0101 nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm một số chế phẩm probiotic có chứa chủng lactobacillus

BỘ Y TẾ BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CẦN THƠ TRẦN HỮU TRÍ NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN KIỂM NGHIỆM MỘT SỐ CHẾ PHẨM PROBIOTIC CÓ CHỨA CHỦNG LACTOBACILLUS LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC ThS DƢƠNG THỊ TRÚC LY Cần Thơ - Năm 2014 LỜI CẢM ƠN Em xin chân thành cảm ơn Cô Dương Thị Trúc Ly hướng dẫn, động viên giúp đỡ em suốt trình thực luận văn Em xin chân thành cảm ơn Thầy Trần Đỗ Hùng, khoa Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học dẫn giúp đỡ em trình làm luận văn Em xin gởi lời cảm ơn đến quí Thầy Cô môn Vi Sinh, đặc biệt Cô Nguyễn Thị Hải Yến, Cô Trần Thị Như Lê, Thầy Dương Hồng Phúc, Cô Đỗ Ánh Minh, Cô Phạm Thị Ngọc Yến Thầy Lương Quốc Bình giúp đỡ tạo điều kiện tốt để em hoàn thành luận văn thời gian quy định Em xin gởi lời cảm ơn đến q Thầy Cơ Liên mơn Hóa phân tích-Kiểm nghiệm-Độc chất, đặc biệt Thầy Đỗ Châu Minh Vĩnh Thọ, Cô Nguyễn Thị Ngọc Vân, Cơ Nguyễn Thị Bích Thủy, Cơ Nguyễn Thị Tường Vi, Thầy Lữ Thiện Phúc Cô Nguyễn Thị Đặng động viên, tạo điều kiện để em hoàn thành luận văn Em xin gởi lời cảm ơn đến Cô Phạm Thị Ngọc Nga, khoa Khoa Học Cơ Bản Chị Trần Mộng Tố Tâm, lớp Dược K34 góp ý giúp đỡ em q trình thực luận văn Xin gởi lời cảm ơn đến bạn Nguyễn Phương Thảo bạn Nguyễn Thanh Nhàn, lớp Dược K35, bạn sinh viên lớp Dược K37 giúp đỡ động viên nhiều suốt trình làm luận văn Con xin cảm ơn cha mẹ động viên, chăm sóc, ủng hộ tạo điều kiện để hoàn thành luận văn LỜI CAM ĐOAN Tơi cam đoan cơng trình nghiên cứu Các số liệu, kết luận văn trung thực chưa công bố cơng trình khác Sinh viên Trần Hữu Trí i MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT iv DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH viii ĐẶT VẤN ĐỀ Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ PROBIOTIC 1.1.1 Lịch sử probiotic 1.1.2 Định nghĩa probiotic 1.1.3 Cơ chế tác dụng probiotic 1.1.4 Chức probiotic 1.2 TỔNG QUAN VỀ LACTOBACILLUS 1.2.1 Vị trí Lactobacillus hệ thống phân loại .7 1.2.2 Phân loại chi Lactobacillus 1.3 TỔNG QUAN VỀ CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH VI SINH VẬT 10 1.3.1 Các phƣơng pháp định danh vi sinh vật 10 1.3.2 Các phƣơng pháp định lƣợng vi sinh vật 12 1.4 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU LIÊN QUAN 13 1.5 MỘT SỐ CHẾ PHẨM PROBIOTIC ĐA CHỦNG TRÊN THỊ TRƢỜNG 15 Chƣơng ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1 ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU 16 2.2 ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 16 2.3 MÔI TRƢỜNG, HÓA CHẤT 16 2.3.1 Môi trƣờng .16 2.3.2 Hóa chất 17 2.4 TRANG THIẾT BỊ DỤNG CỤ 17 2.5 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 ii 2.5.1 Xây dựng qui trình phân tích 18 2.5.2 Thẩm định qui trình phân tích 25 2.5.3 Áp dụng qui trình phân tích chế phẩm probiotic thị trƣờng .28 Chƣơng KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 