Nghiên cứu một số đặc tính của vi khuẩn escherichia coli (nhóm vtec) phân lập từ bò, lợn được giết mổ tại hà nội

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI NGUYỄN THỊ THANH THỦY NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ðẶC TÍNH CỦA VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI (NHĨM VTEC) PHÂN LẬP TỪ BÒ, LỢN ðƯỢC GIẾT MỔ TẠI HÀ NỘI LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP Chuyên ngành: Vi sinh vật học Thú y Mã số : 62 62 50 10 Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Bá Hiên TS ðỗ Ngọc Thúy HÀ NỘI - 2012 LỜI CAM ðOAN Tơi xin cam đoan: Luận án “Nghiên cứu số đặc tính vi khuẩn Escherichia coli (nhóm VTEC) phân lập từ bị, lợn giết mổ Hà Nội” cơng trình nghiên cứu riêng Những số liệu, kết nghiên cứu nêu luận án trung thực, khách quan chưa cơng bố cơng trình khác Tơi xin cam đoan giúp đỡ q trình thực luận án cám ơn thơng tin trích dẫn luận án ñều ñược rõ nguồn gốc Tác giả luận án Nguyễn Thị Thanh Thủy Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sĩ khoa học nông nghiệp ………………………… i LỜI CẢM ƠN Trong suốt q trình thực đề tài hồn thành luận án, tơi ln nhận giúp đỡ nhiều tổ chức cá nhân Nhân dịp này, xin cảm ơn Ban Giám hiệu Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội, Viện ðào tạo Sau ðại học, Khoa Thú y, Bộ môn Vi sinh - Truyền nhiễm, Cơ quan Thú y vùng I ñã tạo ñiều kiện cho tơi theo học chương trình đào tạo Nghiên cứu sinh trường Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Lãnh ñạo tập thể cán Chi cục Thú y Hà Nội nhiệt tình giúp đỡ tơi điều tra, lấy mẫu thực đề tài ðặc biệt, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến người hướng dẫn khoa học TS Nguyễn Bá Hiên - Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội TS ðỗ Ngọc Thúy - Viện Thú y ñã trực tiếp hướng dẫn, giúp đỡ tơi q trình thực đề tài hồn thành luận án Tơi xin cảm ơn PGS.TS Cù Hữu Phú, ThS Lưu Thị Hải Yến tập thể cán Bộ môn Vi trùng - Viện Thú y Quốc gia giúp đỡ tơi thực ñề tài nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn sâu sắc Ban lãnh ñạo tập thể cán Cơ quan Thú y vùng I, nơi công tác ủng hộ, giúp đỡ tơi q trình thực luận án Tơi xin đặc biệt gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, bố mẹ, chồng hai trai bạn ñồng nghiệp, bạn bè đồng hành, đóng góp cơng sức, động viên, giúp đỡ tơi hồn thành luận án Hà Nội, ngày tháng năm 2012 Tác giả luận án Nguyễn Thị Thanh Thủy Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sĩ khoa học nông nghiệp ………………………… ii MỤC LỤC Lời cam ñoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt vii Danh mục bảng ix Danh mục hình xi MỞ ðẦU 1 Tính cấp thiết đề tài Mục tiêu ñề tài 3 Ý nghĩa khoa học thực tiễn ñề tài Những đóng góp luận án Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Vi khuẩn E coli 5 1.1.1 Phân loại E coli 1.1.2 ðặc tính vi khuẩn E coli 1.2 Verotoxigenic Escherichia coli (VTEC) 14 1.2.1 Danh pháp 14 1.2.2 Một số yếu tố độc lực vi khuẩn nhóm VTEC 15 1.2.3 Vai trị VTEC khơng thuộc nhóm O157 22 1.2.4 VTEC ñộng vật 24 1.2.5 VTEC thực phẩm 28 1.2.6 Nhiễm VTEC người 29 1.3 1.4 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn E coli bệnh chúng gây Việt Nam 31 Phương pháp phát VTEC mẫu bệnh phẩm thực phẩm 32 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sĩ khoa học nông nghiệp ………………………… iii 1.4.1 Phương pháp vi sinh vật 33 1.4.2 Phương pháp miễn dịch học 33 1.4.3 Phương pháp sinh học phân tử 34 1.5 Một số kỹ thuật sinh học phân tử dùng ñể phân loại vi sinh vật 1.5.1 Nguyên tắc 40 41 1.5.2 Kỹ thuật 42 1.5.3 44 Ứng dụng kỹ thuật phân tích PFGE Chương NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 NGHIÊN CỨU 45 Nội dung nghiên cứu 45 2.1.1 Thực trạng công tác kiểm sốt giết mổ, vệ sinh thú y địa bàn Hà Nội 2.1.2 Thiết lập chuẩn hóa phương pháp PCR dùng ñể xác ñịnh vi khuẩn VTEC 2.1.3 45 45 Tỷ lệ nhiễm số đặc tính chủng VTEC phân lập ñược 45 2.2 ðịa ñiểm thời gian nghiên cứu 46 2.3 ðối tượng nghiên cứu 46 2.4 Nguyên liệu nghiên cứu 46 2.4.1 Mơi trường, hóa chất, dụng cụ thí nghiệm 46 2.4.2 Các chủng vi khuẩn ñối chứng dương âm 47 2.5 Phương pháp nghiên cứu 2.5.1 Phương pháp lấy mẫu 2.5.2 Phương pháp xác ñịnh số lượng vi khuẩn canh khuẩn 47 47 nuôi cấy 48 2.5.3 Phương pháp tiến hành phản ứng PCR 48 2.5.4 Phương pháp xác ñịnh ñộ ñặc hiệu phản ứng PCR 51 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sĩ khoa học nông nghiệp ………………………… iv 2.5.5 Phương pháp xác ñịnh ñộ nhạy phản ứng PCR 52 2.5.6 Phương pháp phân lập giám ñịnh vi khuẩn VTEC 52 2.5.7 Phương pháp xác ñịnh serotyp kháng nguyên O chủng vi khuẩn phân lập ñược 2.5.8 54 Xác ñịnh ña dạng di truyền chủng VTEC có nguồn gốc khác phản ứng PFGE (Pulsed-field gel 2.5.9 electrophoresis) 55 Xử lý số liệu 56 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Thực trạng cơng tác kiểm sốt giết mổ, vệ sinh thú y ñịa bàn Hà Nội 3.1.1 3.1.2 60 Thực trạng vệ sinh khu giết mổ gia súc, gia cầm ñịa bàn Hà Nội 3.1.4 57 Kết ñiều tra ñiều kiện giết mổ phương tiện vận chuyển ñiểm giết mổ ñịa bàn Hà Nội 3.1.3 57 Thực trạng cơng tác kiểm sốt giết mổ ñiểm giết mổ gia súc, gia cầm ñịa bàn Hà Nội 64 Thực trạng ñiều kiện vệ sinh thú y sở kinh doanh, chợ, tiêu thụ sản phẩm thịt gia súc, gia cầm 3.2 57 69 Thiết lập chuẩn hóa phương pháp PCR dùng ñể xác ñịnh vi khuẩn VTEC 70 3.2.1 Lựa chọn PCR ñơn mồi Multiplex - PCR 70 3.2.2 Lựa chọn mơi trường ni cấy thích hợp để tách chiết DNA mẫu 73 3.2.3 Kết thực phản ứng PCR với chủng vi khuẩn E coli tham chiếu 3.2.4 75 Kết xác ñịnh ñộ nhạy ñộ ñặc hiệu phản ứng PCR dùng ñể xác định VTEC mơi trường nhân tạo Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sĩ khoa học nông nghiệp ………………………… 77 v 3.2.5 Kết xác ñịnh ñộ nhạy ñộ ñặc hiệu phương pháp PCR dùng ñể xác ñịnh VTEC mẫu thịt 3.2.6 Quy trình xác định có mặt vi khuẩn VTEC mẫu thịt 3.3 83 85 Kết xác định tỷ lệ nhiễm VTEC bị, lợn ñiểm giết mổ chợ thuộc ñịa bàn Hà Nội 3.3.1 Thu thập mẫu 3.3.2 Phân lập giám định đặc tính sinh vật hóa học chủng 87 87 E coli 89 3.3.3 Kết phân lập VTEC thịt 93 3.3.4 Kết phân lập VTEC từ mẫu lau thân thịt mẫu phân lị mổ 3.3.5 96 Kết xác định loại ñộc tố chủng VTEC phân lập ñược 3.3.6 Kết xác ñịnh serotyp O chủng VTEC phân lập 3.3.7 Kết phân tích quan hệ di truyền số chủng vi khuẩn VTEC phân lập có nguồn gốc khác KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 98 100 103 107 Kết luận 107 ðề nghị 108 Danh mục cơng trình cơng bố có liên quan đến luận án 109 Tài liệu tham khảo 110 Phụ lục 125 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sĩ khoa học nông