A BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ VIỆN DƯỢC LIỆU Nguyễn Việt Dũng NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT, THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA CÂY BAN LÁ DÍNH (Hypericum sampsonii Hance , họ Ban (H[.]
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ VIỆN DƯỢC LIỆU Nguyễn Việt Dũng NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT, THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA CÂY BAN LÁ DÍNH (Hypericum sampsonii Hance., họ Ban (Hypericaceae) Chuyên ngành: Dược liệu - Dược học cổ truyền Mã số: 9720206 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI, Năm 2023 Cơng trình hồn thành tại: - Viện Dược liệu - Trường Đại học Y Hà Nội Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Nguyễn Duy Thuần PGS TS Phạm Thị Vân Anh Phản biện : …………………………… …………………………… Phản biện : …………………………… …………………………… Phản biện : …………………………… …………………………… Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp trường họp : …………………………………… Vào hồi ……… giờ……ngày……tháng .năm 2023 Có thể tìm đọc Luận án tại: - Thư viện Quốc gia Hà Nội - Thư viện Viện Dược liệu A GIỚI THIỆU LUẬN ÁN Tính cấp thiết luận án Trên giới với phát triển, tiến không ngừng khoa học công nghệ, kinh tế xã hội, chất lượng sống người ngày nâng cao cải thiện Bên cạnh đó, tác động phát triển khoa học kinh tế ảnh hưởng không nhỏ đến môi trường, xã hội đặc biệt sức khỏe cộng đồng Theo thống kê Tổ chức y tế Thế giới tỉ lệ mắc số chứng bệnh hiểm nghèo người ngày gia tăng, xuất số loại bệnh Một số bệnh mà có tỷ lệ mắc cao như: tiểu đường, huyết áp, tim mạch, Alzheimer số bệnh có liên quan tới cholesterol … Để phòng điều trị bệnh, nhà nghiên cứu Y Dược quan tâm ý khai thác hợp chất tự nhiên, mà chủ yếu từ dược liệu tính ưu việt có hiệu độc hại Cây ban dính (Hypericum sampsonii Hance.) có nguồn gốc Trung Quốc, Việt Nam, Nhật Bản, Ấn Độ Myanmar Ở Việt Nam, ban dính thường mọc dại nơi đất ẩm, ven rừng, chân ruộng nước, bãi cỏ Theo y học cổ truyền kinh nghiệm dân gian, ban dính thường sử dụng để điều trị nhiều loại bệnh chảy máu cam, thổ huyết, đái máu, lỵ, kinh nguyệt không đều, ho, mồ hôi trộm … Ngày nay, nhiều nghiên cứu chứng minh ban dính có số tác dụng sinh học giải lo âu, trị suy nhược tâm thần, giảm phát triển khối u, kháng khuẩn, tác dụng chống trầm cảm, tác dụng chống viêm giảm đau, ức chế thần kinh trung ương, chống oxy hóa, tăng cường miễn dịch Hiện nay, nước ta chưa có cơng trình nghiên cứu cơng bố thành phần hóa học, tác dụng sinh học ban dính, việc sử dụng làm thuốc cịn mang tính kinh nghiệm dân gian Nhằm tạo sở khoa học cho khai thác sử dụng có hiệu ban dính làm thuốc chữa bệnh Việt Nam, đề tài “Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học số tác dụng sinh học ban dính Hypericum sampsonii Hance., họ Ban (Hypericaceae)” Mục tiêu nội dung Luận án 2.1 Mục tiêu Luận án Mục tiêu Giám định tên khoa học, nghiên cứu đặc điểm thực vật đặc điểm vi học thân, lá, rễ ban dính Mục tiêu Nghiên cứu thành phần hóa học phần mặt đất ban dính Mục tiêu Đánh giá độc tính cấp cao chiết phần mặt đất ban dính, nghiên cứu số tác dụng sinh học cao chiết phần mặt đất ban dính số hoạt chất phân lập 2.2 Nội dung Luận án ➢ Về thực vật - Giám định tên khoa học, mơ tả đặc điểm hình thái thực vật, nghiên cứu đặc điểm vi học mẫu nghiên cứu ➢ Về thành phần hóa học - Định tính nhóm chất dược liệu nghiên cứu - Chiết xuất phân lập số hợp chất từ phần mặt đất - Xác định cấu trúc hóa học hợp chất phân lập ➢ Về hoạt tính sinh học - Đánh giá độc tính cấp cao chiết phần mặt đất ban dính - Nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa, chống viêm, hoạt tính ức chế enzym acetylcholinesterase in vitro cao chiết phần mặt đất ban dính số hoạt chất phân lập - Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan, cải thiện trí nhớ in vivo cao chiết phần mặt đất ban dính Những đóng góp Luận án 3.1 Về thực vật học Luận án tài liệu Việt Nam mô tả chi tiết đặc điểm hình thái thực vật, đặc điểm vi phẫu thân, lá, rễ bột thân,lá, rễ ban dính – Hypericum sampsonii Hance, họ Ban (Hypericaceae) 3.2 Về hóa học Từ phần mặt đất ban dính – Hypericum sampsonii Hance phân lập xác định cấu trúc hóa học 15 hợp chất, đó: - 05 hợp chất lần phân lập từ ban dính – Hypericum sampsonii., (3,5,6-trihydroxy-1-methoxyxanthone, Petiolin F, Quercetin-3′-O-β-D-galactopyranosid, Quercetin-3-Oβ-D-galactopyranosid, Cratoxyarborenone F) - 10 hợp chất lại, bao gồm ( Mangiferin, Quercetin, 3,5dihydroxy-2′,4′,6′-trimethoxybenzophenon-3-O-α-Lrhamnopyranosid, Neolancerin, Euxanthon, 2-hydroxyxanthon, acid betulinic, 3,5-dihydroxy-2’,4’,6’-trimethoxybenzophenon, I3-II8-biapigenin Daucosterol) 3.3 Về độc tính hoạt tính sinh học - Kết nghiên cứu công bố Ban dính khơng có độc tính cấp mức liều sử dụng đường uống - Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa 09 chất tinh khiết phân lập (HSA1, HSA2, HSA4, HSA9, HSA13, HSA15, HSA16, HSA17 HSA20) cao chiết BLD1 cho thấy nồng độ nghiên cứu 100 μM hai hợp chất HSA1 HSA2 có hoạt tính chống oxy hóa qt gốc tự DPPH tốt so với hợp chất khác nghiên cứu Mẫu cao chiết BLD1 có khả chống oxy hóa quét gốc tự DPPH tốt nồng độ thử nghiệm 100 µg/ml 500 µg/ml Trong chất HSA1 có hoạt tính chống oxi hóa tốt với IC 50 = 35,48 ± 1,23 µM so với HSA2 cao chiết BLD1 - Đánh giá hoạt tính chống viêm 03 chất tinh khiết phân lập (HSA4, HSA9 HSA20) cao chiết BLD1 cho thấy chất HSA4 thể hoạt tính ức chế sản sinh NO tốt với giá trị IC50 = 2,00 ± 0,34 µM so với 02 chất lại Mẫu cao lỏng BLD1 chưa thể hoạt tính nồng độ nghiên cứu - Đánh giá hoạt tính ức chế enzym acetylcholinesterase 09 chất tinh khiết phân lập (HSA1, HSA2, HSA4, HSA9, HSA13, HSA15, HSA16, HSA17 HSA20) cao chiết BLD1 cho thấy, hợp chất HSA15 có hoạt tính ức chế phản ứng thủy phân enzym acetylcholinesterase nồng độ thử nghiệm 50µM 200µM so với hợp chất khác nghiên cứu Ở nồng độ thử nghiệm 100 µg/ml 500 µg/ml, mẫu cao chiết BLD1 có hoạt tính ức chế enzym acetylcholinesterase tốt Với giá trị IC50 HSA15 cao chiết BLD1 thể hoạt tính ức chế enzym acetylcholinesterase mức trung bình - Đã chứng minh cao lỏng phần mặt đất BLD1 Ban dính có tác dụng cải thiện trí nhớ (Thơng qua mơ hình: Mơ hình mê cung nước Morris, Mơ hình mê cung chữ T, Mơ hình trục quay Rotarod), tác dụng chống oxy hóa bảo vệ gan (Thơng qua mơ hình gây tổn thương gan Paracetamol) Ý nghĩa luận án Đây lần lồi Ban dính Việt Nam nghiên cứu đầy đủ thực vật, thành phần hóa học hoạt tính sinh học - Tên khoa học mẫu nghiên cứu xác định giúp cho kết nghiên cứu hóa học tác dụng sinh học khẳng định rõ nguồn gốc - Đặc điểm vi học góp phần nhận biết tiêu chuẩn hóa dược liệu - Kết nghiên cứu thành phần hóa học giúp bổ sung tư liệu cho ngành hóa học hợp chất thiên nhiên nói chung chi Hypericum L., ban dính – Hypericum sampsonii Hance nói riêng - Kết nghiên cứu hoạt tính sinh học ban dính góp phần giải thích kinh nghiệm sử dụng dân gian làm sở cho việc sử dụng ban dính Đồng thời sở khoa học mở triển vọng nghiên cứu đầy đủ để sử dụng rộng rãi dược liệu theo hướng điều trị bệnh liên quan đến ung thư chống viêm Bố cục luận án Luận án có 118 trang, gồm chương, 38 bảng, 44 hình, 165 tài liệu tham khảo 16 phụ lục Các phần luận án: Đặt vấn đề (2 trang), Tổng quan (24 trang), Đối tượng phương pháp nghiên cứu (16 trang), Kết nghiên cứu (55 trang), Bàn luận (18 trang), Kết luận kiến nghị (3 trang) B NỘI DUNG CỦA LUẬN ÁN CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN Đã tổng hợp trình bày cách hệ thống kết nghiên cứu từ trước đến thực vật, thành phần hóa học hoạt tính sinh học chi Hypericum L, số loài tiêu biểu chi ban dính – Hypericum sampsonii Hance, giới Việt Nam CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu Mẫu nghiên cứu thân, rễ Ban dính mọc tự nhiên, có đầy đủ phận (cành, lá, hoa) thu thập xã Hà Vị, huyện Bạch Thông, tỉnh Bắc Kạn tháng 06 năm 2016 Tiêu lưu giữ Phòng tiêu Khoa tài nguyên dược liệu - Viện Dược liệu - NIMM (số hiệu DL-130616); phòng Tiêu thực vật Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam (số hiệu DTT 20160611) 2.2 Phương pháp nghiên cứu - Giám định tên khoa học loài nghiên cứu sở phân tích đặc điểm hình thái thực vật, so sánh với tài liệu cơng bố lồi khóa phân loại thực