(Luận văn) nghiên cứu thiết kế vector tet– off điều khiển tính trạng giới tính trên muỗi aedes aegypti

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM a lu NGUYỄN ĐÌNH DUY KHANH n Tên đề tài: n va “NGHIÊN CỨU THIẾT KẾ VECTOR TET-OFF MANG GENE ĐIỀU p ie gh tn to KHIỂN TÍNH TRẠNG GIỚI TÍNH TRÊN MUỖI AEDES AEGYPT” d oa nl w KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC a nv a lu ll u nf Hệ đào tạo : CNSH-CNTP tz : 2011-2016 z Khóa học : Cơng nghệ sinh học n oi Khoa m Chuyên ngành : Chính quy m co l gm @ an Lu Thái Nguyên, năm 2016 n va ac th si ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM a lu NGUYỄN ĐÌNH DUY KHANH n Tên đề tài: va n “NGHIÊN CỨU THIẾT KẾ VECTOR TET-OFF MANG GENE ĐIỀU p ie gh tn to KHIỂN TÍNH TRẠNG GIỚI TÍNH TRÊN MUỖI AEDES AEGYPT” KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ sinh học d oa nl w Hệ đào tạo a lu Lớp a nv Khoa : K44 CNSH : CNSH-CNTP u nf ll Khóa học m n oi Giảng viên hƣớng dẫn: : 2011-2016 tz TS Nguyễn Văn Hạnh Phịng Cơng nghệ phơi – Viện Công nghệ Sinh học – z gm @ Viện Hàm lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam ThS Vi Đại Lâm l m ĐH Nông Lâm Thái Nguyên co Khoa Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm, an Lu n va Thái Nguyên, năm 2016 ac th si i LỜI CẢM ƠN Trong trình học tập nghiên cứu để hồn thành khóa luận tốt nghiệp với nỗ lực cá nhân, nhận hướng dẫn, giúp đỡ, bảo động viên thầy cô, bạn bè gia đình Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới Thầy giáo: TS Nguyễn Văn Hạnh, Th.S Vi Đại Lâm, Th.S Đỗ Trung Kiên Th.S Lê Bắc Việt, người trực tiếp giúp đỡ hướng dẫn suốt thời gian thực đề tài q trình hồn chỉnh luận văn tốt nghiệp a lu Tôi xin chân thành cảm ơn Thầy cô khoa Công nghệ Sinh học n Tôi xin chân thành cảm ơn cán bộ, anh chị làm việc phịng Cơng n va Công nghệ Thực phẩm dạy dỗ giúp đỡ suốt thời gian qua tn to nghệ phôi - Viện Công nghệ Sinh học – Viện Hàm lâm Khoa học Công nghệ p ie gh Việt Nam giúp đỡ, tạo điều kiện để học tập nghiên cứu Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, người thân bạn oa nl w bè động viên, chia sẻ giúp đỡ tơi vượt qua khó khăn q trình học tập, nghiên cứu hồn thành luận văn d a nv a lu Xin chân thành cảm ơn! u nf Thái Nguyên,20 tháng 05 năm 2016 ll Sinh viên m tz n oi Nguyễn Đình Duy Khanh z m co l gm @ an Lu n va ac th si ii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1: Danh mục thiết bị sử dụng đề tài 15 Bảng 3.2: Tỉ lệ thành phần PCR tạo đoạn gene P1-2 18 Bảng 3.3: Chu trình nhiệt PCR sử dụng mồi P1 P2 tạo đoạn gene P1-2 18 Bảng 3.4: Tỉ lệ thành phần PCR tạo đoạn gene P5-6 20 Bảng 3.5:Chu trình nhiệt PCR sử dụng mồi P5 P6 để tạo đoạn gene P5-6 21 Bảng 3.6: Tỉ lệ thành phần phản ứng cắt sản phẩm tinh PCR đoạn gene P1-2 P5-6 21 a lu Bảng 3.7: Tỉ lệ thành phần PCR tạo đoạn gene P1-6 22 n n va Bảng 3.8: Chu trình nhiệt PCR sử dụng mồi P1 P6 để tạo đoạn P1-6 23 tn to Bảng 3.9: Tỉ lệ thành phần PCR tạo đoạn gene P3-4 23 Bảng 3.10: Chu trình nhiệt PCR sử dụng mồi P3 P4 để tạo đoạn P3-4 24 p ie gh Bảng 3.11: Tỉ lệ thành phần phản ứng cắt sản phẩm tinh PCR đoạn gene P1-6 P3-4 24 oa nl w Bảng 3.12: Tỉ lệ thành phần phản ứng cắt vector pTet-Dual OFF hai enzyme BamHI HindIII 25 d a lu Bảng 3.13: Tỉ lệ thành phần phản ứng cắt P16-34 pTRE-Tight-BI hai a nv enzyme BamHI HindIII 26 u nf Bảng 3.14: Tỉ lệ thành phần PCR tạo đầu nối cho pTRE-Tight-BI-P16-34 