nghiệp ………………………… vi DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT A/E Attaching and Effacing BHI Brain Heart Infusion bp base pair BPW Buffer Peptone Water Cs Cộng CT-SMAC Cefixime Tellurite Selective Supplement DNA Deoxyribonucleic Acid EaggEC Enteroaggregative E coli E coli Escherichia coli EHEC Enterohaemorrhagic E coli EIEC Entero invasive E coli EPEC Enteropathogenic E coli ELISA Enzyme-linked immunosorbent asay ETEC Enterotoxigenic E coli FDA Food and Drug Administration HC Hemorrhagic colitis HUS Hemolytic uremic syndrome kDa Kilodalton LB Luria Bertani MR Methyl Red mDa Megadalton m-TSB modified Trypticase Soy Broth NB Nutrient Broth OMP Outer membrane protein PCR Polymerase chain reaction PFGE Pulsed Field Gel Electrophoresis Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sĩ khoa học nông nghiệp ………………………… vii C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an SLT Shiga - like toxin TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam TE Tris-EDTA buffer TTP Thrombotic thrombocytopenic purpure TSB Tryptic Soy Broth VK Vi khuẩn VP Voges-Proskauer VSATTP Vệ sinh an toàn thực phẩm VT Verotoxin VTEC Verotoxigenic Escherichia coli WHO Tổ chức Y tế giới Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sĩ khoa học nông nghiệp ………………………… Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn viii C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an DANH MỤC CÁC BẢNG STT Tên bảng Trang 1.1 Hoạt tính sinh học loại VT 19 1.2 Một số enzym cắt hạn chế ñược dùng cho kỹ thuật PFGE 43 2.1 Trình tự mồi dùng để xác định gen VT1, VT2 eae 49 2.2 Thành phần chất phản ứng PCR dùng ñể xác ñịnh gen VT1, VT2 eae 2.3 Các chu kỳ nhiệt phản ứng PCR dùng ñể xác ñịnh gen VT1, VT2 eae 2.4 50 Một số yếu tố gây bệnh chủ yếu chủng vi khuẩn E coli ñối chứng dương 2.5 50 51 Một số yếu tố gây bệnh chủ yếu chủng vi khuẩn ñối chứng âm 51 3.1 Số lượng ñiểm giết mổ gia súc, gia cầm ñịa bàn Hà Nội 59 3.2 Kết ñiều tra ñiều kiện ñiểm giết mổ phương tiện vận chuyển ñiểm giết mổ ñịa bàn Hà Nội 3.3 Thực trạng vệ sinh ñiểm giết mổ gia súc, gia cầm thuộc ñịa bàn Hà Nội 3.4 73 Kết thực phản ứng Multiplex – PCR ñể phát chủng vi khuẩn E coli ñối chứng dương 3.6b 72 Kết xác định mơi trường thích hợp ni cấy vi khuẩn E coli ñể chiết tách DNA cho phản ứng PCR 3.6a 68 Kết thử nghiệm phản ứng PCR ñơn Multiplex - PCR ñể phát số gen ñộc lực VTEC 3.5 62 75 Kết thực phản ứng Multiplex – PCR với chủng vi khuẩn đối chứng âm Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sĩ khoa học nông nghiệp ………………………… Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn 75 ix C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 58 Matar G M., Abdo D., Khneisser I., Youssef M., Zouheiry H., Abdelnour G and Harakeh H S (2002), “The multiplex PCR based detection and genotyping of diarrhoeagenic Escherichia coli in diarrhoeal stools”, Ann Trop Med Parasitol, 96 (3), p 317 - 324 59 McMaster C., Roch E.A., Willshaw G.A., Doherty A., Kinnear W and Cheasty (2001), “Verocytotoxin-producing Escherichia coli serotyp O26:H11 outbreak in an Irish Creche”, Eur J Clin Microbiol Infect Dis., 20(6), p 430 - 432 60 McPaeke S J W., Smyth J A and Ball H J (2005), “Characterisation of avian pathogenic Escherichia coli (APEC) associated