Luận án tiến sĩ nghiên cứu sự phân bố, tập tính và độ nhạy cảm với hóa chất diệt côn trùng của muỗi aedes aegypti

i DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tiếng Anh Tiếng việt CSMĐ Chỉ số mật độ muỗi CSNCM Chỉ số nhàcómuỗi Chỉ số dụng cụ chứa CSDCBG nước cóbọ gậy CSNBG Chỉ số cónhàbọ gậy DCCN Dụng cụ chứa nước SD Dengue fever TCYTTG BI Sốt Dengue Tổ chức Y tế giới Breteau index Chỉ số Breteau Kdr Knockdown resistance Kháng ngãgục PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng khuếch đại gen WHO World Health Organization Tổ chức Y tế giới ii MỤC LỤC Trang Danh mục từ viết tắt i Danh mục bảng vi Danh mục hình viii ĐẶT VẤN ĐỀ Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Nghiên cứu phân bố, tập tính vàvai trịtruyền bệnh muỗi Aedes giới vàViệt Nam 1.1.1 Vị tríphân loại muỗi Aedes 1.1.2 Hình thái muỗi Ae aegypti vàAe albopictus 1.1.3 Phân bố, tập tí nh vàvai trịtruyền bệnh muỗi Aedes giới 1.1.4 Phân bố, tập tí nh vàvai trịtruyền bệnh muỗi Aedes Việt Nam 12 1.1.5 Nghiên cứu muỗi Aedes Bình Định vàGia Lai 18 1.2 Nghiên cứu tình trạng kháng hóa chất diệt côn trùng muỗi Aedes 19 1.2.1 Các loại hóa chất diệt trùng 19 1.2.2 Cơ chế kháng hóa chất diệt côn trùng 20 1.2.3 Phương pháp phát muỗi kháng hóa chất diệt trùng 22 1.2.4 Tính kháng hóa chất diệt côn trùng muỗi Aedes giới 23 1.2.5 Nghiên cứu muỗi Aedes kháng với hóa chất Việt Nam 27 1.3 Một số bệnh muỗi Aedes truyền giới vàViệt Nam 30 1.3.1 Một số bệnh muỗi Aedes truyền giới 30 1.3.2 Một số bệnh muỗi Aedes truyền Việt Nam 32 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34 2.1 Đối tượng, địa điểm vàthời gian nghiên cứu 34 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 34 2.1.2 Thời gian nghiên cứu 34 iii 2.1.3 Địa điểm nghiên cứu 34 2.2 Phạm vi nghiên cứu 38 2.3 Phương pháp nghiên cứu 38 2.3.1 Thiết kế nghiên cứu 38 2.3.2 Cỡ mẫu nghiên cứu 39 2.4 Nội dung nghiên cứu 41 2.2.1 Nội dung nghiên cứu mục tiêu 41 2.2.2 Nội dung nghiên cứu mục tiêu 41 2.5 Các kỹ thuật sử dụng nghiên cứu 42 2.5.1 Kỹ thuật soi bắt muỗi ban ngày 42 2.5.2 Kỹ thuật điều tra bọ gậy Aedes 42 2.5.3 Kỹ thuật thu thập bọ gậy Aedes 43 2.5.4 Kỹ thuật định loại muỗi vàbọ gậyAe aegypti vàAe albopictus 44 2.5.5 Kỹ thuật xét nghiệm muỗi nhiễm virus Dengue 45 2.5.6 Kỹ thuật nhân nuôi muỗi Aedes 45 2.5.7 Quy trình thử nhạy cảm muỗi Aedes với hóa chất 46 2.5.8 Kỹ thuật xác định đột biến gen liên quan đến kháng hóa chất muỗi Ae aegypti điểm nghiên cứu 51 2.6 Quy trì nh nghiên cứu 52 2.6.1 Nghiên cứu thực địa 52 2.6.2 Nghiên cứu phịng thínghiệm 52 2.7 Các biến số vàchỉ số nghiên cứu 53 2.7.1 Các biến số nghiên cứu 53 2.7.2 số nghiên cứu 53 2.8 Xử lýsố liệu 55 2.9 Đạo đức nghiên cứu 55 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 56 iv 3.1 Phân bố, tập tính vàtỷ lệ nhiễm virus Dengue muỗi sốt xuất huyết Dengue tỉnh Bình Định vàGia Lai, 2016-2018 56 3.1.1 Thành phần vàtỷ lệ muỗi Aedes điểm nghiên cứu 56 3.1.2 Chỉ số muỗi vàbọ gậy Aedes điểm nghiên cứu 57 3.1.3 Diễn biến số mật độ vàBreteau theo thời gian điểm nghiên cứu 61 3.1.4 Tập tí nh trú đậu muỗi Aedes Bình Định vàGia Lai 67 3.1.5 Tập tí nh sinh sản muỗi Aedes Bình Định vàGia Lai 73 3.1.6 Ảnh hưởng yếu tố mùa đến muỗi Aedes Bình Định vàGia Lai 79 3.1.7 Tỷ lệ muỗi Aedes nhiễm virus Dengue Bình Định vàGia Lai 81 3.2 Độ nhạy cảm muỗi Aedes với hóa chất diệt trùng tỉnh Bì nh Định vàGia Lai, 2016-2018 83 3.2.1 Độ nhạy cảm muỗi với hóa chất diệt trùng Bình Định 83 3.2.2 Độ nhạy cảm muỗi với hóa chất diệt trùng Gia Lai 89 3.2.3 Đột biến gen kdr liên quan đến tính kháng hóa chất diệt trùng muỗi Ae aegypti Bình Định vàGia Lai, 2016-2018 95 Chương BÀN LUẬN 101 4.1 Phân bố, tập tí nh tỷ lệ nhiễm virus Dengue muỗi sốt xuất huyết Dengue Bình Định vàGia Lai, 2016-2018 101 4.1.1 Phân bố muỗi Aedes truyền bệnh sốt xuất huyết Dengue 101 4.1.2 Các số muỗi Aedes điểm nghiên cứu 105 4.1.3 Diễn biến số mật độ vàBreteau điểm nghiên cứu 108 4.1.4 Tập tí nh trú đậu muỗi Aedes Bình Định vàGia Lai 112 4.1.5 Tập tí nh sinh sản muỗi Aedes Bình Định vàGia Lai 116 4.1.6 Ảnh hưởng yếu tố mùa đến muỗi Aedes Bình Định vàGia Lai 120 4.1.7 Tỷ lệ muỗi Aedes nhiễm virus Dengue điểm nghiên cứu 121 4.2 Độ nhạy cảm muỗi Aedes với hóa chất diệt trùng tỉnh Bình Định vàGia Lai, 2016-2018 124 v 4.2.1 Độ nhạy cảm muỗi Aedes với hóa chất diệt trùng 124 4.2.2 Đột biến gen liên quan đến kháng hóa chất diệt trùng muỗi Ae aegypti thu thập điểm nghiên cứu 134 KẾT LUẬN 139 KIẾN NGHỊ 141 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN 142 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC PHỤ LỤC PHỤ LỤC vi DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1 Tóm tắt danh sách điểm điều tra Bình Định vàGia Lai 34 Bảng 2.2 Các hốchất diệt trùng, nồng độ vàthời gian thử nghiệm 47 Bảng 3.1 Số lượng vàtỷ lệ muỗi Aedes điểm nghiên cứu 56 Bảng 3.2 Chỉ số muỗi Aedes điểm nghiên cứu tỉnh Bình Định 57 Bảng 3.3 Chỉ số bọ gậy Aedes điểm nghiên cứu tỉnh Bình Định…… 58 Bảng 3.4 Chỉ số muỗi Aedes điểm nghiên cứu tỉnh Gia Lai 59 Bảng 3.5 Chỉ số bọ gậy Aedes điểm nghiên cứu tỉnh Gia Lai 60 Bảng 3.6 Tỷ lệ muỗi Aedes thu thập vàngoài nhà 68 Bảng 3.7 Số lượng vàtỷ lệ muỗi Ae aegypti thu thập giáthể khác Bình Định 69 Bảng 3.8 Số lượng vàtỷ lệ muỗi Ae albopictus thu thập giáthể khác Bình Định 69 Bảng 3.9 Tỷ lệ muỗi Aedes thu thập vàngoài nhà 70 Bảng 3.10 Số lượng vàtỷ lệ muỗi Ae aegypti thu thập giáthể khác Gia Lai 71 Bảng 3.11 Số lượng vàtỷ lệ muỗi Ae albopictus thu thập giáthể khác Gia Lai 72 Bảng 3.12 Số lượng vàtỷ lệ dụng cụ chứa nước cóbọ gậy thành thị 73 Bảng 3.13 Số lượng vàtỷ lệ dụng cụ chứa nước cóbọ gậy đồng 74 Bảng 3.14 Số lượng vàtỷ lệ dụng cụ chứa nước cóbọ gậy miền núi 75 Bảng 3.15 Số lượng vàtỷ lệ dụng cụ chứa nước cóbọ gậy thành thị 76 Bảng 3.16 Số lượng vàtỷ lệ dụng cụ chứa nước cóbọ gậy nơng thơn 77 Bảng 3.17 Số lượng vàtỷ lệ dụng cụ chứa nước cóbọ gậy nông thôn 78 Bảng 3.18 So sánh dụng cụ chứa nước cóbọ gậy theo mùa Bình Định 79 Bảng 3.19 So sánh dụng cụ chứa nước cóbọ gậy theo mùa Gia Lai 80 vii Bảng 3.20 Tỷ lệ muỗi Aedes nhiễm virus Dengue Bình Định 81 Bảng 3.21 Tỷ lệ muỗi Aedes nhiễm virus Dengue Gia Lai 82 Bảng 3.22 Độ nhạy cảm muỗi Aedes với alphacypermethrin 83 Bảng 3.23 Độ nhạy cảm muỗi Aedes với lambdacyhalothrin 83 Bảng 3.24 Độ nhạy cảm muỗi Aedes với deltamethrin 84 Bảng 3.25 Độ nhạy cảm muỗi Aedes với permethrin 85 Bảng 3.26 Độ nhạy cảm muỗi Aedes với malathion 85 Bảng 3.27 Tổng hợp nhạy cảm muỗi Aedes với hóa chất Bình Định 86 Bảng 3.28 Độ nhạy cảm muỗi Aedes với alphacypermethrin 89 Bảng 3.29 Độ nhạy cảm muỗi Aedes với lambdacyhalothrin 89 Bảng 3.30 Độ nhạy cảm muỗi Aedes với deltamethrin 90 Bảng 3.31 Độ nhạy cảm muỗi Aedes với permethrin 90 Bảng 3.32 Độ nhạy cảm muỗi Aedes với malathion 91 Bảng 3.33 Bảng tổng hợp độ nhạy muỗi Aedes với hóa chất Gia Lai 92 Bảng 3.34 Tỷ lệ muỗi Ae aegypti xuất đột biến gen kdr 95 Bảng 3.35 Phân bố đột biến gen kdr quần thể muỗi Ae aegypti 95 Bảng 3.36 Tỷ lệ đột biến gen kdr muỗi Ae aegypti theo sinh cảnh 96 viii DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1.1a Hình thể Ae aegypti Hình 1.1b Hì nh thể Ae.albopictus Hình 2.1 Sơ đồ điểm nghiên cứu tỉnh Bình Định 35 Hình 2.2 Sơ đồ điểm nghiên cứu tỉnh Gia Lai 37 Hình 2.3 Cách thu thập bọ gậy Aedes dụng cụ chứa nước 43 Hình 2.4 Tấm lưng ngực muỗi Ae aegypti (a) vàAe albopictus (b) 44 Hình 2.5 Răng lược đốt bụng VIII bọ gậy Ae aegypti Ae albopictus 44 Hình 2.6 Phịng ni muỗi khoa Cơn trùng 46 Hình 2.7 Bộ dụng cụ thử nhạy cảm muỗi Aedes với hóa chất 48 Hình 2.8 Đọc kết thử nhạy cảm muỗi Aedes với hóa chất 50 Hình 3.1 Diễn biến số mật độ muỗi Ae aegypti theo thời gian điểm nghiên cứu tỉnh Bình Định 61 Hình 3.2 Diễn biến số Breteau muỗi Ae aegypti theo thời gian điểm nghiên cứu tỉnh Bình Định 62 Hình 3.3 Diễn biến số mật độ muỗi Ae albopictus theo thời gian điểm nghiên cứu Bình Định 63 Hình 3.4 Diễn biến số Breteau muỗi Ae albopictus theo thời gian điểm nghiên cứu tỉnh Bình Định…… 64 Hình 3.5 Diễn biến số mật độ muỗi Ae aegypti theo thời gian điểm nghiên cứu tỉnh Gia Lai 65 Hình 3.6 Diễn biến số mật độ muỗi Ae albopictus theo thời gian điểm nghiên cứu tỉnh Gia Lai 65 ix Hình 3.7 Diễn biến số Breteau muỗi Ae aegypti theo thời gian điểm nghiên cứu tỉnh Gia Lai 66 Hình 3.8 Diễn biến số Breteau muỗi Ae albopictus theo thời gian điểm nghiên cứu tỉnh Gia Lai 67 Hình 3.9 Số lượng muỗi Aedes thu thập theo mùa Bình Định 79 Hình 3.10 Số lượng muỗi Aedes thu thập theo mùa Gia Lai 80 Hình 3.11 Kết điện di sản phẩm PCR virus Dengue 82 Hình 3.12 Sơ đồ phân bố muỗi Ae aegypti nhạy kháng với hóa chất điểm nghiên cứu tỉnh Bình Định 87 Hình 3.13 Sơ đồ phân bố muỗi Ae albopictus nhạy kháng với hóa chất điểm nghiên cứu tỉnh Bình Định 88 Hình 3.14 Sơ đồ phân bố muỗi Ae aegypti nhạy kháng với hóa chất điểm nghiên cứu tỉnh Gia Lai 93 Hình 3.15 Sơ đồ phân bố muỗi Ae albopictus nhạy kháng với hóa chất điểm nghiên cứu tỉnh Gia Lai 94 Hình 3.16 Kết điện di sản phẩm PCR gen kdr muỗi Aedes aegypti điểm nghiên cứu 97 Hình 3.17 Kết giải trì nh tự gen kdr muỗi Ae aegypti 98 Hình 3.18 Phân tí ch phần trì nh tự gen kdr muỗi Ae aegypti dạng nucleotide vàmẫu cịn nhạy với hóa chất nhóm pyrethroid 99 Hình 3.19 Phân tích phần trì nh tự gen kdr muỗi Ae aegypti dạng acid amin vàmẫu cịn nhạy với hóa chất nhóm pyrethroid 100 ĐẶT VẤN ĐỀ Theo Tổ chức Y tế giới, bệnh muỗi truyền lànguyên nhân gây triệu ca chết năm [126] Trong đó, bệnh sốt xuất huyết Dengue (SXHD) vấn đề y tế nghiêm trọng toàn cầu Hiện nay, tỷ lệ mắc SXHD tăng 30 lần sau 50 năm nhiều quốc gia lần báo cáo dịch SXHD, bệnh muỗi Aedes truyền cótốc độ lây lan nhanh giới [123] Ngoài ra, gần số bệnh muỗi Aedes truyền gia tăng mở rộng nhiều khu vực bệnh virus Chikungunya, Zika vàTổ chức Y tế giới cảnh báo bệnh virus Zika làvấn đề khẩn cấp y tế công cộng toàn cầu [71] Bệnh SXHD, bệnh virus Chikungunya vàZika làcác bệnh truyền nhiễm cấp tí nh, lan truyền thông qua vết đốt muỗi Aedes aegypti Aedes albopictus [11],[126] Hiện có 251 quốc gia/vùng lãnh thổ có mơi trường sống thích hợp cho tồn vàphát triển muỗi Ae aegypti Ae albopictus, điều gây mối hiểm họa sức khỏe toàn cầu [106] Ở Việt Nam, bệnh SXHD, bệnh virus Chikungunya vàZika ghi nhận, SXHD làmột mười bệnh truyền nhiễm có tỷ lệ mắc vàtử vong cao 10 năm trở lại Bệnh lưu hành hầu hết tỉnh/thành phố chủ yếu miền Nam Nam Trung Những nơi phát muỗi Ae aegypti, số điểm bắt Ae albopictus Mặc dùChương trì nh phịng chống SXHD quốc gia hoạt động từ năm 1999 làm giảm mắc vàtử vong, nhiên số mắc năm mức cao từ 70.000-100.000 ca vàhàng trăm ca tử vong [7],[11] Tỉnh Bình Định Gia Lai hai tỉnh trọng điểm SXHD miền Trung-Tây Nguyên, năm 2010 có số ca mắc cao kể từ năm 1998, sau số mắc giảm qua năm [4],[45] Nhưng đến năm 2015 số ca mắc gia tăng 95.Murcia O, Henrí quez B, Castro A et al (2019), Presence of the point mutations Val1016Gly in the voltage-gated sodium channel detected in a single mosquito from Panama, Parasites and vectors 12 (1), 62 96.Nazif Ullah Khan, Shams Ullah Khan et al., (2016), Susceptibility status of Dengue vector (Aedes aegypti) against different insecticides in district Mansehra, Khyber Pakhtunkhwa, Pakistan, Journal of Entomology and Zoology Studies, 4(5), pp 1107-1112 97.Nguyen Thi Kim Lien, Nguyen Thi Hong Ngoc, Nguyen Thu Hien et al (2018), Two novel mutations in the voltage-gated sodium channel associated with knockdown resistance (kdr) in the dengue vector Aedes aegypti in Vietnam Journal of Vector Ecology, 43 (1), pp 184-189 98.Olger C.A, Troyo A, Moreira-Soto R.D et al (2015), Dengue viruses in Aedes albopictus Skuse from a pineapple plantation in Costa Rica Journal of vector ecology, 40 (1), pp 184-186 99.Pérez-Castro R, Castellanos J.E et al (2016), Detection of all four dengue serotypes in Aedes aegypti female mosquitoes collected in a rural area in Colombia, Memórias Instituto Oswaldo Cruz 111(4), pp 233-240 100 Prapanthadara L, Nongkran P, Surangchit K et al (2002), Mechanisms of DDT and Permrthrin Resistance in Aedes aegypti from Chiang Mai, Thailand, Dengue Bulletin, 26, pp 185-189 101 Rapeeporn Yaichaaroen, Rachada Kiatfuengfoo, Theeraphap Chareonviriyaphap et al (2005), Characterization of deltamethrin resistance in field populations of Aedes aegypti in Thailand, Journal of Vector Ecology, 30(1), pp 144-150 102 Roop Kumari, Kaushal Kumar, Lakhbir S.C et al (2011), First dengue virus detection in Aedes albopictus from Delhi, India: its breeding ecology and role in dengue transmission, Tropical Medicine &International Health, 16(8), pp 949-954 103 Ronald M.S, Paula P.L, Doris G.C (2018), Co‐occurrence of V1016I and F1534C mutations in the voltage‐gated sodium channel and resistance to pyrethroids in Ae aegypti (L.) from the Colombian Caribbean region, Pest Management Science 104 Roth A, Mercier A, Lepers C, Hoy D et al (2014), Concurrent outbreaks of dengue, chikungunya and Zika virus infections - an unprecedented epidemic wave of mosquito-borne viruses in the Pacific 2012-2014, Eurosurveillance, 19 (41) 105 Saavedra-Rodriguez K, Urdaneta-Marquez L, Rajatileka S et al (2007), A mutation in the voltage-gated sodium channel gene associated with pyrethroid resistance in Latin American Aedes aegypti, Insect Mol Biol, 16(6), pp 785-798 106 Samson Leta, Beyene T.J, De Clercq E.M et al (2018), Global risk mapping for major diseases transmitted by Aedes aegypti and Aedes albopictus, International Journal of Infectious Diseases, 67, pp 25-35 107 Samyra Giarola Cecílio, Willer F Silva, Antonio Helvecio Totola et al (2015), Dengue virus detection in Aedes aegypti larvae from southeastern Brazil, Journal of vector ecology, 40 (1), pp 7174 108 Sébastien Marcombe, Mathieu RB, Pocquet N et al (2012), Insecticide Resistance in the Dengue Vector Aedes aegypti from Martinique: Distribution, Mechanisms and Relations with Environmental Factors, PLoS One, 7(2), e30989 109 Sivan A, Shriram AN, Sunish I.P et al (2015), Studies on insecticide susceptibility of Aedes aegypti (Linn) and Aedes albopictus (Skuse) vectors of dengue and chikungunya in Andaman and Nicobar Islands, India, Parasitology Research, 114(12), pp 4693-4702 110 Sharma S.N, Saxena V.K, Lal S et al (2004), Study on susceptibility status in aquatic and adult stages of Ae aegypti and Ae albopictus against insecticides at international airports of south India, The Journal of communicable diseases 36(3), pp 177-181 111 Smith Letícia B, Kasai S, Scott J.G (2016), Review Pyrethroid resistance in Aedes aegypti and Aedes albopictus: Important mosquito vectors of human diseases, Pestic Biochem Physiol., 133, pp 1-12 112 Somboon P, Prapanthadara L.A, Suwonkerd W et al (2003), Insecticide susceptibility tests of Anopheles minimus s.l., Aedes aegypti, Aedes albopictus, and Culex quinquefasciatus in northern Thailand, Southeast Asian J Trop Med Public Health, 34(1), pp 8793 113 Thavara U, Siriyasatien P, Tawatsin A et al (2006), Double infection of heteroserotypes of dengue viruses in field populations of Aedes aegypti and Aedes albopictus (Diptera: Culicidae) and serological features of dengue viruses found in patients in southern Thailand, Southeast Asian journal of tropical medicine and public health, 37(3), pp 468-476 114 Theeraphap Chareonviriyaphap, Michael J.B, Wannapa S et al (2013), Review of insecticide resistance and behavioral avoidance of vectors of human diseases in Thailand, Parasites & Vectors, 280 115 Thilini C W, Devika B P, Mohamed Mansoor et al (2013), Prevalence and breeding habitats of the dengue vectors Aedes aegypti and Aedes albopictus (Diptera: Culicidae) in the semi-urban areas of two different climatic zones in Sri Lanka, International Journal of Tropical Insect Science, Cambridge University, 33 (4), pp 216-226 116 Tran Vu Phong and Vu Sinh Nam (1999), Key breeding Sites of Dengue Vectors in Hanoi,Vietnam,1994-1997, Dengue Bulletin, 23, pp 67-72 117 Tuksinvaracharn R, Tanayapong P, Pongrattanaman S, Hansasuta P et al (2004), Prevalence of dengue virus in Aedes mosquitoes during dry season by semi-nested reverse transcriptasepolymerase chain reaction (semi-nested RT-PCR), J Med Assoc Thai, 87(2), pp 129-133 118 Urdaneta L, Herrera F, Pernalete M et al (2005), Detection of dengue viruses in field-caught Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) in Maracay, Aragua state, Venezuela by type-specific polymerase chain reaction, Infect Genet Evol, 5(2), pp 177-184 119 Warabhorn Preechaporn, Mullica J, Krisanadej J et al (2006), The Larval Ecology of Ae aegypti and Ae albopictus in Three Topographical Areas of Southern Thailand, Dengue Bulletin, 30, pp 204-213 120 WHO (1997), Dengue haemorrhagic fever Diagnosis, treatment, prevention and control, Geneva 121 WHO (2003), Guideline for Dengue surveillance anh mosquito control, WHO Regional Office for the Western Pacific, Manila 122 WHO (2006), Pesticides and their application for the control of vectors and pests of public health importance, WHO/CDS/NTD/WHOPES/GCDPP/2006.1, 125 123 WHO (2009), Dengue: guidelines for diagnosis, treatment, prevention and control (WHO/HTM/NTD/DEN/2009.1), Geneva, Switzerland 124 WHO (2011), Comprehensive Guidelines for Prevention and Control of Dengue and Dengue Haemorrhagic Fever, WHO Regional Office for South-East Asia, New Delhi 125 WHO (2012), Global plan for insecticide resistance management in malaria vectors, Geneva, Switzerland 126 WHO (2014), A global brief on vector-borne diseases, geneve, Switzerland 127 WHO (2016), Monitoring and managing insecticide resistance in Aedes mosquitoes populations, WHO/ZIKV/VC/16.1, 11p Geneva, Switzerland 128 WHO (2017), Chikungunya, (https://www.who.int/news- room/fact-sheets/detail/chikungunya) 129 WHO (2018), Yellow fever, (https://www.who.int/news- room/fact-sheets/detail/yellow-fever) 130 WHO (2018), Dengue and severe dengue, (http://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/dengue-and-severedengue) 131 Wongkoon S, Jaroensutasinee M., Jaroensutasinee K et al (2013), Distribution, seasonal variation & dengue transmission prediction in Sisaket, Thailand Indian J Med Res, 138(3), pp 347353 132 Wuliandari J.R, Lee S.F, White V.L et al (2015), Association between Three Mutations, F1565C, V1023G and S996P, in the Voltage-Sensitive Sodium Channel Gene and Knockdown Resistance in Aedes aegypti from Yogyakarta, Indonesia, Insects., 6(3), pp 658-685 133 Yuzhe Du, Yoshiko Nomura, Boris S.Z et al (2016), Sodium Channel Mutations and Pyrethroid Resistance in Aedes aegypti, Insects-Open Access Journal, (4), 60 134 Yanola J, Somboon P, Walton C et al (2011), High- throughput assays for detection of the F1534C mutation in the voltage-gated sodium channel gene in permethrin-resistant Aedes aegypti and the distribution of this mutation throughout Thailand, Trop Med Int Health 16(4), pp 501-509 135 Yukiko Higa, Nguyen Thi Yen, Hitoshi Kawada et al (2010), Geographic Distribution of Aedes aegypti and Aedes albopictus Collected from Used Tires in Vietnam, Journal of the American Mosquito Control Association, 26(1), pp 1-9 PHỤ LỤC HÌNH ẢNH CÁC DỤNG CỤ CHỨA NƯỚC Chum vại Phuy Chậu cảnh Xôthùng Lọ hoa Lốp xe Nước gia cầm uống Hố ga Bể măng Bể xi măng Vật phế thải Vật phế thải Vật chứa nước khác PHỤ LỤC QUY TRÌNH XÉT NGHIỆM MUỖI AEDES NHIỄM VIRUS DENGUE Trong nghiên cứu này, sử dụng phương pháp one-step RT- PCR để nhân vùng gen mãhóa protein vỏ E gen virus để sàng lọc mẫu muỗi Aedes nhiễm virus Dengue Vật liệu + Bộ kit tách chiết RNA virus “Viral RNA Mini Kit” hãng Qiagen + Hóa chất dùng phản ứng one-step RT-PCR gồm: sử dụng OneStep RT-PCR kit hãng Qiagen bao gồm buffer 5X, dNTP, Enzym Mix, Rnase-free water vàmồi hãng Sigma-Aldrich + Hóa chất dùng điện di DNA: Agarose (Bio-Rad), Đệm TBE 1X dùng để pha gel agarose vàchạy điện di cóthành phần gồm: Tris 89Mm; Acid boric 89mM; EDTA 0,5M là2mM Đệm nạp mẫu (6X) cóthành phần: Orange G 0,25% (w/v); Glycerol 30% (v/v); Dung dịch nhuộm DNA agarose: Ethydium bromide Phương pháp phát virus Dengue a Nguyên tắc * Nguyên tắc phương pháp one-step RT-PCR: Cả hai giai đoạn phiên mã ngược từ RNA thành cDNA (RT) vàgiai đoạn nhân cDNA (PCR) xảy ống phản ứng, giai đoạn RT xảy trước giai đoạn PCR liền theo sau Trong ống phản ứng RT-PCR cócả loại enzyme reverse transcriptase sử dụng cho chép khuếch đại RT vàDNA sử dụng cho PCR Trong phương pháp one-step RT- PCR, toàn sản phẩm cDNA tham gia vào PCR vìvậy độ nhạy phản ứng làrất cao * Nguyên tắc điện di Nguyên tắc phương pháp điện di dựa vào đặc tí nh cấu trúc acid nucleic Đó đại phân tử tích điện âm đồng khắp bề mặt nên chịu tác động điện trường, chúng di chuyển cực dương điện trường Nancy-520 làchất phát huỳnh quang có khả gắn xen vào DNA mạch đơi Do miếng gel nhuộm với Nancy-520 sau chiếu đèn UV phát vạch DNA b Các bước tiến hành RNA virus Dengue sau tách chiết từ mẫu muỗi sử dụng làm khuôn để chạy phản ứng one-step RT- PCR với cặp mồi bảng 21 Thành phần phản ứng chương trình chạy phản ứng one-step RT- PCR bảng & Bảng Hệ thống mồi đặc hiệu cho gen vỏ E DENV [72] Kích thước sản Trình tự mồi phẩm PCR DEN750 (5’-CAAGAACCGAAACGTGGATG-3’) 1,4Kb DENGUE2639 (5’-TGTGGAAGCAAATATCACCTG-3’) Bảng Thành phần phản ứng one-step RT-PCR Thành phần Thể tích cần lấy Nước SHPT 25 µl 5X buffer 10 µl dNTP µl Mồi DEN750 (10µM) µl Mồi DEN2639 (10µM) µl Enzym mix µl RNA µl Bảng Chương trình chạy one-step RT-PCR phản ứng xác định gen vỏ E Bước Nhiệt độ Thời gian Số chu kỳ Phiên mã ngược 500C 30 phút chu kỳ Hoạt hóa 950C 15 phút chu kỳ Biến tính 940C 30 giây Bắt cặp 520C 30 giây Kéo dài 680C phút Kéo dài 720C phút 40 chu kỳ chu kỳ Đổ gel 2%: Cân 2g agarose cho vào 100 ml dung dịch TE, đun tan agarose, sau để nguội khoảng 500C vàcho Nancy-520 vào với hàm lượng 3,5 µl/100 ml dung dịch Lắc dung dịch đổ vào khuôn, gắn lược để tạo giếng, chờ gel đông thời gian khoảng 30 phút Chạy điện di: lấy µl sản phẩm PCR hịa vào µl loading buffer 6X, cho hỗn hợp vào giếng bảng gel tiến hành chạy điện di với thang 100bp/1Kb Quá trình điện di thực vòng 1h, 140 vol PHỤ LỤC KỸ THUẬT XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN GEN kdr LIÊN QUAN ĐẾN KHÁNG HÓA CHẤT CỦA MUỖI Ae aegypti TẠI CÁC ĐIỂM NGHIÊN CỨU Kỹ thuật tách chiết ADN tổng số Acid nucleic tách chiết DNeasy blood and tissue hãng Qiagen vàcác bước thực theo hướng dẫn nhàsản xuất Kỹ thuật PCR thu nhận gen kdr Phản ứng PCR thực với cặp mồi AaSCF1 vàAaSCR4 vùng gen có kích thước khoảng 650 bp thuộc exon 20 vàexon 21 gen quy định kênh natri (Kawada vàcs., 2016) AaSCF1 5’-AGACAATGTGGATCGCTTCC-3’ AaSCR4 5’-GGACGCAATCTGGCTTGTTA-3’ Thành phần phản ứng 10X Buffer µl 25mM MgCl2 µl 10mM dNTP µl 10µM Primer µl 10µM Primer 2 µl Taq DNA polymerase (5U/ µl) 0,2 µl Nước tinh khiết 31,8 µl DNA khn µl Tổng số 50 µl Chu trình nhiệt: 95oC 5’ 95oC 30 giây 60oC 45 giây 720C phút 72oC 10 phút chu kỳ 35 chu kỳ Sản phẩm PCR bảo quản 40C sử dụng cho phân tích Điện di thạch agarose 1,5% để kiểm tra sản phẩm phản ứng PCR Kết máy đọc dải băng thạch agarose chụp ảnh (Vilber Lourmat) Nếu sản phẩm kích thước gen dự kiến thu nhận tiến hành tinh sản phẩm PCR, làm nguyên liệu cho bước Kỹ thuật tinh sản phẩm PCR Trước giải trì nh tự, sản phẩm PCR tinh QIAquick PCR purification kit (Qiagen) Các bước thực theo hướng dẫn kít Nguyên lýcủa kỹ thuật tinh sạch: Sản phẩm PCR tinh dựa phương pháp cột truyền thống kết hợp với kỹ thuật gắn cóchọn lọc màng silica Cách tiến hành - Thêm 200 µl PB vào 40 µl sản phẩm - trộn - Chuyển cột, ly tâm 13000 vòng/1 phút phút , bỏ dịch bên - Thêm 750 µl PE, ly tâm 13.000 vòng/phút phút, bỏ dịch bên - Ly tâm tiếp 13.000 vòng/1 phút phút, bỏ dịch bên - Chuyển cột sang ống eppendorf - Thêm 30 µl EB, ly tâm 13.000 vòng/1 phút phút - Sản phẩm PCR tinh thu nhận, kíhiệu mẫu vàgiữ -20oC sử dụng Kỹ thuật giải trình tự trực tiếp Sản phẩm PCR sau khuếch đại giải trì nh tự trực tiếp máy giải trì nh tự hãng Beckman Coulter Hệ thống giải trì nh tự Beckman Coulter Sản phẩm PCR gen kdr giải trì nh tự trực tiếp máy giải trình tự hãng Beckman Coulter Các trì nh tự kiểm tra xác định chương trình BLAST Ngân hàng gen NCBI Phân tích trình tự: Ứng dụng phần mềm Sinh tin GenomeLab GeXP, Geneous 8, liệu gen Genbank để phân tích trình tự nucleotide thu gen kdr muỗi Aedes aegypti Kỹ thuật tinh sản phẩm PCR giải trình tự Các bước tinh thủy sản phẩm PCR giải trình tự ethanol: Chuần bị ống eppendorf 1.5ml (đã khử trùng, số lượng ống tương đương số lượng mẫu cần tinh sạch) Thêm vào ống hỗn hợp dung dịch dừng phản ứng với thành phần vàthể tích sau: 3M Natri Acetate pH 5.2 2µl 100mM Na2EDTA pH 8.0 2µl 20mg/ml Glycogen (Cung cấp kèm theo DTCS Quick Start Kit) 1µl Chuyển tồn dung dịch phản ứng PCR giải trì nh tự có vào ống có hỗn hợp dung dịch dừng phản ứng vàtrộn vài giây Thêm vào ống 60µl ethanol lạnh 95% (được bảo quản tủ lạnh -200-C), trộn vàly tâm với tốc độ 14000 vòng/phút 15 phút 40C Cẩn thận hút bỏ dung dịch Bước thực lần Quay khơ chân khơng vịng 10 phút, để khơ tự nhiên nhiệt độ phịng (khơng sử dụng máy ủ nhiệt để làm khơmẫu) Hịa tan DNA tủa vào 40 µl SLS (cung cấp kèm theo DTCS Quick Start Kit) ... ghi nhận muỗi kháng 45% điểm nghiên cứu, có khả kháng 33%, vàcòn nhạy cảm 22% điểm nghiên cứu Độ nhạy muỗi Ae aegypti với hóa chất diệt côn trùng không đồng điểm nghiên cứu v? ?với loại hóa chất khác... vàGia Lai 81 3.2 Độ nhạy cảm muỗi Aedes với hóa chất diệt trùng tỉnh Bì nh Định vàGia Lai, 2016-2018 83 3.2.1 Độ nhạy cảm muỗi với hóa chất diệt trùng Bình Định 83 3.2.2 Độ nhạy cảm. .. tài: ? ?Nghiên cứu phân bố, tập tính, độ nhạy cảm với hóa chất diệt trùng muỗi Aedes aegypti Aedes albopictus tỉnh Bình Định Gia Lai (2016-2018)” tiến hành với hai mục tiêu: Xác định phân bố, tập