vật - Xác định đặc điểm vi phẫu thân, đặc điểm bột dược liệu phương pháp hiển vi - Xác định cấu trúc hợp chất phân lập dựa thông số vật lý phương pháp phổ ESI-MS, HR-EI-MS, NMR chiều chiều, COSY, HMBC, NOESY kết hợp đối chiếu với tài liệu công bố - Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa in vitro: Phương pháp thu dọn gốc tự DPPH - Đánh giá hoạt tính chống viêm in vitro phương pháp xác định khả ức chế sản sinh NO đại thực bào RAW 264.7 - Đánh giá hoạt tính ức chế enzym acetylcholinesterase in vitro phương pháp Ellman’s - Đánh giá tác dụng chống oxy hóa bảo vệ gan thực mơ hình chuột nhắt trắng gây độc gan cấp paracetamol đường uống liều cao - Đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ mơ hình mê cung nước Morris, mê cung nhiều chữ T mơ hình trục quay Rotarod CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Kết mô tả đặc điểm hình thái thực vật, giám định tên khoa học xác định đặc điểm vi học mẫu nghiên cứu 3.1.1 Đặc điểm hình thái thực vật Ban dính thân thảo, sống lâu năm Cây có thân trịn nhẵn, rễ gồm rễ nhiều dễ phụ Lá mọc đối, khơng có cuống lá, dính lấy ơm lấy thân Hoa Ban dính có màu vàng cánh, mọc thành cụm hoa dạng xim ngụ đầu cành hay Lá bắc nhỏ hình mác, đài hình bầu dục Nhị hoa nhiều (30 đến 45 nhị hoa), hợp thành nhóm với nhị dài Quả nang hình trịn, hạt nhiều hình trứng thn dài Mùa hoa vào tháng 4-5, chín rụng vào tháng 7-8 3.1.2 Giám định tên khoa học Đã giám định tên khoa học ban dính thu hái xã Hà Vị, huyện Bạch Thông, tỉnh Bắc Kạn tháng 06 năm 2016 Hypericum sampsonii Hance, họ Ban (Hypericaceae) 3.1.3 Đặc điểm vi học * Vi phẫu thân: Thiết diện cắt ngang thân Ban dính hình trịn hay gần trịn Quan sát từ ngồi vào trong: Biểu bì lớp tế bào hình chữ nhật xếp liên tục, đặn Mô mềm vỏ tế bào hình chữ nhật, xếp khít nằm sát lớp biểu bì Hàng tế bào trụ bì gồm tế bào hình chữ nhật dài, xếp thành lớp sát libe Bó libe-gỗ xếp theo vịng trịn, libe bên ngồi, thường bị ép bẹp Mơ mềm ruột gồm tế bào hình đa giác, có kích thước lớn xếp sát * Vi phẫu lá: Phần gân lá: Mặt cắt ngang gân có mặt lõm, mặt lồi Quan sát thấy có: ngồi lớp biểu bì hình chữ nhật xếp đặn thành dày, hóa cutin phần Mơ mềm tế bào hình đa giác hình trịn, kích thước to nhỏ khác xếp khít Bó libe-gỗ xếp theo kiểu vịng cung với gỗ hướng vào tâm Libe-gỗ tập trung thành bó chủ yếu gân lá, đơi xếp thành bó rời Ở hai bên gân rải rác có bó libe-gỗ phụ Phần phiến lá: Biểu bì lớp tế bào xếp liên tục, đặn Biểu bì gồm tế bào có kích thước nhỏ biểu bì mang lỗ khí Mơ giậu hàng tế bào hình chữ nhật xếp sát nhau, vng góc với biểu bì Mơ khuyết gồm tế bào có kích thước khác xếp lộn xộn, rải rác có bó libe-gỗ nhỏ * Vi phẫu rễ: Mặt cắt ngang rễ Ban dính trịn gần trịn Quan sát từ ngồi vào thấy: Bần gồm từ 3-5 lớp tế bào hình chữ nhật xếp liên tục, đặn thành vịng trịn đồng tâm Mơ mềm tế bào hình trịn, bầu dục, kích thước to nhỏ khác nhau, xếp sát Libe-gỗ nằm phần trung tâm rễ, gỗ chiếm phần lớn thiết diện nằm trong, libe gồm 5-7 lớp tế bảo nhỏ, thành mỏng thường bị ép bẹp * Đặc điểm bột thân, rễ: Bợt lá: có màu xanh nhạt, mùi thơm nhẹ Quan sát kính hiển vi thấy có: Mảnh mơ mềm, Lỗ khí, Mảnh biểu bì phiến lá, Mảnh mạch điểm, Mảnh mạch xoắn Bợt thân: có màu nâu nhạt, khơng mùi, khơng vị Quan sát kính hiển vi thấy có: Mảnh bần, Hạt tinh bột hình cầu có rốn dạng chấm chia vạch, Bó sợi, Mảnh mạch xoắn, Mảnh mạch vịng, Mảnh mạch điểm Bợt rễ: có số đặc điểm giống bột thân như: Mảnh bần, bó sợi, tinh bột, mảnh mạch vịng, mảnh mạch điểm 3.2 Kết nghiên cứu thành phần hóa học phần mặt đất ban dính 3.2.1 Định tính nhóm hợp chất hữu Kết cho thấy nhóm hợp chất có ban dính có chứa chủ yếu nhóm chất sau: flavonoid, tanin, saponin, polysaccarid, đường tự chất béo 3.2.2 Xác định cấu trúc hợp chất phân lập từ phần mặt đất ban dính Bằng phương pháp sắc ký cột tiến hành phân lập 15 hợp chất (HSA1, HSA2, HSA4, HSA6, HSA9, HSA11, HSA12, HSA13, HSA15, HSA16, HSA17, HSA18, HSA20, HSA21 HSA22) từ phần mặt đất ban dính Cấu trúc hợp chất xác định dựa việc phân tích liệu phổ so sánh với tài liệu công bố * Hợp chất HSA1: dạng bột màu vàng Phổ 1H-NMR xuất tín hiệu đặc trưng bao gồm: tín hiệu proton thơm dạng singlet quan sát thấy tại δH 6,36 (1H, s), 6,85 (1H, s), 7,37 (1H, s); tín hiệu proton anome δH 4,59 (1H, d, J = 10,0 Hz) gợi ý cấu trúc hợp chất HSA1 có mặt hai vịng thơm phân tử Phổ 13C-NMR thấy xuất 19 tín hiệu carbon bao gồm: 12 tín hiệu carbon thơm δC 93,3, 102,6, 101,3, 107,6, 108,0, 111,7, 143,7, 150,8, 154,1, 156,2, 161,8 163,8; tín hiệu carbon carbonyl δC 179,1 carbon thuộc phân tử đường δC 61,5, 70,2, 70,6, 73,1, 78,9 81,5 Các tín hiệu phổ 1H-NMR 13C-NMR gợi ý cấu trúc hợp chất HSA1 có dạng xanthone glycosid Các tín hiệu proton gán với tín hiệu carbon tương ứng xác định dựa vào tương tác trực tiếp từ H đến C phổ HSQC Vị trí nhóm hydroxy C-1, C-3 phần đường C-2 xác định dựa vào tương tác HMBC H-4 (δH 6,36) với C-2 (δC 107,6)/ C-3 (δC 163,8) tương tác proton anome H-1′(δH 4,59) với C-2 (δC 107,6)/ C-3 (δC 163,8)/ C-4 (δC 93,3) Các tương tác H-5 (δH 6,85) với C6 (δC 154,1)/ C-7 (δC 143,7) H-8 (δH 7,37) với C-6 (δC 154,1)/ C-7 (δC 143,7)/ C-9 (δC 179,1) cho phép xác định vị trí hai nhóm hydroxy C-6, C-7 Hợp chất HSA1 xác định mangiferin * Hợp chất HSA2: có dạng bột, màu vàng Cơng thức phân tử HSA2 xác định C 14H10O6 xuất píc ion giả phân tử [M+H]+ m/z 275,0549, phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS, CTPT: [C14H11O6: 275,0556] Phổ 1H-NMR hợp chất HSA2 xuất tín hiệu proton thơm δH 6,33 (1H, s), 6,45 (1H, s), 6,81 (1H, d, J = 8,5 Hz), 7,38 (1H, d, J = 8,5 Hz) nhóm methoxy δH 3,81 (s) Phổ 13C-NMR xuất 14 tín hiệu carbon bao gồm: 12 carbon thơm δC 95,1, 95,5, 104,8, 112,4, 115,9, 116,1, 132,0, 145,0, 150,2, 159,0, 161,8 163,2; carbon carbonyl δC 173,3 carbon methoxy δC 55,9 Các tín hiệu phổ 1H-NMR 13C-NMR gợi ý cấu trúc hợp chất HSA2 có dạng xanthon Vị trí nhóm methoxy C-1 hydroxy C-3 xác định dựa vào tín hiệu tương tác phổ HMBC H-2 (δH 6,33) với C-1 (δC 161,8)/ C-3 (δC 163,2)/ C-4 (δC 95,1); H-4 (δH 6,45) với C-2 (δC 95,5)/ C-3 (δC 163,2)/ C-4a (δC 159,0)/ C-9a (δC 104,8) proton methoxy (δH 3,81) với C-1 (δC 161,8) Các tương tác HMBC H-7 (δH 6,81) với C-5 (δC 132,0)/ C-6 (δC 150,2)/ C8a (δC 116,1) H-8 (δH 7,38) với C-6 (δC 150,2)/ C-9 (δC 173,3)/ C-10a (δC 145,0) cho phép xác định vị trí nhóm methoxy C-5 C-6 Từ phân tích kết hợp so sánh số liệu phổ NMR với hợp chất 3,6-dihydroxy-1,5-dimethoxyxanthone, xác định hợp chất HSA2 3,5,6-trihydroxy-1methoxyxanthone * Hợp chất HSA4: có dạng bột, màu vàng Công thức phân tử HSA4 xác định C 19H20O10 xuất píc ion phân tử [M+H] + m/z 407,1016 phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS (tính tốn lý thuyết cho công thức [C19H21O10]+: 407,0978) Phổ 1H-NMR hợp chất HSA4 thấy tín hiệu proton thuộc vịng thơm đối xứng 1,3,5 δH 6,47 (1H, t, J = 2,0 Hz), 6,59 (2H, d, J = 2,0 Hz), hai proton thuộc vòng thơm 3,5,4,6 δH 6,07 (1H, d, J = 1,5 Hz), 6,31 (1H, d, J = 1,5 Hz), proton anome δH 5,24 (1H, d, J = 1,0 Hz) nhóm methyl bậc δH 1,22 (3H, d, J = 6,0 Hz) Phổ 13 C-NMR hợp chất HSA4 xuất 19 tín hiệu carbon bao gồm: nhóm carbon carbonyl (δC 199,3); 12 carbon thơm carbon đặc trưng phần đường rhamnopyranose (Bảng 3.4) Giá trị độ dịch chuyển hóa học phần đường với số tương tác proton anome (JH-1′′/H-2′′ = 1,0 Hz) cho phép dự đoán phần đường hợp chât HSA4 O-α-L-rhamnopyranose Dữ liệu phổ gợi ý hợp chất HSA4 benzophenone glycosid Các tín hiệu tương tác phổ HMBC cho phép xác định phần khung hợp chất HSA4 3,5,2′,4′,6′-pentahydroxybenzophenone-2′O-α-L-rhamnopyranosid Vị trí phần đường liên kết với khung chất C-2′ liên kết glycosid xác định dựa vào tín hiệu tương tác proton anome (δH 5,24) với C-2′(δC 159,4) phổ HMBC Hợp chất HSA4 xác định petiolin F * Hợp chất HSA6: có dạng bột màu vàng Phổ 1H-NMR hợp chất HSA6 xuất tín hiệu ba proton thơm thuộc hệ tương tác spin-spin ABX δH 6,89 (1H, d, J = 8,5 Hz), 7,68 (1H, d, J = 2,0 Hz), 7,54 (1H, dd, J = 2,0, 8,5 Hz) hai proton thơm thuộc hệ tương tác spin-spin AX δH 6,14 (1H, d, J = 2,0 Hz), 6,18 (1H, d, J = 2,0 Hz) Phổ 13C-NMR DEPT hợp chất HSA6 thấy xuất 15 tín hiệu carbon đặc trưng cho dạng hợp chất flavonoid khung quercetin bao gồm: tín hiệu carbon carbonyl δC 175,9; tín hiệu carbon methin δC 93,5, 98,3, 115,2, 115,7, 120,1 tín hiệu carbon khơng liên kết trực tiếp với hydro δC 103,1, 122,1, 135,8, 145,2, 146,9, 147,8, 156,3, 160,8 164,0 Hợp chất HSA6 xác định quercetin * Hợp chất HSA9: có dạng bột màu vàng Phổ 1H-NMR hợp chất HSA9 xuất tín hiệu proton thơm bao gồm: có proton thuộc vịng thơm 1,3,5 δH 6,75 (1H, t, J = 2,0 Hz), 6,89 (1H, dd, J = 1,5, 2,0 Hz), 6,95 (1H, dd, J = 1,5, 2,0 Hz) proton thơm δH 6,31 (2H, s) Bên cạnh cịn quan sát thấy tín hiệu nhóm methoxy δH 3,72 (6H, s) 3,88 (3H, s) tín hiệu đặc trưng đơn vị đường gồm: proton anome δH 5,35 (1H, d, J = 1,5 Hz); nhóm methyl δH 1,23 (3H, d, J = 6,0 Hz) proton vùng có độ dịch chuyển hóa học từ 3,46 đến 3,98 Phổ 13C-NMR HSQC xuất tín hiệu nhóm methyl δC 18,0, 56,0 (4΄-OCH3), 56,3 (2΄-OCH3, 6΄-OCH3), 10 nhóm methine δC 70,7, 72,0, 72,2, 73,8, 91,9 (C-3΄, C-5΄), 100,1, 109,7, 110,0, 111,3 tín hiệu carbon khơng liên kết với hydro δC 111,8, 141,8, 159,0, 160,1 (C-5, C-2΄, C-6΄), 164,4 197,2 Phân tích số liệu phổ 1H- NMR, 13 C-NMR HSQC xác định cấu trúc HSA9 có mặt hai vịng thơm, nhóm keton, ba nhóm methoxy đơn vị đường Độ dịch chuyển carbon thuộc phần đường (δC 100,1, 72,2, 72,0, 73,8, 70,7 18,0) số tương tác nhỏ H-1 H-2 proton anome (JH-1/H-2 = 1,5 Hz) gợi ý phần đường hợp chất HSA9 α-L-rhamnopyranosid Tín hiệu tương tác phổ HMBC H-2 (δH 6,95) với C-4 (δC 110,0)/ C-6 (δC 111,3)/ C=O (δC 197,2), H-4 (δH 6,75) với C-3 (δC 159,0), H-6 (δH 6,89) với C-4 (δC 110,0)/ C-5 (δC 160,1)/ C=O (δC 197,2) proton anome (δH 5,35) với C-3 (δC 159,0) cho phép xác định vị trí nhóm keton, phần đường hydroxy C-1, C-3 C-5 Tương tự, vị trí nhóm methoxy C-2′, C-4′, C-6′ vịng thơm đối xứng lại xác định dựa vào phổ HMBC quan sát thấy có tương tác proton H-3′, H-5′ (δH 6,31) với C-1′ (δC 111,8)/ C-2′, C-6′ (δC 160,1)/ C-4′ (δC 164,4) proton nhóm methoxy (δH 3,72) với C-2′, C-6′ (δC 160,1) nhóm methoxy (δH 3,88) với C-4′ (δC 164,4) Hợp chất HSA9 xác định 3,5-dihydroxy-2′,4′,6′-trimethoxybenzophenon-3-O-α-Lrhamnopyranosid * Hợp chất HSA11: có dạng bột vơ định hình màu vàng Phổ H-NMR hợp chất HSA11 thấy tín hiệu proton thơm meta δH 6,20 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-6), 6,46 (1H, brs, H-8); 10 proton thơm hệ ABX vòng B δH 8,19 (1H, s, H-2′), 6,99 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-5′), 7,90 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-6′) proton anome δH 4,82 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-1′′) gợi ý có mặt đơn vị đường Phổ 13C-NMR HSQC hợp chất HSA11 xuất 21 tín hiệu carbon bao gồm: 15 carbon đặc trưng phần khung flavone carbon đơn vị đường Số liệu độ dịch chuyển hóa học carbon thuộc phần đường (δC 105,2, 72,4, 74,6, 70,1, 77,2 62,3) số tương tác proton anome (JH-1′′/ H-2′′ = 8,0 Hz) cho phép xác định phần đường hợp chất HSA11 O-β-galactopyranosyl Vị trí phần đường hợp chất HSA11 C-3′′ xác định dựa vào tương tác HMBC H1′′ (δH 4,82) với C-3′ (δC 146,7), nhóm cịn lại xác định dựa vào tương tác phổ HSQC HMBC Hợp chất HSA11 xác định quercetin-3′-O-β-D-galactopyranosid * Hợp chất HSA12: có dạng bột vơ định hình, màu vàng nhạt Phổ HR-ESI-MS: m/z 465,1033 [M+H]+, CTPT: C21H21O12 Phổ 1HNMR hợp chất HSA12 xuất tín hiệu hai proton thơm thuộc hệ tương tác spin-spin AX vòng A δH 6,20 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-6) 6,42 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-8); ba proton thơm thuộc hệ tương tác spin-spin ABX vòng B δH 7,85 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-2′), 6,88 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-5′) 7,61 (1H, dd, J = 2,5, 8,5 Hz, H-6′) gợi ý có mặt khung flavon Sự xuất proton anome δH 5,17 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-1′′) gợi ý có mặt đơn vị đường Phổ 13C-NMR HSQC hợp chất HSA12 xuất 21 tín hiệu carbon bao gồm: carbon carbonyl δC 179,5; carbon không liên kết trực tiếp với hydro δC 166,3, 163,0, 158,8, 158,5, 150,0, 145,8, 135,8, 122,9 105,4; 10 carbon methine δC 123,0, 117,8, 116,1, 105,4, 100,0, 94,8, 77,2, 75,1, 73,2 70,0; carbon methylene δC 62,0 Trên phổ HMBC quan sát thấy có tương tác H-6 (δH 6,20) với C-5 (δC 163,0)/ C-7 (δC 166,3)/ C-8 (δC 94,8)/ C-10 (δC 105,4) H-8 (δH 6,42) với C-6 (δC 100,0)/ C-7 (δC 166,3)/ C-9 (δC 158,5)/ C-10 (δC 105,4) xác định proton thơm hệ AX C-6 C-8 Hằng số tương tác JH-1′′/H-2′′ = 8,0 Hz giá trị độ chuyển dịch hóa học phần đường (δC 105,4, 77,2, 75,1, 73,2, 70,0 62,0) cho phép xác định phần đường hợp chất HSA12 O-β-galactopyranosyl Vị trí phần đường liên kết với khung chất C-3 xác định dựa vào 11 tương tác HMBC H-1′′ (δH 5,17) với C-3 (δC 135,8) Tương tác HMBC H-2′ (δH 7,85) với C-2 (δC 158,8)/C-3′ (δC 145,8)/ C-4′ (δC 150,0), H-5′ (δH 6,88) với C-1′ (δC 122,9)/ C-3′ (δC 145,8)/ C-4′ (δC 150,0) H-6′ (δH 7,61) với C-1′ (δC 122,9)/ C-4′ (δC 150,0) gợi ý có mặt nhóm hydroxy C-3′ C-4′ Từ phân tích hợp chất HSA12 xác định quercetin-3-O-β-D-galactopyranosid * Hợp chất HSA13: có dạng bột, màu vàng Phổ 1H-NMR hợp chất HSA13 xuất tín hiệu bốn proton thơm δH 6,27 (1H, s), 7,22 (1H, d, J = 8,5 Hz), 7,32 (1H, d, J = 8,5 Hz) 7,48 (1H, s); proton anome δH 4,92 (d, 9,5) proton đơn vị đường vùng có độ dịch chuyển hóa học từ 3,44 đến 4,30 ppm Trên phổ 13C-NMR HSQC hợp chất HSA13 xuất 19 tín hiệu carbon bao gồm: 13 carbon đặc trưng khung xanthone δC 163,6 (C-1), 108,7 (C-2), 165,4 (C-3), 94,5 (C-4), 159,2 (C-4a), 155,1 (C-4b), 119,5 (C-5), 124,8 (C-6), 151,0 (C-7), 109,5 (C-8), 122,2 (C-8a), 102,3 (C-8b), 181,0 (C-9) đơn vị đường δC 75,5 (CH), 72,4 (CH), 80,5 (CH), 71,7 (CH), 82,5 (CH) 62,8 (CH2) Từ phân tích hợp chất HSA13 dự đốn xanthone glycosid Phổ HMBC t thấy tín hiệu tương tác proton H-5 (δH 7,32) với carbon C-4b (δC 155,1)/ C-7 (δC 151,0)/ C-8a (δC 122,2) proton H-8 (δH 7,48) với C-6 (δC 124,8)/ C-7 (δC 151,0)/ C-8a (δC 122,2)/ C-9 (δC 181,0) với giá trị độ dịch chuyển hóa học C-7 (δC 151,0) cho phép xác định vị trí nhóm hydroxy vịng A Vị trí phần đường C-2 xác định dựa vào tương tác HMBC proton anome (δH 4,92) với C-1 (δC 163,6)/ C-2 (δC 108,7)/ C-3 (δC 165,4) Hợp chất HSA13 xác định neolancerin * Hợp chất HSA15: có dạng bột, màu vàng Phổ 1H-NMR hợp chất HSA15 xuất tín hiệu ba proton thơm thuộc hệ tương tác spin-spin ABX δH 7,32 (1H, dd, J = 3,0, 9,0 Hz), 7,48 (1H, d, J = 9,0 Hz), 7,51 (1H, d, J = 3,0 Hz) hai proton vị trí ortho vòng thơm δH 6,65 (1H, d, J = 9,0 Hz), 7,34 (1H, d, J = 9,0 Hz) nhóm methoxy δH 3,94 (3H, s) Phổ 13 C-NMR DEPT hợp chất HSA15 thấy xuất 14 tín hiệu carbon bao gồm: nhóm methoxy δC 57,8, năm nhóm methine δC 109,0, 109,2, 120,4, 121,4, 126,4 tám carbon 12 không liên kết với hydro δC 109,3, 122,2, 141,6, 147,4, 151,4, 155,5, 155,6 183,4 Các tín hiệu phổ 1D-NMR gợi ý hợp chất HSA15 có cấu trúc khung xanthone, chứa ba nhóm (hai nhóm hydroxy nhóm methoxy) So sánh số liệu phổ NMR hợp chất HSA15 với hợp chất cratoxyarborenone F Xác định hợp chất HSA15 cratoxyarborenone F * Hợp chất HSA16: có dạng bột vơ định hình, màu vàng Phổ H-NMR hợp chất HSA16 thấy xuất tín hiệu ba proton thuộc vòng thơm 1,3,4 δH 7,33 (1H, dd, J = 2,0, 9,0 Hz), 7,44 (1H, d, J = 9,0 Hz), 7,53 (1H, d, J = 2,0 Hz) ba proton thuộc vòng thơm 1,2,3 δH 6,74 (1H, d, J = 8,0 Hz), 6,95 (1H, d, J = 8,5 Hz), 7,63 (1H, dd, J = 8,0, 8,5 Hz) Trên phổ 13 C-NMR DEPT hợp chất HSA16 thấy xuất tín hiệu, điều cho phép xác định có mặt nhóm CH δC 108,1, 109,3, 110,7, 120,2, 126,4, 137,9 carbon không liên kết với hydro 109,5, 122,2, 151,5, 155,5, 157,9, 162,9 183,5 Phân tích liệu 1D-NMR với công thức phân tử xác định C 13H8O4 cho phép dự đoán HSA16 hợp chất xanthon có hai nhóm hydroxy Hợp chất HSA16 xác định euxanthon * Hợp chất HSA17: có dạng bột, màu vàng Phổ 1H-NMR hợp chất HSA17 xuất tín hiệu bảy proton thuộc vịng thơm 1,2 δH 7,44 (1H, ddd, J = 1,0, 8,0, 8,0 Hz), 7,59 (1H, brd, J = 7,0 Hz), 7,83 (1H, ddd, J = 1,5, 7,0, 8,0 Hz), 8,27 (1H, dd, J = 1,5, 8,0 Hz) vòng thơm 1,3,4 δH 7,34 (1H, dd, J = 3,0, 9,0 Hz), 7,59 (1H, d, J = 3,0 Hz) 7,51 (1H, d, J = 9,0 Hz) Trên phổ 13C-NMR DEPT hợp chất HSA17 xuất 13 tín hiệu carbon bao gồm: nhóm carbonyl (δC 179,0), nhóm CH (δC 109,8, 119,2, 120,5, 124,9, 125,9, 127,2, 136,3) carbon không liên kết với hydro (δC 122,0, 123,3, 151,6, 155,5, 157,7) Trên phổ 1D-NMR công thức phân tử xác định dựa vào phổ khối lượng phân giải cao gợi ý hợp chất HSA17 hợp chất khung xanthone đơn giản, có nhóm hydroxy Hợp chất HSA17 xác định 2-hydroxyxanthon * Hợp chất HSA18: có dạng tinh thể hình kim, màu trắng phổ H-NMR hợp chất HSA18 xuất tín hiệu sáu nhóm methyl δ H 0,76 (3H, s), 0,83 (3H, s), 0,94 (3H, s), 0,97 (3H, s), 13 0,98 (3H, s) 1,69 (3H, s), hai proton olefin δ H 4,61 (1H, s), 4,74 (1H, s) proton oxymethine δ H 3,19 (1H, dd, J = 5,0, 11,0 Hz) Trên phổ 13C-NMR HSQC hợp chất HSA18 xuất 30 tín hiệu carbon bao gồm: nhóm carboxyl δ C 180,0; carbon bậc δ C 37,3, 38,9, 40,7, 42,5, 56,3 150,4; nhóm methine δC 38,4, 46,9, 49,3, 50,6, 55,4 79,0; 11 nhóm methylene δC 18,3, 20,9, 25,6, 27,4, 29,7, 30,6, 32,2, 37,1, 34,4, 38,8 109,7; nhóm methyl δ C 14,7, 15,4, 16,1, 16,1, 19,4 28,0 Phổ 1H- NMR, 13C-NMR HSQC cho phép dự đoán hợp chất HSA18 thuộc lớp chất triterpenoid có cấu trúc khung lupane Trên phổ HMBC hợp chất HSA18 thấy có tín hiệu tương tác proton thuộc hai nhóm methyl H-23 (δH 0,76), H-24 (δH 0,83) với carbon C-3 (δC 79,0)/ C-4 (δC 38,9)/ C-5 (δC 55,4) giá trị độ dịch chuyển hóa học C-3 (δC 79,0) cho phép xác định vị trí nhóm hydro C-3 hai nhóm methyl C-4 Tương tự, vị trí nhóm methyl cịn lại C-8, C10, C-14, C-20 xác định dựa vào tương tác HMBC proton H-26 (δH 0,94) với C-7 (δC 34,4)/ C-8 (δC 40,7)/ C-9 (δC 50,6)/ C-14 (δC 42,5), proton H-25 (δH 0,83) với C-1 (δC 38,8)/ C-5 (δC 55,4)/ C-9 (δC 50,6)/ C-10 (δC 37,3), proton H-27 (δH 0,98) với C-8 (δC 40,7)/ C-13 (δC 38,4)/ C-14 (δC 42,5)/ C-15 (δC 30,6) proton H-30 (δH 1,69) với C-19 (δC 46,9)/ C-20 (δC 150,4)/ C29 (δC 109,7) Ngoài ra, tương tác proton H-18 (δH 1,62) với C-13 (δC 38,4)/ C-17 (δC 56,3)/ C-19 (δC 46,9)/ C-28 (δC 180,0) cho phép xác định vị trí nhóm carbonyl C-28 Hợp chất HSA18 xác định acid betulinic * Hợp chất HSA20: có dạng bột màu vàng Phổ 1H-NMR hợp chất HSA20 xuất tín hiệu ba proton thuộc vòng thơm đối xứng 1,3,5 δH 6,49 (1H, t, J = 2,5 Hz), 6,71 (2H, d, J = 2,5 Hz); hai proton vòng thơm đối xứng lại δH 6,30 (2H, brs) chín proton thuộc ba nhóm methoxy δH 3,70 (6H, s), 3,86 (3H, s) Phổ 13C-NMR hợp chất HSA20 xuất 16 tín hiệu carbon bao gồm: nhóm methine δC 91,6 (C-3, C-5), 108,6, 108,8 (C-2, C-6); carbon không liên kết với hydro δC 112,1, 141,7, 159,7 (C-3, C-5), 160,0 (C-2, C-6), 164,3, 197,7 nhóm methoxy δC 56,2, 56,3 Số liệu phổ 1HNMR 13C-NMR hợp chất HSA20 hợp chất HSA9 14 giống ngoại trừ thiếu vắng tín hiệu thuộc phần đường α-rhamnopyranose so với hợp chất HSA9 Kết so sánh cho phép dự đoán hợp chất HSA20 dẫn xuất benzophenone Phổ HMBC thấy xuất tín hiệu tương tác proton H-4 (δH 6,49) với C-2, C-6 (δC 108,8)/ C-3, C-5 (δC 159,7), proton H-2, H-6 (δH 6,71) với C-3, C-5 (δC 159,7)/ C4 (δC 108,6)/ C=O (δC 197,7) với giá trị độ dịch chuyển hóa học carbon C-3, C-5 (δC 159,7) cho phép xác định vị trị nhóm ketone hai nhóm hydro C-1, C-3 C-5 Tương tự, vị trí ba nhóm methoxy C-2′, C-4′, C-6′ xác định dựa vào tương tác HMBC proton H-3′, H-5′ (δH 6,30) với C-1′ (δC 112,1)/ C-2′, C-6′ (δC 160,0)/ C-4′ (δC 164,3) tín hiệu tương tác hai nhóm methoxy (δH 3,70) với C-2′, C-6′ (δC 160,0) nhóm methoxy (δH 56,2) với C-4′ (δC 164,3) Hợp chất HSA20 xác định 3,5-dihydroxy-2′,4′,6′trimethoxybenzophenol * Hợp chất HSA21: có dạng bột màu vàng nhạt Phổ 1H-NMR hợp chất HSA21 xuất tín hiệu 12 proton thơm bao gồm: tám proton thơm thuộc hai hệ tương tác spin-spin AA′BB′ δH 6,67 (2H, dd, J = 1,5, 7,0 Hz), 6,80 (2H, brd, J = 9,0 Hz), 7,35 (2H, , dd, J = 1,5, 7,0 Hz) 7,57 (2H, brd, J = 9,0 Hz); hai proton thuộc hệ tương tác spin-spin AX δH 6,32 (1H, d, J = 2,0 Hz), 6,53 (1H, d, J = 2,0 Hz) hai proton thơm singlet δH 6,32 (1H, s), 6,56 (1H, s) Phổ 13C-NMR DEPT hợp chất HSA21 xuất 30 tín hiệu carbon bao gồm: 12 nhóm methine 18 carbon không liên kết với hydro Số liệu phổ 1D-NMR hợp chất HSA21 gợi ý hợp chất thuộc dạng bisflavone Hợp chất HSA21 I3-II8-biapigenin * Hợp chất HSA22: có dạng bột màu trắng Phổ 1H-NMR hợp chất HSA22 quan sát thấy xuất tín hiệu sáu nhóm methyl δH 0,65 (3H, s), 0,96 (3H, s), 0,90 (3H, d, J = 6,5 Hz), 0,78 (3H, d, J = 7,0 Hz), 0,80 (3H, d, J = 6,5 Hz) 0,81 (3H, d, J = 6,5 Hz); proton olefin δH 5,32 (1H, t, J = 2,5 Hz) proton anome δH 4,22 (1H, d, J = 8,5 Hz) Phổ 13C-NMR hợp chất HSA22 xuất 35 tín hiệu carbon bao gồm: 29 carbon phần aglycon carbon đơn vị đường Giá trị độ dịch chuyển hóa học carbon phần đường (δC 100,8, 73,4, 76,7, 15 70,1, 76,7, 61,1) với số tương tác proton anome (JH-1′′/H-2′′ = 8,5 Hz) cho phép dự đoán phần đường hợp chất HSA22 O-β-glucopyranose Bên cạnh đó, cặp tín hiệu δC 140,4 (C-5), 121,1 (C-6) đặc trưng cho liên kết đôi lần Hợp chất HSA22 xác định daucosterol Hình 4.1 Cấu trúc học học 15 hợp chất phân lập từ ban dính 16 3.3 Kết nghiên cứu độc tính cấp tác dụng sinh học 3.3.1 Độc tính cấp cao chiết Ban dính (BLD1) Chuột nhắt trắng uống cao chiết BLD1 với mức liều khác từ liều thấp 90,0gam dược liệu khơ/kg thể trọng đến liều chuột dung nạp 225,0gam dược liệu khô/kg thể trọng Để đánh giá độc tính cấp Ban dính khơng có chuột chết, khơng có dấu hiệu bất thường Chưa xác định LD50 3.3.2 Tác dụng sinh học 3.3.2.1 Kết xác định hoạt tính chống oxy hóa in vitro 09 chất tinh khiết phân lập cao chiết BLD1 - Trong 09 chất tinh khiết (HSA1, HSA2, HSA4, HSA9, HSA13, HSA15, HSA16, HSA17 HSA20) cho thấy nồng độ 100 μM hai hợp chất HSA1 HSA2 có hoạt tính chống oxy hóa qt gốc tự DPPH tốt so với hợp chất khác nghiên cứu Mẫu cao chiết BLD1 có khả chống oxy hóa quét gốc tự DPPH tốt nồng độ thử nghiệm 100 µg/ml 500 µg/ml tương ứng với IC50 = 35,48 ± 1,23 µM, IC50 = 87,10 ± 2,16 µM IC50 = 93,33 ± 1,78 µg/ml 3.3.2.2 Kết Đánh giá hoạt tính chống viêm in vitro 03 chất tinh khiết phân lập cao chiết BLD1 - 03 chất tinh khiết (HSA4, HSA9 HSA20) có hoạt tính ức chế sản sinh NO tốt nồng độ thử nghiệm 30 µM 100 µM (bảng 3.27), hợp chất HSA4 có hoạt tính ức chế sản sinh NO tốt với giá trị IC50 2,00 ± 0,34 giá trị gần tương đương với chất đối chứng dương 3.3.2.3 Kết xác định hoạt tính hoạt tính ức chế enzym acetylcholinesterase in vitro 09 chất tinh khiết phân lập cao chiết BLD1 - Trong 09 chất tinh khiết (HSA1, HSA2, HSA4, HSA9, HSA13, HSA15, HSA16, HSA17 HSA20) cho thấy hợp chất HSA15 có hoạt tính ức chế phản ứng thủy phân enzym acetylcholinesterase nồng độ thử nghiệm 50µM 200µM so với hợp chất khác nghiên cứu Ở nồng độ thử nghiệm 100 µg/ml 500 µg/ml, mẫu cao chiết BLD1 có hoạt tính ức chế enzym acetylcholinesterase tốt 17 - Vì tiếp tục đưa vào nghiên cứu cho thấy cao chiết BLD1 có hoạt tính ức chế enzym acetylcholinesterase tốt với giá trị IC 50 = 19.95 ± 1.09 µg/ml so với hợp chất HSA15 Cả hai mẫu nghiên cứu thể hoạt tính ức chế enzym acetylcholinesterase mức trung bình 3.3.2.4 Kết nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa bảo vệ gan in vivo cao chiết BLD1 a Kết ảnh hưởng cao chiết BLD1 trọng lượng gan chuột Trọng lượng gan chuột lô dùng cao chiết BLD1: Lô dùng liều 3,6gam/kg giảm rõ rệt so với lơ mơ hình, khác biệt có ý nghĩa thống kê với p < 0,001; Lô dùng liều 10,8gam/kg thể trọng khơng có khác biệt so với lơ mơ hình (p > 0,05) b Kết ảnh hưởng cao chiết BLD1 lên hoạt độ enzym AST, ALT - Lô dùng cao chiết BLD1 hai mức liều nghiên cứu có tác dụng làm giảm rõ rệt hoạt độ enzym AST so với lơ mơ hình (p < 0,001) Cao chiết BLD1 thể tác dụng làm giảm hoạt độ AST tốt silymarin liều 140 mg/kg (p < 0,001) - Lô dùng cao chiết BLD1 hai mức liều nghiên cứu có tác dụng làm giảm rõ rệt hoạt độ ALT so với lơ mơ hình (p < 0,001) Cao chiết BLD1 thể tác dụng làm giảm hoạt độ ALT tốt silymarin liều 140 mg/kg (p < 0,001) c Kết ảnh hưởng cao chiết BLD1 nồng độ MDA dịch đồng thể gan chuột - Lô dùng cao chiết BLD1 hai mức liều nghiên cứu có xu hướng làm giảm nồng độ MDA so với lơ mơ hình, nhiên khác biệt chưa có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) 3.3.2.5 Kết nghiên cứu tác dụng cải thiện trí nhớ in vivo cao chiết BLD1 a Kết nghiên cứu mơ hình mê cung nước Morris * Giai đoạn học hỏi Cao chiết BLD1 liều 3,6gam/kg 10,8gam/kg thời điểm nghiên cứu thời gian tìm thấy bến đỗ có xu hướng giảm so với ngày thứ 2, mức giảm có ý nghĩa thống kê quan sát thấy từ ngày thứ 3, 4, (p