Nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh từ streptomyces 184 26

BỘ Y TẾ VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI:NGHIÊN CỨU LÊN MEN TỔNG HỢP KHÁNG SINH TỪ STREPTOMYCES 184.26 Người hướng dẫn: PGS.TS Cao Văn Thu Sinh viên thực hiện: Bùi Ngọc Bích Lớp: CMSH- 1101 Khóa: K18 HÀ NỘI – 2015 LỜI CẢM ƠN Được phân công Khoa Công nghệ sinh học – Viện đại học mở Hà Nội Và đồng ý thầy giáo hướng dẫn PGS.TS Cao Văn Thu Đại học Dược Hà Nội thực đề tài “ Nghiên cứu tổng hợp kháng sinh từ streptomyces 184.26” Để hồn thành khóa luận tơi xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo tận tình hướng dẫn, giảng dạy tơi suốt q trình học tập, nghiên cứu rèn luyện Khoa Công Nghệ Sinh Học- Viện Đại Học Mở Hà Nội Tôi xin chân thành cảm ơn đến thầy giáo hướng dẫn PGS.TS: Cao Văn Thu tận tình, chu đáo hướng dẫn tơi hồn thành khóa luận Đồng thời biết ơn thầy cô giáo Bộ môn Vi sinh- Sinh học trường Đại Học Dược tạo điều kiện tốt cho tơi hồn thành khóa luận Mặc dù cố gắng để hoàn thành khóa luận hồn chỉnh buổi đầu làm quen với công tác nghiên cứu khoa học hạn chế kinh nghiệm kiến thức nên khơng thể tránh khỏi thiếu sót định thân Tơi mong góp ý q Thầy giáo bạn để khóa luận hồn chỉnh Tơi xin chân thành cảm ơn Hà Nội, ngày 10 tháng năm 2015 Sinh viên Bùi Ngọc Bích MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG I TỔNG QUAN 1.1 Đại cương kháng sinh 1.2 Đại cương xạ khuẩn (Actinomycetes) 1.3 Cải tạo giống bảo quản giống vi sinh vật 1.4 Lên men sinh tổng hợp kháng sinh 1.5 Chiết tách tinh chế kháng sinh 1.6 Sơ lược số phương pháp xác định cấu trúc kháng sinh 1.7 Một số nghiên cứu kháng sinh có nguồn gốc từ Streptomyces 10 CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12 2.1 Đối tượng nghiên cứu 12 2.1.1 Giống xạ khuẩn 12 2.1.2 Vi sinh vật kiểm định 12 2.1.3 Các loại môi trường nuôi cấy 12 2.1.4 Dụng cụ, hóa chất 14 2.2 Phương pháp nghiên cứu 16 2.2.2 Chọn lọc cải tạo giống 16 2.2.3 Lên men, chiết tách kháng sinh 16 2.2.4 Sơ xác định số tính chất kháng sinh thu 16 2.3 Phương pháp thực nghiệm 17 2.3.1 Phương pháp nuôi cấy giữ giống 17 2.3.2 Phương pháp xác định hình thái xạ khuẩn 17 2.3.3 Đánh giá hoạt tính kháng sinh phương pháp khuếch tán 18 2.3.4 Phương pháp chọn mơi trường ni cấy thích hợp 19 2.3.5 Phương pháp cải tạo chọn giống 19 2.3.6 Phương pháp lên men chìm tổng hợp kháng sinh 21 2.3.7 Phương pháp xác định độ bền nhiệt, độ bền pH kháng sinh dịch lọc dịch lên men 21 2.3.8 Các phương pháp chiết tách kháng sinh 22 2.3.8.2 Phương pháp tách kháng sinh sắc ký 22 2.3.9 Phương pháp thu tinh thể kháng sinh tinh khiết 23 2.3.10 Sơ xác định cấu trúc kháng sinh tinh khiết thu 24 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT 25 3.1 Xác định hình thái xạ khuẩn streptomyces 184.26 26 3.2 Kết chọn MT ni cấy thích hợp xác định tác dụng kháng sinh 25 3.3 Kết cải tạo giống 26 3.3.1 Kết