with colisepticaemia compared to faecal isolates from healthy birds”, Veterinary Microbiology, 110, p 245 – 253 61 Mechie S C., Chapman P A and Siddons C A (1997), “A fifteen month study of Escherichia coli O157:H7 in dairy herd”, Epidemiology and Infection, 118, p 17 – 25 62 Meng J., Zhao S., Doyle M P., Mitchell S E and Kresovich S (1996), “Polymerase chain reaction for detecting Escherichia coli O157:H7”, International Journal of Food Microbiology, 32, p 103 – 113 63 Meng J., Zhao S., Doyle M P., Mitchell S E and Kresovich S (1997), “A multiplex PCR for identifying Shiga-like toxin-producing Escherichia coli O157:H7”, Letters in Applied Microbiology, 24, p 172 – 176 64 Mohammad A Islam, Abdus S Mondol, Enne de Boer, Rijkelt R Beumer, Marcel H Zwietering, Kaisar A Talukder and Annet E Heuvelink (2008), “Prevalence and Genetic Characterization of Shiga Toxin-Producing Escherichia coli Isolates from Slaughtered Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sĩ khoa học nông nghiệp ………………………… Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn 118 C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Animals in Bangladesh”, Applied and environmental microbiology, Vol 74, No 17, p 5414–5421 65 Montenegro M A., Bulte M., Trumpf T., Aleksic S., Reuter G., Bulling E and Helmuth R (1990), “Detection and characterization of fecal verotoxin-producing Escherichia coli from healthy cattle”, Journal of Clinical Microbiology, 28 (6), p 1417 – 1421 66 O’Brien A D and Samuel J E., Tesh V L., Burris J A., Owens J W., Gordon V M., Wadolkowski E A., (1993), “Comparison of the relative toxicities of Shiga-like toxins typ I and typ II for mice”, Infection and Immunity, 61, p 3392 – 3402 67 Orskov F., and Orskov I (1992), “Escherichia coli serotyping and disease in man and animal”, Can.J Micro., 38, pp.699-704 68 Osek J (2000), “Clonal analysis of Escherichia coli strains isolated from pigs with post-weaning diarrhea by pulsed-field gel electrophoresis”, FEMS Microbiol Lett., 186, pp.327-331 69 Paton A W., J C Paton, P N Goldwater, P A Manning (1993), “Direct detection of Escherichia coli Shiga-like toxin genes in primary fecal cultures using the polymerase chain reaction”, J Clin Microbiol, 31, p 3063 – 3067 70 Paton A W., Ratcliff R M., Doyle R M., Seymour-Murray J., Davos D., Lanser J A and Paton J C (1996), “Molecular microbiological investigation of an outbreak of hemolytic-uremic syndrome caused by dry fermented sausage contaminated with Shiga-like toxinproducing Escherichia coli”, Journal of Clinical Microbiology, 34 (7), p 1622 – 1627 71 Paton J C and A W Paton (1998), “Pathogenesis and diagnosis of Shiga toxin-producing Escherichia coli infections”, Clin Microbiol Rev., 11, p 450 – 479 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sĩ khoa học nông nghiệp ………………………… Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn 119 C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 72 Paton J C and A W Paton (2002), “Direct detection and characterization of Shiga toxigenic Escherichia coli by multiplex PCR for stx1, stx2, eae, ehxA and saa”, Journal of clinical microbiology, Vol 40, No 1, p 271 – 274 73 P Alexa, L Konstantinova, Z Sramkova-Zajacova (2011), “Faecal shedding of