0102 nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm một số chế phẩm probiotic có chứa chủng bifidobacterium

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CẦN THƠ NGUYỄN PHƯƠNG THẢO NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN KIỂM NGHIỆM MỘT SỐ CHẾ PHẨM PROBIOTIC CÓ CHỨA CHỦNG BIFIDOBACTERIUM LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC CẦN THƠ - 2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CẦN THƠ NGUYỄN PHƯƠNG THẢO NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN KIỂM NGHIỆM MỘT SỐ CHẾ PHẨM PROBIOTIC CÓ CHỨA CHỦNG BIFIDOBACTERIUM LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC ThS DƯƠNG THỊ TRÚC LY CẦN THƠ - 2014 LỜI CẢM ƠN Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến cô Dương Thị Trúc Ly, người trực tiếp hướng dẫn đề tài, tận tình bảo, động viên ln hỗ trợ em suốt trình thưc đề tài Em xin chân thành cảm ơn thầy cô môn Vi Sinh (cô Nguyễn Thị Hải Yến, cô Trần Thị Như Lê, thầy Dương Hồng Phúc, cô Đỗ Ánh Minh, cô Phạm Thị Ngọc Yến thầy Lương Quốc Bình) giúp đỡ tạo điều kiện tốt để em hồn thành luận văn thời gian quy định Em xin chân thành cảm ơn thầy liên mơn Hóa Phân Tích-Kiểm Nghiệm-Độc Chất (thầy Đỗ Châu Minh Vĩnh Thọ, cô Nguyễn Thị Ngọc Vân, Nguyễn Thị Bích Thủy, Nguyễn Thị Tường Vi, thầy Lữ Thiện Phúc, cô Nguyễn Thị Đặng) tạo điều kiện thuận lợi để em hoàn thành tốt luận văn Em xin cảm ơn chị Trần Mộng Tố Tâm, bạn Trần Hữu Trí Nguyễn Thanh Nhàn quan tâm, giúp đỡ, hỗ trợ em suốt trình thực đề tài LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa công bố cơng trình khác Sinh viên Nguyễn Phương Thảo MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN LỜI CAM ĐOAN MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC HÌNH DANH MỤC BẢNG ĐẶT VẤN ĐỀ Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan probiotic 1.2 Giới thiệu vi khuẩn Bifidobacterium 1.3 Tổng quan phương pháp phân tích vi sinh vật 13 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1 Vật liệu 18 2.2 Địa điểm nghiên cứu 19 2.3 Phương pháp nghiên cứu 19 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 34 3.1 Kết xây dựng qui trình 34 3.2 Kết thẩm định qui trình 41 3.3 Kết phân tích chế phẩm thị trường 54 Chương BÀN LUẬN 61 4.1 Xây dựng qui trình phân tích 61 4.2 Thẩm định qui trình phân tích 63 4.3 Áp dụng qui trình thẩm định phân tích số chế phẩm thi trường 66 KẾT LUẬN 69 KIẾN NGHỊ 70 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ATP Adenosine triphosphate Phân tử mang lượng B Bifidobacterium cfu Colony forming unit Đơn vị hình thành khuẩn lạc DNA Deoxyribonucleic acid Vật chất di truyền cấp độ phân tử E Escherichia EFFCA European Food and Feed Cultures Association Hiệp hội giống lương thực thực phẩm châu Âu ELISA Enzyme linked immuno sorbent assay Phương pháp hấp thụ miễn dịch dùng enzym En Enterococcus FAO Food and Agriculture Organization Hiệp hội nông lương giới GRAS Generally recognized as safe Nhóm vi khuẩn xem an toàn Ig Immunoglobulin Globulin miễn dịch L Lactobacillus Le Leuconostoc LAB Lactic acid bacteria Vi khuẩn sinh acid lactic LOD Limit of detection Giới hạn phát LOQ Limit of quantification Giới hạn định lượng MRSA De Mann-Rogosa-Sharpe agar Pe Pediococcus Pr Propionibacter PCR Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi polymerase khuếch đại AND) S Staphylococcus Sa Saccharomyces Sp Sporolactobacillus St Streptococcus DANH MỤC HÌNH Hình 3.1 Hình dạng khuẩn lạc vi khuẩn Bifidobacterium bifidum môi trường MRSAC 35 Hình 3.2 Kết nhuộm Gram, nhuộm kháng acid, nhuộm bào tử vi khuẩn Bifidobacterium bifidum 35 Hình 3.3.Hình dạng khuẩn lạc vi khuẩn Bifidobacterium breve môi trường MRSAL 36 Hình 3.4 Kết nhuộm Gram, nhuộm kháng acid, nhuộm bào tử vi khuẩn Bifidobacterium breve 37 Hình 3.5 Hình dạng khuẩn lạc vi khuẩn Bifidobacterium longum môi trường MRSAF 38 Hình 3.6 Kết nhuộm Gram, nhuộm kháng acid, nhuộm bào tử vi khuẩn Bifidobacterium longum 39 Hình 3.7 Sơ đồ thể tính tuyến tính qui trình định lượng Bifidobacterium bifidum khoảng nồng độ [25, 250] cfu/ml 44 Hình 3.8 Sơ đồ thể tính tuyến tính qui trình định lượng Bifidobacterium breve khoảng nồng độ [25, 250] cfu/ml 45 Hình 3.9 Sơ đồ thể tính tuyến tính qui trình định lượng Bifidobacterium longum khoảng nồng độ [25, 250] cfu/ml 46 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Những vi sinh vật sử dụng làm probiotic người Bảng 1.2 Các chủng loài Bifidobacterium Bảng 3.1 Môi trường điều kiện nuôi cấy chọn lọc cho Bifidobacterium 34 Bảng 3.2 Kết định lượng vi khuẩn Bifidobacterium bifidum 36 Bảng 3.3 Kết định lượng vi khuẩn Bifidobacterium breve 38 Bảng 3.4 Kết định lượng vi khuẩn Bifidobacterium longum 39 Bảng 3.5 Kết thử nghiệm giới hạn vi sinh vật gây bệnh 40 Bảng 3.6 Kết thử nghiệm độ đặc hiệu, độ nhạy qui trình định danh Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium longum 41 Bảng 3.7 Kết thử nghiệm giới hạn phát vi khuẩn Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium longum 42 Bảng 3.8 Kết xác định độ đặc hiệu, độ nhạy qui trình định lượng Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium longum 43 Bảng 3.9 Số khuẩn lạc đếm nồng độ vi khuẩn Bifidobacterium bifidum 44 Bảng 3.10 Số khuẩn lạc đếm nồng độ vi khuẩn Bifidobacterium breve 45 Bảng 3.11 Số khuẩn lạc đếm nồng độ vi khuẩn Bifidobacterium longum 46 Bảng 3.12 Kết thử nghiệm độ lặp lại qui trình định lượng Bifidobacterium bifidum 47 Bảng 3.13 Kết thử nghiệm độ lặp lại qui trình định lượng Bifidobacterium breve 48 Bảng 3.14 Kết thử nghiệm độ lặp lại qui trình định lượng Bifidobacterium longum 49 Bảng 3.15 Kết thử nghiệm độ qui trình định lượng Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium longum 50 Bảng 3.16 Kết giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium longum 51 Bảng 3.17 Kết xác định độ đặc hiệu Candida albicans, Escherichia coli, Salmonella, Shigella, Staphylococcus aureus 52 Bảng 3.18 Kết xác định giới hạn phát Candida albicans, Escherichia coli, Salmonella, Shigella, Staphylococcus aureus 53 Bảng 3.19 Kết phân lập mẫu chế phẩm chứa Bifidobacterium bifidum 54 Bảng 3.20 Kết nhuộm Gram, nhuộm kháng acid, nhuộm bào tử chủng vi khuẩn phân lập từ mẫu chế phẩm chứa Bifidobacterium bifidum 55 Bảng 3.21 Kết phản ứng sinh hóa chủng vi khuẩn phân lập từ mẫu chế phẩm chứa Bifidobacterium bifidum 55 Bảng 3.22 Kết số vi sinh vật sống mẫu chế phẩm chứa Bifidobacterium bifidum 55 Bảng 3.23 Kết phân lập mẫu chế phẩm chứa Bifidobacterium breve 56 Bảng 3.24 Kết nhuộm Gram, nhuộm kháng acid, nhuộm bào tử chủng vi khuẩn phân lập từ mẫu chế phẩm chứa Bifidobacterium breve 56 Bảng 3.25 Kết phản ứng sinh hóa chủng vi khuẩn phân lập từ mẫu chế phẩm chứa Bifidobacterium breve 56 Bảng 3.26 Kết số vi sinh vật sống mẫu chế phẩm chứa Bifidobacterium breve 57 Bảng 3.27 Kết phân lập 12 mẫu chế phẩm chứa Bifidobacterium longum 57 Bảng 3.28 Kết nhuộm Gram, nhuộm kháng acid, nhuộm bào tử chủng vi khuẩn phân lập từ mẫu chế phẩm A1, A2, B1, B2, C1, C2, D1, D2 chứa Bifidobacterium longum 58 Bảng 3.29 Kết phản ứng sinh hóa chủng vi khuẩn phân lập từ mẫu chế phẩm A1, A2, B1, B2, C1, C2, D1, D2 chứa Bifidobacterium longum 59 Bảng 3.30 Kết số vi sinh vật sống 12 mẫu chế phẩm chứa Bifidobacterium longum 59 Bảng 3.31 Kết phát vi sinh vật gây bệnh 12 mẫu chế phẩm chứa Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium longum 60 PL-5 Cách chuẩn bị Hòa tan thành phần lít nước cất Hấp tiệt trùng 15 phút 1210C pH = 7,2 ± 0,2 250C Bảo quản 10 - 300C 1.1.8 Môi trường MSA Thành phần Bảng PL1.8 Thành phần môi trường MSA Thành phần Cao thịt bị Casein từ dịch tụy Dịch tiêu hóa mô động vật Natri clorid D-manitol Đỏ phenol Agar-agar Hàm lượng (g/l) 1,0 5,0 5,0 75,0 10,0 0,025 15,0 Cách chuẩn bị Hòa tan thành phần lít nước cất Hấp tiệt trùng 15 phút 1210C pH = 7,4 ± 0,2 250C Bảo quản 10 - 300C 1.1.9 Môi trường Hektoen Thành phần Bảng PL1.9 Thành phần môi trường Hektoen Thành phần Tryptose Cao nấm nem Bile salts Bios N.3 Lactose Sucrose Salicin Sodidum clorid Sodium thiosulphate Hàm lượng (g/l) 12,0 3,0 9,0 12,0 12,0 2,0 5,0 5,0 PL-6 Fe-ammonium citrate Brom thymol blue Acid fuchsin Agar-agar 1.5 0.065 0.1 15,0 Cách chuẩn bị Hòa tan thành phần lít nước cất vô trùng Gia nhiệt đổ đĩa vô trùng pH = 7,6 ± 0,2 250C Bảo quản 10 - 300C CHÚ Ý: KHÔNG HẤP KHỬ TRÙNG MÔI TRƯỜNG 1.1.10 Môi trường Sabouraud Thành phần Bảng PL1.10 Thành phần môi trường Sabouraud Thành phần Hàm lượng (g/l) Cao nấm men 5,0 Cao thịt 5,0 Dextrose 40,0 Agar-agar 15,0 Cách chuẩn bị Hịa tan thành phần lít nước cất Hấp tiệt trùng 15 phút 1210C pH = 5,7 ± 0,2 250C Bảo quản 10 - 300C 1.2 THUỐC THỬ 1.2.1 Thuốc nhuộm Gram Tím gentian Dung dịch lugol Cồn 95% Đỏ safranin PL-7 1.2.2 Thuốc nhuộm bào tử Methylen blue Cồn acid Carbonfuchsin 1.2.3 Thuốc nhuộm kháng acid Carbonfuchsin Nước cất Methylen blue 1.2.4 Thuốc thử Uffelmann Dung dịch phenol 1%, nhỏ dung dịch sắt (III) chlorid vào từ từ có màu tím PL-8 PHỤ LỤC MỘT SỐ TÍNH CHẤT SINH HÓA CỦA BIFIDOBACTERIUM BIFIDUM, BIFIDOBACTERIUM BREVE, BIFIDOBACTERIUM LONGUM Bảng PL2.1 Tính chất sinh hóa điển hình B bifidum, B breve, B longum B bifidum B breve B longum Trực khuẩn Gram dương Trực khuẩn Gram dương Trực khuẩn Gram dương Bào tử - - - Kháng acid - - - Di động - - - Catalase - - - Sinh acid lactic + + + Lên men α-L-fructose - + - Lên men L-arabinose - - + Lên men Cellobiose - - - Lên men D-fructose + + + Lên men D-galactose + + + Lên men D-lactose + + + Lên men maltose - + + Lên men D-manitol - Lên men D-mannose - + Lên men melezitose - - + + + Nhuộm Gram Lên men melibiose - Lên men raffinose - + + Lên men D-ribose - + + Lên men salicin - - - Lên men D-sorbitol - - - + + Lên men sucrose Lên men trehalose - Lên men D-xylose - - PL-9 PHỤ LỤC CÁCH PHA ỐNG ĐỘ ĐỤC CHUẨN MCFARLAND CÁCH PHA HUYỀN DỊCH VI KHUẨN THEO ĐỘ ĐỤC MCFARLAND 3.1 CÁCH PHA ỐNG ĐỘ ĐỤC CHUẨN MCFARLAND Độ đục chuẩn McFarland 0,5 pha cách: - Lấy 0,6ml dung dịch 1% BaCl2.2H2O (10g/lít) cho vào ống đong (loại 100ml) - Sau đổ đầy 100ml dung dịch 1% H2SO4 (10ml H2SO4 đặc/lít) - Phân phối vào ống nghiệm (trong, sạch) khoảng 5ml (Nên chọn ống nghiệm có đường kính tương đương với ống nghiệm sau dùng để pha huyền dịch vi khuẩn) - Ống nghiệm chứa độ đục chuẩn hàn kín Nếu bảo quản nơi tránh ánh sáng, ống độ đục chuẩn sử dụng tháng 3.2 PHA HUYỀN DỊCH VI KHUẨN THEO ĐỘ ĐỤC MCFARLAND Cách pha huyền dịch vi khuẩn theo độ đục McFrarland: - Thu từ 5-10 khuẩn lạc vi khuẩn hòa vào 5ml dung dịch nước muối sinh lý - Để ống nghiệm vào máy vortex đánh cho đồng - So sánh với độ đục chuẩn McFarland 0,5 Độ đục tương đương với huyền dịch có nồng độ 108cfu/5ml (gọi HD1) Nếu ống nghiệm pha nhạt thu thêm khuẩn lạc cho vào, đục làm lại ống khác - Từ ống có nồng độ 108cfu/5ml tiếp tục pha loãng tới nồng độ mong muốn nước muối sinh lý micropipet PL-10 PHỤ LỤC HÌNH ẢNH KẾT QUẢ XÂY DỰNG QUI TRÌNH PHÂN TÍCH BIFIDOBACTERIUM BIFIDUM, BIFIDOBACTERIUM BREVE, BIFIDOBACTERIUM LONGUM 4.1 KẾT QUẢ QUI TRÌNH ĐỊNH DANH BIFIDOBATERIUM BIFIDUM Hình PL4.1 Phản ứng catalase âm tính Bifidobacterium bifidum Hình PL4.2 Vi khuẩn Bifidobacterium bifidum khơng có khả di động PL-11 Hình PL4.3 Vi khuẩn Bifidobacterium bifidum có khả sinh acid lactic Hình PL4.4 Phản ứng lên men đường L-arabinose, D-mannose, D-xylose, salicin, D-fructose, D-lactose 4.2 KẾT QUẢ QUI TRÌNH ĐỊNH DANH BIFIDOBACTERIUM BREVE Hình PL4.5 Phản ứng catalase âm tính vi khuẩn Bifidobacterium breve PL-12 Hình PL4.6 Vi khuẩn Bifidobacterium breve khơng có khả di động Hình PL4.7 Vi khuẩn Bifidobacterium breve có khả sinh acid lactic Hình PL4.8 Phản ứng lên men đường D-fructose, D-lactose, D-mannose, maltose, sucrose, salicin, L-arabinose, D-xylose Bifidobacterium breve PL-13 4.3 KẾT QUẢ QUI TRÌNH ĐỊNH DANH BIFIDOBACTERIUM LONGUM Hình PL4.9 Phản ứng catalase âm tính vi khuẩn Bifidobacterium longum Hình PL4.10 Vi khuẩn Bifidobacterium longum khơng có khả di động Hình PL4.11 Vi khuẩn Bifidobacterium longum có khả sinh acid lactic PL-14 Hình PL4.24 Phản ứng lên men đường L-arabinose, D-fructose, D-lactose, maltose, sucrose salicin vi khuẩn Bifidobacterium longum PL-15 PHỤ LỤC MỘT SỐ TÍNH CHẤT ĐIỂN HÌNH CỦA CANDIDA ALBICANS, ESCHERICHIA COLI, SALMONELLA, SHIGELLA, STAPHYLOCOCCUS AUREUS 5.1 CANDIDA ALBICANS Hình PL5.1 Khuẩn lạc C albicans mơi trường Sabouraud Hình PL5.2 Kết nhuộm Gram C albicans PL-16 Hình PL5.3 Phản ứng germ tube dương tính C albicans 5.2 ESCHERICHIA COLI Hình PL5.4 Khuẩn lạc E coli mơi trường EMB Hình PL5.5 Phản ứng indol (+), thử nghiệm MR (+), thử nghiệm VP (-) thử nghiệm citrat (-) E coli PL-17 5.3 SALMONELLA Hình PL5.6 Khuẩn lạc Salmonella mơi trường Hektoen Hình PL5.7 Kết mơi trường KIA Salmonella cho phản ứng lên men lactose (-), glucose (+), sinh H2S (+), sinh gas (-) PL-18 5.4 SHIGELLA Hình PL5.8 Khuẩn lạc Shigella mơi trường Hektoen Hình PL5.9 Kết môi trường KIA Shigella cho phản ứng lên men lactose (-), glucose (+), sinh H2S (-), sinh gas (-) PL-19 5.5 STAPHYLOCOCCUS AUREUSI Hình PL5.10 Khuẩn lạc S aureus mơi trường MSA Hình PL5.11 Nhuộm Gram S aureus cho kết cầu khuẩn Gram dương Hình PL5.12 Phản ứng coagulase dương tính S Aureus