sàng lọc ngẫu nhiên 26 3.3.2 Kết đột biến 27 3.4 Kết lên men sinh tổng hợp kháng sinh 28 3.5 Kết đánh giá ảnh hưởng pH nhiệt độ đến độ bền kháng sinh dịch lọc 30 3.6 Kết chọn dung môi hữu chiết xuất kháng sinh 31 3.7 Kết tách kháng sinh sắc ký lớp mỏng 32 3.8 Kết chạy sắc kí cột 33 3.9 Sơ xác định cấu trúc hóa học số đặc điểm KS thu 35 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO 38 PHỤ LỤC 41 DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ CÁI VIẾT TẮT AND Acid 2'- deoxyribonucleic B.subtilis Bacillus subtilis DM Dung môi DMHC Dung môi hữu ĐB Đột biến Gr(-) Gram âm Gr(+) Gram dương HTKS Hoạt tính kháng sinh ISP International Streptomyces Project (chương trình Streptomyces quốc tế) KS Kháng sinh KTCC Khuẩn ty chất KTKS Khuẩn ty khí sinh MC Mẫu chứng MT Môi trường MTdt Môi trường dịch thể E coli Escherichia coli ATCC 25922 s Sai số chuẩn hiệu chỉnh SKLM Sắc ký lớp mỏng SLNN Sàng lọc ngẫu nhiên TB Tế bào UV Ultra violet (tử ngoại) V Thể tích VSV Vi sinh vật DANH MỤC BẢNG, DANH MỤC PHỤ LỤC Bảng 2.1 Các vi sinh vật kiểm định 12 Bảng 2.2: Thành phần môi trường nuôi cấy xạ khuẩn (g/100ml) 13 Bảng 2.3 Môi trường nuôi cấy VSV kiểm định 14 Bảng 2.4 Các dung môi sử dụng số đặc tính 14 Bảng 3.1 Kết thử HTKS với 10 VSV kiểm định 25 Bảng 3.2 Kết thử nghiệm HTKS sàng lọc ngẫu nhiên 26 Bảng 3.3 Kết thử HTKS đột biến lần 27 Bảng 3.4: Kết thử HTKS đột biến lần 28 Bảng 3.5 Kết thử HTKS chọn môi trường lên men 29 Bảng 3.6 Kết lên men biến chủng tốt MT2dt 29 Bảng 3.7 Kết ảnh hưởng pH đến độ bền kháng sinh 30 Bảng 3.8 Ảnh hưởng nhiệt độ tới độ bền kháng sinh dịch lọc 30 Bảng 3.9 Kết chiết kháng sinh DMHC pH khác 31 Bảng 3.10 Kết tách kháng sinh dịch chiết SKLM 32 Bảng 3.11 Kết thử HTKS phân đoạn sau chạy cột lần 33 Bảng 3.12 Kết SKLM PĐ 2-12 lần chạy cột lần tách KS1, KS2 34 Bảng 3.13 Kết SKLM PĐ 2-15 lần chạy cột lần tách KS2, KS3 35 Phụ lục Bảng 3.14 Kết thử HTKS sàng lọc ngẫu nhiên 41 Phụ lục Bảng 3.15 Kết thử HTKS đột biến lần 42 Phụ lục Bảng 3.16 Kết thử HTKS đột biến lần 44 Phụ lục 4: Hình ảnh thử HTKS SLNN E coli 46 Phụ lục 5: Hình ảnh thử HTKS ĐB E coli 46 Phụ lục 6: Hình ảnh thử HTKS ĐB B subtilis 47 Phụ lục 7: Hình ảnh phổ tử ngoại vết (UV) vết KS2 Streptomyces 184.26 47 Phụ lục 8: Hình ảnh phổ tử ngoại vết (UV) vết KS2 Streptomyces 184.26 48 Phụ lục 9: Hình ảnh phổ hồng ngoại (IR) KS2 Streptomyces 184.26 48 Phụ lục 10: Hình ảnh phổ khối (IM) KS2 Streptomyces 184.26 49 ĐẶT VẤN ĐỀ Năm 1928 Alexander Fleming ngẫu nhiên phát ức chế phát triển S.aureus Penicillin notatum, đến năm 1940, Ermst Chain Howard Walter chiết Penicillin từ chủng Penicilium chrysogenium có hoạt tính cao nhiều lần cứu hàng ngàn thương binh chiến tranh giới thứ Từ đó, cơng trình nghiên cứu kháng sinh liên tục tiến hành, ứng dụng rộng rãi y học lâm sàng, ngành công nghệ lên men sản xuất kháng sinh đời Mặc dù có nhiều thành công việc