Trung Hải tn to nước [1] p ie gh Việt Nam nước có bệnh dịch lưu hành Từ năm 1960 đến dịch có xu hướng lan rộng phát triển với số mắc bệnh oa nl w chết ngày tăng Bệnh chiếm tỉ lệ cao bệnh truyền nhiễm Việt Nam, nguyên nhân hàng đầu gây tử vong cho trẻ d nv a lu tình trạng tải cho bệnh viện mùa dịch [4], [5] Dịch bệnh không f an có chu kì rõ rệt, đợt dịch lớn hàng năm bệnh dịch xảy rải rác oi lm ul Để giải vấn đề nhiều hướng nghiên cứu thử nghiệm áp dụng Các nhà khoa học giới thành công việc tạo muỗi at nh biến đổi gene kĩ thuật DNA tái tổ hợp Những muỗi biến đổi gene z thả ngồi mơi trường giao phối với muỗi tạo hệ muỗi z bị khuyếm khuyết chết trước trưởng thành Các nhà khoa học Mỹ @ gm Đại học Rocckefeller nghiên cứu biến đổi gene muỗi, vơ hiệu hóa om l.c nhạy bén khứu giác chúng người, khiến chúng khơng có khả tìm kiếm mục tiêu để hút máu Nhóm nghiên cứu cho muỗi có quan an Lu thụ cảm khứu giác gọi orco, xem phận cần thiết để phối hợp với n va ac th 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 si 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 31 Sử dụng enzyme T4 ligase để nối vector pTRE – Tight – BI sau nối DNA kẹp tóc quy định tính trạng giới tính muỗi Aedes aegypti với pTet – DualON tạo rỗng trình nối để ống eppendofp ủ qua đêm 370C, thành phần phản ứng nối trình bày bảng 3.11 Bảng 3.11: Thành phần phản ứng nối Thành phần phản ứng Thể tích (µl) a lu n n va 2.0 µl Buffer ligase 2.0 µl Vector pTRE – Tight – BI + DNA kẹp tóc 4.0 µl pTet – DualON tạo rỗng 13.0 µl p ie gh tn to T4 ligase Tổng 20.0 µl oa nl w Sau q trình nối nhiệt độ phịng 10 phút, tiến hành đem bất hoạt 650 C 10 phút d Sau nối T4 ligase đoạn DNA kẹp tóc Tra-2 RNAi quy định tính a lu nv trạng giới tính chèn vào pTRE – Tight - BI vào vector pTRE – Tight f an – BI ta tiến hành biến nạp vào tế bào E.coli DH5α khả biến ul oi lm Tiến hành nhặt khuẩn lạc đơn đem nuôi sinh khối với 3ml môi trường LB lỏng có chứa kháng sinh ni lắc 370C qua đêm Sau q trình nh at ni ta tách DNA plasmid theo GenJET Plasmid Miniprep Kit hãng z Thermo Scientific khuẩn lạc nuôi sinh khối mơi trường lỏng LB có z om l.c 40C để sử dụng cho phần gm @ chứa kháng sinh để kiểm tra trình nối T4 Sản phẩm sau tách an Lu n va ac th 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 si 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 32 Phần KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết tạo đoạn DNA kẹp tóc Tra-2 RNAi quy định giới tính muỗi Aedes aegypti 4.1.1 Kết tạo đoạn DNA từ vector pJET1.2-2 Kết điện di sau tiến hành cắt vector PJET1.2-2 chứa đoạn DNA hai enzyme HindIII Acc65I, thể hình 4.1 M a lu n n va 3000bp p ie gh tn to 3000bp oa nl w 284bp 250bp d f an nv a lu oi lm ul nh at Hình 4.1: Hình ảnh vector pJET1.2-2 sau cắt enzyme HinIII Acc65I z z @ gm Đường chạy M: Thang chuẩn Gene RulerTM DNA 1kb Ladder; đường om l.c chạy số vector pJET1.2-2 cắt enzyme Acc65I HinIII Vector PJET1.2-2 cho hai band, band kích thước khoảng an Lu 3000bp band kích thước khoảng 284bp band hiển thị rõ nét băng vạch nhà sản xuất thiết kế Với kết chúng tơi cắt n va ac th 