Áp dụng kỹ thuật lamp để giám sát vi khuẩn tả trong mẫu nước ngoại cảnh tại một số tỉnh miền bắc việt nam

Khoa công nghệ sinh học – Viện Đại Học Mở Hà Nội 2016 MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu: PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TÌNH HÌNH DỊCH TẢ TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM 1.1.1 Tình hình dịch tả giới: 1.1.2 Tình hình dịch tả Việt Nam : 10 1.2 DỊCH TỄ HỌC BỆNH TẢ 13 1.2.1 Nguồn truyền nhiễm: 13 1.2.2 Đường truyền nhiễm 14 1.3 SINH THÁI HỌC CỦA BỆNH TẢ 15 1.3.1 Hình thái vi khuẩn Tả: 15 1.3.2 Cấu trúc genome vi khuẩn Tả : 16 1.3.3 Tính kháng nguyên : 17 1.4 PHÂN LOẠI : 18 1.5 ĐỘC TỐ TẢ : 20 1.6 CƠ CHẾ GÂY BỆNH : 21 1.7 Một số phương pháp nghiên cứu phát Vibrio Cholerae 22 1.7.2 Kỹ thuật PCR : 22 1.7.3 Kỹ thuật Real Time - PCR: 23 1.7.4 Kỹ thuật LAMP : 24 Nguyễn Hồng Uyên - 1201 Khoa công nghệ sinh học – Viện Đại Học Mở Hà Nội 2016 PHẦN II PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU VÀ THỜI GIAN THỰC HIỆN 30 2.1.1 Đối tượng địa điểm thu thập mẫu : 30 2.1.2 Kỹ thuật lấy mẫu Số lượng mẫu thu thập : 30 2.1.3 Thời gian thu thập mẫu: 31 2.2 CƠ SỞ VẬT CHẤT TRONG QUÁ TRÌNH NGHIÊN CỨU: 31 2.2.1 Trang thiết bị sử dụng 31 2.2.2 Mơi trường – Hóa chất sinh phẩm 32 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU: 33 2.3.1 Kỹ thuật nuôi cấy truyền thống : 33 2.3.2 Kỹ thuật PCR: 37 2.3.3 Kỹ thuật LAMP 40 PHẦN KẾT QUẢ 44 3.1 Phân lập vi khuẩn Tả kỹ thuật nuôi cấy truyền thống 44 3.2 Kết phát gen O1, O139 Vibrio cholerae mẫu nước ngoại cảnh 49 3.2.1 Kết phát gen O1,O139 kỹ thuật PCR 49 3.2.2 Kết phát gen O1, O139 kỹ thuật LAMP 51 3.3 Khảo nghiệm độ nhạy độ đặc hiệu kỹ thuật LAMP với gen O1, O139 vi khuẩn Tả Error! Bookmark not defined 3.3.1 Khảo nghiệm độ nhạy kỹ thuật LAMP với gen O1 Error! Bookmark 3.3.2 Khảo nghiệm độ nhạy kỹ thuật LAMP với gen O139Error! Bookmar Nguyễn Hồng Uyên - 1201 Khoa công nghệ sinh học – Viện Đại Học Mở Hà Nội 2016 MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Bệnh tả bệnh nhiễm trùng đường ruột cấp tính vi khuẩn tả nhóm O1 O139 gây ra, bệnh truyền trực tiếp qua đường phân - miệng ăn uống bị nhiễm vi khuẩn tả có độc tố Cơ thể bị nhiễm trùng nặng biểu triệu chứng bệnh trầm trọng tử vong Đây bệnh nhiễm trùng cấp tính đường tiêu hóa, dễ lây từ người sang người có khả gây đại dịch với tỉ lệ tử vong cao không điều trị cách kịp thời Có 200 nhóm huyết học Vibrio cholerae nhiên có nhóm O1 O139 có khả gây bệnh tả gây dịch tả [6] Hiện nay, bệnh tả mối đe dọa tới sức khỏe cộng đồng nhiều nước phát triển châu Á, châu Phi Nam Mỹ [1] Có nhiều vụ dịch tả có khởi phát vùng ven biển [2], nơi thích hợp cho tồn phát triển vi khuẩn tả [15][2] Nghiên cứu giám sát môi trường nước ngoại cảnh vịnh Bengal thấy vi khuẩn tả gây dịch tả có mối liên quan với vi khuẩn tả vùng biển cửa sông [3][2] Vi khuẩn tả cho sinh sống tìm thấy ruột non người, thật biết đến tác nhân gây bệnh tồn mơi trường nước thời gian khơng có dịch bệnh [4] Vi khuẩn bám vào quan động vật phù du, động vật giáp xác, thực vật thủy sinh nước biển nước cửa sơng sống sót cách hình thành màng sinh học bề mặt sinh vật [5] màng sinh học nước [7] Vì vậy, giám sát Vi khuẩn tả O1 O139 vùng nước cửa sông ven biển nơi thường xuyên có khởi phát dịch thời gian trước có ý nghĩa lớn giúp cảnh báo sớm vụ dịch xảy Nguyễn Hồng Uyên - 1201 Khoa công nghệ sinh học – Viện Đại Học Mở Hà Nội 2016 giúp cho công tác phịng chống kiểm sốt dịch dịch tả cách chủ động hơn, giảm thiểu tác động thiệt hại dịch tả gây Có nhiều phương pháp áp dụng việc phát vi khuẩn tả môi trường nước ngoại cảnh như: Phương pháp nuôi cấy, phương pháp PCR, phương pháp RealTime – PCR Trong phương pháp ni cấy phân lập thực phổ biến để định danh loài vi khuẩn xem tiêu chuẩn vàng Tuy nhiên phương pháp tốn nhiều thời gian nhân công, đồng thời khơng thể phân biệt cách xác khuẩn tả sinh độc tố không sinh độc tố Hiện người ta thường sử dụng phương pháp PCR hay Real Time-PCR để phát gen O1, O139 gen độc tố (ctxA) vi khuẩn tả Thế kỹ thuật PCR hay RT-PCR phải sử dụng máy móc sinh phẩm đắt tiền LAMP kỹ thuật cho phép khuếch đại DNA với độ đặc hiệu cao, độ nhạy nhanh chóng điều kiện đẳng nhiệt phát triển Notomi [8] sử dụng cho bệnh truyền nhiễm Sử dụng mồi (primer) khác thiết kế đặc biệt nhận đoạn riêng biệt gen đích (target gene) q trình phản ứng xảy nhiệt độ cố định dùng phản ứng thay mạch Khuếch đại phát gene hoàn thành bước cách ủ hỗn hợp mẫu, primers, DNA polymerase có hoạt tính thay mạch chất nhiệt độ cố định (khoảng 65°C) [9][14] Phương pháp cho hiệu khuếch đại cao với lượng DNA khuếch đại đến 109-1010 lần vịng 15-60 phút Bởi tính đặc hiệu cao, diện sản phẩm khuếch đại chứng tỏ có mặt đoạn gene quan tâm, quan sát mắt thường Dựa vào lý so trên, tiến hành đề tài: “Áp dụng kỹ thuật LAMP để giám sát vi khuẩn tả mẫu nước ngoại cảnh số tỉnh miền bắc Việt Nam” Nguyễn Hồng Uyên - 1201 Khoa công nghệ sinh học – Viện Đại Học Mở Hà Nội 2016 1.2 Mục tiêu: - Thăm dò khả ứng dụng kỹ thuật LAMP để giám sát vi khuẩn tả mẫu nước ngoại cảnh - Phát vi khuẩn tả môi trường nước ngoại cảnh kỹ thuật nuôi cấy, kỹ thuật PCR kỹ thuật LAMP - Xác định độ nhạy kỹ thuật LAMP phát gen đặc hiệu O1, O139 vi khuẩn tả Nguyễn Hồng Uyên - 1201 Khoa công nghệ sinh học – Viện Đại Học Mở Hà Nội 2016 PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TÌNH HÌNH DỊCH TẢ TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM 1.1.1 Tình hình dịch tả giới: Bệnh Tả xuất từ lâu đời mối đe dọa toàn giới Mỗi năm ước tính có khoảng triệu ca mắc bệnh tả 200.000 ca tử vong châu Phi khoảng 100.000 châu Á[42] Một phần ba số trẻ em tuổi, phần tư từ 5-14 tuổi số lại người lớn Bệnh tả cho xuất cách hàng kỷ đồng sông Hằng tiểu lục địa Ấn Độ Thế kỷ thứ 19 đợt dịch tả lan tràn tới nhiều vùng giới từ Nam Á theo đường buôn bán, hành hương di tản Trong thời gian có đại dịch, nhiều vụ dịch lớn có tỷ lệ tử vong cao xảy khắp thành thị châu Âu, châu Mỹ Năm 1849, có điều tra tiếng John Snow (Bác sỹ người Anh) chứng minh nước môi trường truyền bệnh tả Từ năm đầu kỷ 19 có nhiều đợt dịch tả lớn hay đại dịch tả toàn cầu Sáu đợt đại dịch liên tiếp xảy tất lục địa, làm chết hàng triệu người Đợt đại dịch (đại dịch thứ 7) týp gây bệnh El Tor dần trở thành tác nhân bùng phát dịch bắt đầu năm vào 1961 Nam Á, lan sang châu Phi vào năm 1971 nước châu Mỹ năm 1991 Chủng có đặc điểm khác với V.cholerae cổ điển có khả sinh yếu tố làm tan máu Tác nhân nguyên nhân gây bệnh hầu hết vụ dịch tả nay, v v Năm 1883, Robert Koch (nhà vi sinh vật người Đức) phân lập thành công vi khuẩn từ phân bệnh nhân biểu triệu chứng bệnh Tả Có tài liệu cho trước 30 năm nhà giải phẫu học người Ý phát phẩy khuẩn nguyên nhân gây bệnh Các vụ đại dịch bắt nguồn từ châu Á, sau lan tới châu lục khác nhiều nước, nhiều năm Cho Nguyễn Hồng Uyên - 1201 Khoa công nghệ sinh học – Viện Đại Học Mở Hà Nội 2016 đến nay, dịch tả lưu hành khắp giới nguyên nhân gây tử vong cao nhiều quốc gia Qua vụ dịch, có số ghi nhận đáng ý dịch tễ học, sinh bệnh học, điều trị phịng chống bệnh tả tóm tắt sau: Vụ đại dịch thứ (1816 – 1826 ) : Lần ghi nhận bệnh tả xảy dạng đại dịch, vụ đại dịch bắt đầu vào năm 1817 khu vực châu thổ sông Hằng, ban đầu xuất Ấn Độ làm chết 10000 binh lính Anh khơng biết người dân Ấn Độ[33] Sau bệnh lan tới nhiều nước thuộc châu Á Trung Quốc, Indonesia ( nơi có 100.000 người chết đảo Java), Thái Lan, Nhật Bản, v v châu Phi[34] Vụ đại dịch thứ hai ( 1829 – 1851 ) : Năm 1831, xảy Nga, Hungary (khoảng 100.000 người chết) Đức Vào năm 1832, dịch xảy Luân Đôn (hơn 55.000 người chết Anh) [35] , Pháp, Canada, Mỹ (NewYork)[36] Dịch xảy bờ Thái Bình Dương Bắc Mỹ vào năm 1834[37] Hai năm sau dịch bùng phát Anh Wales, vào năm 1848 có 52.000 chết Có nguồn cho có 150.000 người Mỹ chết bệnh tả khoảng năm 1832 1849[38] Trong vụ đại dịch này, đầu năm 1930, O’Shaughnessy người chứng minh phân bệnh nhân bị bệnh tả có tính kiềm có nồng độ điện giải cao Sau phát có ý nghĩa này, Latta điều trị thành công số bệnh nhân tả nước nặng phương pháp tiêm tĩnh mạch dung dịch chứa muối điện giải[43] Vụ đại dịch thứ ( 1852 – 1860 ) : Chủ yếu ảnh hưởng Nga với triệu ca tử vong Năm 1852, bệnh tả lan sang phía đơng đến Indonesia sau xâm nhập vào Trung Quốc Nhật Bản vào năm 1854 Philippines bị nhiễm năm 1858 Hàn Quốc năm 1859 Vào năm 1859, dịch bùng phát trở lại Bengal làm lây lan sang Iran, Iraq, Ả Rập Nga [39] Trên Nguyễn Hồng Uyên - 1201 Khoa công nghệ sinh học – Viện Đại Học Mở Hà Nội 2016 khắp đất nước Tây Ban Nha, bệnh tả gây 236.000 ca tử vong năm 1854 –1855[32] Vụ đại dịch thứ (1863 – 1875) : Lây lan chủ yếu châu Âu châu Phi Dịch cướp 90.000 mạng sống Nga năm 1866[ 40] Dịch tả hoành hành dội New Orleans thành phố, thị trấn dọc theo triền sông Missippi, Missouri Ohio nước Mỹ[44] Vụ đại dịch thứ (1881 – 1896) : 1883–1887 cướp 250.000 sinh mạng châu Âu chết 50.000 người châu Mỹ[41] Tại Ai Cập Calcutta (Ấn Độ), Robert Koch phân lập vi khuẩn tả từ phân bệnh nhân bị bệnh tả, năm sau Koch phân lập vi khuẩn tả Ông liền cơng bố thơng tin bệnh biện pháp phịng tránh[45] Vụ đại dịch thứ ( 1899 – 1923 ) : Gây vụ dịch lớn vùng Trung Cận Đông bán đảo Ban Căng, từ năm 1921 đến năm 1961, vụ dịch tả lớn xảy Ai Cập năm 1947 với 32.978 trường hợp tả, gây tử vong 20.472 người, dịch tả chủ yếu lưu hành nước thuộc khu vực Đông Nam Á châu Á, vụ đại dịch tác nhân gây bệnh V cholerae O1, typ sinh học cổ điển[43] Vụ đại dịch thứ bảy (1962– 4966) : Tác nhân gây bệnh V cholerae O1, týp sinh học El Tor, Goschlich lần phân lập năm 1905 chia làm giai đoạn sau: - Từ năm 1961-1962 dịch tả khu trú đảo thuộc Indonesia nước Đông Nam Á, với tổng số 13.393 người mắc, tử vong 1.977 người [10][11] Năm 1963-1969 thời gian ngắn dịch xuất nhiều nước châu Á: Ấn Độ, Pakistan, Liên Xơ cũ, I-Rắc, Việt Nam bắt đầu có dịch tả El Tor vào tháng năm 1964[12] - Giai đoạn từ năm 1970-1990 theo số liệu Tổ chức Y tế Thế giới có 36 nước có dịch tả, điều đáng ý Li Băng, Syri chủng Nguyễn Hồng Uyên - 1201 Khoa công nghệ sinh học – Viện Đại Học Mở Hà Nội 2016 gây dịch El Tor Ogawa, nước liền kề Ả rập-Xê út, Israel chủng gây dịch lại El Tor Inaba[12] - Tiếp theo năm 1991 đến điều đáng ý nước Trung Mỹ Nam Mỹ 21/23 nước có bệnh tả, năm 1994 châu Mỹ La Tinh chiếm 50% số bệnh nhân tả toàn giới Tháng 7/1994 xảy vụ dịch tả thảm khốc trại tỵ nạn Uganda với 58.057 trường hợp bị bệnh tả, tử vong 23.800 người, năm 1996 số người mắc tả châu Phi chiếm 60% tổng số trường hợp mắc tả giới Tháng 12 năm 1992 vụ dịch lớn lại sảy nước này[13][16] - Vi khuẩn gây bệnh xác định V cholerae O139 "Bengal" Về mặt di truyền, O139 "Bengal" hình thành từ El Tor cấu trúc kháng nguyên chúng biến đổi Tất lứa tuổi (kể vùng có dịch) bị nhiễm Chủng O139 gây bệnh 11 nước Đơng nam Á (tính đến năm 2005) Khơng có số liệu xác số người bị bệnh O139 nước khơng thơng báo cụ thể trường hợp bệnh O1 hay O139 riêng rẽ Trong năm cuối kỷ 20 dịch tả ngày trở nên nghiêm trọng, bệnh tả xảy tất châu lục, tập trung chủ yếu nước phát triển, y học có hiểu biết đáng kể sinh bệnh học điều trị bệnh tả tỷ lệ tử vong bệnh tả mức độ cao, đặc biệt khu vực châu Phi[46][47] Những đặc điểm týp El Tor giúp khẳng định khả "tiếp tục gây nguy hiểm" bao gồm: Tỷ lệ nhiễm El Tor thấp nhiều so với tỷ lệ nhiễm týp cổ điển, thời gian mang trùng sau bị bệnh El Tor dài so với trường hợp nhiễm týp cổ điển, El Tor có khả tồn ngồi mơi trường tốt hơn, dài týp cổ điển Chính El Tor có khả gây dịch nơi Týp cổ điển "tung hoành" Nguyễn Hồng Uyên - 1201 Khoa công nghệ sinh học – Viện Đại Học Mở Hà Nội 2016 Tháng năm 1997, dịch bùng phát cộng đồng 90 ngàn người tị nạn Ruanđa Cộng Hồ Cơng gơ Chỉ 22 ngày đầu có 1.521 người chết Đa số trường hợp chết không can thiệp kịp thời[48] Tại Mỹ, dịch tả xuất vào năm 1800 sau khống chế đảm bảo vệ sinh nguồn nước sinh hoạt Tuy vậy, giao thông du lịch tạo điều kiện để bệnh xuất lẻ tẻ Đa số trường hợp du lịch nước Mỹ La tinh, châu Phi, châu Á Một số trường hợp nhiễm bệnh ăn thức ăn mang từ quốc gia lưu hành bệnh[17] Đến nay, dịch tả lưu hành châu lục Á, Phi, Mỹ la tinh Ở Đông Bắc Thái Lan, Thicumpon cộng thấy 57 số 60 chủng V.cholerae O1 ELTor phân lập năm 1986 nhạy cảm với thực khuẩn thể tả VI [18] Tuy nhiên, tất 113 chủng phân lập năm 1988 lại không nhạy cảm với thực khuẩn thể tả Ở Lào, tỉ lệ mắc tử vong bệnh tả xảy ra, chủng V.cholerae O1 El Tor phân lập từ 1993 – 1999 nhạy cảm Polymycin, dịch tả biến năm 1997 tái xuất vào năm 1998 1.1.2 Tình hình dịch tả Việt Nam : Bệnh tả nguyên nhân quan trọng gây tiêu chảy cấp Việt Nam từ kỷ qua với triệu trường hợp mắc bệnh tả thông báo Dịch tả xuất lần đầu vào năm 1862 1885, gây tử vong 13% quân xâm lược Pháp Sau đó, dịch tả tiếp tục xâm nhập từ số nước châu Á vào Việt Nam: Từ Campuchia xâm nhập theo đường sông vào năm 1926 – 1927, từ Hồng Kông xâm nhập theo đường biển vào tỉnh miền bắc Hải Phịng Móng Cái vào năm 1937 – 1938 Sau bệnh lan theo đường sắt đường đến toàn vùng Bắc Bộ Trung Bộ Số người mắc lên tới 20.678 người, số chết 14.992 người, tỷ lệ tử vong tới 70% [43] Bệnh tả Eltor lần xuất miền Nam năm 1964 với 20.009 người mắc bệnh, 821 người tử vong Năm 1976, dịch tả lớn xảy Nguyễn Hồng Uyên - 1201 10 Khoa công nghệ sinh học – Viện Đại Học Mở Hà Nội 2016 Bảng 3.2: Kết thử nghiệm tính chất sinh vật hóa học STT Tính chất sinh vật Tiêu chuẩn đánh hóa học giá dương tính Kết chủng NAG Oxidase (+) 56(100%) Glucose (+) 56(100%) Gas (-) 56(100%) H2S (-) 56(100%) Lactose (-) 56(100%) Mannitol (+) 56(100%) Motility (+) 56(100%) Urease (-) 56(100%) Indole (+) 56(100%) 10 LDC (+) 56(100%) 11 Sucrose (+) 56(100%) 12 Mannose (+) 40(71.43%) 13 Arabinose (-) 42(85.71%) Nguyễn Hồng Uyên - 1201 47 Khoa công nghệ sinh học – Viện Đại Học Mở Hà Nội 2016 Hình 3.4 Kết xét nghiệm sinh vật hóa học Bảng cho thấy đặc trưng nghi ngờ tính chất sinh hóa V cholerae nhóm NAG.Tất khuẩn lạc nghi ngờ có phản ứng dương tính với oxydase có tính chất sinh hóa giống hệt V.cholerae Có đến 40 (71.43%) (14.29%) khuẩn lạc nghi ngờ có kết quảdương tính với mannose arabinoza , tương ứng thuộc nhóm I , II III NAG Bảng 3.3 : Kết qủa phân nhóm NAG theo Herzberg Nhóm Mannoza Saccaroza Arabinoza Tổng số chủng NAG phân lập I + + - 32 II - + - 16 III + + + IV - + + V + - - VI - - - Nguyễn Hồng Uyên - 1201 48 Khoa công nghệ sinh học – Viện Đại Học Mở Hà Nội 2016 3.2 KẾT QUẢ PHÁT HIỆN GEN O1, O139 CỦA VIBRIO CHOLERAE TRONG MẪU NƯỚC NGOẠI CẢNH 3.2.1 Kết phát gen O1,O139 kỹ thuật PCR Hải Phòng, Hà Nội, Thái Bình tỉnh xuất dịch Tả vài năm trước Nên chọn tỉnh thành để tiến hành lấy mẫu Trong nghiên cứu áp dụng kỹ thuật PCR đa mồi phát gen đặc hiệu V.cholerae O1 O139 gen độc tố ctxA, gián tiếp chứng minh xuất vi khuẩn tả môi trường nước Bảng 3.4: Kết PCR cho mẫu nước Hà Nội, Hải Phịng,Thái Bình Thời gian Địa điểm PCR Mẫu (n) VC O1 VC O139 ctxA toxR 10 0 10 10 0 10 10 0 10 0 10 0 10 Hà Nội Hải Tháng 10, Phòng 2015 Thái Bình Hà Nội Hải Tháng 12, Phịng 2015 Nguyễn Hồng Uyên - 1201 49 Khoa công nghệ sinh học – Viện Đại Học Mở Hà Nội 2016 Thái Bình 10 0 10 10 0 10 0 10 0 0 90 56 Hà Nội Hải Tháng 2, Phòng 2016 Thái Bình Tổng cộng Bằng phương pháp ni cấy truyền thống, không phát V cholerae O1 O139 từ mẫu nước môi trường ngoại cảnh, phương pháp PCR, phát gen đặc hiệu V cholerae O139 vi khuẩn tả mẫu nước Hải Phòng (chiếm tỷ lệ 1.11%), mẫu dương tính với O1 mẫu nước Hải Phòng (chiếm tỷ lệ 2.22%) Kết chứng minh có mặt V cholearae O1 V cholerae O139 môi trường nước ngoại cảnh Việt Nam Tuy nhiên chủng không mang gen độc tố ctxA nên gây bệnh người Kết cho thấy tỷ lệ phát vi khuẩn tả kỹ thuật PCR cao hẳn so với kỹ thuật nuôi cấy Bằng kỹ thuật PCR đơn mồi đãphát gen toxR gen điều hòa độc tố V cholerae từ mẫu nước Thái Bình, Hải Phịng Hà Nội với tỷ lệ 62.3% (56/90 chủng) Nguyễn Hồng Uyên - 1201 50 Khoa công nghệ sinh học – Viện Đại Học Mở Hà Nội 2016 3.2.2 Kết phát gen O1, O139 kỹ thuật LAMP Bảng 3.5: Kết so sánh việc phát gen O1 , O139 kỹ thuật LAMP kỹ thuật PCR mẫu nước Hà Nội, Hải Phòng Thái Bình Thời gian Địa điểm Hà Nội Tháng 10, 2015 PCR Mẫu LAMP (n) VC O1 VC O139 VC O1 VC O139 10 0 10 2 10 0 0 10 0 10 0 10 0 10 0 10 0 10 0 22 Hải Phịng Thái Bình Hà Nội Hải Tháng 12, 2015 Phịng Thái Bình Hà Nội Tháng 2, 2016 Hải Phịng Thái Bình Tổng cộng Nguyễn Hồng Un - 1201 90 3(3,34%) 25(27,78%) 51 Khoa công nghệ sinh học – Viện Đại Học Mở Hà Nội 2016 Hình 3.5 Kết kỹ thuật LAMP mẫu nước Hải Phòng tháng 12 năm 2015 Căn vào bảng thấy với kỹ thuật PCR, chúng tơi tìm thấy mẫu dương tính với gen đặc hiệu O1 O139 Hải Phịng mẫu dương tính với gen O1 mẫu dương tính với gen O139 Chiếm 3.34% tổng số chủng phân lập Cịn kỹ thuật LAMP chúng tơi tìm thấy 25 mẫu dương tính với gen O1 O139 tỉnh Hà Nội, Hải Phịng, Thái Bình Trong Hà Nội tìm thấy 12 mẫu dương tính với gen O139 khơng có mẫu dương tính với gen O1 Tại Hải Phịng có mẫu dương tính với gen O1 mẫu dương tính với gen O139 Tại Thái Bình có mẫu dương tính với gen O139 mẫu dương tính với gen O1 Tổng số mẫu dương tính với gen O1 O139 chiếm đến 27.78% ( 25/90) chủng phân lập Như kỹ thuật LAMP tìm thấy số mẫu dương tính lớn nhiều lần so với kỹ thuật PCR Kỹ thuật PCR khơng thể tìm mẫu dương tính với gen O1 O139 hai tỉnh thành Hà Nội Thái Bình, kỹ thuật LAMP lại làm điều Số lượng mẫu dương tính lớn Hà Nội hiểu dân số thủ đô tải, người dân từ tỉnh đổ xô Hà Nội tập trung nhiều khu dân cư với hoạt động buôn bán sầm uất nên thành phố gặp vấn đề lớn nước nước thải Các ao hồ, sông ngày ô nhiễm Tạo Nguyễn Hồng Uyên - 1201 52 Khoa công nghệ sinh học – Viện Đại Học Mở Hà Nội 2016 điều kiện cho dịch bệnh phát triển Mặc dù tỷ lệ dương tính cao xác định sinh vật sống hay chết, phương pháp LAMP phương pháp hỗ trợ mạnh mẽ để xác nhận lại kết kỹ thuật nuôi cấy truyền thống Đồng thời tồn gen O1 gen O139 khiến tăng thêm lo ngại tiềm bùng nổ dịch tả dấu hiệu cho thấy mức cảnh báo tăng cao Trường hợp đòi hỏi phải đến địa điểm lấy mẫu Hà Nội để kiểm tra cẩn thận lại 3.3 KHẢO NGHIỆM ĐỘ NHẠY CỦA KỸ THUẬT LAMP VỚI GEN O1, O139 CỦA VI KHUẨN TẢ: 3.3.1.Khảo nghiệm độ nhạy kỹ thuật LAMP với gen O1: Chủng tiêu chuẩn sử dụng thí nghiệm V cholerae O1 Mak 757 ElTor Ogawa ( O1+, ctxA+) Dịch nuôi cấy tăng sinh điều chỉnh mức 105 CFU/1ml trước đem tách chiết ADN Bảng 3.6 Khảo nghiệm độ nhạy kỹ thuật LAMP kỹ thuật PCR với gen O1 Phương pháp Pha lỗng dịch ni cấy cho thí nghiệm Chủng Mak 757 ElTor CFU/ml 104 103 102 101 Ogawa LAMP + + + + PCR + + +/- - Nhìn bảng 3.6 ta thấy kỹ thuật LAMP phát gen sản xuất độc tố Tả (CT) V cholerae Mak 757 (týp sinh học ElTor nhóm huyết Ogawa) tìm thấy nồng độ 102 CFU/ml Cao gấp mười lần kỹ thuật PCR Hơn nữa, kỹ thuật LAMP phát nồng độ nhỏ 101CFU/ml Nguyễn Hồng Uyên - 1201 53 Khoa công nghệ sinh học – Viện Đại Học Mở Hà Nội 2016 3.3.2 Khảo nghiệm độ nhạy kỹ thuật LAMP với gen O139 Chủng tiêu chuẩn sử dụng thí nghiệm V cholerae O139 AI4450 ( O139+, ctxA+) Dịch nuôi cấy tăng sinh điều chỉnh mức 105 CFU/1ml trước đem tách chiết ADN Bảng 3.7 Khảo nghiệm độ nhạy kỹ thuật LAMP kỹ thuật PCR với gen O139 Phương pháp Pha loãng dịch ni cấy cho thí nghiệm Chủng CFU/ml 104 103 102 101 LAMP + + + + PCR + + +/- - AI4450 Nhìn bảng 3.6 ta thấy kỹ thuật LAMP phát gen sản xuất độc tố Tả (CT) V cholerae O139 AI4450 tìm thấy nồng độ 102 CFU/ml Cao gấp mười lần kỹ thuật PCR Hơn nữa, kỹ thuật LAMP phát nồng độ nhỏ 101CFU/ml Nguyễn Hồng Uyên - 1201 54 Khoa công nghệ sinh học – Viện Đại Học Mở Hà Nội 2016 KẾT LUẬN - Không phát V cholerae O1 O139 môi trường nước ngoại cảnh phương pháp ni cấy.Khơng tìm thấy gen độc tố tả ctxA tổng số 90 mẫu nước ngoại cảnh - Kỹ thuật LAMP có khả phát vi khuẩn tả ngoại cảnh cao phương pháp nuôi cấy kỹ thuật PCR - K ỹ thuật LAMP phát gen O1 O139 tốn 95 phút so với kỹ thuật PCR có độ nhạy cao gấp 10 lần kỹ thuật sau làm thử nghiệm - K ỹ thuật LAMP khơng địi hỏi máy móc phức tạp kỹ thuật PCR, thao tác đơn giản, thời gian thực ngắn Do kỹ thuật LAMP cơng cụ đắc lực hỗ trợ phương pháp nuôi cấy truyền thống việc cảnh báo dịch sớm báo động nơi chuẩn bị bùng phát dịch Tả KHUYẾN NGHỊ Việc giám sát vi khuẩn Tả môi trường ngoại cảnh Việt Nam phải thực thường xuyên liên tục Chúng ta cần phối hợp phương pháp xét nghiệm để dự báo phòng chống bệnh dịch Tả có hiệu kịp thời Nguyễn Hồng Uyên - 1201 55 Khoa công nghệ sinh học – Viện Đại Học Mở Hà Nội 2016 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG ANH Barua, D 1992 History of cholera, p 1–5 In D Barua andW B Greenough III (ed.), Cholera Plenum, New York, NY Huq, A., R B Sack, A Nizam, I M Longini, G B Nair, A Ali, J G Morris, Jr., M N Khan, A K Siddique, M Yunus, M J Albert, D A Sack, and R R Colwell 2005 Critical factors influencing the occurrence of Vibrio cholerae in the environment of Bangladesh Appl Environ Microbiol 71: 4645–4654 Faruque, S M., M J Islam, Q S Ahmad, A S Faruque, D A Sack, G B Nair, and J J Mekalanos 2005 Self-limiting nature of seasonal cholera epidemics: role of host-mediated amplification of phage Proc Natl Acad Sci U S A 102:6119–6124 Faruque, S M., M J Albert, and J J Mekalanos 1998 Epidemiology, genetics, and ecology of toxigenic Vibrio cholerae Microbiol Mol Biol Rev 62:1301–1314 Alam, M., M Sultana, G B Nair, R B Sack, D A Sack, A K Siddique, A Ali, A Huq, and R R Colwell 2006 Toxigenic Vibrio cholerae in the aquatic environment of Mathbaria, Bangladesh Appl Environ Microbiol 72:2849–2855 Sack, D A., R B Sack, G B Nair, and A K Siddique 2004 Cholera Lancet 363:223–233 Alam, M., M Sultana, G B Nair, A K Siddique, N A Hasan, R B Sack, D A Sack, K U Ahmed, A Sadique, H Watanabe, C J Grim, A Huq, and R R Colwell 2007 Viable but nonculturable Vibrio cholerae O1 in biofilms in the aquatic environment and their role in cholera transmission Proc Natl Acad Sci U S A 104:17801–17806 Nguyễn Hồng Uyên - 1201 56 Khoa công nghệ sinh học – Viện Đại Học Mở Hà Nội 2016 Notomi, T., et al (2000) "Loop-mediated isothermal amplification of DNA." Nucleic Acids Research 28(12): E63 Hara-Kudo, Y., et al (2007) "Sensitive and rapid detection of Vero toxin-producing Escherichia coli using loop-mediated isothermal amplification." Journal Medical Microbiology 56(Pt 3).pp 398-406 10 CDC (2004), “Cholera and other Vibrio illness surveillance summaries:summary of human Vibrio isolates reported to CDC, 2004”, Atlanta, GA: US Department of Health and Human Services, CDC, MMWR, 47, pp.654-658 11 Ehara M., Nguyen B.M., Nguyen D.T., Toma C., Higa N (2004), “Drug susceptibility and its genetic basic in epidemic Vibrio cholerae O1 in Vietnam”, Epidemiol Infect, 132, pp.595-600 12 Morris J.G., Picardi J.L., Lee J.V., Roberts A (1984),“Isolation of nontoxigenic Vibriocholerae Ogoup from a patient with severe gastro intestinal disease”, J Clin Microbio, 19(2), pp.297-297 13 Peak S.H., Lee S.H.,Cho J.H and Kim Y.S (2000), “Development of rapid one-step immuno-chromato graphic assay”, Methods, 22, pp.53-60 14 Yamayaki W, et al (2008) "Development and evaluation of a loop- mediated isothermal amplification assay for rapid and simple detection of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli." Journal of Medical Microbiology57(4), pp: 444-451 15 Gil, A I., V R Louis, I N Rivera, E Lipp, A Huq, C F Lanata, D N Taylor, E Russek-Cohen, N Choopun, R B Sack, and R R Colwell 2004 Occurrence and distribution of Vibrio cholerae in the coastal environment of Peru Environ Microbiol 6:699–706 16 Sinh D.V., Maria H.M., Matte G.R., Jiang S., Sabeena F., Shukla B.N., Sanyal S.C., Huq A and Colwell R.R (2001), “Molecular Analysis of V Nguyễn Hồng Uyên - 1201 57 Khoa công nghệ sinh học – Viện Đại Học Mở Hà Nội 2016 cholerae O1, O139, non - O1, and non - O139 Strains: Clonal Relationships between Clinical and environmental Isolates”, Applied and Environmental Microbiology, Rajiv Gandihic entrefor Biotechnology, Jagath, Thiruvananthap uram 695014, India, Center for Marine Biotechnology, University of Maryland Biotechnology Institue, Baltimore, Maryland 17 CDC (1995), “Update: Vibrio cholerae O1 western hemisphere, 1991-1994, and Vibrio cholerae O139 Asia”, MMWR, 44, pp.215-219 18 Dalsgaard A., Skov M.N., Taylor D.N (1997), “Molecular evolution of Vibrio cholerae O1 strains isolated in Lima, Peru, from 1991 to 1995”,Journal of Clincal Microbiology, 35(5), pp.1151-1156 19 Faruque, A.S.G, Fucchs, G.J and Alberts, M J 1996 Changing epidemiology of cholerae due to Vibrio cholerae O1 and O139 Bengal in Dhaka, Bangladesh Epidemiology Infection, 1996 Jun , 116 (3) 275 – 20 Bauman, P., A,L, Furniss, J.V.Lee, 1984 Genus I, Vibrio Pacini 1854, 411 AL, 518-538 N.R Krieg and J G Holt (ed) Bergey’s manual of systematic bacteriology vol1.Williams and Wilkins, Baltimore 21 Vijayalakshmi N, R S.rao and S.Badrinath (1997) Minimum inhibitory concentration (MIC) of some antibiotics against Vibrio cholerae O139 isolates from Pondicherry Epidemiology and Infection 119(1)25 22 Jacob John T, Mary V Jesudason (1972) The First Epidemic of Vibrio cholera O139 J Clin Microbiol; Vol 33, No 7, 49-53 23 Ramamurthy, T., et al (1993) "Emergence of novel strain of Vibrio cholerae with epidemic potential in southern and eastern India." Lancet 341(8846).pp.703-704 24 Spangler, B D (1992) "Structure and function of cholera toxin and the related Escherichia coli heat-labile enterotoxin." Microbiological Reviews56(4).pp 622-647 Nguyễn Hồng Uyên - 1201 58 Khoa công nghệ sinh học – Viện Đại Học Mở Hà Nội 2016 25 Albert, M J (1993) Personal reflections on the discovery of Vibrio cholerae 0139 synonym Bengal: a tribute to team work and international collaboration J Diarrhoeal Dis Res 11:207-210 26 Faruque SM; Nair GB (editors) (2008) Vibrio cholerae: Genomics and Molecular Biology Caister Academic Press ISBN 978-1-904455-33-2 27 Reidl J , Karl E Klose Vibrio cholerae and cholera : out of the water and into the host FEMS Microbiology 26(2002) 125 - 139 28 Chow, K.H., et al., 2001 Detection of RTX toxin gene in Vibrio cholerae by PCR J Clin Microbiol 39(7): p 2594-7 29 Hara-Kudo, Y., et al (2007) "Sensitive and rapid detection of Vero toxin-producing Escherichia coli using loop-mediated isothermal amplification." Journal Medical Microbiology 56(Pt 3).pp 398-406 30 Yamayaki W, et al (2008) "Development and evaluation of a loop- mediated isothermal amplification assay for rapid and simple detection of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli." Journal of Medical Microbiology57(4), pp: 444-451 31 Tomita, N., et al (2008) "Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products." Nature Protocols 3(5).pp.877-882 32 Kohn, George C (2008) Encyclopedia of plague and pestilence: from ancient times to the present Info base Publishing tr 369 ISBN 0-81606935-2 CÁC WEBSITE 33 John Pike “Cholera- Biological Weapons” Globalsecurity.org 34 G William Beardslee “The 1832 Cholera Epidemic in New York State” Earlyamerica.com Nguyễn Hồng Uyên - 1201 59 Khoa công nghệ sinh học – Viện Đại Học Mở Hà Nội 2016 35 “Asiatic Cholera Pandemic of 1826–37” http://www.ph.ucla.edu/EPI/snow/pandemic1826-37.html 36 “The Cholera Epidemic Years in the United States” http://www.tngenweb.org/darkside/cholera.html 37 Cholera's seven pandemics, cbc.ca http://web.archive.org/web/20080513221429/http:/www.cbc.ca/health/story/2 008/05/09/f-cholera-outbreaks.html 38 The 1832 Cholera Epidemic in New York State – Page 2) http://www.earlyamerica.com/early-america-review/volume-4/the-1832cholera-epidemic-part-2/ 39 .( Asiatic Cholera Pandemic of 1846–63 UCLA School of Public Health.) http://www.ph.ucla.edu/epi/Snow/pandemic1846-63.html 40 “Eastern European Plagues and Epidemics 1300–1918” http://kehilalinks.jewishgen.org/Myadel/pandemics.htm 41 ( “Cholera – LoveToKnow 1911” 1911encyclopedia.org) 42 Số liệu Tổ chức Y tế giới WHO http://www.wpro.who.int/vietnam/topics/cholera/vi/ TIẾNG VIỆT 43 Phùng Đắc Cam (2003), Vibrio cholerae bệnh dịch tả, Nxb Y học, Hà Nội, tr.53-74 44 Nguyễn Tăng Ấm, Đặng Đức Trạch, Nguyễn Duy Thanh (1983), Bệnh tả El Tor, dịch tễ học lâm sàng, Nxb Y học, Hà Nội, tr.7-195 45 Nguyễn Đăng Hiền, Nguyễn Thị Mai Hương, Đặng Ngân Hà (2008), “Nghiên cứu dịch tễ học bệnh tiêu chảy virut Rota Việt Nam từ 20072008”, Tạp chí Y học dự phịng, 5(7), tr.19-20 46 Vũ Thanh Bình, Phùng Đắc Cam (1992), “TCP thành phần kháng nguyên Vcholerae”, Tạp chí Vệ sinh phòng dịch, 2(4), tr.87-89 Nguyễn Hồng Uyên - 1201 60 Khoa công nghệ sinh học – Viện Đại Học Mở Hà Nội 2016 47 Lương Văn Đàm, Nguyễn Bá Cẩn, Hoàng Văn Sinh, Vũ văn Nhung (2003), “Một số nhận xét vụ dịch tả Thanh Hố”, Cơng trình nghiên cứu khoa học, Trung tâm Y tế Dự phịng tỉnh Thanh Hố, tr.58-65 48 Nguyễn Đồng Tú, Ngơ Tuấn Cường, Nguyễn Hồi Thu, Lê Thanh Hương, Nguyễn Bình Minh, Đỗ Kim Ninh, Phạm Văn Dịu, Trần Minh Thuỷ (2008), “Giám sát Vibrio cholerae O1 Vibrio phage môi trường nước ngoại cảnh - Các yếu tố dự báo dịch tả”, Tạp chí Y học dự phòng, 18(4) 49 CDC/NCID Viện Vệ sinh Dịch tễ học Những phương pháp xét nghiệm chẩn đoán Vibrio cholera NXB Y học1993 Nguyễn Hồng Uyên - 1201 61