phát kháng sinh tiến kỹ thuật sản xuất kháng sinh, bệnh nhiễm khuẩn nguyên nhân hàng đầu gây tử vong toàn giới, khoảng 17 triệu người chết năm Tự sử dụng thuốc lạm dụng kháng sinh yếu tố quan trọng gây tượng kháng kháng sinh, giảm tuổi thọ thuốc Do thấy cấp thiết phải liên tục cho nghiên cứu phát triển loại thuốc kháng sinh Khí hậu Việt Nam có điều kiện thuận lợi cho phát triển đa dạng hệ VSV, đáng ý xạ khuẩn có khả sinh tổng hợp kháng sinh, số 55% chi Streptomyces sản xuất Chi cịn có nhiều VSV ngồi khả sinh tổng hợp kháng sinh cịn tổng hợp chất khác: chất điều trị ung thư (actinomycin D), chất kích thích tăng trưởng sử dụng nhiều chăn ni… Chính tơi chọn đề tài “Nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh từ Streptomyces 184.26” với mục tiêu sau: - Cải tạo giống theo hướng nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh - Xác định, lựa chọn môi trường lên men thích hợp, chiết xuất, tinh chế KS - Sơ xác định vài đặc tính vật lí, hóa học kháng sinh tổng hợp CHƯƠNG I TỔNG QUAN 1.1 Đại cương kháng sinh 1.1.1 Định nghĩa kháng sinh Theo quan niệm truyền thống: "Kháng sinh sản phẩm trao đổi chất tự nhiên vi sinh vật tạo ra, có tác dụng ức chế phát triển tiêu diệt chọn lọc vi sinh vật khác" Theo quan niệm nay: Kháng sinh đại diện cho tất hợp chất có nguồn gốc tự nhiên tổng hợp có tác dụng ức chế tiêu diệt chọn lọc vi sinh vật nhiễm sinh (cũng với tế bào ung thư) nồng độ thấp, mà khơng có tác dụng tác dụng yếu lên người, động vật thực vật đường cung cấp chung Kháng sinh sản phẩm trao đổi chất thứ cấp sinh tổng hợp mạnh mẽ giai đoạn phát triển sau (pha logarit muộn, pha dừng, pha suy tàn) sinh trưởng VSV [9] 1.1.2 Phân loại kháng sinh Có nhiều cách khác để phân loại kháng sinh:
Phân loại theo nguồn gốc: Kháng sinh có nguồn gốc tự nhiên, kháng sinh có nguồn gốc bán tổng hợp, tổng hợp
Phân loại theo tính nhạy cảm vi khuẩn với kháng sinh: kháng sinh diệt khuẩn , kháng sinh kìm khuẩn
Phân loại theo chế tác dụng: Ức chế tổng hợp vách tế bào vi khuẩn, ức chế tổng hợp protein, ức chế tổng hợp acid nucleic, ức chế chuyển hóa, thay đổi tính thấm màng tế bào
Phân loại theo cấu trúc hóa học: Đây cách phân loại khoa học giúp cho người nghiên cứu nhanh chóng định hướng đặc điểm chất kháng sinh phát biết cấu trúc hóa học nó, tránh lãng phí thời gian để nghiên cứu đặc điểm khác Khái quát theo đích tác dụng kháng sinh: - Tổng hợp thành tế bào: β –lactam, vancomycin… - Màng tế bào chất: Polyen, amphotericin,… - Tổng hợp ADN: Actinomycin, anzamycin - Tổng hợp protein: Aminoglycosid (ribosome), macrolid (liên kết t-ADN)… - Trao đổi chất hô hấp: Antimycin,… - Trao đổi chất folat: Sulfamid,… Sơ đồ chế tác dụng kháng sinh trình bày phụ lục P.1 1.1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả sinh kháng sinh xạ khuẩn - Sự hình thành chất kháng sinh xạ khuẩn: kháng sinh sản phẩm chuyển hóa thứ cấp hình thành vào cuối pha lũy thừa, đầu pha cân trình sinh trưởng - Ảnh hưởng thành phần lên men: nguồn carbon, nguồn nitơ, phosphat vô yếu tố vi lượng - Ảnh hưởng điều kiện ni cấy: độ thơng khí, nhiệt độ, pH, tuổi giống.