Nghiên cứu một số đặc tính của protease từ nấm ký sinh côn trùng

Đồ án tốt nghiệp GVHD:Ths Đào Thị Thanh Xuân tr-êng đại học vinh khoa hoá học đồ án tốt nghiệp Đề tài: Nghiên cứu số đặc tính protease từ nấm ký sinh côn trùng Giáo viên h-ớng dẫn: Ths Sinh viên thực : Lớp Đào Thị Thanh Xuân Nguyễn Thị Hồng : 47K - Hoá Vinh, tháng 12 năm 2010 LỜI CẢM ƠN Nguyễn Thị Hồng Trang Lớp 47K - KSCNTP Đồ án tốt nghiệp GVHD:Ths Đào Thị Thanh Xuân Em xin chân thành cảm ơn ThS Đào Thị Thanh Xuân, giảng viên khoa Hóa học , trƣờng Đại học Vinh tận tình hƣớng dẫn em suốt q trình nghiên cứu hồn thành đồ án tốt nghiệp Em xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới thầy cơ, cán hƣớng dẫn thí nghiệm Phịng hóa thực phẩm, Phịng hóa hữu cơ, Trung tâm kiểm định chất lƣợng thực phẩm Trƣờng Đại học Vinh tạo điều kiện tận tình giúp đỡ em suốt q trình nghiên cứu hồn thành đồ án tốt nghiệp Tôi xin gửi lời cám ơn chân thành tới bạn phịng thí nghiệm thực phẩm tạo điều kiện giúp đỡ tơi hồn thành đồ án Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn vơ hạn tới gia đình, ngƣời thân bạn bè động viên giúp đỡ suốt trình học tập làm đồ án tốt nghiệp Vinh, ngày tháng năm 2010 SVTH: Nguyễn Thị Hồng MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN Nguyễn Thị Hồng Trang Lớp 47K - KSCNTP Đồ án tốt nghiệp GVHD:Ths Đào Thị Thanh Xuân CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG TRONG ĐỀ TÀI DANH MỤC HÌNH CĨ TRONG ĐỀ TÀI LỜI MỞ ĐẦU 1.1 Lý chọn đề tài 1.2 Nhiệm vụ nghiên cứu 10 1.3 Vật liệu, phạm vi nội dung nghiên cứu 10 1.3.1 Vật liệu 10 1.3.2 Phạm vi nghiên cứu 11 1.3.3 Nội dung nghiên cứu 11 1.3.4 Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài 11 CHƢƠNG 11 TỔNG QUAN .11 1.1 Nấm ký sinh côn trùng Beauveria 13 1.2 Enzyme protease 14 1.2.1 Giới thiệu chung 14 1.2.2 Lịch sử nghiên cứu 15 1.2.3 Phân loại protease 18 1.2.3.1 Exoprotease .19 1.2.3.2 Endoprotease 19 1.2.4.1 Ảnh hƣởng nhiệt độ .22 1.2.3.2 Ảnh hƣởng pH 23 1.2.4.3 Điểm đẳng điện .23 1.3.4.4 Trọng lƣợng phân tử .24 1.2.5 Vai trò protease 25 1.2.5.1 Chức sinh học protease trình tự nhiên 25 1.2.5.2 Ứng dụng protease công nghiệp, đời sống 26 1.2.6 Nguồn thu nhận protease 30 1.2.6.1 Protease từ thực vật 30 1.2.6.2 Protease từ động vật .31 1.2.6.3 Protease từ vi sinh vật 32 CHƢƠNG 40 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 40 2.1 Vật liệu, hoá chất thiết bị 40 2.1.1 Vật liệu môi trường 40 2.1.1.1 Vật liệu .40 2.1.1.2 Các môi trƣờng dinh dƣỡng .41 2.2 Hóa chất thiết bị: 42 2.1.2.1 Hoá chất .42 2.1.2.2 Thiết bị .44 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 45 2.2.1 Điều kiện nuôi cấy 45 2.2.2 Kỹ thuật cấy chuyền giữ giống 45 2.2.3 Tuyển chọn chủng sinh tổng hợp enzyme protease 45 2.2.4 Xác định hoạt độ protease 45 2.2.4.1 phƣơng pháp tuyển chọn định tính 45 Nguyễn Thị Hồng Trang Lớp 47K - KSCNTP Đồ án tốt nghiệp GVHD:Ths Đào Thị Thanh Xuân 2.2.4.2 Xác định Hoạt độ protease đƣợc xác định theo phƣơng pháp Anson cải tiến 46 2.2.5 Khảo sát thời gian thu nhận ảnh hưởng môi trường nuôi cấy 47 2.2.6 Tinh chế protease 47 2.2.7 Nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng đến hoạt độ enzyme 48 2.2.7.1 Khảo sát ảnh hƣởng T0 tới hoạt độ enzyme 48 2.2.7.2 Khảo sát ảnh hƣởng pH tới hoạt độ enzyme 48 2.2.7.3 Khảo sát khả chịu mặn enzyme .48 2.2.8 Nghiên cứu ứng dụng protease từ beauveria 48 Chƣơng III 50 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 50 3.1 Sinh tổng hợp protease 50 3.2 Khảo sát khả sinh hoạt tính protease chủng Beauveria môi trƣờng khác sau 3, 4, 5, 6,7 ngày nuôi 53 3.3 Tinh chế làm protease 55 3.3.1 Tinh protease dịch nuôi chủng chủng nghiên cứu tác nhân (NH4)2SO4: 55 3.3.2 Tinh protease dịch nuôi chủng chủng nghiên cứu tác nhân dung môi hữu cơ: aceton, etanol, metanol 57 3.3.2.1 Tinh protease aceton 57 3.3.2.2 Tinh protease dung môi etanol 59 3.3.2.3 Tinh protease dung môi metanol 61 3.3.3 Lựa chọn tác nhân thích hợp để kết tủa protease dịch nuôi chủng nghiên cứu 63 3.4 Nghiên cứu số yếu tố ảnh hƣởng đến hoạt độ enzyme 64 3.4.1 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt độ enzyme 64 3.4.2 Ảnh hưởng pH đến hoạt độ enzyme 65 3.4.3 Nghiên cứu khả chịu mặn enzyme 67 3.5 Nghiên cứu ứng dụng protease từ nấm beauveria 69 CHƢƠNG IV: KẾT LUẬN 69 TÀI LIỆU THAM KHẢO 71 CÁC CHỮ VIẾT TẮT 3,4-DCl 3,4- dichloroisocoumarin BPN” Bacterial protease Nagaza Nguyễn Thị Hồng Trang Lớp 47K - KSCNTP Đồ án tốt nghiệp GVHD:Ths Đào Thị Thanh Xuân BP Novo Bacterial protease Novo DFP Diisopropylfluorophosphate PCMB p-chloromercuribenzoate PMSF Phenyl methyl sulfonyl fluoride SDS PAGE Sodium Dodecyl Sunfat PolyAcrylamide Gel Electrophoresis TCA Acid Tricloaxetic TLCK Tosyl-L-lysine chloromethyl ketone TPCK Tosyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone Nấm ký sinh trùng IPF Mcb: Mơi trƣờng PDA M1: Khống chất M2: Khoáng chất glucoza M1: Khoáng chất glucoza, cao nấm men pepton Ttu Nhiệt độ tối ƣu DANH MỤC BẢNG TRONG ĐỀ TÀI Bảng 1: Một vài chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus có ứng dụng nhiều cơng nghiệp 17 Bảng 2: Giá trị pI protease thu nhận đƣợc từ chủng Bacillus 24 Nguyễn Thị Hồng Trang Lớp 47K - KSCNTP C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Đồ án tốt nghiệp GVHD:Ths Đào Thị Thanh Xuân Bảng 3: Trọng lƣợng phân tử vài protease từ vi khuẩn 24 Bảng : Khả sinh protease môi trƣờng YPG pH= 7,6 chủng Beauveria đem tuyển chọn sau ngày 51 Hình 16: Nấm phát triển mơi trƣờng lỏng sau ngày nuôi 52 Bảng 6: Hoạt tính chủng Vn 1641 môi trƣờng khác 3, 4, 5, 6, ngày ni 53 Bảng 7: Hoạt tính chủng Vn 1482 môi trƣờng khác 3, 4, 5, 6, ngày nuôi 54 Bảng Tinh protease dịch nuôi chủng Vn1482 tác nhân (NH4)2SO4 bão hòa 55 Bảng 9: Tinh protease dịch nuôi chủng Vn 1641 tác nhân(NH4)2SO4 56 Bảng 10: Tinh protease dịch ni chủng Vn1359 tác nhân (NH4)2SO4 bão hịa.57 Bảng 11: Tinh protease từ chủng Vn 1482 dung môi aceton 57 Bảng 12: Tinh protease từ chủng Vn 1641 dung môi aceton 58 Bảng 13: Tinh protease từ chủng Vn 1359 dung môi aceton 58 Bảng 14: Tinh protease từ chủng Vn 1482 dung môi etanol 59 Bảng 15: Tinh protease dịch nuôi chủng Vn 1641 etanol 60 Bảng 16: Tinh protease dịch nuôi chủng Vn 1359 etanol 60 Bảng 18: Tinh protease dịch nuôi chủng Vn 1641 metanol 62 Bảng 19: Tinh protease từ chủng Vn 1359 dung môi metanol 62 Bảng 20: Ảnh hƣởng nhiệt độ đến hoạt độ enzyme tinh chế từ canh trƣờng chủng nghiên cứu 64 Bảng 21: Ảnh hƣởng nhiệt độ đến hoạt độ enzyme tinh chế từ canh trƣờng nuôi chủng nghiên cứu: 66 Bảng 22: Ảnh hƣởng NaCl đến hoạt độ enzyme tinh chế từ canh trƣờng nuôi chủng nghiên cứu 67 Bảng 23: Khả thủy phân enzyme tinh chế từ canh trƣờng chủng 1482 69 Bảng 24: Hiệu suất thủy phân enzyme tinh chế từ canh trƣờng chủng 1482 69 DANH MỤC HÌNH CĨ TRONG ĐỀ TÀI Hình1: Beauveria bassiana: Cicada (Ve) (left); HawkMoth Larva (giữa) 14 and Chinch Bug(rệp) (right) 14 Hình 2: Mơ hình phân tử enzyme protease 15 Nguyễn Thị Hồng Lớp 47K - KSCNTP Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn Trang C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Đồ án tốt nghiệp GVHD:Ths Đào Thị Thanh Xuân Hình 3: Cấu trúc không gian enzyme protease (renin) 15 Hình Sơ đồ phân loại protease 19 Hình 5: Cơ chế tác dụng protease 25 Hình 6: Ứng dụng protease sản xuất thuốc 26 Hình 7: Ứng dụng protease sản xuất xà phòng 27 Hình 8: Nguồn thu enzyme Protease từ thực vật 31 Hình 9: Clostridium 34 Hình 10: Bacillus 34 Hình 11: Nấm mốc 35 Hình 12: Xạ khuẩn 35 Hình 14: Chuẩn bị chất thủy phân 49 Hình 15: Vịng thuỷ phân chủng có hoạt tính sinh protease 51 Hình 16: Đƣờng chuẩn tyrosin 51 Hình 17: Mẫu đối chứng mẫu kiểm tra hoạt tính protease thuốc thử Folin Vn1359(1), Vn1482(2), Vn1641(3) 52 Hình 18: Hoạt tính protease theo thời gian chủng Vn 1641, Vn1482, Vn1359 52 Hình 19: Ảnh hƣởng thời gian nuôi đến khả tổng hợp protease chủng Vn 1359 môi trƣờng M1, M2, M3 53 Hình 20: Hoạt tính chủng Vn 1641 môi trƣờng M1, M2, M3 Sau 3, 4, 5, 6, ngày nuôi 54 Hình 21 Hoạt tính chủng Vn 1641 môi trƣờng M1, M2, M3 Sau 3, 4, 5, 6, ngày nuôi 54 Hình 22: Hiệu suất thu hồi protease dịch nuôi chủng Vn 1482 56 tác nhân (NH4)2SO4 56 Hình 23 : Hiệu suất thu hồi protease dịch nuôi chủng Vn 1641 56 tác nhân (NH4)2SO4 56 Hình 24 : Hiệu suất thu hồi protease dịch nuôi chủng Vn 1359 57 tác nhân (NH4)2SO4 57 Hình 25: Hiệu suất thu hồi protease dịch nuôi chủng Vn 1482 aceton 58 Hình 26: Hiệu suất thu hồi protease dịch nuôi chủng Vn 1641 aceton: 58 Hình 27: Hiệu suất thu hồi protease dịch nuôi chủng Vn 1359 aceton: 59 Hình 28: Hiệu suất thu hồi protease dịch ni chủng Vn 1482 etanol 59 Hình 29: Mẫu đối chứng mẫu kiểm tra hoạt tính protease thuốc thử Folin tinh dung môi etanol theo nồng độ khác 60 Hình 30: Hiệu suất thu hồi protease dịch nuôi chủng Vn 1641 etanol 60 Hình 31: Hiệu suất thu hồi protease dịch nuôi chủng Vn 1359 etanol 61 Hình 32: Hiệu suất thu hồi protease dịch nuôi chủng Vn 1482 metanol 62 Hình 33: Hiệu suất thu hồi protease dịch ni chủng Vn 1641 metanol 62 Hình 34: Hiệu suất thu hồi protease dịch nuôi chủng Vn 1359 metanol 63 Nguyễn Thị Hồng Lớp 47K - KSCNTP Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn Trang