27 ll Bảng 3.15: Chu trình nhiệt PCR tạo đầu nối cho pTRE-Tight-BI-P16-34 27 m n oi Bảng 3.16: Tỉ lệ thành phần phản ứng cắt DNA plasmid pTet-Dual OFF sản tz phẩm PCR pTRE-Tight-BI hai enzyme PspXI XhoI 28 Bảng 3.17: Tỉ lệ thành phần PCR khuẩn lạc E.coli biến nạp 30 z m co l gm @ Bảng 3.18: Tỉ lệ thành phần phản ứng nối sau cắt enzyme cắt 32 an Lu n va ac th si 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 iii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 2.1: Cấu trúc vector pTet-Dual-OFF (Catalog No 631113) Hình 2.2: Cơ chế hoạt động pTet-Dual-OFF Hình 2.3: Cấu tạo vector pTRE-Tight-BI (Catalog No 631068) Hình 4.1: Kết điện di kiểm tra sản phẩm tách chiết tinh DN muỗi Aedes aegypti 33 Hình 4.2a: Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR đoạn gene P1-2 34 Hình 4.2b: Kết điện di kiểm tra sản phẩm tinh sau PCR đoạn gene P1-234 a lu Hình 4.3a: Kết giải trình tự đoạn gene P1-2 35 n n va Hình 4.3b: Kết so sánh giải trình tự đoạn gene P1-2 với đoạn gene Tra-2 RNAi35 tn to Hình 4.4a: Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR đoạn gene P3-4 36 Hình 4.4b: Kết tinh sản phẩm PCR đoạn gene P3-4 36 p ie gh Hình 4.5a: Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR đoạn gene P5-6 37 Hình 4.5b: Kết điện di kiểm tra sản phẩm tinh sau PCR đoạn gene oa nl w P5-6 37 Hình 4.6a: Kết điện di sản phẩm cắt P1-2 P5-6 enzyme SalI 38 d a lu Hình 4.6b: Kết điện di sản phẩm tinh P1-2 P5-6 sau cắt a nv enzyme SalI 38 u nf Hình 4.7: Kết điện di sản phẩm cắt P3-4 P5-6 Acc65I 39 ll Hình 4.8a: Kết điện di sản phẩm nối đoạn P1-2 P5-6 40 m n oi Hình 4.8b: Kết điện di sản phẩm nối đoạn P3-4 P5-6 40 tz Hình 4.9a: Kết điện di sản phẩm cắt pJET P1-6 enzyme HindIII Acc65I41 Hình 4.9b: Kết điện di sản phẩm cắt pJET P3-4 enzyme HindIII z gm @ Acc65I 41 Hình 4.10a: Kết tinh sản phẩm cắt vector pJET P1-6 pJET P3-4 l co enzyme HindIII Acc65I 42 m Hình ảnh 4.10b: Kết tinh sach DNA plasmid pJET P16-34 sau biến nạp 42 an Lu n va ac th 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 si 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 iv Hình 4.10c: Kết điện di sản phẩm pJET P16-34 sau cắt enzyme HindIII BamHI 43 Hình 4.10d: Kết tinh đoạn P16-34 (Tra-2 RNAi) sau cắt HindIII BamHI từ DNA plasmid pJET P16-34 43 Hình 4.11a: Kết kiểm tra sản phẩm cắt vector pTRE-Tight-BI pJET p1634 enzyme BamHI HindIII 44 Hình 4.11b: Kết tinh sản phẩm cắt vector pTRE-Tight-BI P16-34 enzyme BamHI HindIII 44 Hình 4.12a: Kết biến nạp vector pTRE-Tight-BI P16-34 tạo vector pTRE- a lu Tight-BI-P16-34 vào tế bào khả biến E.coli DH5α 45 n n va Hình 4.12b: Kết PCR kiểm tra khuẩn lạc biến nạp tạo vector pTRE-Tight- tn to BI-P16-34 45 Hình 4.13: Kết điện di kiểm tra sản phẩm tinh DNA plasmid pTRE-Tight- p ie gh BI-P16-34 sản phẩm cắt DNA plasmid pTRE-Tight-BI-P16-34 enzyme BamHI HindIII để kiểm tra đoạn chèn P16-34 46 oa nl w Hình 4.14a: Khuẩn lạc E.coli mang vector pTet-Dual OFF 47 Hình 4.14b: Kết điện di tinh DNA plasmid pTet-Dual OFF 47 d a lu Hình 4.15: Kết điện di kiểm tra sản phẩm cắt vector pTet-Dual OFF a nv BamHI XhoI 47 ll u nf m tz n oi z m co l gm @ an Lu n va ac th 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 si 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 v DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT n n va Bp Base pair – Cặp bazơ nitơ cDNA Complementary Deoxyribonucleic Acid DNA Deoxyribonucleic Acid Dox Doxycyline E.coli Escherichia coli Kb Kilo base – Kilo bazơ nitơ LB Lauria Broth miRNA Micro Ribonucleic Acid mRNA Messenger Ribonucleic Acid– RNA thông tin MSC I Multiple cloning site I MSC II Multiple cloning site II PCR Polymerase chain reaction – phản ứng chuỗi trùng hợp tn to Kháng kháng sinh Ampicillin p ie gh a lu Ampr RNA Release of Insects carrying a Dominant Lethal oa nl w RIDL Ribonucleic Acid d Interference Ribonucleic Acid– RNA can thiệp SIRM Sterile Insect Release Method SiRNA Smal interfering Riboncleic Acid SIT Sterile Insect Techmique – Kĩ thuật vô trùng côn trùng TAE Tris-acetate-EDTA Tet Tetracyline Tet-OFF pTet-Dual OFF tTA Tetracycline-repressible transactivato a nv a lu RNAi ll u nf m tz n oi z gm @ Tra-2 RNAi Transformer-2 Interference Ribonucleic Acid 5-bromo-4-chloro-3indoly-β-D-galactoside m co l X-gal an Lu n va ac th 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 si 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 vi MỤC LỤC PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề: 1.2 Mục tiêu nghiên cứu: 1.3 Mục đích nghiên cứu: 1.4 Ý nghĩa khoa học thực tiến đề tài: 1.4.1 Ý nghĩa khoa học 1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn a lu PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU n 2.1 Cơ sở khoa học n va 2.1.1 Bối cảnh thực ý tưởng đề tài tn to 2.1.2 Genee biểu tính trạng giới tính muỗi Aedes aegypti ( p ie gh Transformer-2 RNAi) 2.1.3 Vector Tet-OFF (pTet-Dual OFF) oa nl w 2.1.4 Vector pTRE-Tight-BI 2.2 Tình hình nghiên cứu ngồi nước 11 d a lu 2.2.1 Tình hình nghiên cứu giới 11 a nv 2.2.2 Tình hình nghiên cứu nước 12 u nf PHẦN 3: ĐỐI TƢỢNG, VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP ll m NGHIÊN CỨU 13 n oi 3.1 Đối tượng phạm vi nghiên cứu 13 tz 3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 13 z @ 3.1.2 Phạm vi nghiên cứu 13 l gm 3.2 Vật liệu nghiên cứu 13 3.2.1 Hóa chất 13 co m 3.2.2 Thiết bị 15 Lu an 3.2.3 Vật liệu 15 n va ac th 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 si 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 vii 3.3 Địa điểm thời gian tiến hành nghiên cứu 16 3.4 Nội dung nghiên cứu 16 3.5 Phương pháp nghiên cứu 16 3.5.1 Tách chiết tinh DNA muỗi Aedes aegypti 16 3.5.2 PCR phân lập đoạn gene quy định tính trạng giới tính muỗi Aedes aegypti 17 3.5.3 Thiết kế vector pTet-Dual-OFF mang gene quy định tính trạng giới tính muỗi Aedes aegypti (Tra-2 RNAi kẹp tóc) 25 a lu 3.5.4 Phương pháp biến nạp vào tế bào E.coli khả biến để chọn dịng, ni n sinh khối tách DNA plasmid 28 n va 3.5.5 Phương pháp nối Kit Ligation (M0202) 32 tn to PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33 p ie gh 4.1 Kết tách chiết tinh DNA muỗi Aedes aegypti 33 4.2 Kết PCR phân lập đoạn gene quy định tính trạng giới tính muỗi oa nl w Aedes aegypti 33 4.3 Kết thiết kế vector pTET-Dual-OFF, lai ghép chèn đoạn DNA quy d a nv a lu định tính trạng giới tính muỗi Aedes aegypti vào vector 43 PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 48 u nf 5.1 Kết luận 48 ll m 5.2 Kiến nghị 48 n oi tz TÀI LIỆU THAM KHẢO 55 I Tài liệu Tiếng Việt 49 z gm @ II Tài liệu Tiếng Anh 50 III Tài liệu Internet 50 m co l an Lu n va ac th 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 si 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề: Trên giới, theo Tổ chức Y tế giới (WHO), ước