verotoxigenic Escherichia coli in cattle in the Czech Republic”, Veterinarni Medicina, 56 (4), p 149 – 155 74 Peiris J.S.M., P.H.M Leung, W.C Yam and W.W.S Ng (2001), “The prevalence and characterization of verotoxin-producing Escherichia coli isolated from cattle and pigs in an abattoir in Hong Kong”, Epidemiol Infect., 126, p 173 – 179 75 Pourbakhsh S., Dho-Moulin M., Bree A., Desautels C., Martineau-Doize B and Fairbrother J M (1997), “Localization of the in vivo expression of P and F1 fimbriae in chickens experimentally inoculated with pathogenic Escherichia coli”, Microbiol Pathog., 22, p 331 – 341 76 Pryor W., Hodson E., McIntyre P and Bettelheim K A (1990), “Toxigenic Escherichia coli in haemolytic ureamic syndrome” , The Medical Journal of Australia, 152, p 221 – 222 77 Rasmussen M A., Cray W C Jr., Casey T A and Whipp S C (1993), “Rumen contents as a reservoir of enterohemorrhagic Escherichia coli”, FEMS Microbiology Letters, 114, p 79 – 84 78 Saiki R K., Gelfand D H., Stoffel S., Scharf S J., Higuchi R., Horn G T., Mullis K B and Erlich H A (1987), “Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase”, Science, 239, p 487 – 491 79 Samadpour M., Onerth J E., Liston J., Tran N Nguyen D., Whittam T S., Wilson R A and Tarr P I (1994), “Occurrence of Shiga-like Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sĩ khoa học nông nghiệp ………………………… Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn 120 C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an toxin producing Escherichia coli in retail fresh seafood, beef, lamb, pork and poultry from grocery stores in Seattle, Washington”, Applied and Environmental Microbiology, 60 (3), p 1038 – 1040 80 Sambrook J., and Russell D.W (editor) (2001), “Chapter 5: Gel electrophoresis of DNA and Pulsed –field agarose gel electrophoresis”, In: Molecular cloning: a laboratory manual, 3rd edition Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 5.55-5.90 81 Sandhu K S., Clarke R C., McFadden K., Brouwer A., Louie M., Wilson J., Lior H and Gyles C L (1996), “Prevalence of the eaeA gene in verotoxigenic Escherichia coli strains from dairy cattle in Southwest Ontario”, Epidemiology and Infection, 116, p -7 82 Schmidt H., Rusmann H., Schwarzkoft A., Aleksic S., Heesemann J and Karch H (1994), “Prevalence of attaching and effacing Escherichia coli in stool samples from patients and controls”, Zentrablatt fur Bakteriologie, 281 (2), p 201 – 213 83 Schmidt H., Beutin L and Karch H (1995), “Molecular analysis of the plasmid-encoded hemolysin of Escherichia coli O157:H7 strain EDL 933”, Infection and Immunity, 63 (3), p 1055 – 1061 84 Stein P E, Boodhoo A., Tyrrell G J., Brunton J L and Read R J (1992), “cvCrystal structure of the cell-binding B oligomer of verotoxin-1 from E coli”, Nature (London), 355, p 748 – 750 85 Xiaodong Xia, Jianghong Meng, Patrick F McDermott, Sherry Ayers, Karen Blickenstaff, Thu-Thuy Tran, Jason Abbott, Jie Zheng, and Shaohua Zhao (2010) Presence and Characterization of Shiga Toxin-Producing Escherichia coli and Other Potentially Diarrheagenic E coli Strains in Retail Meats Applied and environmental microbiology, 76, p 1709-1717 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sĩ khoa học nông nghiệp ………………………… Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn 121 C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 86 Takeda Y (1995), “Shiga and Shiga-like (Vero) toxins”, Bacterial toxins and virulence factors in disease (Edited by: Moss J., Iglewski B., Vaughan M and Tu A T ), Marcel Dekker Inc., p 313 – 326 87 Tenover F.C., Arbeit R.D., Goering R.V., Mickelsen P.A., Murray B.E., Persing D.H., and Swaminathan B (1995), “Intrepreting chromosomal DNA restriction paterns produced by pulsed-field gel electrophoresis: criteria for bacterial strain typing”, J.Clin Microbiol., 33, pp.2233-2239 88 Thomas A., Cheasty T., Frost J A., Chart H., Smith H R and Rowe B (1996), “Verocytotoxin-producing Escherichia coli, particularly serogroup O157, associated with human infections in England and Wales: 1992 – 4”, Epidemiology and Infection, 117, p – 10 89 Thi Thu Thao Van, George Moutafis, Peter J Coloe (2007), “Antibiotic resistance in food-borne bacterial contaminants in Vietnam” Applied Environmental Microbiology, 73:7906-11 90 Tozzi A E., Niccolini A., Caprioli A., Luzzi I., Montini G., Zacchello G., Gianviti A., Principato F and Rizzoni G (1994), “A community outbreak of haemolytic-uraemic syndrome in children occurring in a large area of Northern Italy over a period of several months”, Epidemiology and Infection, 113, p 209 – 219 91 Vu Khac Hung (2004), “Escherichia coli – prevalence and comparison of virulence factors in strains isolated from pigs with diarrhea in Slovak Republic”, The degree of Doctor, Slovak Republic 92 Xu Jian-Guo, Cheng Bo-Kun and Jing Hual-Qi (1999), “Escherichia coli O157:H7 and Shiga like-toxin-producing Escherichia coli in China”, World Journal of Gastroenterology, ISSN 1007-9327 93 Yu J and Kapper J B (1992), “Cloning and characterization of the eae gene of enterohaemorrhagic Escherichia coli O157:H7”, Molecular biology, (3), p 411 – 417 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sĩ khoa học nông nghiệp ………………………… Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn 122 C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 94 Zhao T., Doyle M P., Shere J and Garber L (1995), “Prevalence of enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 in a survey of a dairy herds”, Applied and Environmental Microbiology, 61 (4), p 1290 – 1293 95 Wachsmuth (1994), “Summary: public health, epidemiology, food safety, laboratory diagnosis”, Recent advances in Verocytotoxinproducing Escherichia coli infection, Karmali M A and Goglio A G (eds.), Elsevier, Amsterdam, p -6 96 Waters J R., Sharp J C M and Dev V J (1994), “Infection caused by Escherichia coli O157:H7 in Alberta, Canada and in Scotland: a five year review, 1987 – 1991”, Clinical Infectious Disease, 19, p 834 – 843 97 Wieler L H., Vieler E., Erpenstein C., Schlapp T., Steinruck H., Bauerfeind R., Byomi A and Baljer G (1996), “Shiga toxinproducing Escherichia coli strains from bovines association of adhesion with carriage of eae and other genes”, Journal of Clinical Microbiology, 34 (12), p 2980 – 2984 98 Willshaw G A., Smith H R., Roberts D., Thirlwell J., Cheasty T and Rowe B (1993), “Examination of raw beef products for the presence of verocytotoxin producing Escherichia coli, particularly those of serogroup O157”, Journal of Applied Bacteriology, 75, p 420 – 426 99 Willshaw G.A., Cheasty T., Smith H.R., O'Brien S.J and Adak G.K (2001), “Verocytotoxin-producing Escherichia coli (VTEC) O157 and other VTEC from human infections in England and Wales: 1995-1998”, J Med Microbiol, 50 (2), p 135 – 142 100 Winkle S M., Refai M and Rhode R (1972), “On the antigenic relationship of Vibrio cholera to Enterobacteriaceae”, Annales de L’institut Pastuer, 123, p 775 – 781 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sĩ khoa học nông nghiệp ………………………… Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn 123 C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an TRANG WEB 101 Phương Thuận (2011), “Hơn 6000 người bị ngộ ñộc thực phẩm năm”, ttp://giadinh.net.vn/2011032509425334p1044c1045/hon-6000 nguoi-bi-ngo-doc-thuc-pham-moi-nam.htm Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sĩ khoa học nông nghiệp ………………………… Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn 124 C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an PHỤ LỤC Phụ lục Môi trường, hóa chất phân lập, giám định vi khuẩn E coli (nhóm VTEC) thực phản ứng khác Mơi trường, hóa chất phân lập, giám định vi khuẩn E coli
Mơi trường MacConkey (Oxoid - England): Hịa tan 52g mơi trường lít nước cất vơ trùng, hấp 1210C 15 phút, sau để nguội 500C đổ đĩa Petri
Mơi trường thạch máu (Blood agar base) hãng Sanofi - France: Hòa tan 40g lít nước cất, hấp tiệt trùng 1210C 15 phút, ñể nguội ñến 45-500C Bổ sung thêm 5% máu thỏ máu cừu ñã tách sợi huyết lắc đều, pH =7,4±0,2
Mơi trường Nutrient broth (Merck – Germany): Hịa tan 8g lít nước cất, hấp vô trùng 1210C 15 phút, pH =7,4±0,2, 250C
Mơi trường mTSB (Merck – Germany): Hịa tan 33g lít nước cất, hấp vơ trùng 1210C 15 phút, pH =7,3±0,2, ñổ ống farcol lấy mẫu
Mơi trường BPW (Oxoid - England): ): Hịa tan 20g lít nước cất, hấp vơ trùng 1210C 15 phút, pH =7,3±0,2
Môi trường EMB Agar (Merck – Germany): Hịa tan 36g lít nước cất, hấp vô trùng 1210C 15 phút, pH =7,4±0,2
Mơi trường SIM (Eiken – Japan): Hịa tan 39g lít nước cất, chia ống nút vặn khoảng 3-5ml/ống, hấp vô trùng 1210C 15 phút, pH =7,4±0,2
Môi trường CT-SMAC (Cefixime Tellurite Selective Supplement) hãng Oxoid – England: lọ cho 2ml nước cất vơ trùng vào lắc đến tan hết, bổ sung vào 500ml mơi trường SMAC (Sorbitol MacConkey Agar) vơ trùng, lắc ñều, ñổ ñĩa petri Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sĩ khoa học nông nghiệp ………………………… Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn 125 C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an
Mơi trường đường loại: Pha dung dịch ñường loại 20%, hấp cách quãng 1000C vòng 30 phút/ ngày, hấp ngày Hóa chất dùng phản ứng PCR, Multiplex-PCR
Mồi loại: hãng Fermentas cung cấp Mồi hồn ngun ñệm TE (Invitrogen, USA)
AMP x bufer, dNTP stock, 50 x TAE, Taq-DNA polymerase, Gel loading bufer hãng Fermentas cung cấp
Ethidium bromide 10mg/ml: Invitrogen, USA cung cấp
Dung dịch ñiện di TBE 10X (Tris – Borate – EDTA): Hòa tan 108g TrisBase (Merck), 55g axit Boric (Sigma) 5,84g EDTA (Fluka) lít nước cất, lắc cho tan hết Khi sử dụng, pha loãng 10 lần với nước cất
Thạch agarose 0,8-2% : Cân xác lượng agarose (US-Bio) cần sử dụng cho vào bình tam giác, bổ sung đệm TBE vừa ñủ ñể ñạt nồng ñộ theo yêu cầu Làm tan chảy tồn thạch lị vi sóng Khi thạch nguội đến 500C, bổ sung ethidium bromide (0,5µl ethidium bromide /10ml thạch agarose), lắc ñều ñổ khn chuẩn bị trước, gắn lược ðể thạch ñông tự nhiên khoảng 15 - 30 phút Gỡ bỏ lược, ñặt thạch vào bể ñiện di, bổ sung ñệm TBE ngập mặt thạch tiến hành bơm mẫu ñể ñiện di sản phẩm PCR Hóa chất dùng phản ứng PFGE
Dung dịch rửa (Wash buffer): Hòa 40ml NaCl 5M, 10ml Tris-HCl 1M (pH 7,2), 200ml EDTA 0,5M (pH 8,0) 750 ml nước cất Lắc ñều hấp 1210C 15 phút
Dung dịch phá vỡ tế bào vi khuẩn (bacterial cell lysis solution) Hòa tan 0,5ml Tris-HCl 1M (pH 7,5), 0,5ml NaCl 5M, 10ml EDTA 0,5M (pH 8,0), 100mg sodium deoxycholate, 250 mg N-lauroylsarcosine/sodium salt với 39ml nước cất Lắc cho tan hết vô trùng cách lọc qua giấy lọc Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sĩ khoa học nông nghiệp ………………………… Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn 126 C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 0,22µm Sau đó, bổ sung 50mg lysozyme, lắc cho tan ñều, bảo quản 40C
Dung dịch proteinase K (Bacterial cell protenase K solution) Hòa tan 0,5g N-lauroylsarcosine/sodium salt 50ml EDTA 0,5M (pH 8,0) Lắc nhẹ làm ấm dung dịch tan hết, vơ trùng dung dịch cách lọc qua giấy lọc 0,22µm Sau ñó, bổ sung 1,25 ml proteinase K (nồng ñộ 20mg/ml), lắc cho tan ñều, bảo quản 40C
Dung dịch ñệm TE (Tris –EDTA buffer) Hòa tan 5ml Tris-HCl 1M ml EDTA 0,5M (pH 8,0) 495 ml nước cất
Dung dịch PMSF 1mM Hòa tan 17,4 mg PMSF 100ml nước cất Lắc ñều hấp 1210C 15 phút
Dung dịch BSA/spermidine restriction enzyme Trộn 100µl Restriction enzyme buffer 10X (promega), 10µl acetylated BSA (10mg/ml), 20µl spermidine trihydrochloride (100mM) với 0,87 ml nước cất Dung dịch chuẩn bị trước tiến hành phản ứng Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sĩ khoa học nông nghiệp ………………………… Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn 127 C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Phụ lục Một số hình ảnh lấy mẫu sở giết mổ Minh Hiền, Trung Văn Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sĩ khoa học nông nghiệp ………………………… Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn 128 C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Phụ lục Một số hình ảnh thực trạng hoạt ñộng giết mổ số sở giết mổ nhỏ lẻ Cạo lông bẩn Pha lọc thân thịt bẩn Tách lòng thân thịt bẩn Tách lòng thân thịt bẩn Làm lịng cạnh thân thịt Khơng có khu làm lịng riêng biệt Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sĩ khoa học nông nghiệp ………………………… Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn 129 C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Hình thức vận chuyển phổ biến Vận chuyển thân thịt xe máy không che đậy Phụ lục Một số hình ảnh mua bán thịt chợ ðằng sau quầy bán thịt chợ Thạch Bàn Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sĩ khoa học nông nghiệp ………………………… Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn 130 C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Phụ lục 5: Một số hình ảnh phịng thí nghiệm Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sĩ khoa học nông nghiệp ………………………… Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn 131 C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn