0158 nghiên cứu ứng dụng các phương pháp sắc ký phân tích thành phần hóa học tâm sen (nelumbo nucifera gaertn nelumbonaceae)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CẦN THƠ PHAN QUỐC DUY NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CÁC PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN HÓA HỌC TÂM SEN (Nelumbo nucifera Gaertn., Nelumbonaceae) LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP DƯỢC SỸ ĐẠI HỌC Người hướng dẫn khoa học: ThS ĐỖ CHÂU MINH VĨNH THỌ Cần Thơ – 2015 i 1LỜI CẢM ƠN Xin dành tặng luận văn cho bà nội, người thương yêu, động viên nguồn động lực to lớn giúp tơi hồn thành cơng trình Đầu tiên trân trọng nhất, xin dành lời cảm ơn chân thành sâu sắc đến ThS Đỗ Châu Minh Vĩnh Thọ, người Thầy hết lòng hướng dẫn, truyền đạt kiến thức kỹ quý báu với tất nhiệt thành cho trình thực Tiếp theo, xin gửi lời cảm ơn chân thành tới quý thầy cô Liên mơn Hố phân tích – Kiểm nghiệm – Độc chất Liên môn Dược liệu – Thực vật dược – Dược cổ truyền hết lòng giúp đỡ, tạo điều kiện tốt cho tơi hồn thành tốt công việc Xin cám ơn tất quý thầy cô trường Đại học Y Dược Cần Thơ truyền đạt kiến thức hữu ích, giúp tơi vượt qua khó khăn hồn thành tốt cơng việc Cũng xin gửi lời cảm ơn đến anh Đức – công ty VIACIMEX, Cần Thơ anh Hiếu – phịng kiểm nghiệm, cơng ty Dược Hậu Giang, Cần Thơ cung cấp hỗ trợ nhiệt tình cho tơi q trình làm việc Con xin cám ơn gia đình người thân, đặc biệt ba mẹ cô ba ln bên con, động viên chăm sóc suốt thời gian làm việc Xin cám ơn anh chị làm đề tài Kiểm nghiệm – Dược liệu K35 bảo kinh nghiệm quý báu, cám ơn bạn làm đề tài Kiểm nghiệm – Dược liệu – Hoá dược K36 bên chia sẻ vui buồn, giúp đỡ động viên công việc ii LỜI CAM ĐOAN Tôi tên Phan Quốc Duy, xin cam đoan cơng trình nghiên cứu Các số liệu kết nêu luận văn trung thực chưa sử dụng tài liệu khác Thành phố Cần Thơ – tháng 6/2015 Sinh viên Phan Quốc Duy iii 2MỤC LỤC Nội dung Trang LỜI CẢM ƠN .i LỜI CAM ĐOAN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ TỪ VIẾT TẮT v DANH MỤC CÁC BẢNG .vi DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ VÀ HÌNH vii ĐẶT VẤN ĐỀ Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ CÂY SEN 1.2 HÓA HỌC VỀ TÂM SEN 1.3 TỔNG QUAN VỀ CÁC PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ ỨNG DỤNG TRONG PHÂN LẬP HỢP CHẤT THIÊN NHIÊN 10 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 17 2.2 ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU .17 2.3 HĨA CHẤT, DUNG MƠI, TRANG THIẾT BỊ .17 2.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 26 3.1 PHÂN LẬP FLAVONOID TÂM SEN .26 3.2 PHÂN LẬP ALKALOID TÂM SEN 31 3.2.2 Thu phân đoạn akaloid từ cao TA 32 3.3 KIỂM TRA ĐỘ TINH KHIẾT CỦA EN-11 VÀ TF-6 .34 3.4 XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CỦA EN-11 VÀ TF-6 34 Chương BÀN LUẬN 39 4.1 THĂM DÒ ĐIỀU KIỆN CHIẾT XUẤT CAO TOÀN PHẦN FLAVONOID VÀ ALKALOID TỪ TÂM SEN THÍCH HỢP NHẤT 39 iv 4.2 THĂM DỊ HỆ DUNG MƠI KHAI TRIỂN VLC CHO CAO ALKALOID pH 10 VÀ CAO TOÀN PHẦN FLAVONOID TÂM SEN 42 4.3 KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ THÍCH HỢP PHÂN LẬP EN-11 VÀ TF-6 BẰNG SẮC KÝ LỎNG BÁN ĐIỀU CHẾ 45 4.4 KIỂM TRA ĐỘ TINH KHIẾT CÁC CHẤT THU ĐƯỢC .48 4.5 BIỆN GIẢI CẤU TRÚC CỦA CÁC CHẤT PHÂN LẬP ĐƯỢC 49 KẾT LUẬN 53 KIẾN NGHỊ 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC v DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ TỪ VIẾT TẮT Từ viết tắt Ý nghĩa Nguyên gốc ACN Acetonitrile Acetonitril Bz Benzene Capillary electrophoresis, Capillary zone electrophoresis Chloroform Benzen Điện di mao quản, điện di mao quản vùng Chloroform Dược điển Việt Nam EtOAc Dược điển Việt Nam Electrospray interface/mass spectrometry Ethylacetate H2O Nước Nước HCOOH Acid formic IR Acid formic High – performance liquid chromatography Infrared – Red MeOH Methanol Methanol NMR Nuclear magnetic resonance Cộng hưởng từ hạt nhân NH4OH Amonium hydroxyd Amoni hydroxyd PDA Photo diode array Đầu dò dãy diod quang QTOF Quadrupole Time of Flight Tứ cực thời gian bay Rf Retardation factor Hệ số lưu trữ SKĐ Sắc ký đồ Sắc ký đồ SKLM Sắc ký lớp mỏng Sắc ký lớp mỏng TEA Triethylamin Triethylamin TT Thuốc thử Thuốc thử UV – VIS Ultraviolet – Visible Tử ngoại khả kiến VLC Vacumn liquid chromatography Sắc ký lỏng hỗ trợ chân không VS Vanillin - sulfuric CE, CZE Cf DĐVN ESI/MS HPLC Giao diện phun ion/khối phổ Ethylacetat Sắc ký lỏng hiệu cao Hồng ngoại Vanillin – sulfuric vi 4DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Trang Bảng 1.1 Cấu trúc alkaloid tâm Sen nhân bisbenzylisoquinolin Bảng 1.2 Cấu trúc alkaloid tâm Sen nhân benzylisoquinolin Bảng 1.3 Cấu trúc hóa học alkaloid tâm Sen khung aporphin, proaporphin Bảng 1.4 Tổng hợp nghiên cứu chiết xuất phân lập tâm Sen Bảng 1.5 Các nghiên cứu nước flavonoid tâm Sen Bảng 1.6 Một số loại gel dextran Sephadex G tính chất gel 12 Bảng 1.7 So sánh sắc ký lỏng phân tích, bán điều chế điều chế 13 Bảng 1.8 Tương quan khối lượng mẫu – đường kính cột HPLC bán điều chế 14 Bảng 3.1 Kết khảo sát điều kiện chiết xuất flavonoid toàn phần tâm Sen 26 Bảng 3.2 Các phân đoạn flavonoid sau cột VLC cao toàn phần flavonoid 27 Bảng 3.3 Các phân đoạn flavonoid F3 sau Sephadex 28 Bảng 3.4 Các phân đoạn flavonoid F4 sau Sephadex 29 Bảng 3.5 Kết thu hứng TF-6 từ phân đoạn F3-5 30 Bảng 3.6 Các phân đoạn alkaloid sau chạy cột VLC cao TA 32 Bảng 3.7 Kết thu hứng alkaloid từ phân đoạn A3 tinh chế 33 Bảng 4.1 Kết khảo sát dung môi khai triển VLC cao TA tâm Sen 43 Bảng 4.2 Kết khảo sát dung môi khai triển VLC cao TF 44 Bảng 4.3 Các pha động thăm dò phân lập EN-11 từ phân đoạn A3 tinh chế 46 Bảng 4.4 Các pha động thăm dò phân lập TF-6 từ phân đoạn F3-5 47 Bảng 4.5 Dữ liệu phổ 13C, 1H-NMR, COSY, HMBC EN-11 50 Bảng 4.6 Dữ liệu phổ 13C, 1H-NMR, COSY, HMBC TF-6 52 vii DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ VÀ HÌNH Hình Trang Hình 1.1 Sen hồng Sen trắng Hình 1.2 Cấu trúc lotusin demethylcoclaurin Hình 1.3 Cấu trúc pronuciferine liriodenine Hình 1.4 Cấu trúc methylcorypallin Hình 1.5 Cấu trúc cinnamoyl-4-(2-aminoethyl)-phenol Hình 1.6 Cấu trúc Sephadex LH-20 11 Hình 1.7 Minh họa chế tách Sephadex LH-20 13 Hình 2.1 Quy trình chiết cao tồn phần flavonoid ngấm kiệt với cồn acid 18 Hình 2.2 Quy trình chiết cao tồn phần flavonoid chiết hỗ trợ siêu âm 19 Hình 2.3 Quy trình chiết xuất dịch chiết nước acid từ nguyên liệu tâm Sen 21 Hình 2.4 Quy trình chiết xuất cao alkaloid pH 10 tâm Sen (cao TA) 22 Hình 2.5 Quy trình lắc phân bố lỏng – lỏng với pH thay đổi tinh chế A3 23 Hình 3.1 Quy trình chiết xuất cao tồn phần flavonoid (cao TF) 27 Hình 3.2 SKLM phân đoạn VLC cao TF với hệ EtOAC – MeOH – H2O – HCOOH (100:17:13:1) 28 Hình 3.3 SKLM phân đoạn sau sắc ký rây phân tử phân đoạn F3 với hệ EtOAC – MeOH – H2O – HCOOH (100:17:13:1) 29 Hình 3.4 SKLM phân đoạn sau sắc ký rây phân tử phân đoạn F4 với hệ EtOAC – MeOH – H2O – HCOOH (100:17:13:1) 30 Hình 3.5 SKĐ lần thu hứng TF-6 từ phân đoạn F3-5 31 Hình 3.6 SKLM cao TA với hệ Cf – MeOH – NH4OH (90:10:5) 31 Hình 3.7 SKLM VLC cao TA với hệ Cf – MeOH – NH4OH (90:10:5) 32 Hình 3.8 SKĐ lần thu hứng EN-11 từ phân đoạn A3 tinh chế 33 Hình 3.9 Phổ UV-Vis EN-11 MeOH 35 Hình 3.10 Phổ MS EN-11 35 Hình 3.11 Phổ 1H – NMR EN-11 36 viii Hình 3.12 Phổ 13C-NMR EN-11 36 Hình 3.13 Phổ UV-Vis TF-6 MeOH 37 Hình 3.14 Phổ MS TF-6 37 Hình 3.15 Phổ 1H – NMR TF-6 38 Hình 3.16 Phổ 13C – NMR TF-6 38 Hình 4.1 SKLM khảo sát pH thích hợp chiết xuất flavonoid từ dịch nước acid với hệ dung môi EtOAc – MeOH – H2O – HCOOH (100:17:13:1) 40 Hình 4.2 SKLM hệ S3, S4, S6, S7 với thuốc thử Dragendorff 43 Hình 4.3 Overlay SKĐ khảo sát điều kiện sắc ký phù hợp phân lập EN-11 46 Hình 4.4 Overlay SKĐ khảo sát điều kiện sắc ký phù hợp phân lập TF-6 từ phân đoạn F3-5 48 Hình 4.5 Cấu trúc hóa học tương tác xa EN-11 (apoglaziovin) 51 Hình 4.6 Cấu trúc hóa học TF-6 (calycosin) 52 0ĐẶT VẤN ĐỀ Trong kho tàng thực vật thuốc Việt Nam, Sen (Nelumbo nucifera Gaertn., Nelumbonaceae) gắn liền với sống tâm linh người Việt, tượng trưng cho tinh khiết trường thọ Cây Sen mọc ao hồ, có khắp miền đất nước, đặc biệt Đồng Tháp Mười, nơi xem xứ sở cánh đồng Sen Sen số dược thảo mà tất phận vị thuốc q, có giá trị sinh học cao Danh y Hải Thượng Lãn Ông viết: “Cây mọc từ bùn đen mà không ô nhiễm mùi bùn, đượm khí thơm lành trời đất nên củ, lá, hoa, tua, vỏ quả, ruột thuốc hay” Với tiến y học khoa học kỹ thuật, thêm nhiều tác dụng dược lý quý giá Sen tìm giảm co thắt trơn [1], cầm máu [1], [12], kháng HIV [58], kháng serotonin [50], điều trị cao huyết áp [30], chống loạn nhịp tim [59], tiểu đường [35], hạ cholesterol [56], chống oxy hoá [14], [31], [44], [55], chống ung thư [42]… Trong đó, alakaloid flavonoid thành phần đóng góp vào tác dụng sinh học Ngày với tiến khoa học phân tích, giới có nhiều cơng trình nghiên cứu chiết xuất, phân lập, xác định cấu trúc, tiêu chuẩn hóa số thành phần alkaloid, flavonoid có tác dụng sinh học Sen, nhằm tìm hướng điều trị hiệu quả, an toàn kiểm soát chất lượng nguồn nguyên liệu chế phẩm từ Sen Tuy nhiên, Việt Nam việc sử dụng tâm Sen làm thuốc đông y hay chế phẩm bào chế từ tâm Sen thuốc viên uống, cao thuốc, loại trà… dạng cao toàn phần, dịch chiết toàn phần Việc xác định thành phần alkaloid, flavonoid có tác dụng sinh học với hàm lượng bỏ ngỏ việc nghiên cứu thành phần hóa học, tiêu chuẩn hóa alkaloid, flavonoid kỹ thuật sắc ký đại tâm Sen Việt Nam dùng làm chất chuẩn đối chiếu để khảo sát tác dụng sinh học việc định tính, định lượng chưa thực PL-12 Hình PL-5.3 Phổ 13C-NMR mở rộng EN-11 PL-13 Hình PL-5.4 Phổ 13CPD DEPT EN-11 PL-14 Hình PL-5.5 Phổ 13CPD DEPT mở rộng EN-11 PL-15 Hình PL-5.6 Phổ HMBC EN-11 PL-16 Hình PL-5.7 Phổ HMBC mở rộng EN-11 PL-17 Hình PL-5.8 Phổ HMBC mở rộng EN-11 PL-18 Hình PL-5.9 Phổ HMBC mở rộng EN-11 PL-19 Hình PL-5.10 Phổ HSQC EN-11 PL-20 Hình PL-5.11 Phổ HSQC mở rộng 1của EN-11 PL-21 Hình PL-5.12 Phổ HSQC mở rộng 2của EN-11 PL-22 Hình PL-5.13 Phổ DEPT TF-6 PL-23 Hình PL-5.14 Phổ HMBC TF-6 PL-24 Hình PL-5.15 Phổ HMBC mở rộng TF-6 PL-25 Hình PL-5.16 Phổ HSQC TF-6 PL-26 Hình PL-5.17 Phổ HSQC mở rộng TF-6