tình năm có khoảng 2,5 – tỷ người có nguy mắc bệnh muỗi truyền nhiễm sốt rét, sốt vàng da, sốt nhiệt đới (sốt dengue), đặc biệt cuối năm 2015 đầu 2016 đến suất bệnh virus Zika Trong 50- 100 triệu người mắc bệnh muỗi Aedes aegypti, khoảng 500.000 trường hợp mắc bệnh muỗi Aedes aegypti phải điều trị, 90% trẻ em 15 tuổi, tỉ lệ tử vong muỗi Aedes aegypti 5% a lu Bệnh lưu hành nhiều vùng Đông Nam Á Thái Bình Dương 100 nước n thuộc khu vực khí hậu nhiệt đới, cận nhiệt đới [8], [1] va n Hiện Việt Nam nước có bệnh dịch lưu hành, bệnh tn to chiếm tỉ lệ cao bệnh truyền nhiễm Việt Nam, p ie gh nguyên nhân hàng đầu gây tử vong cho trẻ tình trạng tải cho bệnh viện mùa dịch Từ năm 1960 đến dịch có xu hướng lan rộng phát triển Ở oa nl w Tây Nguyên năm có dịch lớn 1983, 1987,1988, 1991, 1995 2004 với số mắc từ 54,80 đến 553,38/100.000 dân số chết từ 0,08 – 1,34/100.000 dân [6], [4], [5],[3] Năm 2008, tỉnh phía Nam, 78.414 trường hợp mắc, 85 trường hợp chết, d a lu tỉnh Cà Mau có số bệnh nhân 8.284, tử vong trường hợp [20] Năm 2009 a nv nước có số bệnh nhân chết 105.370/87 [21] Để giải vấn đề trên, nhiều u nf hướng nghiên cứu thử nghiệm áp dụng Các nhà khoa học giới ll thành công việc tạo muỗi biến đổi gene kĩ thuật DNA tái tổ hợp m n oi Những muỗi đực biến đổi gene thả ngồi mơi trường giao phối tz với muỗi tự nhiên tạo hệ muỗi bị khiếm khuyết chết trước trưởng thành [19], [20] Các nhà khoa học Mỹ Đại học Rocckefeller nghiên z cứu tạo muỗi biến đổi gene không phát mùi người, hạn chế trình gm @ lây truyền bệnh tật qua loài trung gian [19] l Ở Việt Nam nay, ứng dụng công nghệ DNA tái tổ hợp khơng cịn m co vấn mẻ, có nhiều cơng trình nghiên cứu áp dụng Cơng nghệ Sinh Lu học để tạo sinh vật biến đổi gene nhằm tạo sản phẩm ứng dụng vào thực an tiễn Xuất phát từ tính cấp thiết bệnh nguy hiểm lây truyền qua muỗi n va ac th 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 si 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 36 Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR, sản phẩm tinh sau PCR đoạn gene P3-4 hình 4.4a hình 4.4b : a lu n n va p ie gh tn to Hình 4.4b: Kết tinh sản phẩm PCR đoạn gene P3-4 phẩm PCR đoạn gene P3-4 Đường chạy M: DNA ladder Đường chạy M: DNA ladder oa nl w Hình 4.4a: Kết điện di kiểm tra sản d Đường chạy 1: P3-4 tinh a nv a lu Đường chạy 1:PCR đoạn gene P3-4 u nf ll Tại nhiệt độ gắn mồi 650C, đoạn gene P3-4 tạo với kích m n oi thước theo lý thuyết khoảng 240bp Sản phẩm PCR giải trình tự để kiểm tz tra giống đoạn P1-2 Kết kiểm tra giải trình tự đoạn gene P3-4 với trình tự cần phân lập từ đoạn gene Tra-2 RNAi z m co l gm @ an Lu n va ac th 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 si 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 37 Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR, sản phẩm tinh sau PCR đoạn gene P5-6 hình 4.5a hình 4.5b a lu n n va p ie gh tn to Hình 4.5a: Kết điện di kiểm tra sản sản phẩm tinh sau PCR oa nl w phẩm PCR đoạn gene P5-6 đoạn gene P5-6 d Đường chạy M: DNA ladder a lu Đường chạy M: DNA ladder Đường chạy 1: P5-6 a nv Đường chạy 6: P5-6 Hình 4.5b: Kết điện di kiểm tra ll u nf m Sau điện di sản phẩm PCR tinh sản phẩm PCR, đoạn gene n oi P5-6 tạo với kích thước theo lý thuyết khoảng 150bp nhiệt độ tz gắn mồi 550 C Cũng giống đoạn gene P1-2 P3-4, đoạn gene z giải trình tự để so sánh với trình tự lý thuyết Kết giải trình tự với m co l gm @ trình tự đoạn gene Tra-2 RNAi an Lu n va ac th 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 si 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 38 Kết điện di sản phẩm cắt, tinh sản phẩm cắt đoạn gene P1-2 P5-6 sau cắt enzyme SalI hình 4.6a hình 4.6b: a lu n n va p ie gh tn to oa nl w Hình 4.6a: Kết điện di sản phẩm cắt P1-2 P5-6 enzyme SalI Hình 4.6b: Kết điện di sản phẩm tinh P1-2 P5-6 sau cắt enzyme SalI d Đường chạy M: DNA ladder Đường chạy 1và 2: Sản phẩm cắt P1-2 Đường chạy 1: P5-6 tinh Đường chạy 4: Sản phẩm cắt P5-6 Đường chạy 2: P1-2 tinh a nv a lu Đường chạy M: DNA ladder ll u nf m n oi Sử dụng enzyme SalI để cắt hai đoạn gene P1-2 P5-6, mục đích tạo đầu tz nối gắn kết P1-2 P5-6 Kết theo lý thuyết tạo band vạch kèm theo mẩu DNA ngắn kích thước khơng đáng kể Theo hình ảnh điện di, cho z l gm @ thấy cắt tinh sản phẩm cắt hai đoạn gene P1-2 P5-6 Kết điện di sản phẩm cắt tinh sản phẩm cắt hai đoạn gene m co P3-4 P5-6 enzyme Acc65I, hình 4.7: an Lu n va ac th 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 si 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 39 a lu n n va p ie gh tn to Hình 4.7: Kết điện di sản phẩm cắt P3-4 P5-6 Acc65I oa nl w Đường chạy M: DNA ladder Đường chạy 2: sản phẩm cắt P3-4 d a nv a lu Đường chạy 4: sản phẩm cắt P5-6 ll u nf Sử dụng enzyme Acc65I để cắt hai đoạn gene P3-4 P5-6, mục đích tạo m đầu nối gắn kết P3-4 P5-6 Kết theo lý thuyết tạo band vạch n oi kèm theo mẩu DNA ngắn kích thước khơng đáng kể Theo hình ảnh điện di, tz cho thấy cắt tinh sản phẩm cắt hai đoạn gene P3-4 P5-6 z m co l gm @ an Lu n va ac th 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 si 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 40 Kết điện di sản phẩm nối đoạn gene P1-2 với P5-6 P3-4 với P5-6 T4 ligase hình 4.8a hình 4.8b: a lu n n va p ie gh tn to Hình 4.8b: Kết điện di sản phẩm nối đoạn P1-2 P5-6 nối đoạn P3-4 P5-6 oa nl w Hình 4.8a: Kết điện di sản phẩm Đường chạy M: DNA ladder Đường chạy 1,2 3: Sản phẩm nối Đường chạy 1: Sản phầm nối P3-4 với d Đường chạy M: DNA ladder a lu P1-2 với P5-6 P5-6 a nv u nf Sau tiến hành cắt đoạn P1-2 với P5-6 enzyme SalI, hai sản ll phẩm nối lại với T4 ligase Theo lý thuyết sản phẩm điện di m n oi cho ba band vạch với kích thước tương ứng là: 150bp, 240bp, 390bp Band vạch tz quan tâm band P1-6 tạo có kích thước khoảng 390bp Kết thực tế sau điện di kiểm tra sản phẩm nối cho hai band vạch kích thước 150bp 240bp z @ Q trình nối tạo đoạn gene P1-6 khơng thành cơng (hình 4.8a) Thay đổi quy trình l gm tạo đoạn gene Tra-2 RNAi, tiến hành nối đoạn P3-4 với P5-6 trước để tạo đoạn P3456 nối lại P1-2 để tạo đoạn P16-34 hoàn chỉnh (Tra-2 RNAi) Kết nối P3-4 co m với P6 cho hai band vạch kích thước 150bp 240bp Quá trình nối tạo đoạn an Lu P34-56 khơng thành cơng (hình 4.8b) n va ac th 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 si 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 41 Do không sử dụng phương pháp nối trực tiếp để nối đoạn P1-2, P3-4, P5-6 tạo đoạn gene Tra-2 RNAi quy định tính trạng giới tính Chúng tơi chuyển sang phương pháp khác tổng hợp gene cắt nối thông qua vector Đoạn gene P12-56 (P1-6) đoạn gene P3-4 đặt sẵn đưa vào vector pJET 1.2 tạo thành vector pJET P1-6 pJET P3-4 Sau đó, vector pJET P1-6 vector pJET P3-4 cắt hai enzyme HindIII Acc65I Khi cắt hai enzyme, hai hệ thống pJET P1-6 pJET P3-4 cho hai band vạch với kích thước tương ứng vào khoảng 284bp 3000bp; 284bp 3000bp Thu nhận band vạch khoảng 3000bp đường chạy pJET P1-6; đường chạy pJET P3-4 thu a lu nhận band vạch khoảng 284bp Hai hệ thống nối lại T4 ligase n Kết điện di sản phẩm cắt tinh sản phẩm cắt hai hệ thống n va biến nạp vào E.coli khả biến để nhân dòng chọn khuẩn lạc tn to pJET P1-6 pJET P3-4 hình 4.9a hình 4.9b: p ie gh d oa nl w a nv a lu ll u nf m Hình 4.9b: Kết điện di sản phẩm cắt pJET P1-6 enzyme HindIII cắt pJET P3-4 enzyme HindIII Acc65I Acc65I tz n oi Hình 4.9a: Kết điện di sản phẩm Đường chạy M: DNA ladder Đường chạy 1: Sản phẩm cắt pJET P1-6 Đường chạy 1: Sản phẩm cắt pJET P3- z Đường chạy M: DNA ladder gm @ co l nhuộm với Ethidium Bromide m Đường chạy 3: Sản phầm cắt pJET an Lu P3-4 không nhuộm Ethidium Bromide n va ac th 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 si 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 42 Sản phẩm cắt hai hệ thống pJET P1-6 pJET P3-4 sau điện di cho hai band vạch với kích thước tương ứng lý thuyết Sản phẩm cắt tinh với band vạch quan tâm dùng để làm nguyên liệu nối Kết tinh sản phẩm cắt vector pJET P1-6 pJET P3-4 enzyme HindIII Acc65I (hình 4.10a); Sản phẩm tinh DNA plasmid pJET P16-34 sau biến nạp (hình 4.10b); Điện di sản phẩm pJET P16-34 sau cắt enzyme HindIII BamHI (hình 4.10c); Sản phẩm tinh P16-34 (Tra-2 RNAi) sau cắt BamHI HindIII từ DNA plasmid pJET P16-34 (hình 4.10d): a lu n n va p ie gh tn to d oa nl w a lu Hình ảnh 4.10b: Kết tinh sach DNA phẩm cắt vector pJET P1-6 pJET plasmid pJET P16-34 sau biến nạp a nv Hình 4.10a: Kết tinh sản ll u nf m P3-4 enzyme HindIII Acc65I Đường chạy M: DNA ladder Đường chạy 1: Đoạn gene P3-4 từ Đường chạy 1: DNA plasmid pJET P16-34 tz n oi Đường chạy M: DNA ladder z pJET P3-4 cắt enzym m co l enzyme HindIII Acc65I gm Đường chạy 2: pJET P1-6 sau cắt @ HindIII Acc65I an Lu n va ac th 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 si 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 43 B ằng phươ ng pháp tổng hợp gene cắt a lu nối n n va thơng Hình 4.10c: Kết điện di sản phẩm Hình 4.10d: Kết tinh đoạn pJET P16-34 sau cắt enzyme P16-34 (Tra-2 RNAi) sau cắt HindIII BamHI HindIII BamHI từ DNA plasmid Đường chạy M: DNA ladder pJET P16-34 Đường chạy 4: pJET P16-34 cắt Đường chạy M: DNA ladder enzyme HindIII BamHI Đường chạy 1:Tinh pTRE-Tight BI tn to qua hai p ie gh vector sau cắt BamHI HindIII oa nl w P1-6 pJET Đường chạy 2: Tinh P16-34 d a lu pJET P3-4 thiết kế thành công đoạn gene quy định tính trạng giới tính P16-34 a nv (Tra-2 RNAi) với kích thước khoảng 630bp u nf 4.3 Kết thiết kế vector pTET-Dual-OFF, lai ghép chèn đoạn DNA quy ll định tính trạng giới tính muỗi Aedes aegypti vào vector m n oi Đoạn gene Tra-2 RNAi sau thiết kế thành công, tiến hành thiết kế tz vector pTET-Dual-OFF mang đoạn gene Tra-2 RNAi quy định tính trạng giới tính Kết bước thiết kế vector pTet-Dual-OFF đưa sau: z gm @ Kết kiểm tra sản phẩm cắt tinh sản phẩm cắt vector pTRETight-BI pJET P16-34 enzyme BamHI HindIII, hình 4.11a m co l 4.11b: an Lu n va ac th 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 si 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 44 a lu Hình 4.11b: Kết tinh sản cắt vector pTRE-Tight-BI pJET phẩm cắt vector pTRE-Tight-BI p16-34 enzyme BamHI và P16-34 enzyme BamHI HindIII HindIII n Hình 4.11a: Kết kiểm tra sản phẩm n va tn to Đường chạy M:DNA ladder Đường chạy M: DNA ladder p ie gh Đường chạy 2: sản phẩm cắt pTRE- vector pTRE-Tight-BI sau cắt Tight-BI oa nl w Đường chạy 4: Sản phẩm cắt pJET P16-34 Đường chạy 1: Sản phẩm tinh Đường chạy 2: Sản phẩm tinh P16-34 sau cắt d a lu a nv Kết kiểm tra PCR sản phẩm biến nạp tạo vector pTRE-Tight-BI-P16-34 m hình 4.12b: ll u nf từ vector pTRE-Tight-BI đoạn gene Tra-2 RNAi (P16-34) hình 4.12a tz n oi z m co l gm @ an Lu n va ac th 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 si 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 45 a lu n Hình 4.12b: Kết PCR kiểm tra pTRE-Tight-BI P16-34 tạo vector khuẩn lạc biến nạp tạo vector pTRE- pTRE-Tight-BI-P16-34 vào tế bào khả Tight-BI-P16-34 biến E.coli DH5α Đường chạy M: DNA ladder n va Hình 4.12a: Kết biến nạp vector p ie gh tn to Đường chạy đến 9: PCR khuẩn lạc oa nl w tạo đoạn P3-4 d Hình 4.12b cho kết điện di PCR khuẩn lạc tạo đoạn gene P3-4 với a lu a nv kích thước 240bp để kiểm tra sản phẩm nối có thành cơng hay khơng Trong u nf đường chạy từ đến 9, có đường chạy số khuẩn lạc số cho kích ll thước 240bp Kết luận khuẩn lạc số chứa vector biến nạp pTRE-Tight-BI-P16-34 m tz n oi (hình 4.12a) z m co l gm @ an Lu n va ac th 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 si 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 46 Kết điện di kiểm tra sản phẩm tinh DNA plasmid pTRE-Tight-BIP16-34 từ sinh khối khuẩn lạc số kết kiểm tra sản phẩm cắt DNA plasmid pTRE-Tight-BI-P16-34 enzyme BamHI HindIII để kiểm tra đoạn chèn P16-34, hình 4.13: a lu n n va p ie gh tn to Hình 4.13: Kết điện di kiểm tra sản phẩm tinh DNA plasmid pTRETight-BI-P16-34 sản phẩm cắt DNA plasmid pTRE-Tight-BI-P16-34 enzyme BamHI HindIII để kiểm tra đoạn chèn P16-34 oa nl w Đường chạy M: DNA ladder Đường chạy 1: sản phẩm cắt DNA plasmid pTRE-Tight-BI-P16-34 d a lu enzyme BamHI HindIII a nv Đường chạy 2:Sản phẩm DNA plasmid pTRE-Tight-BI-P16-34 tinh u nf Tại đường chạy số hình 4.13, kích thước band vạch khoảng 3442bp ll khớp với lý thuyết Ngoài đường chạy số 1, cắt DNA plasmid hai m n oi enzyme BamHI HindIII để kiểm tra đoạn chèn P16-34; kết cho hai band tz vạch kích thước khoảng 630bp 2814bp với kích thước đoạn chèn P16-34 vector pTRE-Tight-BI cắt enzyme bamHI HindIII Biến nạp z gm @ tinh DNA plasmid pTRE-Tight-BI-P16-34 thành công Kết biến nạp, nuôi sinh khối vector pTet-Dua OFF tinh DNA l plasmid pTet-Dual OFF để làm nguyên liệu cho trình thiết kế vector mang gene co m điều khiển tính trạng giới tính muỗi Aedes aegypti, hình 4.14a hình an Lu 4.14b: n va ac th 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 si 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 47 a lu Hình 4.14a: Khuẩn lạc E.coli Hình 4.14b: Kết điện di tinh DNA mang vector pTet-Dual OFF plasmid pTet-Dual OFF n Đường chạy M: DNA ladder va n Đường chạy đến 6: Vector pTet-Dual OFF tn to Kết điện di sản phẩm cắt vector pTet-Dual OFF enzyme p ie gh BamHI XhoI để kiểm tra sản phẩm tinh DNA plasmid hình 4.15: Hình 4.15: Kết điện di kiểm tra sản phẩm cắt vector pTet-Dual oa nl w OFF BamHI XhoI d Đường chạy M: DNA ladder a lu Đường chạy 1:DNA pTet- Dual OFF a nv Đường chạy 2: pTet-Dual OFF cắt u nf MscI ClaI ll Đường chạy 3: pTet-Dual OFF cắt m tz n oi BamHI XhoI Kết thúc q trình biến nạp, ni sinh khối khuẩn lạc để nhân dòng pTetDual OFF với số lượng lớn Kích thước lý thuyết vector pTet-Dual OFF vào z khoảng 4903bp Theo kết điện di hình 4.14b sản phẩm tinh cho band vạch @ gm kích thước khoảng 4903 bp kiểm tra lại enzyme cắt BamHI XhoI cho hai l band vạch kích thước 4296bp bà 607bp (hình 4.15) Kết luận m co tinh DNA plasmid pTet-Dual OFF dùng cho bước thí nghiệm sau trình thiết kế vector pTet-Dual OFF an Lu Do thời gian thực đề tài nghiên cứu có hạn; chúng tơi tạm thời dừng lại n va ac th 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 si 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 48 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Đã tách chiết tinh DNA tổng số loài muỗi Aedes aegypti Đã phân lập đoạn gene Tra-2 RNAi quy định tính trạng giới tính muỗi Aedes aegypti có kích thước khoảng 630bp Đã thành cơng q trình gắn lõi Tra-2 RNAi vào vector pTre-Tight-BI tạo vector pTre-Tight-BI-P16-34 với kích thước khoảng 3442bp để đưa vào vector pTet-Dual OFF Tinh số lượng lớn DNA plasmid pTet-Dual OFF sau a lu biến nạp nuôi sinh khối để làm nguyên liệu cho bước nghiên cứu sau n n va Đã nắm phương pháp PCR; phương pháp thiết kế tạo vector; tn to phương pháp cắt nối đoạn DNA vào vector; phương pháp biến nạp vào tế bào E.coli khả biến p ie gh 5.2 Kiến nghị Tiếp tục nối vector pTre-Tight-BI-P16-34 vào vector pTet-Dual OFF để tạo oa nl w vector pTet-Dual OFF mang gene điều khiển tính trạng giới tính muỗi Aedes aegypti hoàn chỉnh d a nv a lu ll u nf m tz n oi z m co l gm @ an Lu n va ac th 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 si 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO I Tài liệu Tiếng Việt Bộ Y tế (2006), Giám sát, chẩn đoán điều trị bệnh sốt dengue/ sốt xuất huyết dengue, Nhà xuất Y học, Hà Nội Bộ Y Tế (2008), Báo cáo tổng kết hoạt động 2007 kế hoạch 2008, phòng chống sốt xuất huyết khu vực phía Nam, Dự án quốc gia phịng chống sốt xuất huyết khu vực phía Nam TP.Hồ Chí Minh, tr.1-15 Hồng Anh Vường CS (2006), Báo cáo Hội nghị tổng kết hoạt ñộng năm 2001-2005 dự án phòng chống SD/SXHD khu vực Tây Nguyên, Viện Vệ sinh a lu Dịch tễ Tây Nguyên, 2/2006, tr.1-16 n n va Hoàng Anh Vường, Nguyễn Ái Phương CS (1993), “Đặc ñiểm dịch tễ học cứu khoa học 1993, Hội nghị khoa học Y- dược Viện Trường Tây Nguyên- p ie gh tn to Dengue xuất huyết Tây Nguyên, từ 1983-1993”, Kỷ yếu công trình nghiên Khánh Hịa, tr 338-345 Hồng Anh Vường, Vũ Thị Hồng Gấm (1998), “ Đặc ñiểm dịch tễ học oa nl w SD/SXHD Đắc Lắc, năm 1995-1997”, Tập san Vệ sinh phòng dịch Tây Nguyên, (9), tr.16-27 d a lu Huỳnh Thị Đoan Dung (1999), Dịch tễ học vụ dịch sốt xuất huyết TP Buôn Ma u nf 1999 a nv Thuột năm 1998”, luận văn tốt nghiệp bác sĩ Y khoa Tây Nguyên, khóa 1993- ll Nguyễn Nhật Cảm, Vũ Sinh Nam, Nguyễn Thuý Hoa, Nguyễn Thị Yên, Nguyễn m n oi Thị Lan Anh, Phan Trọng Lân, Hilary Ranson, Emma Warr, “Khảo sát đột tz biến gene kháng hóa chất diệt côn trùng KDR-VAL1016GLY số quần thể muỗi Aedes Aegypti kỹ thuật HOLA Việt Nam” (2009) Tạp trí Y z gm @ học dự phịng, tập XIX,số 7(106),tr.10-115 Tổ chức Y tế Thế giới (2001), Tài liệu hướng dẫn phòng chống sốt Dengue sốt co l xuất huyết dengue, Nhà xuất Y học, Hà Nội m Trung tâm Y tế dự phòng Cà Mau (2008), Hội nghị Tổng kết hoạt động phòng an Lu chống SXHD tỉnh Cà Mau từ 2004-2008 n va ac th 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 si 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99