C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Đồ án tốt nghiệp GVHD:Ths Đào Thị Thanh Xuân Hình 35: Hiệu suất thu hồi protease dịch ni chủng nghiên cúu tác nhân khác 63 Hình 36: Ảnh hƣởng nhiệt độ đến hoạt tính protease chủng nghiên cứu 65 Hình 37: Ảnh hƣởng pH đến hoạt tính protease chủng nghiên cứu 66 Hình 38 Ảnh hƣởng NaCl đến hoạt độ enzyme tinh chế từ 67 canh trƣờng nuôi chủng Vn1359 67 Hình 39: Ảnh hƣởng NaCl đến hoạt độ enzyme tinh chế từ 68 canh trƣờng nuôi chủng Vn1641 68 Hình 40: Ảnh hƣởng NaCl đến hoạt độ enzyme tinh chế từ 68 canh trƣờng nuôi chủng Vn1482 68 LỜI MỞ ĐẦU 1.1 Lý chọn đề tài Nguyễn Thị Hồng Lớp 47K - KSCNTP Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn Trang C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Đồ án tốt nghiệp GVHD:Ths Đào Thị Thanh Xuân Enzyme chất xúc tác sinh học, có chất protein, có cấu trúc phân tử phức tạp tinh vi, hoạt lực xúc tác cao nhiều so với chất xúc tác thơng thƣờng, có tính đặc hiệu cao, khoảng hoạt động pH nhiệt độ hẹp Ngày nay, với phát triển mạnh mẽ Công nghệ sinh học, chế phẩm enzyme đƣợc sản xuất nhiều, chúng có nhiều ứng dụng ngành khác nhƣ chất tẩy rửa, thực phẩm, thức ăn gia súc, dƣợc phẩm, thuộc da, dệt len…[45] Hàng năm lƣợng enzyme đƣợc sản xuất giới đạt khoảng 300.000 với giá trị tỷ USD, đƣợc phân phối lĩnh vực khác Protease nhóm enzyme quan trọng enzyme công nghiệp, chiếm khoảng 60% tổng giá trị enzyme toàn giới Dự báo tăng trƣởng protease thị trƣờng công nghiệp tiếp tục tăng năm sau [40], [47], [49] Protease thuộc nhóm enzyme thuỷ phân, protease phân cắt protein, đoạn peptid thành đoạn peptid ngắn cuối axit amin Là enzyme đƣợc ứng dụng nhiều ngành công nghệ thực phẩm nhƣ công nghệ sản xuất phomat, làm mềm thịt trình chế biến đồ hộp, cơng nghệ sản xuất loại nƣớc chấm, xử lý làm bia, thuộc da, y tế v.v…Những năm gần protease kiềm đƣợc bổ sung vào loại mỹ phẩm chất tẩy rửa, xử lý môi trƣờng hay số ứng dụng ngành dƣợc phẩm nhƣ loại thuốc trị ho, giảm phù nề…[41] Qua nhiều năm, việc gia tăng sử dụng vi sinh vật nhƣ nguồn cung cấp protease cải thiện đáng kể hiệu sản xuất sản phẩm đƣợc tạo nhiều Tuy nhiên giá thành chế phẩm protease cịn cao, hạn chế việc sử dụng rộng rãi enzyme sản xuất Các chế phẩm thu đƣợc sau q trình ni cấy sản xuất enzyme chƣa phải chế phẩm có độ tinh khiết cao protein chiếm 2030%, bị bất hoạt số điều kiện trình sản xuất Vì việc nghiên cứu nguồn thu nhận protease khắc phục số hạn chế nêu vấn đề cần thiết Nấm ký sinh côn trùng (IPF) khơng nhóm có tính đa dạng sinh học cao, nguồn lợi tài ngun q mà cịn có vai trị quan trọng phịng trừ sinh học sâu hại trồng y - dƣợc Có số lồi IPF đƣợc ứng dụng để sản Nguyễn Thị Hồng Lớp 47K - KSCNTP Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn Trang C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Đồ án tốt nghiệp GVHD:Ths Đào Thị Thanh Xuân xuất hoạt chất sinh học, enzyme, sản xuất thuốc chữa bệnh nhƣ chất tăng cƣờng sinh lực cho ngƣời nhƣ Cordyceps sinensis “Đông trùng - Hạ thảo” (Nguyễn Lân Dũng nnk, 2005) Một số loài đƣợc nghiên cứu sản xuất thuốc trừ sâu sinh học nhƣ: Beauveria, Metarhizium, Paecillomyces, (Morakot T., 2003) Beauveria bassiana đƣợc đăng ký giới cho việc phịng trừ sâu bệnh nơng nghiệp Những chủng nấm công bào tử lây nhiễm lên vật chủ gây bệnh cho côn trùng cách sản sinh enzyme thuỷ phân nhƣ protease, chitinase lipase, enzyme thuỷ phân biểu bì lớp côn trùng Với protease thu nhận từ nấm ký sinh côn trùng mở hƣớng là: nguyên liệu để sản xuất thuốc trừ sâu sinh học để thay phần thuốc trừ sâu hoá học vốn độc hại với ngƣời gây nhiễm mơi trƣờng [6], [15], [52]; ngồi cịn có khả kháng khuẩn, kháng virut chống ung thƣ đƣợc chứng minh nhà khoa học Hàn Quốc.[38] Protease từ nấm ký sinh côn trùng đƣợc dự đốn chất có hoạt tính sinh học cao ứng dụng nhiều lĩnh vực Vì mà việc “Nghiên cứu số đặc tính protease từ nấm ký sinh trùng” tiền đề cho nghiên cứu sâu enzyme mở hƣớng nghiên cứu ứng dụng enzyme 1.2 Nhiệm vụ nghiên cứu Trong đồ án này, chúng tơi có nhiệm vụ: Tuyển chọn chủng có hoạt tính sinh tổng hợp protease cao Khảo sát, lựa chọn mơi trƣờng ni nấm thích hợp để chúng sinh tổng hợp protease cao thời điểm thu nhận protease từ dịch nuôi Chọn lọc tác nhân thích hợp để tinh enzyme Nghiên cứu số yếu tố ảnh hƣởng đến hoạt độ enzyme protease tinh đƣợc Nghiên cứu ứng dụng protease rừ beauveria nhằm phát huy hiệu enzyme vừa thu nhận đƣợc 1.3 Vật liệu, phạm vi nội dung nghiên cứu 1.3.1 Vật liệu Nguyễn Thị Hồng Lớp 47K - KSCNTP Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn Trang 10 C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Đồ án tốt nghiệp GVHD:Ths Đào Thị Thanh Xuân 100 Hiệu suất thu hồi (%) 84.69 100 90.42 87.32 77 80 62.47 68.83 63.53 60.38 60 40 20 1:2 1:3 1:4 1:5 1:6 1:7 1:8 1:9 1:10 T ỷ lệ Vm/Vdm Hình 32: Hiệu suất thu hồi protease dịch nuôi chủng Vn 1482 metanol Bảng 18: Tinh protease dịch nuôi chủng Vn 1641 metanol Tỷ lệ Vm/Vdm Hoạt độ Protease ( U/ml) Hiệu suất thu hồi protease(%) 1: 1: 1: 1: 1: 1: 0.084 0.15 0.179 0.21 25.3 45.18 59.34 63.25 81.02 59.94 55.42 1: 10: 0.269 0.199 0.184 0.164 0.361 49.4 100 100 100 Hiệu suất thu hồi (%) 1: 81.02 80 59.34 63.25 59.94 60 55.42 45.18 49.4 40 25.3 20 1:2 1:3 1:4 1:5 1:6 1:7 1:8 1:9 1:10 T ỷ lệ Vm/Vdm Hình 33: Hiệu suất thu hồi protease dịch nuôi chủng Vn 1641 metanol Bảng 19: Tinh protease từ chủng Vn 1359 dung môi metanol Tỷ lệ Vm/Vdm 1: 1: 1: 1: 1: 1: 1: 1: 10: Hoạt độ Protease ( U/ml) 0.238 0.309 0.318 0.272 0.228 0.176 0.171 0.151 0.35 Hiệu suất thu hồi protease(%) 68 88.29 90.86 77.71 65.14 50.29 48.86 43.14 100 Nguyễn Thị Hồng Lớp 47K - KSCNTP Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn Trang 62 C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Đồ án tốt nghiệp GVHD:Ths Đào Thị Thanh Xuân Hiệu suất thu hồi (%) 100 100 88.29 90.86 77.71 80 68 65.14 60 50.29 48.86 43.14 40 20 1:2 1:3 1:4 1:5 1:6 1:7 1:8 1:9 1:10 T ỷ lệ Vm/Vdm Hình 34: Hiệu suất thu hồi protease dịch nuôi chủng Vn 1359 metanol Kết cho thấy: Đối với chủng Vn1482 tỷ lệ dung môi/dịch chiết = 1:6 cho hiệu suất thu hồi cao đạt 90,42% Đối với chủng Vn1641 tỷ lệ Vm/Vdm = 1:6 cho hiệu suất thu hồi cao đạt 81.02% Đối với chủng Vn1359 tỷ lệ Vm/Vdm = 1:4 cho hiệu suất thu hồi cao đạt 90.86% 3.3.3 Lựa chọn tác nhân thích hợp để kết tủa protease dịch nuôi chủng nghiên cứu Hiệu suất thu hồi (%) 100 (NH4)2S O4 80 Ac e to n 60 Eta no l 40 M e ta no l 20 Vn1482 Vn1641 Vn1359 Chủng Hình 35: Hiệu suất thu hồi protease dịch nuôi chủng nghiên cúu tác nhân khác Kết cho ta thấy: Đối với chủng Vn1482 tác nhân amoni sunphat bão hòa, etanol 980, aceton 99,5%, metanol 99,5% dung môi hữu sử dụng để kết tủa protein để tinh chế protease chọn đƣợc etanol tác nhân kết tủa tốt cho hiệu suất thu hồi cao đạt 96,23% Nguyễn Thị Hồng Lớp 47K - KSCNTP Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn Trang 63 C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Đồ án tốt nghiệp GVHD:Ths Đào Thị Thanh Xuân Đối với chủng Vn1641 tác nhân dung môi hữu sử dụng để kết tủa protein để tinh chế protease chọn đƣợc etanol tác nhân kết tủa tốt cho hiệu suất thu hồi cao đạt 94,05% tỷ lệ Vm/Vdm = 1:3 Còn chủng Vn1359 tác nhân dung môi hữu sử dụng để kết tủa protein để tinh chế protease chọn đƣợc etanol tác nhân kết tủa tốt cho hiệu suất thu hồi cao đạt 94% tỷ lệ Vm/Vdm = 1:3 Cũng từ kết cho thấy tăng nồng độ dung mơi hiệu suất thu hồi protease tăng lên tăng đến điểm cực đại nồng độ định Điểm cực đại chủng loại dung môi khác phụ thuộc vào nồng độ cấu trúc protease dịch nuôi Tuy nhiên, tiếp tục tăng nồng độ lên hiệu suất thu hồi lại giảm nồng độ chất kết tủa cao gây biến tính enzyme 3.4 Nghiên cứu số yếu tố ảnh hƣởng đến hoạt độ enzyme 3.4.1 Ảnh hƣởng nhiệt độ đến hoạt độ enzyme Để nghiên cứu ảnh hƣởng nhiệt độ lên hoạt độ protease, tiến hành nuôi ngày mơi trƣờng M2 (Glucose –Khống- Casein), lọc sơ tiến hành kết tủa protease dịch nuôi etanol với tỷ lệ 1:3 ( Vm/Vdm), ly tâm tách tủa 40C với vận tốc 6000v/phút 15 phút Kết tủa đƣợc hoà tan trở lại nƣớc cất với thể tích thể tích dịch ni ban đầu, ủ nhiệt độ 10ºC, 20ºC, 30ºC, 35ºC , 40ºC, 50ºC, 60ºC 24h, kết thu đƣợc nhƣ sau: Bảng 20: Ảnh hƣởng nhiệt độ đến hoạt độ enzyme tinh chế từ canh trƣờng chủng nghiên cứu Nhiệt độ ( 0C) Chủng 10 20 30 35 40 50 60 Nguyễn Thị Hồng Hoạt độ (U/ml) Vn1359 Vn 1641 0.11 0.12 0.21 0.21 0.31 0.28 0.37 0.38 0.28 0.4 0.21 0.2 0.08 0.11 Lớp 47K - KSCNTP Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn Trang 64 Vn1841 0.08 0.17 0.51 0.6 0.55 0.18 0.06 C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Đồ án tốt nghiệp GVHD:Ths Đào Thị Thanh Xuân 0.7 Vn1482 Vn1641 Vn1359 Hoạt độ protease( U/ml) 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 10 20 30 40 50 60 Nhiệt độ C 70 Hình 36: Ảnh hƣởng nhiệt độ đến hoạt tính protease chủng nghiên cứu Từ kết ta thấy: Enzyme enzyme tinh chế từ canh trƣờng nuôi Vn 1359 tối ƣu nhiệt độ 350 C hoạt độ đạt tới 0.38( U/ml) Enzyme tinh chế từ canh trƣờng nuôi Vn 1461 enzyme chịu nhiệt tƣơng đối tốt, nhiệt độ từ 100C đến 300C enzyme hoạt động tƣơng đối yếu, nhƣng tăng nhiệt độ lên 350C hoạt độ tăng lên đáng kể tối ƣu nhiệt độ 40 C hoạt độ đạt tới 0.4 ( U/ml) Nếu tăng nhiệt độ lên 500C hoạt độ lại 50% so với hoạt độ cực đại Enzyme tinh chế từ canh trƣờng nuôi Vn 1482 tối ƣu nhiệt độ 35 C hoạt độ đạt tới 0.6 ( U/ml) Nếu tiếp tục tăng nhiệt độ lên 400C hoạt độ giảm 91,67% so với hoạt độ cực đại Kết cho thấy tăng nhiệt độ hoạt độ enzyme tinh chế từ dịch nuôi chủng Vn1359, Vn1641, Vn1482 nhiệt độ tối ƣu enzyme có nguồn gốc khác không giống Tuy nhiên nhiệt tối ƣu chúng nằm khoảng từ 350C đến 400C Đến nhiệt độ tối ƣu tiếp tục tăng nhiệt độ hoạt độ giảm tƣơng đối nhanh Qua thấy vận tốc phản ứng enm tăng nhiệt độ tăng, phân tử chất enzyme chuyển động hỗn độn hơn, va chạm, tiếp xúc với nhiều nên phản ứng xảy nhanh Tuy nhiên enzyme có chất protein tăng nhiệt độ tới giói hạn vận tốc phản ứng enzyme bị giảm bị biến tính protein 3.4.2 Ảnh hƣởng pH đến hoạt độ enzyme Nguyễn Thị Hồng Lớp 47K - KSCNTP Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn Trang 65 C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Đồ án tốt nghiệp GVHD:Ths Đào Thị Thanh Xuân Để nghiên cứu ảnh hƣởng pH lên hoạt độ protease, tiến hành nuôi chủng môi trƣờng M2 (Glucose –Khống- Casein), sau ngày thu lấy dịch ni kết tủa protease dịch nuôi etanol với tỷ lệ 1:3( Vm/Vdm), ly tâm tách tủa 40C với vận tốc 6000v/phút 15 phút Kết tủa đƣợc hoà tan trở lại đệm citric - photphat ( pH – 5), đệm Sorensen( pH – 8) đệm glycinNaOH( pH – 12) với thể tích thể tích dịch ni ban đầu, ủ nhiệt độ 40ºC với chủng Vn1641, 350C chủng Vn1482 Vn1359 24h, kết thu đƣợc nhƣ sau: Bảng 21: Ảnh hƣởng nhiệt độ đến hoạt độ enzyme tinh chế từ canh trƣờng nuôi chủng nghiên cứu: Hoạt độ enzyme (U/ml) Vn 1359 Vn 1641 Vn 1482 0.03 0.03 0.03 0.18 0.2 0.04 0.25 0.24 0.34 0.28 0.32 0.53 0.34 0.35 0.6 0.37 0.38 0.58 0.4 0.57 0.39 0.29 0.45 0.41 10 0.13 0.34 0.27 11 0.07 0.17 0.2 12 0.05 0.06 0.03 Nƣớc cất 0.31 0.37 0.59 mẫu ban đầu 0.4 0.42 0.6 pH 0.7 Hoạt độ protease (U/ml) Vn14 0.6 Vn16 0.5 Vn13 59 0.4 0.3 0.2 0.1 10 11 pH 12 Hình 37: Ảnh hƣởng pH đến hoạt tính protease chủng nghiên cứu pH có ảnh hƣởng lớn đến vận tốc phản ứng enzyme, có thay đổi pH làm cho hoạt tính xúc tác enzyme thay đổi pH mà trạng thái ion hóa enzyme chất thể cách tốt đƣợc gọi pH thích hợp Tử kết nghiên cứu cho thấy pH thích hợp cho hoạt động enzyme tinh chế từ canh Nguyễn Thị Hồng Lớp 47K - KSCNTP Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn Trang 66 C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Đồ án tốt nghiệp GVHD:Ths Đào Thị Thanh Xuân trƣờng nuôi chủng Vn 1359 nhiệt độ 350C từ đến tối ƣu pH =8, chủng Vn 1641 400C từ đến 10 tối ƣu pH =9 , chủng Vn 1359 nhiệt độ 350C từ đến tối ƣu pH = Nhƣ dựa vào cách phân loại protease theo pH hoạt động protease tinh chế từ canh trƣờng nuôi chủng Vn 1359 chủng Vn 1481 thuộc protease trung tính, cịn chủng Vn 1641 thuộc protease kiềm 3.4.3 Nghiên cứu khả chịu mặn enzyme Để nghiên cứu ảnh hƣởng NaCl lên hoạt độ protease, tiến hành nuôi chủng mơi trƣờng M2 (Glucose –Khống- Casein ), sau ngày thu lấy dịch nuôi kết tủa protease dịch nuôi etanol với tỷ lệ 1:3( Vm/Vdm), ly tâm tách tủa 40C với vận tốc 6000v/phút 15 phút Enzyme sau kết tủa đƣợc tủa đƣợc hòa tan trở lại dung dịch muối có nồng độ 10%, 12,5%, 15%, 20%, 35%, 30%, 35% đƣợc ủ nhiệt độ tối ƣu enzyme 24 giờ, đem xác định hoạt độ đƣợc kết nhƣ sau: Bảng 22: Ảnh hƣởng NaCl đến hoạt độ enzyme tinh chế từ canh trƣờng nuôi chủng nghiên cứu Nồng độ muối Hoạt độ enzyem (U/ml) 0% 10% 12,5% 15% 20% 25% 30% 35% Hoạt độ enzyme (U/ml) Vn 1359 Vn1641 Vn 1482 0.38 0.421 0.6 0.376 0.547 0.385 0.234 0.503 0.391 0.31 0.205 0.491 0.24 0.124 0.401 0.112 0.08 0.208 0.08 0.03 0.09 0.01 0.006 0.003 0.50 0.40 0.30 0.20 0.10 0.00 0% 10% 12,5% 15% 20% 25% 30% 35% Nồng độ NaCl (%) Hình 38 Ảnh hƣởng NaCl đến hoạt độ enzyme tinh chế từ canh trƣờng nuôi chủng Vn1359 Nguyễn Thị Hồng Lớp 47K - KSCNTP Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn Trang 67 C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an GVHD:Ths Đào Thị Thanh Xuân Hoạt độ enzym (U/m) Đồ án tốt nghiệp 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0% 10% 12,5% 15% 20% 25% 30% 35% Nồng độ NaCl ( %) Hình 39: Ảnh hƣởng NaCl đến hoạt độ enzyme tinh chế từ Hoạt độ enzym (U/ml) canh trƣờng nuôi chủng Vn1641 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0% 10% 12,5% 15% 20% 25% 30% 35% Nồng độ NaCl (%) Hình 40: Ảnh hƣởng NaCl đến hoạt độ enzyme tinh chế từ canh trƣờng nuôi chủng Vn1482 Từ kết ta thấy NaCl có ảnh hƣởng đến hoạt độ enzyme protease tinh chế từ canh trƣờng nuôi chủng nghiên cứu Đối với chủng Vn1482 Vn1641 NaCl làm giảm hoạt độ enzyme nồng độ nồng