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 si 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 33 thành công vector PJET1.2-2 Chúng tiến hành thu nhận tinh đoạn DNA có kích thước khoảng 284bp kít kít QIAGEN Gel Extraction Kit để sử dụng cho nghiên cứu sau 4.1.2 Kết tạo vector pJET1.2-1 rỗng Kết hình ảnh điện di vector pJET1.2-1 rỗng cắt enzyme Acc65I HindIII hình 4.2 a lu n n va p ie gh tn to d oa nl w f an nv a lu oi lm ul Hình 4.2: Hình ảnh vector pJET1.2-1 sau cắt enzyme HindIII Acc65I nh Đường chạy M: Thang chuẩn Gene RulerTM DNA 1kb Ladder; đường at chạy số vector pJET1.2-1 cắt enzyme Acc65I HinIII z z gm @ Vector PJET1.2-1 sau cắt enzyme HindIII Acc65I cho hai band, band kích thước khoảng 3000bp band kích thước xuất thiết kế om l.c khoảng 284bp band hiển thị rõ nét băng vạch nhà sản an Lu n va ac th 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 si 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 34 Với kết chúng tơi cắt thành cơng vector PJET1.2-1 loại bỏ đoạn khoảng 284bp lấy đoạn band kích thước khoảng 3000bp chứa đoạn DNA Chúng tối tiến hành thu đoạn gene kích thước khoảng 3000bp chứa đoạn đoạn DNA kít kít QIAGEN Gel Extraction Kit để sử dụng cho nghiên cứu sau Kết đọc trình tự đoạn Sau có kết tinh đoạn DNA tiến hành đọc trình tự để kiểm tra so sánh với gene Tra-2 Kết hình 4.3 hình 4.4 a lu khơng có sai khác so với gene Tra-2: n n va p ie gh tn to oa nl w Hình 4.3: Hình ảnh đọc trình tự đoạn gene d f an nv a lu oi lm ul at nh z z om l.c gm @ an Lu Hình 4.4: Kết so sánh với đoạn gene tra-2 n va ac th 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 si 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 35 Sau trình nối T4 ligase vector PJET1.2-1 tạo rỗng đoạn DNA 2, sản phẩm nối biến nạp vào tế bào khả biến E.coli DH5α Hình ảnh vector PJET1.2-1 đoạn DNA trước nối T4 ligase thể hình 4.5 M a lu n 3000bp va 1000bp n tn to p ie gh 250bp 284bp oa nl w Hình 4.5: Hình ảnh vector pJET1.2-1 đoạn DNA trước nối T4 d a lu Đường chạy M: Thang chuẩn Gene RulerTM DNA 1kb Ladder; đường f an nv chạy số đoạn chèn 2; đường chạy số vector pJET1.2-1 tạo rỗng oi lm ul 4.2 Kết chuyển đoạn DNA kẹp tóc Tra-2 RNAi quy đinh tính trạng giới tính muỗi Aedes aegypti vào vector at nh 4.2.1 Kết qủa cắt đoạn DNA kẹp tóc Tra-2 RNAi từ pJET1.2-1 sau nối z đoạn DNA z Kết cắt DNA kẹp tóc Tra-2 RNAi từ pJET1.2-1 sau nối đoạn om l.c gm @ DNA thể hình 4.6 an Lu n va ac th 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 si 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 36 M 3000bp 3000bp 630bp a lu 250bp n Hình 4.6: Hình ảnh đoạn DNA kẹp tóc Tra-2 RNAi cắt va n enzyme BamHI HinIII từ vector pJET1.2-1 – đoạn sau tn to nối (Đường chạy 2) p ie gh Đường chạy M: Thang chuẩn Gene RulerTM DNA 1kb Ladder; đường BamHI oa nl w chạy số số sản phẩm cắt pJET1.2-1 với đoạn cắt HinIII d Với kết việc cắt enzyme BamHI HindIII cho nv a lu band DNA sáng, rõ nét với kích thước band khoảng 2370bp f an khoảng 630bp phù hợp với mục đích nghiên cứu, chúng tơi tiến hành oi lm ul thu band có kích thước band khoảng 630bp tách DNA kít QIAGEN Gel Extraction Kit để tách gel at nh Đoạn DNA kẹp tóc Tra-2 RNAi có kích thước khoảng 630bp cắt z enzyme BamHI HindIII sau tinh thể hai z om l.c gm @ đường chạy hình 4.7 an Lu n va ac th 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 si 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 37 M 1000bp 630bp 250bp a lu n n va p ie gh tn to Hình 4.7: Hình ảnh đoạn DNA kẹp tóc Tra-2 RNAi cắt enzyme BamHI HinIII sau tinh (đường chạy 2) Đường chạy M: Thang chuẩn Gene RulerTM DNA 1kb Ladder; đường oa nl w chạy số số sản phẩm cắt pJET1.2-1 với đoạn cắt HinIII BamHI sau tinh d 4.2.2 Kết vector pTRE – Tight – BI nhân với số lượng lớn, cắt a lu nv enzyme nhằm tạo vector rỗng để nhận đoạn DNA kẹp tócTra-2 RNAi f an quy định tính trạng giới tính ul oi lm Vector pTRE – Tight – BI sau nhân số lượng lớn vi khuẩn E.coli DH5α tạo rỗng để nhận đoạn DNA quy định tính nh at trạng giới tính enzyme BamHI HindIII Kết z z hình 4.8 om l.c gm @ an Lu n va ac th 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 si 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 38 M 3000bp 2800bp 1000bp a lu n n va tn to p ie gh Hình 4.8: Kết vector pTRE – Tight – BI tạo rỗng enzyme BamHI HindIII oa nl w Đường chạy M: Thang chuẩn Gene RulerTM DNA 1kb Ladder; đường chạy số vector pTRE – Tight – BI cắt HinIII BamHI d a lu Kết cho band kích thước khoảng 2800bp sáng, rõ nét với kết f an nv phù hợp với kích thước ban đầu biến nạp vào vi khuẩn ul E.coli DH5α Đoạn gene thu nhận tinh kít oi lm QIAGEN Gel Extraction Kit để tách DNA Để chuẩn bị nhận đoạn chèn DNA nh kẹp tóc Tra-2 RNAi quy định tính trạng giới tính muỗi Aedes aegypti at 4.2.3 Kết chèn đoạn DNA kẹp tóc quy định tính trạng giới tính z z muỗi Aedes aegypti vào vector pTRE – Tight - BI @ gm Plasmid pTRE – Tight – BI sau chèn đoạn DNA kẹp tóc Tra- om l.c RNAi quy định tính trạng giới tính cắt hai enzyme BamHI HinIII Bất hoạt enzyme để hạn chế biến tính, q trình nối thực an Lu cách thêm T4 ligase vào hỗn hợp Plasmid chuyển vào tế bào n va ac th 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 si 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 39 E.coli DH5α biến nạp vào vi khuẩn [9] Nuôi cấy phân lập lượng lớn DNA Kết chèn đoạn DNA kẹp tóc Tra-2 RNAi vào vector pTRE – Tight – BI thể hình 4.9 a lu 3000bp 2800bp n n va tn to 1000bp 630bp p ie gh oa nl w Hình 4.9: Kết chèn đoạn DNA kẹp tóc Tra-2 RNAi vào pTRE – Tight – d a lu BI cắt enzyme BamHI HinIII (đường chạy số 2) f an nv Đường chạy M: Thang chuẩn Gene RulerTM DNA 1kb Ladder; đường chạy số oi lm ul bỏ trống; đường chạy số sản phẩm cắt plasmid pTRE – Tight – BI nối với đoạn DNA kẹp tóc BamHI HindIII; đường chạy số sản nh phẩm pTRE – Tight – BI nối với DNA kẹp tóc Tra-2 RNAi khơng cắt at Kết điện di kiểm tra sản phẩm nối hình 4.2.3 cho thấy: Đường z z chạy số cho band sáng rõ nét, band kích thước khoảng 2800bp @ gm plasmid pTRE – Tight – BI band có kích thước khoảng 630bp kích om l.c thước đoạn chèn DNA kẹp tóc Tra-2 RNAi quy định tính trạng giới tính muỗi Aedes aegypti Với kết phù hợp với kích thước đem nối lúc an Lu đầu plasmid pTRE – Tight – BI đoạn chèn DNA kẹp tóc Tra-2 RNAi n va ac th 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 si 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 40 4.3 Kết tạo vector Tet – on hoàn chỉnh 4.3.1 Kết vector pTet – DualON nhân với số lượng lớn, cắt enzyme nhằm tạo vector rỗng để nhận đoạn lõi Vector pTet – DualON nhân lên với số lượng phương pháp biến nạp sốc nhiệt vi khuẩn E.coli DH5α tách plasmid hóa chất để thu DNA Vector tạo rỗng để nhận vector pTRE- Tight – BI sau chèn đoạn DNA kẹp tóc Tra-2 RNAi quy định tính trạng giới tính muỗi Aedes aegpti enzyme NsiI XhoI Kết a lu hình 4.10 n va n M p ie gh tn to 4906bp d oa nl w 3000bp f an nv a lu 1000b p oi lm ul at nh z Hình 4.10: Kết cắt vector pTet – DualON enzyme NsiI XhoI (Đường chạy số 2) z gm @ Đường chạy M: Thang chuẩn Gene RulerTM DNA 1kb Ladder; đường om l.c chạy số 1- 2: Vector pTet – DualON cắt enzyme NsiI XhoI an Lu n va ac th 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 si 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 41 Kết hình 4.3.1 cho band vạch rõ nét kích thước khoảng 4906bp điểm cắt NsiI XhoI thiết kế điểm cắt vector pTet – DualON nhằm mục đích tạo vector pTet – DualON rỗng để nối với plasmid pTRE – Tight – BI sau nối thành công đoạn DNA kẹp tóc quy định tính trạng giới tính muỗi Aedes aegypti đầu nối NsiI XhoI nên vector pTet – DualON sau cắt enzyme NsiI XhoI khơng bị thay đổi kích thước Kết tạo thành công vector pTet – DualON rỗng chuẩn bị để nối a lu với plasmid pTRE – Tight – BI sau nối với đoạn DNA kẹp tóc n n va p ie gh tn to d oa nl w f an nv a lu oi lm ul at nh z z om l.c gm @ an Lu n va ac th 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 si 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 42 Phần KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Từ kết nghiên cứu đưa kết luận sau: Đã tạo đoạn DNA kẹp tóc Tra-2 RNAi kiểm sốt gene quy định tính trạng giới tính muỗi Aedes aegypti từ vector PJET1.2-1 a lu vector PJET1.2-2 có kích thước 630bp phương pháp tổng hợp gene n cắt nối va n Đã nối thành công đoạn DNA kẹp tóc quy định tính trạng giới tính tn to có kích thước 630bp với plasmid pTRE – Tight – BI có kích thước 2812bp p ie gh Đã tạo vector pTet – DualON rỗng enzyme XhoI NsiI với kích thước 4906bp để chuẩn bị nhận vector pTRE – Tight – BI sau oa nl w nối thành công với đoạn DNA kẹp tóc Tra-2 RNAi quy định tính trạng giới tính muỗi Aedes aegypti d nv a lu 5.2 Kiến nghị f an Tiếp tục hoàn thiện nội dung chèn plasmid pTRE – Tight – BI sau oi lm ul nối đoạn DNA kẹp tóc Tra-2 RNAi quy định tính trạng giới tính muỗi Aedes aegypti vào vector pTet – DualON tạo rỗng at nh z z om l.c gm @ an Lu n va ac th 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 si 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 TÀI LIỆU THAM KHẢO I Tài liệu tiếng việt Bộ Y tế, (2006), “Giám sát, chuẩn đoán điều trị bệnh sốt dengue/ sốt xuất huyết dengue”, Nhà xuất Y học Hà Nội Đỗ Năng Vịnh, (2007), “Công nghệ can thiệp RNA (RNAi) gây bất hoạt gene tiềm ứng dụng to lớn”, Tạp chí sinh học 5(3): 265-275 Đỗ Thị Mỹ Hương, (2009), “Nghiên cứu số đặc điểm sinh thái muỗi Aedes