[9] 1.2 Đại cương xạ khuẩn (Actinomycetes) Xạ khuẩn nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria), phân bố rộng rãi tự nhiên Trước chúng xếp vào Tản thực vật, ngày nay, chúng xếp vào vi khuẩn (Schizomyces) Đa số xạ khuẩn vi khuẩn Gr (+), hiếu khí, hoại sinh, có cấu tạo dạng sợi phân nhánh (khuẩn ty), tỷ lệ G+C > 55% Chúng sinh tổng hợp nhiều sản phẩm trao đổi chất quan trọng như: kháng sinh, enzym, vitamin,… Vì thế, chúng nghiên cứu nhiều Tuy nhiên số xạ khuẩn gây hại cho người động vật 1.2.1 Đặc điểm hình thái xạ khuẩn Streptomyces Streptomyces chi xạ khuẩn Gram (+) - Khuẩn lạc xạ khuẩn Streptomyces: đặc biệt, thường có dạng khơ ráp, dạng phấn, khơng suốt, có nếp gấp tỏa theo hình phóng xạ, dùng que cấy khơng di chuyển khuẩn lạc xạ khuẩn KTCC bám sâu vào thạch - Khuẩn ty xạ khuẩn: Đường kính khuẩn ty xạ khuẩn thay đổi khoảng từ 0,3-1,0 µm đến 2-3µm Đa số khuẩn ty xạ khuẩn khơng có vách ngăn, màu sắc khuẩn ty phong phú: đỏ, cam, đen, lục cam, nâu, KTCC tiết vào mơi trường số loại sắc tố như: sắc tố tan nước, sắc tố tan DMHC, đặc biệt có lồi tạo sắc tố melanoid sẫm đen - KTCC phát triển thời gian dài không khí thành KTKS Sau thời gian phát triển, đỉnh KTKS xuất chuỗi bào tử mọc đơn hay mọc vòng (thẳng, uốn cong, xoắn lò xo, ) - Bào tử trần quan sinh sản chủ yếu chi xạ khuẩn Streptomyces Bề mặt bào tử nhẵn, sần sùi da cóc, có gai, có tóc,…với hình dạng phong phú: hình cầu, hình ellipsoic, hình trụ 1.2.2 Đặc điểm cấu tạo tế bào xạ khuẩn - Thành tế bào: có dạng kết cấu lưới, dày khoảng 10-20 nm, có chức trì hình dạng khuẩn ty bảo vệ tế bào Chi Streptomyces thuộc nhóm CWI có chứa L-DAP (L- diaminopimelic acid) glycin - Màng tế bào chất: dày khoảng 7,5-10nm Chúng có cấu trúc chức giống vi khuẩn nói chung - Mesosom nằm phía tế bào chất, có hình phiến, hình bọng hay hình ống Mesosom làm tăng diện tích tiếp xúc màng tế bào chất qua làm tăng cường hoạt tính enzym, tăng vận chuyển điện tử… - Các vật thể ẩn nhập tế bào chất xạ khuẩn gồm có hạt phosphat, hạt polysaccarid 1.2.3 Đặc điểm sinh lý Streptomyces VSV dị dưỡng, có tính oxi hóa cao Để phát triển, chúng phân giải hydratcarbon làm nguồn cung cấp vật chất lượng, đồng thời thủy phân hợp chất gelatin, casein, chúng khử nitrat thành nitrit Streptomyces loại xạ khuẩn hơ hấp hiếu khí, nhiệt độ tối thích thường 25-300C, pH tối thích thường từ 6,8-7,5 Sắc tố tạo thành từ Streptomyces chia thành nhóm: sắc tố hòa tan, sắc tố KTCC, sắc tố KTKS, sắc tố melanoid.