Nghiên cứu tạo chế phẩm vi sinh vật có khả năng phân giải cellulose để xử lý rơm rạ thành phân bón hữu cơ

Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ sinh học LỜI CẢM ƠN Trong suốt trình thực tập thực luận văn nhận quan tâm, giúp đỡ nhiệt tình từ đơn vị thực tập Bằng lòng trân trọng biết ơn sâu sắc, xin chân thành cảm ơn: GS.TS Phạm Quốc Long – Viện trưởng Viện Hóa học Hợp chất thiên nhiên - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam tạo điều kiện cho thực tập viện Th.S Hồng Thị Bích – cán Trung tâm phát triển sản phẩm tự nhiên , người thầy tận tình bảo, truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm tạo điều kiện thuận lợi giúp tơi hồn thành khóa luận Các anh chị cán Trung tâm phát triển sản phẩm tự nhiên giúp đỡ tận tình cho lời khuyên quý báu suốt thời gian thực tập phịng Để hồn thành luận văn, sinh viên cần phải áp dụng tất kiến thức hiểu biết mà tích luỹ suốt năm học trường Chính vậy, kiến thức mà em tiếp thu năm học Viện Đại học Mở Hà Nội tảng vững giúp em hoàn thành luận văn Em xin gửi lời tri ân chân thành tới thầy cô khoa Công nghệ sinh học tận tình giảng dạy, giúp đỡ em suốt năm tháng vừa qua Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn đến gia đình , người thân bạn bè luôn bên cạnh quan tâm, sẻ chia , động viên giúp đỡ suốt trình học tập hồn thành khóa luận Hà Nội , ngày 20 tháng 05 năm 2015 Sinh viên Đặng Thu Thảo Khoá luận tốt nghiệp Đặng Thu Thảo – K18.11-04 Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ sinh học DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 : Lượng phát thải đốt rơm rạ phế thải từ ngắn ngày khác đồng ruộng châu Á hàng năm] Bảng 1.2 Lượng khí phát thải hoạt động đốt rơm rạ theo tỉ lệ ước tính ĐBSH [9] Bảng1.3 Giá trị trung bình thành phần hóa học rơm, rạ lúa (%) Bảng 1.4 Vi sinh vật phân huỷ lignocellulose (nuôi cấy được) 15 Bảng 1.5 Các tiêu định lượng bắt buộc phân bón 18 Bảng 2.1 Mật độ quang dãy dung dịch chuẩn Glucose 25 Bảng 3.1 Kết sàng lọc sơ hoạt tính cellulase mơi trường có 32 chất CMC 32 Bảng 3.2 Đường kính vịng phân giải chủng vsv môi trường chất CMC 33 Bảng 3.3 Ảnh hưởng pH đến khả sinh cellulase chủng vsv chọn 40 Bảng 3.4 Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả sinh cellulase chủng vsv chọn 41 Bảng 3.5 Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả sinh cellulase chủng vsv chọn 42 Bảng 3.6 Nồng độ đường khử dịch thủy phân 44 Bảng 3.7 Diện tích pic theo nồng độ glucose chuẩn 44 Bảng 3.8 Nồng độ glucose theo diện tích pic 45 Bảng 3.9 Sự thay đổi tỷ số C/N theo thời gian đống ủ rơm rạ 49 Khoá luận tốt nghiệp Đặng Thu Thảo – K18.11-04 Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ sinh học DANH MỤC CÁC HÌNH Hinh 1.1.Cấu trúc cellulose Hình 1.2: Cấu trúc khơng đồng phân tử cellulose Hình 1.3.a Xylan - Hemicellulose A Hình 1.3.b Arabinoxylan Hemicellulose B Hình 1.4 Các thành phần cấu tạo nên lignin Hình 1.5 Cấu trúc mạng lưới lignin Hình 1.6 Ba loại enzyme phức hệ cellulase 12 Hình 1.7 Cơ chế tác động hiệp đồng enzyme exo-endo endo-endo 13 Hình 1.8 Cơ chế trình thủy phân theo King Reese 14 Hình 2.1 Đồ thị Glucose chuẩn 25 Hình 3.1: Thử hoạt tính sơ phương pháp cấy chấm điểm 31 Hình 3.2 Thử hoạt tính chủng vsv môi trường CMC 34 Hình 3.3 Hình thái khuẩn lạc tế bào chủng Hud 4-1 34 HÌnh 3.4 Vị trí phân loại chủng Hud 4-1 với lồi có quan hệ họ 36 hàng gần 36 Hình 3.5 Hình thái khuẩn lạc (A) hình thái quan sinh sản (B) chủng AF67 (scale bar 20 µm) 37 Hình 3.6 Hình ảnh khuẩn lạc chủng 2P 38 Hình 3.7 Vị trí phân loại vủa chủng 2P 39 Hình 3.8 Ảnh hưởng pH tới hoạt tính chủng vsv chọn 40 Hình3.9: Ảnh hưởng nhiệt độ tới khả sinh trưởng chủng vsv 41 Hình 3.10 Ảnh hưởng thời gian tới hoạt tính chủng vsv chọn 43 Hình 3.11 Thiết bị lên nen quy mơ pilot 50 l / mẻ 43 Hình 12: Đồ thị đường chuẩn glucose 45 HÌnh 3.13 Sắc ký đồ glucose dung dịch thủy phân 46 Hình 3.14 Qui trình sản xuất chế phẩm qui mơ phịng thí nghiệm 47 Hình 3.15: Sự thay đổi tỷ số C/N theo thời gian đống ủ rơm rạ 49 Khoá luận tốt nghiệp Đặng Thu Thảo – K18.11-04 Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ sinh học DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Chữ viết đầy đủ CT Công thức ĐC Đối chứng CMC Cacboxy Methyl Cellulose VSV Vi sinh vật x.k xạ khuẩn vk vi khuẩn n.m nấm mốc RR Rơm rạ Khoá luận tốt nghiệp Đặng Thu Thảo – K18.11-04 Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ sinh học MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƯƠNG I : TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan nguyên liệu rơm rạ 1.1.1.Thống kê lượng rơm rạ phế thải 1.1.2 Ảnh hưởng rơm rạ tới môi trường 1.2 Các thành phần rơm rạ 1.2.1 Cellulose 1.2.2 Hemicellulose 1.2.3 Lignin 1.2.4 Các biện pháp xử lý rơm rạ 1.4.1 Tiền xử lý rơm rạ 1.4.2 Sử dụng vi sinh vật chế phẩm phân hủy 10 1.3 Cellulase nguồn vi sinh vật thu nhận cellulase 11 1.3.1 Enzyme cellulase 11 1.3.1 Giới thiệu enzyme cellulase 11 1.3.2 Cơ chế thủy phân Cellulose 12 1.3.2 Các nguồn vi sinh vật thu nhận cellulase 14 1.4 Tổng quan phân hữu sinh học tiêu đánh giá 16 1.4.1 Tổng quan phân hữu sinh học 16 1.4.2 Các tiêu đánh giá 17 1.5 Tình hình nghiên cứu ngồi nước 18 1.5.1 Tình hình nghiên cứu giới 18 1.5.2 Tình hình nghiên cứu Việt Nam 19 CHƯƠNG II : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1 Đối tượng nghiên cứu 21 Khoá luận tốt nghiệp Đặng Thu Thảo – K18.11-04 Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ sinh học 2.2 Hóa chất, thiết bị mơi trường nghiên cứu 21 2.2.1 Hóa chất 21 2.2.2.2 Thiết bị dụng cụ nghiên cứu 22 2.2.2.3 Môi trường nghiên cứu 22 2.3 Các phương pháp nghiên cứu 23 2.3.1 Phương pháp xác định hoạt tính cellulase 23 2.3.2.1 Sàng lọc sơ hoạt tính cellulase 23 2.3.2.2 Tuyển chọn chủng có hoạt tính cellulase 23 2.3.2 Phương pháp định lượng hoạt tính cellulase 24 2.3.2.1 Phương pháp xác định DNS 24 2.3.2.2 Xác định lượng đường khử glucose HPLC 26 2.3.2.3 Xác định hoạt tính cellulase 26 2.3.4 Phương pháp đánh giá hiệu xử lý phế phụ phẩm nơng nghiệp 27 2.3.4.1 Phân tích Ni tơ tổng số phương pháp Kendan 28 2.4.2.2 Phân tích hàm lượng Cacbon hữu tổng số Phương Pháp WalkleyBlack 29 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31 3.1 Sàng lọc sơ khả phân giải cellulose chủng vi sinh vật 31 3.2 Định tính hoạt tính cellulase phương pháp đục lỗ thạch 33 3.3 Định danh chủng vi sinh vật nghiên cứu 34 3.4 Nghiên cứu số điều kiện môi trường ảnh hưởng đến khả sinh trưởng phát triển chủng vi sinh vật 39 3.4.1 Ảnh hưởng pH lên khả sinh enzyme cellulase chủng VSV 39 3.4.2 Ảnh hưởng nhiệt độ lên khả sinh enzyme cellulase chủng vi sinh vật 41 3.4.3 Ảnh hưởng thời gian lên men đến khả sinh enzyme cellulase chủng vi sinh vật 42 3.5 Lên men quy mơ phịng thí nghiệm 50l/mẻ tạo chế phẩm phân hủy rơm rạ 43 3.6 Đánh giá khả phân giải cellulose thành đường dịch enzyme thô 43 3.6.1 Đánh giá hàm lượng đường sinh phương pháp DNS 43 3.6.2 Đánh giá hàm lượng đường phương pháp HPLC 44 Khoá luận tốt nghiệp Đặng Thu Thảo – K18.11-04 Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ sinh học 3.7 Phối trộn tạo chế phẩm vi sinh vật 47 3.7.1 Quy trình 47 3.7.2 Thuyết minh quy trình 48 3.7.3 Thử nghiệm khả phân giải celluose chế phẩm vi sinh vật 48 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO 51 PHỤ LỤC Khoá luận tốt nghiệp Đặng Thu Thảo – K18.11-04 MỞ ĐẦU Trong năm qua, nơng nghiệp Việt Nam có bước tiến lớn Từ nước có nơng nghiệp lạc hậu chuyển thành nước xuất nhiều sản phẩm nông nghiệp đem lại nguồn thu ngoại tệ cho ngân sách Nhà nước Trong đó, lúa có vai trị quan trọng với đời sống người dân Việt Nam Tổng diện tích gieo trồng lúa ước đạt 7,8 triệu với sản lượng đạt 44,84 triệu [1] Chính vậy, lượng phế phụ phẩm nông nghiệp (rơm rạ) để lại sau thu hoạch lớn Rơm rạ để tự nhiên cần thời gian phân hủy lâu, tỷ lệ C/N cao nên cày vùi rơm rạ trực tiếp vào đất, gây tượng bất động dinh dưỡng đất, trình phân hủy gây tượng ngộ độc hữu cho lúa Do đại đa số nơng dân thường có tập qn đốt bỏ để chuẩn bị đất cho vụ mùa tiếp theo.Theo ước tính đốt rơm thải 36,32 kg khí CO, 4,54 kg hydrocarbon 3,18 kg bụi tro 56,00 kg CO2 thành góp phần gây hiệu ứng nhà kính, gây nhiễm mơi trường khơng khí Để hạn chế bất lợi này, rơm rạ trước hoàn trả lại cho vụ mùa cần trải qua qúa trình phân hủy vi sinh vật thích hợp nhằm rút ngắn thời gian phân hủy, tạo nguồn phân hữu giúp tăng suất trồng giảm dịch bệnh trồng Xử lý chất thải hữu vi sinh vật để làm phân bón hữu hướng nghiên cứu nhà khoa học quan tâm tính ứng dụng thực tiễn cao Từ sở khoa học thực tiễn thực đề tài: “Nghiên cứu tạo chế phẩm vi sinh vật có khả phân giải cellulose để xử lý rơm rạ thành phân bón hữu cơ”, nhằm tận dụng nguồn phế thải nơng nghiệp sản xuất phân bón cho trồng, góp phần xây dựng nơng nghiệp bền vững, giảm thiểu ô nhiễm môi trường Khoá luận tốt nghiệp Đặng Thu Thảo – K18.11-04 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan nguyên liệu rơm rạ 1.1.1.Thống kê lượng rơm rạ phế thải [ ] Nước ta nước nông nghiệp với triệu đất nông nghiệp Trong trồng nông nghiệp, lúa lương thực quan trọng sản xuất nhiều Năm 2014 , diện tích trồng lúa nước giảm suất lúa tốt nên tổng sản lượng lúa tăng đáng kể so vơi năm 2013 Theo ước tính Tổng cục Thống kê , tổng diện tích gieo trồng lúa ước đạt 7,8 triệu ha, giảm 96,8 ngàn so với năm 2013, suất đạt 57,4 tạ/ha, tăng 1,7 tạ/ha, nên sản lượng lúa nước đạt 44,84 triệu tấn, tăng 80,4 vạn so với năm 2013 Theo Tổng cục Thống kê, khối lượng xuất gạo năm 2014 đạt 6,52 triệu với giá trị xuất 3,04 tỷ USD Thị trường nhập gạo lớn Trung Quốc Philipin với tăng trưởng mạnh năm trở thành thị trường nhập gạo lớn thứ , thị trường khác Malaysia, Indonesia…đều có tăng trưởng Những số thống kê cho thấy phần sức ảnh hưởng mạnh mẽ sản xuất lúa với kinh tế nước nhà Trong 20 năm đổi mới, sản xuất lúa nước ta chuyển sang sản xuất lúa hàng hóa, có bước phát triển vượt bậc So với năm 1983 diện tích trồng lúa tăng từ 5,9 triệu lên 7,8 triệu (năm 2014), sản lượng từ 14.500 triệu tăng lên 47,84 triệu (năm 2014) theo hàng năm có khoảng 30 triệu rơm rạ.[3] 1.1.2 Ảnh hưởng rơm rạ tới môi trường Hiện nay, với phát triển kinh tế xã hội mức độ giới cao, đại phận rơm không thu gom sử dụng.Thêm vào đó, việc gia tăng số mùa vụ canh tác hàng năm làm gia tăng lượng rơm rạ thải môi trường Biện pháp người dân sử dụng với lượng rơm rạ thải nói đốt đồng ruộng Tại thời điểm thu hoạch, độ ẩm rơm rạ lên tới 60% Tuy nhiên điều kiện thời tiết khô hanh rơm rạ đạt trạng thái độ ẩm cân khoảng 10- 12% Việc đốt rơm đồng xem biện pháp thuận lợi, rẻ tiền nhất.Có khả tiêu diệt nguồn sâu bệnh cỏ dại cho vụ sau, đồng thời trả lại cho đất nguyên tố dinh dưỡng đạm, lân, kali [13] Khoá luận tốt nghiệp Đặng Thu Thảo – K18.11-04 Việc đốt rơm rạ bừa bãi đồng ruộng tạo nhiều khí thải độc hại làm ô nhiễm môi trường Những loại khí thải chủ yếu tạo đốt rơm rạ đồng ruộng bao gồm khí Dioxit Cacbon (CO2), Cacbon Monoxide (CO), khí Methane (CH4), Oxit Nitơ (NOx N2O), Oxit Sulphur (SO2 SOx), NonMethan Hydrocarbon (NMHC ) bụi hay vật chất dạng hạt (như TPM, PM25, PM10 ) khí Polycyclic Aromatic Hydrocarbons (PAHs), Polychlorinated Dioxins Furans (PCDD/F) Trong số lượng khí thải CO2 chiếm tỷ trọng cao [1] Theo Streets & cs.(2003), hàng năm lượng phát thải đốt rơm rạ phế thải từ ngắn ngày khác đồng ruộng châu Á ước tính bảng 1.1 Khí thải từ đốt rơm rạ có chứa nhiều chất xem tác nhân gây hiệu ứng nhà kính CO2, CH4, N2O, NMHC (non-methane hydrocarbon) [9] Bảng 1.1 : Lượng phát thải đốt rơm rạ phế thải từ ngắn ngày khác đồng ruộng châu Á hàng năm [9] STT Tên khí Khối lương ( triệu tấn) CO2 379 NOx 0,96 s SO2 0,1 CH4 0,68 CO 23 Trong năm gần đây, tình trạng đốt rơm rạ sau vụ gặt tình trạng chung hầu hết vùng trồng lúa số tỉnh thuộc ĐBSH , ĐBSCL , đặc biệt ĐBSH Theo số liệu ước tính phịng NN&PTNT huyện Bình Giang, Hải Dương tỷ lệ rơm rạ đốt đồng ruộng chiếm 30% Ở nơi gần đô thị huyện ngoại thành Hà Nội số địa tỷ lệ rơm rạ đốt đồng ruộng đạt tới 60-90% Thực trạng diễn phổ biến nước ta Khoá luận tốt nghiệp Đặng Thu Thảo – K18.11-04 Kết bảng 3.4 hình 3,9 cho thấy chủng vi khuẩn Hud 4-1 hoạt động điều kiện nhiệt độ khoảng 35-370C, nấm mốc AF khoảng 28-300C xạ khuẩn 2P 40-450C Trong chủng nghiên cứu chủng xạ khuẩn 2P chủng ưa nhiệt, chiụ nhiệt độ lên đến 45-500C 3.4.3 Ảnh hưởng thời gian lên men đến khả sinh enzyme cellulase chủng vi sinh vật Nuôi cấy chủng vi sinh vật điều kiện thích hợp Ở thời điểm trình lên men, tiến hành hút dịch, ly tâm thu dịch Nồng độ protein enzyme hịa tan q trình lên men xác định hoạt tính enzyme celulase đo phương pháp đục lỗ thạch Kết bảng: Bảng 3.5 Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả sinh enzyme cellulase chủng vsv chọn Thời gian (giờ) 12 24 36 48 60 72 84 96 Hoạt tính enzmym (D-d,mm) Hud 4-1 AF 2P 7.3 5.34 3.4 16.8 14.7 12.7 20.2 18.2 16.2 25.4 23.2 27.4 24.56 27.5 27.4 20.5 31.3 29.5 15.4 30.1 28.1 10.4 25.3 22.7 Hud4-1 AF6 2P Khoá luận tốt nghiệp 42 Đặng Thu Thảo – K18.11-04 Hình 3.10 Ảnh hưởng thời gian tới hoạt tính chủng vsv chọn Kết cho thấy, chủng vi khuẩn Hud 4-1, sau 48 h hàm lượng protein hoạt tính enzyme thu cao nhất, chủng nấm mốc xạ khuẩn thời gian lên men kéo dài (72h) Các thông số nhiệt độ, pH thời gian nuôi cấy chủng VSV giữ ổn định trình lên men pilot quy mơ 50l/mẻ 3.5 Lên men quy mơ phịng thí nghiệm 50l/mẻ tạo chế phẩm phân hủy rơm rạ Các chủng vi sinh vật sau hoạt hóa giống nhân giống cấp 1, lên men hệ thống lên men chìm 50l/mẻ điều kiện thích hợp với chủng vi sinh vật Các chủng VSV sau lên men để lạnh 4-80C qua đêm Sau đó, tách phần dịch lên men (dịch enzyme thô) sinh khối vi sinh vật Hình 3.11 Thiết bị lên nen quy mơ pilot 50 l / mẻ 3.6 Đánh giá khả phân giải cellulose thành đường dịch enzyme thô 3.6.1 Đánh giá hàm lượng đường sinh phương pháp DNS Cho vào bình tam giác 250ml 5g chất 100 ml nước cất Bổ sung dịch enzyme thô đo nồng độ đường khử sinh phương pháp DNS Dựa vào phương trình đường chuẩn ta có kết bảng 2: Khoá luận tốt nghiệp 43 Đặng Thu Thảo – K18.11-04 Bảng 3.6 Nồng độ đường khử dịch thủy phân Hàm lượng đường khử Nồng độ enzyme enzyme Thời gian (giờ) 2% 3% 4% 5% 0.25 0.39 0.59 0.65 1.68 2.10 2.82 2.68 3.27 3.03 4.53 4.67 4.39 4.45 4.97 5.22 4.46 5.19 4.93 4.95 3.68 4.37 4.41 4.02 (mg/ml) Kết cho thấy, với nồng độ enzyme 3% sau 4h thủy phân cellulose 500C cho lượng đường sinh lớn Nồng độ đường khử đo 5.19 mg/ml 3.6.2 Đánh giá hàm lượng đường phương pháp HPLC 3.6.2.1 Dựng đường chuẩn glucose Bảng 3.7 Diện tích pic theo nồng độ glucose chuẩn Nồng độ glucose dung dịch Diện tích chuẩn (µg/ml) Khố luận tốt nghiệp 200,97 1912918 301,455 3456940 401,94 5139274 44 Đặng Thu Thảo – K18.11-04 Hình 12: Đồ thị đường chuẩn glucose 3.6.2.2 Kết xác định hàm lượng glucose phương pháp HPLC Với nồng độ enzyme 3%, sau 4h thủy phân 500C, tăng nhiệt độ lên 901000C 10 phút để ngừng trình phản ứng Dịch thủy phân lọc thơ ly tâm loại bã cellulose 10.000 vịng/phút 20 phút Dịch thủy phân được máy HPLC Dựa vào đường chuẩn glucose tính nồng độ glucose dung dịch thủy phân Kết bảng 3.8 sắc ký đồ hình 3.13: Bảng 3.8 Nồng độ glucose theo diện tích pic Diện tích píc Nồng độ glucose (µg/ml) Kết (% dung dịch glucose thủy phân dung dịch thủy phân) 3235255 265,2 3,33 3205885 263,3 3,33 Trung bình Khố luận tốt nghiệp 3,33 45 Đặng Thu Thảo – K18.11-04 HÌnh 3.13 Sắc ký đồ glucose dung dịch thủy phân Nồng độ glucose dung dịch thủy phân 264 µg/ml bình định mức 250 ml với 2ml dịch thủy phân đưa vào bình định mức (200 thể tích dịch thủy phân ban đầu) Vì vậy, % glucose dung dịch thủy phân 3,33% Như vậy, tổng lượng glucose có dịch sau thủy phân là: (0,264 x 250 : 2) x 200 = 6600 µg = 6,6 mg Khoá luận tốt nghiệp 46 Đặng Thu Thảo – K18.11-04 3.7 Phối trộn tạo chế phẩm vi sinh vật 3.7.1 Quy trình Chủng vi sinh vật Nấm : AF Vi khuẩn: Hud 4-1 Xạ Khuẩn: 2P Hoạt hóa giống (Mơi trường ĐT thạch) Nhân giống cấp (cho chủng riêng rẽ) (Lắc ổn nhiệt, môi trường dịch thể ĐT) Nhân giống cấp (cho chủng riêng rẽ) (Bình lên men 2L có sục khí, mơi trường dịch thể ĐT) Lên men thiết bị lên men 50 lít (Mơi trường dịch thể ĐT) Dịch Để lạnh 4-80C, 24h Bã Phối trộn chất mang Sấy, 400C Độ ẩm 15% Chế phẩm enzyme cellulase thô dạng dịch Sản phẩm chế phẩm vi sinh Hình 3.14 Qui trình sản xuất chế phẩm qui mơ phịng thí nghiệm Khố luận tốt nghiệp 47 Đặng Thu Thảo – K18.11-04 3.7.2 Thuyết minh quy trình
Phối trộn chủng vi sinh vật Dịch lên men chủng vi sinh vật phối trộn với thành sản phẩm hỗn hợp với tỉ lệ 1:1:1
Làm lạnh Dịch sinh khối vi sinh vật làm lạnh 4-80C qua đêm, sinh khối vi sinh vật lắng xuống, từ dễ dàng tách sinh khối khỏi dịch lên men
Phối trộn chất mang • Dịch sinh khối vi sinh vật trộn với chất mang theo tỉ lệ 1:2 (chất mang gồm thành phần với tỉ lệ thành phần theo khối lượng sau bột đậu tương: Dịch chiết bột đậu tương, NaCl, glucoza, cám gạo, CaCO3 sấy khô 50oC 1-2 ngày Mật độ vi sinh vật đạt mật độ từ 108 VSV/g chế phẩm • Sấy khơ sản phẩm phối trộn 35-40oC đến đạt độ ẩm 15-18% • Hỗn hợp nguyên liệu tiếp tục phối trộn với than bùn theo tỉ lệ 1:1 (than bùn sấy khô 1000C đến đạt độ ẩm