aegypti mối liên quan đến sốt Dengue/ Sốt xuất huyết a lu Dengue tỉnh Đắc Lắc”, 2004-2008 n Hoàng Anh Vường, Nguyễn Ái Phương, (1993), “ Đặc điểm dịch tễ học va n Dengue xuất huyết Tây Nguyên, từ 1983-1993”, Kỷ yếu cơng trình p ie gh tn to nghiên cứu khoa học 1993, Hội nghị khoa học Y – dược Viện trường Tây Nguyên – Khánh Hòa, trang 338-345 Hoàng Anh Vường, Vũ Thị Hồng Gấm, (1998), “ Đặc điểm dịch tễ học oa nl w SD/SXHD Đắc Lắc, năm 1995-1997”, Tập san vệ sinh phòng dịch Tây Nguyên, (9), tr.16-17 d nv a lu II Tài liệu Tiếng Anh f an Andrew Z Fire, Craig C Mello, (2006), “For their discovery of RNA oi lm ul interference – gene silencing by double – stranded RNA”, The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2006 at nh Clontech Laboratories, Inc.A Takara Bio Company1290 Terra Bella z Ave.Mountain View, CA 94043Technical Support (US) z @ Cleo Goyvaerts, Therese Liechtenstein, Christopher Bricogne, David gm Escors and Karine Breckpot, (2013), “Targeted Lentiviral Vector: Current om l.c Applications and Future Potential), DOI: 10.5772/52770 Duong Thanh Hoang, Hanoi City (VN); Kim Phuc Hoang, Oxford(GB), an Lu (2014), “Culicinae mosquito tra-2 RNA interference technique to n va ac th 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 si 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 gentically produce maleness population” , Pub No.: US 2014/0331342 A1, Pub Date: NOV 6, 2014 10 Fortier E, Belote JM, (2000), “Temperature-dependent gene silencing by an expressed inverted repeat in Genesis Drosophila”, 2000 Apr;26(4):240-4 11 Fire A, Xu S, Montgomery MK, Kostas SA, Driver SE, Mello CC, (1998), “Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans”, Nature 1998 Feb 19; 391(6696):806-11 a lu 12 Gareth J Lycett, Fotis C Kafatos and Thanasis G Loukeris, (2014), n “Conditional expression in the malaria mosquito Anopheles stephensi va n with Tet-On and Tet-Off systems”, 10.1543/genetis.104.028175 tn to 13 Guoliang Fu, Lees RS, NImmo D, Aw D, Jin L, Gray P, Berendonk TU, p ie gh White-Cooper H, Scaife S, Kim Phuc H, Marinotti O, Jasinskiene N, James AA, Alphey L, (2010), “Female- specific flightless phenotype for oa nl w mosquito control”, doi: 10.1073/pnas.1000251107 Epub 2010 Feb 22 14 Hammond SM, Caudy AA, Hannon GJ, (2001), “Post – transcriptional d nv a lu gene silencing by double – stranded RNA”, PMID: 11253050 f an 15 Hubert Amrein, Tom Maniatis and Rolf Nothiger, (1990), “Alternatively oi lm ul spliced transcripts of the sex-determining gene tra-2 of Drosophila encode functional proteins of different size”, The EMBO Journal vol.9 no 1 at nh pp.361 – 3629 z 16 Matthew Degennaro, Carolyn S McBride, Laura Seeholzer, Takao z @ Nakagawa, Emily J Dennis, Chloe Goldman, Nijole Jasinskiene, Anthony A gm James & Leslie B Vosshall, (2013), “Orco mutant mosquitoes lose strong om l.c Preference for humans and are not repelled by volatile DEEF”, 498(7455):487-91 Doi: 10.1038/nature12206 Epub 2013 May 29 an Lu n va ac th 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 si 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99