[9] 1.2.4 Xác định hình thái xạ khuẩn Xác định hình thái chuỗi bào tử dựa vào cách phân loại theo ISP Bảng 3.13 Kết SKLM phân đoạn 2- 15 lần chạy cột lần tách KS1, KS2 Rf Phân đoạn Vết Vết 2 0.59 - 0.57 0,51 0.53 0,52 0.54 0,49 0.50 0,47 0,52 0,47 - 0,48 - 0,47 10 - 0,43 11 - 0,39 12 - 0,40 13-15 - - Nhận xét: -phân đoạn có vết kháng sinh, nhận thấy kháng sinh (KS1), gộp lại với lượng KS1 từ lần tinh chế thu m1 = 0,0145g - Từ phân đoạn - 12, có vết kháng sinh, nhận thấy vết kháng sinh (KS2), gộp lại thu đươc m2 = 0,0264g Tổng kết: Hiệu suất tách KS1 là: %H= 0,0145/0,101 = 14,36% Hiệu suất tách KS2 là: %H= 0,0264/0,101 = 26,13% 3.9 Sơ xác định cấu trúc hóa học số đặc điểm KS thu Thấy HTKS hiệu suất tách KS2 thu cao KS nên tiến hành xác định cấu trúc hóa học số đặc điểm KS2 chủ yếu 35  Phổ UV (MeOH) λmax (phụ lục 11) : Phổ UV có đỉnh hấp thụ bước sóng 441 nm 301 nm, chứng tỏ cấu trúc kháng sinh có nhân thơm, liên kết bội dị tố O, N, halogen…  Phổ khối lượng MS (phụ lục P.12): m/z= 686,29 [M+H/Na]- Phân tích lý thuyết cho kết khối lượng phân tử dự kiến 685,29 đvC  Phổ IR(KBr) vmax cm-1 (phụ lục P.11): dựa vào đỉnh hấp thụ ghi thành phần kháng sinh có nhóm chức sau: _ 2978,09 cm-1 đặc trưng cho nhóm –OH chức H-bonded _ 2601,97 cm-1 đặc trưng cho nhóm –OH chức carbonxylic (-COOH) _ 2945,30 cm-1 đặc trưng cho liên kết C-H ankanes đầu dãy ( CH2=R) _ 1658,78 cm-1 đặc trưng cho liên kết C=O cú nhóm chức aldehyl (R-CH=O) nhóm chức ester (RCOOR) _ 1033,85 cm-1 đặc trưng cho liên kết C-N nhóm chức amid liên kết C-F Fluoride _1170,79 cm-1 đặc trưng cho liên kết C-O alcohol, ester, carboxylic acid, anhydride C-F Fluoride C-N nhóm chức amin _ 1396,46 cm-1 đặc trưng cho liên kết C-X halogenide (Fluoride , Chloride , Bromide, Iodide ) _ 731,02 cm-1 đặc trưng cho liên hết C-Cl _ 464,84 cm-1 đặc trưng cho liên kết C-Br C-I halogenide 36 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Qua q trình nghiên cứu, tơi hồn thành mục tiêu khóa luận rút số kết luận sau: • Xác định đặc điểm hình thái chủng Streptomyces 184.26 • Chủng xạ khuẩn Streptomyces 184.26 q trình ni cấy tạo kháng sinh phổ rộng có tác dụng Gr (+) Gr (-) + Cải tạo chủng Streptomyces 184.26 theo hướng sinh tổng hợp kháng sinh cách sàng lọc, đột biến tạo 10 chủng có hoạt tính kháng sinh cao hẳn chủng gốc • Lựa chọn mơi trường lên men thích hợp MT2dt, biến chủng ĐB1.10 cho HTKS cao + Kháng sinh chiết tốt dung môi Ethylacetat pH=3, tinh chế hỗn hợp dung mơi thích hợp + Hiệu suất tách KS: Hiệu suất tách KS1 là: %H= 0,0145/0,101 = 14,36% Hiệu suất tách KS2 là: %H= 0,0264/0,101 = 26,13% Kiến nghị - Tiếp tục tiến hành phân loại chủng Streptomyces 184.26 theo ISP - Tiếp tục cải tạo giống phương pháp truyền thống kỹ thuật di truyền nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp tinh chế KS - Tiến hành đo cộng hưởng từ hạt nhân để xác định xác cấu trúc KS thu - Tiến hành giải trình tự gen để xác định xác tên khoa học chủng Streptomyces 184.26 - Nghiên cứu, tinh chế xác định cấu trúc hóa học thành phần KS khác Streptomyces 184.26sinh tổng hợp - Nghiên cứu khả chống nấm chủng Streptomyces 184.26 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Trần Tử An (2002), Phương pháp chiết ứng dụng kiểm nghiệm độc chất, Trung tâm Thông tin – thư viện ĐH Dược Hà Nội, trang 40-41, 49-59 Kiều Hữu Ảnh (1999), Giáo trình Vi sinh vật học công nghiệp, NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội, trang 167- 184 Bộ mơn Hóa Phân tích (2006), Hóa phân tích II, trường Đại học Dược Hà Nội, Hà Nội, trang 23-69, 125-147, 215-219, 318 Bộ môn Vi sinh- sinh học (2005), Thực tập vi sinh - ký sinh, trường Đại học Dược Hà Nội, Hà Nội, trang 37-54 Bộ Y tế (2007), Dược lý học, NXB Y học, Hà Nội, tập 2, trang 130- 142 Bộ Y tế (2007), Hóa hữu cơ, NXB Y học, Hà Nội, tập 1, trang 105-1179 Bộ Y tế (2007), Kiểm nghiệm dược phẩm, NXB Y học, Hà Nội, trang 68- 82, 115-133 Bộ Y tế (2007), Kỹ thuật sản xuất dược phẩm, NXB Y học, Hà Nội, tập 2, trang 26-40, 81-93 Bộ Y tế (2008), Vi sinh vật học, NXB Giáo dục, Hà Nội, trang 36-39, 90-95 10 Nguyễn Văn Cách (2005), Công nghệ lên men chất kháng sinh, NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội, trang 11-16 11 Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2001), Vi sinh vật học, NXB Giáo dục, trang 39-41 12 Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Kim Nữ Thảo (2006), Các nhóm vi khuẩn chủ yếu - Phân loại xạ khuẩn 13 Từ Minh Koóng (2004), Cơ sở công nghệ sinh học sản xuất dược phẩm, NXB Y học, Hà Nội, trang 42-54 14 Đỗ Thu Hà (2002), Định loại chủng Streptomyces, Tạp chí sinh học, Hà Nội, tập 24 (số 1), trang 59-63 38 15 Từ Văn Mạc (2003), Phân tích hóa lý, phương pháp phổ nghiệm nghiên cứu cấu trúc phân tử, NXB Khoa học ký thuật, trang 150 – 165 16 Trần Thị Phương Nhung (2012), Nghiên cứu lên men sinh tổng hợp kháng sinh từ Streptomyces 155.29, Luận văn Thạc sỹ Dược học, trường Đại học Dược Hà Nội, trang 2-13 17 Hồ Viết Quý (2002), Chiết tách, phân chia, xác định chất dung môi hữu cơ, NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội, tập 1, trang 9-27 18 Hồng Trọng m, Dương Văn Tuệ (2001), Hóa học hữu cơ, NXB khoa học kỹ thuật, Hà Nội, tập 4, trang 240-250 19 Nguyễn Văn Thanh (2001), Công nghệ sinh học dược, NXB Giáo dục, Hà Nội, trang 14-56 20 Cao Văn Thu, Bùi Việt Hà, Quách Thị Lê Hà, Nguyễn Thị Thúy Hiền, Nguyễn Hồng Hạnh, Võ Thi Linh, Vũ Nguyên Thành, Phan Văn Kiên, Võ Thi Thu Thủy (2010), Nghiên cứu lên men sinh tổng hợp kháng sinh nhờ Streptomyces 15.29 - Streptomyces microflavus, Tạp chí Khoa học Công nghệ, 48(5), trang 108-111 Tiếng Anh 21 Meyyappan Arumugam, Anindita Mitra, Arnab Pramanik, Malay Saha, Ratan Gachhui and Joydeep Mukherjee (2012), International Joural of Systematic and Evolutionary Microbiology, The Society for General Microbiology, page 139- 144 22 Thompson J D., Gibson T.J., Plewniak F., Jeanmougin F., Higgins D.G (1997), The ClustalX windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools, Nucl.Acids Res 25, page 4786- 4882 23 Tobias Kieser, Mervyn J Bibb, Mark J Buttner, Keith F Chater, David A Hopwood (2000), Practical Streptomyces Genetics, The John Innes Foundation Norwich, page 170-171 24 Donald L – Pavia, Gary M.Lampman, George S.Kriz, James R.Vyvyan 39 (2008), Introduction to spectroscopy, Deparment of Chemistry Wertern Washington University Bellingham – Whashing 25 Ser HL, Zainal N, Palanisamy UD, Goh BH, Yin WF, Chan KG, Lee LH (2014), Streptomyces gilvigriseus sp nov., a novel actinobacterium isolated from mangrove forest soil, Antonie Van Leeuwenhoek 26 Norimasa Tamehiro, Takeshi Hosaka, Jun Xu, Haifeng Hu, Noboru Otake, Kozo Ochi (2003), Applied and Environmental Microbiology, Innovative Approach for Improvement of an Antibiotic-Overproducing Industrial Strain of Streptomyces albus 40 PHỤ LỤC Hoạt tính kháng sinh ( D , s) Dạng chủng E.coli D (mm) Dạng chủng B.subtilis s D (mm) Hoạt tính kháng sinh ( D , s) P.mirabilis D s (mm) s B.subtilis D (mm) 1.4 26.23 s SLNN.1 22.96 2.21 26.06 0.66 SLNN.17 22.30 SLNN.2 22.63 1.59 25.96 2.61 SLNN.18 22.50 0.88 25.33 1.61 SLNN.3 22.90 1.11 25.76 0.05 SLNN.19 22.90 0.34 26.66 2.31 SLNN.4 23.56 1.53 27.06 1.01 SLNN.20 23.66 1.02 26.53 0.65 SLNN.5 21.83 1.76 27.26 0.98 SLNN.21 23.70 1.03 25.06 1.91 SLNN.6 22.90 1.31 26.40 0.95 SLNN.22 20.93 0.47 28,00 1.11 SLNN.7 23.60 1.73 26.13 1.10 SLNN.23 20.53 0.50 28.16 1.50 SLNN.8 25.40 0.88 23.83 0.87 SLNN.24 21,00 0.36 26.80 0.78 SLNN.9 24.56 1.22 27.30 2.55 SLNN.25 23.30 0.60 26.23 0.85 SLNN.10 23.90 1.21 23.23 0.41 SLNN.26 21.56 1.40 24.53 0.05 SLNN.12 24.46 1.00 23.23 1.33 SLNN.27 21.30 0.75 24.93 1.80 SLNN.13 24.23 0.64 25.20 2.81 SLNN.28 21.20 1.11 24.06 0.70 SLNN.14 19.83 2.51 26.60 0.34 SLNN.29 22.13 1.15 24.13 1.55 SLNN.15 21.46 0.76 26.90 0.81 SLNN.30 24.90 1.20 25.73 2.11 SLNN.16 24.23 0.83 24.66 2.35 SLNN.31 24.30 1.12 26,83 2.05 Phụ lục Bảng 3.14 Kết thử HTKS sàng lọc ngẫu nhiên 41 2.797022 Hoạt tính kháng sinh (Streptomyces 184.225) Biến E.coli chủng D s (mm) B.subtilis % biến đổi D (mm) s hoạt tính % biến đổi hoạt tính ĐB1.1 22,53 2,95 112,08 21,90 2,60 103,30 ĐB1.2 23,53 1,83 117,06 22,89 1,86 107,97 ĐB1.3 21,50 1,15 106,96 23,30 1,93 109,90 ĐB1.4 21,80 0,85 108,45 22,56 1,15 106,41 ĐB1.5 22,03 1,10 109,60 23,04 0,96 108,67 ĐB1.6 21,33 1,77 106,11 22,26 1,41 105,00 ĐB1.7 23,89 1,93 118,85 24,86 0,05 117,26 ĐB1.8 22,70 1,76 112,93 23,43 2,35 110,51 ĐB1.9 21,93 1,05 109,10 22,83 1,28 107,68 ĐB1.10 24,46 1,33 121,69 25,56 1,15 120,56 ĐB1.11 21,43 1,65 106,61 22,06 0,73 104,05 ĐB1.12 23,53 1,40 117,06 22,45 1,29 105,89 ĐB1.13 22,20 1,90 110,44 21,63 2,65 102,02 ĐB1.14 21,83 0,46 108,60 22,93 0,63 108,16 ĐB1.15 22,80 1,24 113,43 21,33 0,80 100,61 ĐB1.16 20,50 1,11 101,99 21,50 2,85 101,41 ĐB1.17 22,36 1,70 111,24 22,13 1,00 104,38 ĐB1.18 21,76 1,88 108,25 22,23 1,36 104,85 ĐB1.19 22,00 0,43 109,45 23,80 0,60 112,26 ĐB1.20 22,06 0,49 109,75 22,20 0,17 104,71 42 ĐB1.21 21,10 1,60 104,97 23,80 1,70 112,26 ĐB1.22 21,33 0,77 106,11 23,36 1,44 110.18 ĐB1.23 23,30 1,00 115,92 21,96 1,15 103,58 ĐB1.24 23,00 1,44 114,42 22,90 2,13 108,01 ĐB1.25 21,90 0,34 108,95 22,83 0,75 107,68 ĐB1.26 23,43 0,96 116,56 21,23 0,55 100,14 ĐB1.27 20,53 1,00 102,13 22,96 1,92 108,16 ĐB1.28 21,56 0,87 107,26 23,23 1,02 109,57 ĐB1.29 22,30 1,21 110,49 23,43 1,40 110,51 ĐB1.30 21,66 0,90 107,76 23,23 0,90 109,57 ĐB1.31 22,66 0,90 112,73 22,23 0,90 104,85 ĐB1.32 23,70 0,51 117,91 23,66 1,64 111,60 ĐB1.33 25,56 1,67 127,16 24,10 2,88 113,67 ĐB1.34 22,96 2,01 114,22 22,10 1,12 104,24 Chứng 20,10 1,57 100,00 21,20 2,33 100,00 Phụ lục Bảng 3.15 Kết thử HTKS đột biến lần 43 Hoạt tính kháng sinh (Streptomyces 184.225) Biến E.coli chủng D (mm) s ĐB2.1 22.90 0,35 ĐB2.2 23.66 ĐB2.3 B.subtilis % biến đổi % biến đổi D (mm) s 106,71 22,93 0,45 100,74 0,41 110,25 22.96 0,92 100,87 22,70 0,69 105,77 23,23 0,92 102,06 ĐB2.4 22.16 0,45 103,26 23,23 0,97 102,06 ĐB2.5 23,96 0,86 111,64 23,86 0,85 104,83 ĐB2.6 22.46 0,52 104,65 23,26 0,85 102,19 ĐB2.7 23.60 0,24 109,97 23,33 0,11 102,50 ĐB2.8 23,60 0,11 109,97 24,60 0,34 108,08 ĐB2.9 23,20 0,36 108,10 23,00 0,24 101,05 ĐB2.10 22.46 0,46 104,65 23,06 0,07 101,31 ĐB2.11 22.86 0,53 106,52 23,43 0,83 102,94 ĐB2.12 23.26 0,23 108,38 22,76 0,55 100,00 ĐB2.13 22.16 0,59 103,26 23,42 0,96 102,89 ĐB2.14 24.00 0,65 111,83 22,88 0,63 100,52 ĐB2.15 22.85 1,37 106,47 23,40 0,60 102,81 ĐB2.16 22.18 2,80 106,24 23,62 0,64 103,77 ĐB2.17 23.80 0,51 110,90 22,81 0,94 100,21 ĐB2.18 21.52 1,09 100,27 22,79 0,92 100,13 ĐB2.19 21.60 1,50 101,11 23,83 0,91 104,70 ĐB2.20 22,96 1,20 106,98 23,03 0,46 101.18 ĐB2.21 23.26 0,87 108,38 23,13 0,64 101,62 hoạt tính 44 hoạt tính ĐB2.22 21.70 0,19 101,11 23,73 0,13 104,26 ĐB2.23 22.23 0,41 103,58 23,16 0,89 101,75 ĐB2.24 25,26 0,20 117,70 24,53 0,81 107.77 ĐB2.25 23.80 0,95 110,90 22,96 0,23 100,87 ĐB2.26 22.13 0,50 103,12 23,63 0,98 103,82 ĐB2.27 22.33 0,87 104,05 23,20 0,81 101,93 ĐB2.28 24,76 0,93 115,37 25,70 0,47 112,91 ĐB2.29 22.03 0,20 102,65 23.23 0,50 102,06 ĐB2.30 24.10 0,55 112,30 23,00 0,45 101,05 ĐB2.31 21,76 0,55 100,74 23,40 0,57 102,81 ĐB2.32 22.40 0,36 104,38 22,80 0,58 100,17 ĐB2.33 23,50 0,86 109,50 23,00 0,38 101,05 ĐB 2.34 25,40 1,55 118,35 25,93 0,92 113,92 Chứng 21,46 0,15 100,00 22,76 0,27 100,00 Phụ lục Bảng 3.16: Kết thử HTKS đột biến lần 45 Phụ lục 4: Hình ảnh thử HTKS SLNN E.coli Phụ lục 5: Hình ảnh thử HTKS ĐB E.coli 46 Phụ lục 6: Hình ảnh thử HTKS đột biết B.subtilis Phụ lục 7:Hình ảnh Phổ tử ngoại (UV) vết KS2 Streptomyces 184.26 47 Phụ lục 8:Hình ảnh Phổ tử ngoại (UV) vết KS2 Streptomyces 184.26 Phụ lục 9: Hình ảnh phổ hồng ngoại ( IR) KS2 Streptomyces 184.26 48 Phụ lục 10: Hình ảnh Phổ khối (IM) KS2 Streptomyces 184.26 49