độ muối tăng đến 30% hoạt độ cịn khoảng 7,12% đến 15% so với hoạt độ ban đầu Nếu mơi trƣờng có nồng độ muối 35% enzyme hầu nhƣ bất hoạt Đối với chủng Vn 1359 nồng độ NaCl nằm khoảng từ 10 -12.5 (%) làm tăng hoạt độ enzyme, tiếp tục tăng nồng độ NaCl lại kìm hãm hoạt độ enzyme Điều đƣợc giải thích nhƣ sau: natri đóng vai trị chất đệm để ổn định pH cho mơi trƣờng tham gia vào trung tâm hoạt động protease từ chủng Vn1359 Khi ion Na+ ion Cl -làm cho trung tâm hoạt động enzyme có độ bền lớn định hƣớng liên kết theo hình học hồn tồn xác định Ion Na+ Có thể góp phần tạo hình thể thuận lợi cho enzyme làm dễ dàng cho enzyme gây kết gắn đƣợc với chất đơn giản tham gia trực tiếp vào xúc tác nhƣ nhiều phản ứng oxy hóakhử Trong trƣờng hợp ion Na+ đóng vai trị nhƣ chất thứ hai Nhƣng Nguyễn Thị Hồng Lớp 47K - KSCNTP Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn Trang 68 C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Đồ án tốt nghiệp GVHD:Ths Đào Thị Thanh Xn nồng độ q cao lại trở thành chất kìm hãm gây nhiễu động học enzyme làm biến tính protein làm chậm ngừng phản ứng 3.5 Nghiên cứu ứng dụng protease từ nấm beauveria Để nghiên cứu độ thủy phân enzyme vừa thu nhận đƣợc chất khác nhau, tiến hành nuôi chủng Vn1482 môi trƣờng M2 ( Glucose –Khoáng- Casein ), sau ngày thu lấy dịch nuôi kết tủa protease dịch nuôi etanol với tỷ lệ 1:3( Vm/Vdm), ly tâm tách tủa 40C với vận tốc 6000v/phút 15 phút Tủa đƣợc hồ tan nƣớc cất với thể tích thể tích dịch enzyme ban đầu Lấy 4ml enzyme đem cho vào 100ml chất khác nồng độ 4% Kết thu đƣợc sau pha loãng 15 lần Bảng 23: Khả thủy phân enzyme tinh chế từ canh trƣờng chủng 1482 Cơ chất Mật độ quang Nồng độ tyrosine/ 15 ( µml/l) Dung dịch A Dung dịch B Dung dịch C Dung dịch D 0.698 0.53 0.426 0.707 1.26 0.946 0.753 1.276 Nồng độ tyrosine ( µM/l)(a) 23.066 17.32 13.79 23.362 Nồng độ tyrosine ( g/l) 3.424 2.571 2.047 3.468 Thí nghiệm tiến hành với loại nguyên liệu: bột cá, bột thịt, bột đậu nành, bột tôm Trong bột cá hàm lƣợng protein khoảng 20÷22%, bột thịt khoảng 18÷19%, bột đậu nành 35%÷40% , bột tơm 19÷23% Bảng 24: Hiệu suất thủy phân enzyme tinh chế từ canh trƣờng chủng 1482 Hàm lƣợng axit amin quy Dung dịch phản Hàm lƣợng Hiệu suất thủy phân tyrosin enzyme (1) ứng protein (g/l) (%)(3) thủy phân*(g/l)(2) A B C D 8÷ 8.8 7.2÷7.6 7.6÷9.2 14÷16 3.7642 2.82642 2.25031 3.81252 38.909÷42.8 33.829÷35.708 26.934÷33.829 21.675÷24.771 Kết cho hiệu suất thủy phân protein loại nguyên liệu nhƣ sau: bột cá (38.909 %÷42.8%), bột thịt (33.829%÷35.708%), bột đậu nành (21.675÷24.771), bột tơm (26.934÷33.829) Bột cá cho hiệu suất thủy phân cao nhất, sau bột cá bột thịt, thấp bột đậu nành Kết cho thấy mức độ thủy phân protein protease từ canh trƣờng chủng Vn 1482 phụ thuộc vào tính chất nguyên liệu, tỷ lệ enzyme chất CHƢƠNG IV: KẾT LUẬN Nguyễn Thị Hồng Lớp 47K - KSCNTP Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn Trang 69 C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Đồ án tốt nghiệp GVHD:Ths Đào Thị Thanh Xuân  Từ chủng nghiên cứu tuyển chọn đƣợc chủng Vn1359, Vn1482, Vn1641 có khả sản sinh protease Trong chủng này, chủng Vn1482 có khả sinh tổng hợp enzyme protease cao Khảo sát điều kiện nuôi cấy theo phƣơng pháp nghiên cứu độc lập đạt hoạt độ enzyme 0.34 (U/ml) với chủng Vn1359, 0.36 (U/ml) với chủng Vn1641, 0.53 (U/ml) với chủng Vn1482 mơi trƣờng tối ƣu Glucose –Khống- Casein  Protease đƣợc thu hồi sau ngày nuôi Glucose – Khoáng - Casein nhiệt độ 300C, pH 7.6  Dung môi etanol đƣợc xem tác nhân thích hợp để kết tủa protease từ chủng Vn1359, Vn1641, Vn1482 Nếu sử dụng etalol với tỷ lệ 1:3 hiệu suất thu hồi enzyme 96.23% chủng Vn1482, 90.06 % chủng Vn1641, 94% chủng Vn1359  Nhiệt độ tối ƣu enzyme tinh chế đƣợc từ chủng Vn1359 350C hoạt độ đạt 0.38( U/ml), từ chủng Vn1641 400C hoạt độ đạt 0.4( U/ml), từ chủng Vn1482là 350C hoạt độ đạt 0.6 ( U/ml)  pH tối ƣu enzyme tinh chế đƣợc từ chủng Vn1359 hoạt độ đạt 0.39( U/ml), từ chủng Vn1641 hoạt độ đạt 0.41( U/ml), từ chủng Vn1482là hoạt độ đạt 0.6 ( U/ml)  Đối với chủng Vn1482 Vn1641 NaCl làm giảm hoạt độ enzyme nồng độ nồng độ muối tăng đến 30% hoạt độ cịn khoảng 7,12% đến 15% so với hoạt độ ban đầu Nếu môi trƣờng có nồng độ muối 35% enzyme hầu nhƣ bất hoạt chủng Vn 1359 nồng độ NaCl nằm khoảng từ 10 -12.5 (%) làm tăng hoạt độ enzyme, tiếp tục tăng nồng độ NaCl lại kìm hãm hoạt độ enzyme  Hiệu suất thủy phân protease tinh chế từ dịch nuôi chủng Vn 1482 bột cá (38.909 %÷42.8%), bột thịt(33.829%÷35.708%), bột đậu nành(21.675÷24.771),, bột tơm (26.934÷33.829) Bột cá cho hiệu suất thủy phân cao nhất, sau bột cá bột thịt, thấp bột đậu nành  Hƣớng nghiên cứu đề tài là: Nguyễn Thị Hồng Lớp 47K - KSCNTP Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn Trang 70 C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Đồ án tốt nghiệp GVHD:Ths Đào Thị Thanh Xuân -Tuyển chọn thêm số chủng có hoạt tính protease cao từ nấm ký sinh côn trùng - Nghiên cứu điều kiện lên men quy mô pilot quy mô công nghiệp - Cố định enzyme - Đột biến, tách dòng gen tạo biến chủng có khả sinh tổng hợp protease cao - Nghiên cứu số yếu tố ảnh hƣởng đến hoạt độ enzyme nhƣ: chất hoạt động bề mặt, chất oxy hoá, ion kim loại… - Nghiên cứu ứng dụng cụ thể enzyme thu nhận đƣợc sản xuất nƣớc mắm, sữa, xử lý môi trƣờng, công nghệ thuộc da, công nghệ dệt may… TÀI LIỆU THAM KHẢO Bùi Minh Trí, 2005 Xác suất thống kê quy hoạch thực nghiệm, Nhà xất khoa học kỹ thuật, trang 121-149 Đặng Thị Thu, Lê NGọc Tú, Tô Kim Anh, Phạm Thu Thủy, Nguyễn Xuân Sâm, 2004, Công nghệ Enzyme Nhà xuất khoa học kỹ thuật, 17 Lê Đức Ngọc, Trịnh Lê Hùng, Võ Sĩ Hùng, Phạm Quý Hải, Vũ anh Phƣơng, Lã Phúc Cƣờng 1996 Nghiên cứu protease bí đao I - Khảo sát nguồn protease bí đao Việt Nam Tạp chí Hóa Học, T34, số ĐB, tr 63-67 Nguyễn Thị Hồng Lớp 47K - KSCNTP Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn Trang 71 C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Đồ án tốt nghiệp GVHD:Ths Đào Thị Thanh Xuân Phạm Thị Trân Châu, Đinh Thƣơng Vân 1981, Proteinaza dứa Một số tính chất chế phẩm enzyme chƣa tinh chế Tạp chí vi sinh vật học 4,11 Trần Đình Toại, Đỗ Ngọc Lanh, Nguyễn Văn Thiết, Nguyễn Thu Hoài 1994, Nghiên cứu khả thủy phân số loại protein papain Tạp chí hóa học, T32, số 4, tr 33-36 Vo Mai, Pham Thi Thuy, Han Thi Nhung (1995, Occurence of entomopathogenic fungi Beauveria and Metarhizium parasiting rice brown planthopper in the Mekong delta, Protection Plant, 35- 37 (Vietnam.) Aono R and K Horikoshi 1983 Chemical composition of cell wall ò alkalophilic strains of Bacillus licheniformis: purification and general properties J Bacteriol 129: 191-7 Adinarayana K and Ellaiah P, 2002, “Responza surface optimisation of the critical medium components for the production of alkaline protease by a newly isolated Bacillus sp.” Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, 5(3), 272 Adinarayana K, Ellaiah P, Prasad DS 2003 Purification and Paritial Characterization of Thermostable Zarine Alkaline Protease from a Newly Isolated Bacillus subtilis PE-11 AAPS PharmSciTech.; 4(4): article 56 10 Agrawal D, Patidar P, Banerjee T, Patil S, 2004, “Production of alkaline protease by Penicillum sp under SSF conditions and its application to soy proteinhydrolysis” Process Biochemistry, 39, 977 11 Anwar A, Saleemuddin M, 1998, “Alkaline Protease: a review” Bioresource Technology, 64, 175 12 Asha Ai Kembhavi, Anuradha Kulkarni and Aditi Pant 1993 Salt Tolerant and Thermostable Alkaline Protease from Bacillus subtilis NCIM N0 64 AppBiochem Biotech 38; 84-91 13 Banerjee U.C, Sani R.K, Azmi W, Soni R, 1999 “Thermostable alkaline protease from Bacillus brevis and its characterization as a laundry detergent additive” Processm Biochemistry, 35, 213 Nguyễn Thị Hồng Lớp 47K - KSCNTP Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn Trang 72 C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Đồ án tốt nghiệp GVHD:Ths Đào Thị Thanh Xuân 14 Beg Q.K, Sahai V, Gupta R, 2003 “Statistical media optimization and alkaline protease production from Bacillus mojavensis in a bioreactor” Process Biochemistry, 39, 203 15 C Paterson, A Keith Charnley, Richard M.Cooper (1994) , Protease of insect pathofenic fungus Metarhizium anisopliae, Microbiology, 140 185 -189],[15 Priyanka Dhar and Gurvinder Kaur (2010), Production of cuticle – degrading 16 Chaplin M and Bucke C, 1990 “The large-scale uza of enzymes in solution”, In Enzyme Technology, edited by M Chaplin and C Bucke, (Cambridge University Press 17 Christer J et al 1996 Method for liming hides and skins United States Pantent 5,508,195 18 Cowan D.A, “Industrial Enzymes”, 1994 In Biotechnology-The science and the business, edited by V Mozas and R.E Cape, (Harwood Academic Publishers, Switzerland, pp.326-328 19 Durham D.R, Stewart D.B, Stellwag E.J, 1987 “Novel alkaline- and heatstable zarine Protease from alkalophilic Bacillus sp strain GX6638” Journal of Bacteriology, 169, 2762 20 Ferrero M.A, Castro G.R, Abate C.M, Biagori M.D, Siňeriz F, 1996 “Thermostable alkaline Protease of Bacillus licheniformis MIR 29: isolation, production and characterization” Applied Microbiology and Biotechnology, 45, 327 21 Forgarty William M 1983 Microbial enzymes and biotechnology Applied Sience Publishers LTD 22 Fujiwara N and Yamamoto K, 1987 “Production of alkaline protease in a low-cost medium by alkalophilic Bacillus sp and properties of the enzyme” Journal of Fermentation Technology, 65, 345 23 Fujiwara N, Yamamoto K, Masui A, 1991 “Utilization of a thermostable alkaline protease from an alkalophilic thermophile for the recovery of silver Nguyễn Thị Hồng Lớp 47K - KSCNTP Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn Trang 73 C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Đồ án tốt nghiệp GVHD:Ths Đào Thị Thanh Xuân 24 Gupta R, Beg Q.K, Khan S, Chauhan B, 2002a “An overview on fermentation, Downstream processing and properties of microbial alkaline Protease” Applied Microbiology and Biotechnology, 60, 381 25 Gupta R, Beg Q.K, Lorenz P, 2002b “Bacterial alkaline Protease: molecular approaches and industrial applications” Applied Microbiology and Biotechnology, 59, 15 26 Horikoshi K and T Akiba, 1982 Ankalphilic microorganisms A new microbial world Japan Sientific Society Press Tokyo Springer-Verlag, New York 27 Horikoshi K, 1996 “Alkaliphiles – from an industrial point of view” FEMS Microbiology Reviews, 18, 259 28 Horikoshi K, 1999 “Alkaliphiles: Some applications of their products for biotechnology” Microbiology and Molecular Biology Reviews, 63, 735 29 Horikoshi Koki 1971 Production of Ankaline Enzymes by Alkalophilic Microorganisms Part I Ankaline Protease Produced by Bacillus No, 221 Agr Biol Chem.,35,1047-1414 30 Huang Q, Peng Y, Li X, Wang H, Zhang Y, 2003 “Purification and characterization of an extracellular alkaline zarine protease with dehairing function from Bacillus pumilus” Current Microbiology, 46, 169 31 Hunter- Cereva J C , 1986 The beginning: Zaarching for enzymes in nature-screening strategies and isolation of novel enzymes World Biotech Rep.,2(3): 13-24 32 Kumar C.G and Takagi H, 1999 “Microbial alkaline Protease: from a bioindustrial viewpoint” Biotechnology Advances, 17, 561 33 Kumar C.G, Tiwari M.P, Jany K.D, 1999 “Novel alkaline zarine Protease from alkalophilic Bacillus spp.: purification and some properties” Process Biochemistry, 34, 441 34 Labbe J P., Rebegrotte P & Turpine M, 1974 Demonstration of extracellular leucine aminopeptidazas (EC 3.4.1) of Aspergillus oryzae (IP410) Study of leucine amonopeptideaza function, Critical Reviews of the Academy ò Science, Paris, 278D, 2699 Nguyễn Thị Hồng Lớp 47K - KSCNTP Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn Trang 74 C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Đồ án tốt nghiệp GVHD:Ths Đào Thị Thanh Xuân 35 Leluk J, Pham Tran Chau, Kieleczawa XXI Meet Pol Biochem Soc., Krakov, Abstract, 1885, p 139 36 Margesin R, Palma N, Knauzader F, Schinner F, 1992 “Purification and characterization of an alkaline zarine protease produced by a psychrotrophic Bacillus sp.” Journal of Biotechnology, 24, 203 37 Mc Tigye M A., C T Kelly, W M Forgaty and E M Doyle 1994 Production studies on the alkaline amylazas of three alkalophylic Bacillus ap Biotechnol Lett 16: 569-574) 38 Michael J Bidochka, George G Khachtourian (1887), Purification and properties of extracellular protease proceduced by entomopathogenic fungus Beauveria bassiana, Experimental Mycology, 53 (7) 1679-1684 39 Morihara K 1956 Studies on protease of Pzaudomonas Part I The production of the enzyme under various cultural conditions –Bull Agric Chem Soc Japan, 20, 243 40 Nunes,A.S; Martins, M.L.L , 2001 Isolation, properties and kinetics of growth of a thermophilic Bacillus sp Braz J Microbiol.,32: 271-275 41 Outtrup Helle Bullerup et al 1994 Alkaline protease from Bacillus J20 United States Patent 5,358,865 42 Outtrup Helle Bullerup et al 1995 Alkaline protease Bacillus sp JP 395, Method of making and detergent compositions United States Patent 5,466,594 43 Öztürk B, 2001 “Immobilization of lipaza from Candida rugosa on hydrophobic and hydrophilic supports”, M.S Thesis, İzmir Institute of Technology, Biotechnology Department, Izmir 44 Pietrowa J.S., Wincjunajte M.M Opredelenie proteoliticheskoi aktivnosti fermentnykh preparatov mikrobiologicheskovo proiskhozhdenia, Priklad Biochem Mikro-bio, 1966; 232 45 R Gupta, Q.K Beg, P Lorenz, 2002 Bacterial alkaline Protease:Molecular approaches and industrial applications, Appl Microbiol Biotechnol 59 15–32 Nguyễn Thị Hồng Lớp 47K - KSCNTP Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn Trang 75 C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn