ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM o0o NGUYỄN MINH THÀNH Tên đề tài THIẾT KẾ VECTOR TET – ON ĐIỀU KHIỂN TÍNH TRẠNG GIỚI TÍNH TRÊN MUỖI AEDES AEGYPTI KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo Ch[.]
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM o0o NGUYỄN MINH THÀNH Tên đề tài: THIẾT KẾ VECTOR TET – ON ĐIỀU KHIỂN TÍNH TRẠNG GIỚI TÍNH TRÊN MUỖI AEDES AEGYPTI KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành: Cơng nghệ sinh học Khoa : CNSH - CNTP Khóa học : 2012 – 2016 Thái Nguyên, năm 2016 n ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM o0o NGUYỄN MINH THÀNH Tên đề tài: THIẾT KẾ VECTOR TET – ON ĐIỀU KHIỂN TÍNH TRẠNG GIỚI TÍNH TRÊN MUỖI AEDES AEGYPTI KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Lớp : K44 - CNSH Khoa : CNSH - CNTP Khóa học : 2012 – 2016 Giảng viên hƣớng dẫn:1 TS Nguyễn Văn Hạnh Viện CNSH – Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam ThS Vi Đại Lâm Khoa CNSH – CNTP – Trƣờng ĐH Nông Lâm Thái Nguyên Thái Nguyên, năm 2016 n i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, cố gắng nỗ lực thân, nhận nhiều quan tâm giúp đỡ nhiệt tình thầy giáo, bạn bè người thân Trước hết xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban giám hiệu Trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên, Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm, tập thể cán Phịng Cơng nghệ phơi – Viện Cơng nghệ Sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam tồn thể thầy, giáo truyền đạt cho kiến thức, kĩ quý báu suốt thời gian học tập rèn luyện trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên Tôi xin chân thành cảm ơn thầy TS Nguyễn Văn Hạnh – Phịng Cơng nghệ phơi – Viện Cơng nghệ Sinh học, ThS Vi Đại Lâm Khoa Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm hướng dẫn trực tiếp đề tài, thầy tận tình bảo, giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho tơi hồn thành tốt đề tài Tôi xin cảm ơn nghiên cứu sinh Đỗ Trung Kiên, anh, chị bạn sinh viên tham gia nghiên cứu – Phịng Cơng nghệ phơi – Viện Cơng nghệ Sinh học Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến bố mẹ, thầy cô, bạn bè ủng hộ mặt vật chất tinh thần giúp tơi hồn thành tốt đề tài Tơi xin chân thành cảm ơn! Thái nguyên, tháng năm 2016 Sinh viên Nguyễn Minh Thành n ii DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT ARN Acid ribonucleic – Một hại loại acid nucleic CTAB Cetyltrimethyl Amonium Bromide DNA Deoxyribonucleic Acid – Một loại nucleic acid DOX Doxycycline dsRNA E.coli LB MLPA Double strand RNA – RNA sợi đôi Escherichia coli Lauria Broth Multiplex Ligation Dependent Probe Amplification (khuếch đại phụ thuộc mẫu dò) Polymerase Chain Reaction: phản ứng chuỗi tổng hợp PCR chuỗi polymer (Phản ứng khuếch đại DNA ống nghiệm) µl PCMV IE PTGS TeT-on Microlit ( µl = 10-3 ml) Promoter encephalomyocarditis virus internal ribosome entry site Posttranscriptional gene silencing ( làm bất hoạt gene sau phiên mã) Vector pTet – DualON TRE Tetracycline -responsive RNAi RNA interference SiRNA Small interfeing RNA RISC IRES2 RNP RNA-induced silencing complex ( phức hợp làm câm lặng RNA) Internal ribosome entry site Ribonucleoprotein n iii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1:Danh mục thiết bị sử dụng đề tài 19 Bảng 3.2: Thành phần phản ứng cắt pJET1.2-1 24 Bảng 3.3: Thành phần phản ứng cắt PJET1.2-2 24 Bảng 3.4: Thành phần phản ứng nối 26 Bảng 3.5: Thành phần phản ứng cắt 27 Bảng 3.6: Thành phần phản ứng cắt 27 Bảng 3.7: Thành phần phản ứng nối 28 Bảng 3.8: Thành phần phản ứng PCR 29 Bảng 3.9: Thành phần phản ứng cắt 29 Bảng 3.10: Thành phần phản ứng cắt 30 Bảng 3.11: Thành phần phản ứng nối 31 n iv DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 2.1: Cấu trúc vector Tet- On 10 Hình 2.2: Cơ chế hoạt động vector Tet-On 12 Hình 2.3: Cấu tạo vector pTRE-Tight-BI [7] 13 Hình 3.1: Cấu trúc vector pJET1.2 20 Hình 4.1: Hình ảnh vector pJET1.2-2 sau cắt enzyme HinIII Acc65I 32 Hình 4.2: Hình ảnh vector pJET1.2-1 sau cắt enzyme HindIII Acc65I 33 Hình 4.3: Hình ảnh đọc trình tự đoạn gene 34 Hình 4.4: Kết so sánh với đoạn gene tra-2 34 Hình 4.5: Hình ảnh vector pJET1.2-1 đoạn DNA trước nối T4 35 Hình 4.6: Hình ảnh đoạn DNA kẹp tóc Tra-2 RNAi cắt enzyme 2) BamHI HinIII từ vector pJET1.2-1 – đoạn sau nối (Đường chạy 36 Hình 4.7: Hình ảnh đoạn DNA kẹp tóc Tra-2 RNAi cắt enzyme BamHI HinIII sau tinh (đường chạy 2) 37 Hình 4.8: Kết vector pTRE – Tight – BI tạo rỗng enzyme BamHI HindIII 38 Hình 4.9: Kết chèn đoạn DNA kẹp tóc Tra-2 RNAi vào pTRE – Tight – BI cắt enzyme BamHI HinIII (đường chạy số 2) 39 Hình 4.10: Kết cắt vector pTet – DualON enzyme NsiI XhoI (Đường chạy số 2) 40 n v MỤC LỤC Trang Phần 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu yêu cầu đề tài 1.2.1 Mục tiêu đề tài 1.2.2 Yêu cầu đề tài 1.3 Ý nghĩa đề tài 1.3.1 Ý nghĩa khoa học 1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn Phần 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Cơ sở khoa học 2.1.1 Muỗi biến đổi gene 2.1.2 Công nghệ RNAi 2.1.3 Gene biểu tính trạng giới tính muỗi Aedes aegypti (Transformer-2 RNAi) 2.1.4 Vector Tet – On 10 2.1.5 Vector pTRE-Tight-BI 13 2.2 Tình hình nghiên cứu nước nước 15 2.2.1 Tình hình nghiên cứu giới 15 2.2.2 Tình hình nghiên cứu nước 16 Phần 3: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 3.1 Đối tượng phạm vi nghiên cứu 17 3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 17 3.1.2 Phạm vi nghiên cứu 17 3.2 Địa điểm thời gian nghiên cứu 17 3.2.1 Địa điểm nghiên cứu 17 n vi 3.2.2 Thời gian tiến hành 17 3.3 Hóa chất, thiết bị vật liệu 17 3.3.1 Hóa chất 17 3.3.2 Thiết bị 19 3.3.3 Dụng cụ 19 3.3.4 Vật liệu 20 3.4 Nội dung nghiên cứu 20 3.5 Phương pháp nghiên cứu 21 3.5.1 Tạo đoạn DNA kẹp tóc Tra-2 RNAi quy định giới tính muỗi Aedes aegypti 21 3.5.2 Chuyển đoạn DNA kẹp tóc Tra-2 RNAi quy định tính trạng giới tính vào vector pTRE – Tight – BI 26 3.5.3 Tạo vector Tet – On hoàn chỉnh 29 Phần 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 32 4.1 Kết tạo đoạn DNA kẹp tóc Tra-2 RNAi quy định giới tính muỗi Aedes aegypti 32 4.1.1 Kết tạo đoạn DNA từ vector pJET1.2-2 32 4.1.2 Kết tạo vector pJET1.2-1 rỗng 33 4.2 Kết chuyển đoạn DNA kẹp tóc Tra-2 RNAi quy đinh tính trạng giới tính muỗi Aedes aegypti vào vector 35 4.2.1 Kết qủa cắt đoạn DNA kẹp tóc Tra-2 RNAi từ pJET1.2-1 sau nối đoạn DNA 35 4.2.2 Kết vector pTRE – Tight – BI nhân với số lượng lớn, cắt enzyme nhằm tạo vector rỗng để nhận đoạn DNA kẹp tócTra-2 RNAi quy định tính trạng giới tính 37 4.2.3 Kết chèn đoạn DNA kẹp tóc quy định tính trạng giới tính muỗi Aedes aegypti vào vector pTRE – Tight - BI 38 n vii 4.3 Kết tạo vector Tet – on hoàn chỉnh 40 4.3.1 Kết vector pTet – DualON nhân với số lượng lớn, cắt enzyme nhằm tạo vector rỗng để nhận đoạn lõi 40 Phần 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42 5.1 Kết luận 42 5.2 Kiến nghị 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO n Phần MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Theo tổ chức y tế giới, ước tính hàng năm giới có khoảng 2,5 – tỷ người có nguy mắc bệnh muỗi truyền nhiễm sốt rét, sốt vàng da, sốt nhiệt đới (sốt dengue) Trong 50 – 100 triệu người mắc bệnh muỗi Aedes aegypti, khoảng 500.000 trường hợp mắc bệnh muỗi Aedes aegypti phải điều trị, 90% trẻ em 15 tuổi, tỉ lệ tử vong muỗi Aedes aegypti 5% Bệnh lây lan 100 nước khu vực có khí hậu nhiệt đới, cận nhiệt đới Châu Mỹ cao 42 nước, châu Phi 20 nước, khu vực Tây Thái Bình Dương 29 nước, Đơng Nam Á nước Địa Trung Hải nước [1] Việt Nam nước có bệnh dịch lưu hành Từ năm 1960 đến dịch có xu hướng lan rộng phát triển với số mắc bệnh chết ngày tăng Bệnh chiếm tỉ lệ cao bệnh truyền nhiễm Việt Nam, nguyên nhân hàng đầu gây tử vong cho trẻ tình trạng tải cho bệnh viện mùa dịch [4], [5] Dịch bệnh khơng có chu kì rõ rệt, đợt dịch lớn hàng năm bệnh dịch xảy rải rác Để giải vấn đề nhiều hướng nghiên cứu thử nghiệm áp dụng Các nhà khoa học giới thành công việc tạo muỗi biến đổi gene kĩ thuật DNA tái tổ hợp Những muỗi biến đổi gene thả môi trường giao phối với muỗi tạo hệ muỗi bị khuyếm khuyết chết trước trưởng thành Các nhà khoa học Mỹ Đại học Rocckefeller nghiên cứu biến đổi gene muỗi, vơ hiệu hóa nhạy bén khứu giác chúng người, khiến chúng khơng có khả tìm kiếm mục tiêu để hút máu Nhóm nghiên cứu cho muỗi có quan thụ cảm khứu giác gọi orco, xem phận cần thiết để phối hợp với n