30 3.1 KẾT QUẢ XÂY DỰNG QUI TRÌNH 30 3.1.1 Khảo sát để tìm mơi trƣờng phân lập, định danh định lƣợng chọn lọc cho vi khuẩn .30 3.1.2 Qui trình phân tích L.acidophilus, L.kefir, L.rhamnosus 33 3.1.3 Qui trình thử giới hạn vi sinh vật gây bệnh .35 3.2 KẾT QUẢ THẨM ĐỊNH QUI TRÌNH PHÂN TÍCH 36 3.2.1 Thẩm định qui trình định danh L.acidophilus, L.kefir, L.rhamnosus 36 3.2.2 Thẩm định qui trình định lƣợng L.acidophilus, L.kefir, L.rhamnosus 38 3.2.3 Kết thẩm định qui trình thử giới hạn vi sinh vật gây bệnh .46 3.3 KẾT QUẢ PHÂN TÍCH CHẾ PHẨM PROBIOTIC TRÊN THỊ TRƢỜNG 48 3.3.1 Kết phân tích chế phẩm probiotic chứa L.acidophilus .48 3.3.2 Kết phân tích chế phẩm probiotic chứa L.kefir 50 3.3.3 Kết phân tích chế phẩm probiotic chứa L.rhamnosus 51 3.3.4 Kết thử giới hạn vi sinh vật gây bệnh .52 Chƣơng BÀN LUẬN 53 4.1 XÂY DỰNG QUI TRÌNH PHÂN TÍCH .53 4.1.1 Khảo sát để tìm mơi trƣờng phân lập, định danh định lƣợng chọn lọc cho vi khuẩn L.acidophillus, L.kefir, L.rhamnosus 53 4.1.2 Qui trình phân tích L.acidophilus, L.kefir, L.rhamnosus 54 4.1.3 Qui trình thử giới hạn vi sinh vật gây bệnh .56 4.2 THẨM ĐỊNH QUI TRÌNH PHÂN TÍCH 57 4.2.1 Thẩm định qui trình định danh L.acidophilus, L.kefir, L.rhamnosus .57 4.2.2 Thẩm định qui trình định lƣợng L.acidophilus, L.kefir, L.rhamnosus .58 4.2.3 Thẩm định qui trình thử giới hạn vi sinh vật gây bệnh 61 iii 4.3 ÁP DỤNG QUI TRÌNH ĐÃ THẨM ĐỊNH PHÂN TÍCH CHẾ PHẨM PROBIOTIC TRÊN THỊ TRƢỜNG .62 4.3.1 Chế phẩm probiotic chứa L.acidophilus 62 4.3.2 Chế phẩm probiotic chứa L.kefir .63 4.3.3 Chế phẩm probiotic chứa L.rhamnosus 63 4.3.4 Thử giới hạn vi sinh vật gây bệnh 64 KẾT LUẬN 66 KIẾN NGHỊ .67 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết Từ nguyên Ý nghĩa tắt a.pro acid propionic Acid propionic ADN Acid deoxyribose nucleic Vật chất di truyền cấp độ phân tử BA Blood agar Môi trƣờng thạch máu Ba.sub Bacillus subtilis Loài Bacillus subtilis Ba.coa Bacillus coagulans Loài Bacillus coagulans Bi.bifi Bifidobacterium bifidum Loài Bifidobacterium bifidum Bi.bre Bifidobacterium breve Loài Bifidobacterium breve Bi.lac Bifidobacterium lactis Loài Bifidobacterium lactis Bi.long Bifidobacterium longum Loài Bifidobacterium longum BE Bile esculin Muối mật bile esculin CA Columbia agar Môi trƣờng thạch columbia C Candida Chi Candida chloram chloramphenicol Kháng sinh chloramphenicol cfu Colony forming unit Đơn vị khuẩn lạc đvcp Đơn vị chế phẩm Đơn vị chế phẩm E Escherichia Chi Escherichia En Enterococcus Chi Enterococcus ELISA Enzyme-linked immuno sorbent Kỹ thuật sinh hóa phát kháng assay nguyên, kháng thể EMB Eosin methylene blue Môi trƣờng chọn lọc E.coli gen gentamycin Kháng sinh gentamycin kan kanamycin Kháng sinh kanamycin KIA Kligler’s iron agar Môi trƣờng thử khả lên men glucose, lactose v KN Kháng nguyên Nguyên nhân gây kháng KT Kháng thể Chất gắn đặc hiệu với kháng nguyên L Lactobacillus Chi Lactobacillus L.a Lactobacillus acidophilus Loài Lactobacillus acidophilus L.c Lactobacillus casei Loài Lactobacillus casei L.k Lactobacillus kefir Loài Lactobacillus kefir L.p Lactobacillus plantarum Loài Lactobacillus plantarum L.r Lactobacillus rhamnosus Loài Lactobacillus rhamnosus LC Level critical Lƣợng vi sinh vật thấp mẫu cho 50% kết dƣơng tính LOD Limit of detection Giới hạn phát L-cys L-cystein Cystein đồng phân L LOQ Limit of quantification Giới hạn định lƣợng MPN Most propable number Phƣơng pháp ƣớc đoán số lƣợng vi khuẩn MRSA De Mann-Rogosa-Sharpe agar Môi trƣờng thạch MRS MR-VP Methyl red, Voges-Proskauer Thử nghiệm MR - VP MSA Mannitol salt agar Môi trƣờng MSA PCR Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi polymerase khuếch đại ADN ARN Acid ribose nucleic Vật chất di truyền cấp độ phân tử S Staphylococcus Chi Staphylococcus Strep.the Streptococcus thermophilus Loài Streptococcus thermophilus spp species pluriel Nhiều loài ssp sub species Loài phụ SIM H2S-indole-motility Mơi trƣờng tìm H2S, indol, khả di động Van vancomycin Kháng sinh vancomycin vi DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Tóm tắt chế tác dụng chủng probiotic Bảng 1.2 Bảng phân loại nhóm vi khuẩn chi Lactobacillus .10 Bảng 2.1 Trang thiết bị dụng cụ sử dụng .17 Bảng 3.1 Kết khảo sát tìm mơi trƣờng phân lập, định danh định lƣợng chọn lọc cho vi khuẩn L.acidophilus, L.kefir, L.rhamnosus 30 Bảng 3.2 Kết định danh L.acidophilus, L.kefir, L.rhamnosus .34 Bảng 3.3 Kết định lƣợng L.acidophilus, L.kefir, L.rhamnosus 35 Bảng 3.4 Kết thử giới hạn vi sinh vật gây bệnh 35 Bảng 3.5 Kết thử nghiệm độ đặc hiệu, độ nhạy qui trình định danh L.acidophilus, L.kefir, L.rhamnosus 36 Bảng 3.6 Kết thử nghiệm giới hạn phát qui trình định danh L.acidophilus, L.kefir, L.rhamnosus 37 Bảng 3.7 Kết thử nghiệm độ đặc hiệu, độ nhạy qui trình định lƣợng L.acidophilus, L.kefir, L.rhamnosus 38 Bảng 3.8 Số khuẩn lạc đếm đƣợc nồng độ vi khuẩn L.acidophilus 38 Bảng 3.9 Số khuẩn lạc đếm đƣợc nồng độ vi khuẩn L.kefir 39 Bảng 3.10 Số khuẩn lạc đếm đƣợc nồng độ vi khuẩn L.rhamnosus 39 Bảng 3.11 Kết thử nghiệm độ lặp lại qui trình định lƣợng L.acidophilus 40 Bảng 3.12 Kết thử nghiệm độ lặp lại qui trình định lƣợng L.kefir 41 Bảng 3.13 Kết thử nghiệm độ lặp lại qui trình định lƣợng L.rhamnosus 42 Bảng 3.14 Kết thử nghiệm độ qui trình định lƣợng L.acidophilus 43 Bảng 3.15 Kết thử nghiệm độ qui trình định lƣợng L.kefir .43 Bảng 3.16 Kết thử nghiệm độ qui trình định lƣợng L.rhamnosus 44 Bảng 3.17 Kết giới hạn phát hiện, giới hạn định lƣợng L.acidophilus .44 Bảng 3.18 Kết xác định độ đặc hiệu, độ nhạy qui trình thử giới hạn C.albicans, E.coli, Salmonella, Shigella, S.aureus 46 vii Bảng 3.19 Kết xác định giới hạn phát C.albicans, E.coli, Salmonella, Shigella, S.aureus .47 Bảng 3.20 Kết định danh chế phẩm chứa L.acidophilus 49 Bảng 3.21 Kết định lƣợng chế phẩm chứa L.acidophilus 49 Bảng 3.22 Kết định danh chế phẩm chứa L.kefir 50 Bảng 3.23 Kết định lƣợng chế phẩm chứa L.kefir 50 Bảng 3.24 Kết định danh chế phẩm chứa L.rhamnosus 51 Bảng 3.25 Kết định lƣợng chế phẩm chứa L.rhamnosus 52 Bảng 3.26 Kết thử giới hạn vi sinh vật gây bệnh 10 mẫu chế phẩm .52 Bảng 4.1 Điều kiện phân lập, định danh định lƣợng chọn lọc cho 54 L.acidophillus, L.kefir, L.rhamnosus 54 Bảng 4.2 Cách tính độ đặc hiệu độ nhạy qui trình phân tích vi sinh vật .57 Bảng 4.3 Kiểm tra tính tƣơng thích, ý nghĩa hệ số phƣơng trình hồi qui 58 61 4.2.2.5 Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng Kết từ bảng 3.17 cho thấy giới hạn phát qui trình định lƣợng L.acidophilus, L.kefir, L.rhamnosus khơng q 10cfu/ml theo qui định tài liệu tham khảo [16] Do qui trình có giới hạn phát tin cậy đƣợc Kết từ bảng 3.17 cho thấy giới hạn định lƣợng qui trình định lƣợng L.acidophilus, L.kefir, L.rhamnosus 15,2cfu/ml Nồng độ đủ thấp để qui trình định lƣợng đƣợc đảm bảo độ xác, độ mức chấp nhận đƣợc Kết luận: kết thẩm định qui trình định lƣợng L.acidophilus, L.kefir, L.rhamnosus đạt tất thông số quy định nên chúng tơi áp dụng qui trình định lƣợng xây dựng để xác định số lƣợng vi khuẩn L.acidophilus, L.kefir, L.rhamnosus sống chế phẩm probiotic đa chủng lƣu hành thị trƣờng 4.2.3 Thẩm định qui trình thử giới hạn vi sinh vật gây bệnh 4.2.3.1 Độ đặc hiệu, độ nhạy Độ đặc hiệu qui trình đƣợc tính dựa kết thử nghiệm 30 mẫu chuẩn âm, độ nhạy qui trình đƣợc tính dựa kết thử nghiệm 30 mẫu chuẩn dƣơng theo công thức bảng 4.2 Khi tiến hành chủng vi khuẩn âm tính dƣơng tính, độ đặc hiệu độ nhạy qui trình phát vi sinh vật gây bệnh đạt 90% theo qui định tài liệu tham khảo [16] Từ kết cho thấy qui trình đặc hiệu nhạy với loại vi khuẩn cần phát hiện, phân biệt đƣợc với vi khuẩn khác dùng làm probiotic Điều quan trọng qui trình phân tích chế phẩm probiotic đa chủng, gồm nhiều vi sinh vật khác chế phẩm 4.2.3.2 Giới hạn phát Theo bảng 3.19, giới hạn phát qui trình phát vi sinh vật gây bệnh đạt mức cho phép ≤ 10cfu/ml [16] Giới hạn phát cho C.albicans, E.coli, Salmonella, Shigella, S.aureus lần lƣợt 1cfu/ml, 1cfu/10ml, 1cfu/ml, 1cfu/ml, 1cfu/ml Nhƣ qui trình phát đƣợc vi sinh vật gây bệnh nhiễm 62 chế phẩm mức thấp Kết luận: kết thẩm định qui trình phát vi sinh vật gây bệnh cho thấy độ đặc hiệu giới hạn phát đạt theo qui định Do chúng tơi áp dụng qui trình để phát loại vi sinh vật gây bệnh thƣờng nhiễm chế phẩm probiotic đa chủng lƣu hành thị trƣờng 4.3 ÁP DỤNG QUI TRÌNH ĐÃ THẨM ĐỊNH PHÂN TÍCH CHẾ PHẨM PROBIOTIC TRÊN THỊ TRƢỜNG 4.3.1 Chế phẩm probiotic chứa L.acidophilus 4.3.1.1 Phân lập Cấy vạch ba chiều mẫu chế phẩm chứa L.acidophilus môi trƣờng MRSAsalicin 1% ủ 370C vi hiếu khí 72 Mỗi mẫu, thu đƣợc khuẩn lạc đặc trƣng cho L.acidophilus Tiếp theo, lấy khuẩn lạc đem tăng sinh làm môi trƣờng MRSA để tiến hành định danh 4.3.1.2 Định danh Kết từ bảng 3.20 cho thấy chủng vi khuẩn phân lập đƣợc trực khuẩn Gram dƣơng, đứng riêng lẻ thành đám, thành cặp, không sinh bào tử, không kháng acid, không sinh enzym catalase, khơng di động, khơng sinh indol, có khả sinh acid lactic Sau tiến hành thực phản ứng lên men loại đƣờng phản ứng lên men đƣờng glucose 450C Kết thu đƣợc chủng vi khuẩn cho phản ứng dƣơng tính với loại đƣờng glucose, lactose, maltose, mannose, sucrose, salicin, âm tính với đƣờng mannitol đồng thời cho kết lên men glucose 450C âm tính Những tính chất hồn tồn phù hợp với tính chất L.acidophilus đƣợc ghi nhận tài liệu nhƣ thực nghiệm tiến hành Vì vậy, chúng tơi kết luận chủng vi khuẩn phân lập đƣợc thuộc loài L.acidophilus 4.3.1.3 Định lượng Định lƣợng mẫu chế phẩm chứa L.acidophilus phƣơng pháp đếm khuẩn lạc môi trƣờng MRSA-salicin 1% Sau ủ 370C vi hiếu khí 72 giờ, đếm số khuẩn lạc đặc trƣng môi trƣờng Kết từ bảng 3.24 cho thấy số 63 lƣợng vi sinh vật sống mẫu chế phẩm nằm khoảng giới hạn cho phép 4.3.2 Chế phẩm probiotic chứa L.kefir 4.3.2.1 Phân lập Cấy vạch ba chiều mẫu chế phẩm chứa L.kefir môi trƣờng MRSA pH 4,58 ủ 370C vi hiếu khí 72 Mỗi chế phẩm, thu đƣợc khuẩn lạc đặc trƣng cho L.kefir Tiếp theo, lấy khuẩn lạc đem tăng sinh làm mơi trƣờng MRSA để tiến hành định danh 4.3.2.2 Định danh Kết từ bảng 3.22 cho thấy chủng vi khuẩn phân lập đƣợc trực khuẩn Gram dƣơng, đứng riêng lẻ thành đám, thành cặp, không sinh bào tử, không kháng acid, không sinh enzym catalase, khơng di động, khơng sinh indol, có khả sinh acid lactic Sau tiến hành thực phản ứng lên men loại đƣờng phản ứng lên men đƣờng glucose 450C Kết thu đƣợc chủng vi khuẩn cho phản ứng dƣơng tính với loại đƣờng glucose, maltose, âm tính với loại đƣờng arabinose, mannose, sucrose, xylose, đồng thời cho kết lên men glucose 450C âm tính Những tính chất hồn tồn phù hợp với tính chất L.kefir đƣợc ghi nhận tài liệu nhƣ thực nghiệm tiến hành Vì vậy, chúng tơi kết luận chủng vi khuẩn phân lập đƣợc thuộc loài L.kefir 4.3.2.3 Định lượng Định lƣợng mẫu chế phẩm chứa L.kefir phƣơng pháp đếm khuẩn lạc môi trƣờng MRSA pH 4,58 Sau ủ 370C vi hiếu khí 72 giờ, đếm số khuẩn lạc đặc trƣng môi trƣờng Kết từ bảng 3.26 cho thấy số lƣợng vi sinh vật sống mẫu chế phẩm nằm khoảng giới hạn cho phép, có mẫu không đạt yêu cầu lƣợng vi sinh vật sống thấp dƣới mức cho phép so với nhãn 4.3.3 Chế phẩm probiotic chứa L.rhamnosus 4.3.3.1 Phân lập Cấy vạch ba chiều mẫu chế phẩm chứa L.rhamnosus môi trƣờng MRSA- 64 vancomycin 1mg/l ủ 430C vi hiếu khí 72 Mỗi chế phẩm, thu đƣợc khuẩn lạc đặc trƣng cho L.rhamnosus Tiếp theo, lấy khuẩn lạc đem tăng sinh mơi trƣờng MRSA để tiến hành định danh 4.3.3.2 Định danh Kết từ bảng 3.24 cho thấy chủng vi khuẩn phân lập đƣợc trực khuẩn Gram dƣơng, đứng riêng lẻ thành đám, thành cặp, không sinh bào tử, không kháng acid, không sinh enzym catalase, khơng di động, khơng sinh indol, có khả sinh acid lactic Sau tiến hành thực phản ứng lên men loại đƣờng phản ứng lên men đƣờng glucose 450C Kết thu đƣợc chủng vi khuẩn cho phản ứng dƣơng tính với loại đƣờng glucose, mannitol, sucrose, sorbitol, âm tính với loại đƣờng arabinose, xylose, đồng thời cho kết lên men glucose 450C âm tính Những tính chất hồn tồn phù hợp với tính chất L.rhamnosus đƣợc ghi nhận tài liệu nhƣ thực nghiệm tiến hành Vì vậy, chúng tơi kết luận chủng vi khuẩn phân lập đƣợc thuộc loài L.rhamnosus 4.3.3.3 Định lượng Định lƣợng mẫu chế phẩm chứa L.rhamnosus phƣơng pháp đếm khuẩn lạc môi trƣờng MRSA-vancomycin 1mg/l Sau ủ 430C vi hiếu khí 72 giờ, đếm số khuẩn lạc đặc trƣng môi trƣờng Kết từ bảng 3.28 cho thấy số lƣợng vi sinh vật sống mẫu chế phẩm nằm khoảng giới hạn cho phép 4.3.4 Thử giới hạn vi sinh vật gây bệnh Tiến hành qui trình thử giới hạn vi sinh vật gây bệnh 10 mẫu chế phẩm probiotic đƣợc định danh định lƣợng Kết từ bảng 3.29 cho thấy 10 mẫu chế phẩm probiotic không phát vi khuẩn Candida albicans, Escherichia coli, Shigella, Salmonella, Staphylococcus aureus Nhƣ chế phẩm probiotic xem nhƣ an toàn ngƣời sử dụng Các chế phẩm probiotic đa chủng có chứa chi Lactobacillus thị trƣờng chủ yếu đƣợc bào chế dƣới dạng thuốc bột, thuốc cốm viên nang cứng Qua trình 65 thực nghiệm dạng bào chế trên, chế phẩm cho kết đạt tiêu định danh thử giới hạn vi sinh vật gây bệnh Đối với tiêu định lƣợng, có mẫu chế phẩm chứa L.kefir khơng đạt, chế phẩm cịn lại đạt 66 KẾT LUẬN Sau thực đề tài, đạt đƣợc kết sau: - Xây dựng đƣợc qui trình kiểm nghiệm chế phẩm probiotic dạng đa chủng chứa L.acidophilus, L.kefir, L.rhamnosus thẩm định qui trình - Xây dựng đƣợc qui trình thử giới hạn vi sinh vật gây bệnh thẩm định qui trình - Áp dụng qui trình thẩm định vào phân tích chế phẩm probiotic đa chủng, phân lập đƣợc chủng vi khuẩn L.acidophilus, chủng vi khuẩn L.kefir chủng vi khuẩn L.rhamnosus - Định danh đƣợc 10 chủng vi khuẩn phân lập đƣợc theo phƣơng pháp sinh hóa thƣờng qui đến mức loài - Xác định đƣợc số lƣợng sống 10 chủng vi khuẩn phân lập đƣợc chế phẩm phƣơng pháp đếm số khuẩn lạc Trong có mẫu chế phẩm chứa L.kefir khơng đạt tiêu định lƣợng - Thử giới hạn loài vi sinh vật gây bệnh Candida albicans, Escherichia coli, Salmonella, Shigella, Staphylococcus aureus 10 mẫu chế phẩm probiotic đa chủng, không phát thấy loại vi sinh vật 67 KIẾN NGHỊ - Tiếp tục tiến hành định danh vi khuẩn L.acidophilus, L.kefir, L.rhamnosus phân lập đƣợc phƣơng pháp PCR để kết luận xác - Tiếp tục xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm loài vi khuẩn khác thuộc chi Lactobacillus chế phẩm probiotic - Tiếp tục xây dựng qui trình thử giới hạn vi sinh vật gây bệnh với loài vi sinh vật gây bệnh khác - Áp dụng qui trình xây dựng kiểm nghiệm chế phẩm probiotic đa chủng khác có chứa L.acidophilus, L.kefir, L.rhamnosus lƣu hành thị trƣờng - Tiến hành thử tác dụng sinh học chế phẩm probiotic kiểm nghiệm TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Bộ mơn Vi Sinh (2013), Giáo trình thực tập Vi Sinh Học, Khoa Y-trường Đại học Y Dược Cần Thơ, tr.11-15, 26-53 Đinh Hữu Dung (2008), Kỹ thuật đảm bảo chất lượng xét nghiệm vi sinh học, Nhà xuất y học, tr.9-60 Nguyễn Tiến Dũng (2007), Phương pháp kiểm nghiệm vi sinh vật thực phẩm, trường Đại học Khoa học Tự nhiên-Đại học Quốc Gia TP.HCM Nguyễn Thị Vĩnh Hồng, Khổng Thị Minh Huệ (2012), “Tình hình kiểm tra chất lượng chế phẩm probiotics viện kiểm nghiệm thuốc trung ương”, Tạp chí Kiểm nghiệm thuốc tập 10.(36) (số 2/2012), tr.1 Nguyễn Duy Khang (2003), “Kỹ thuật nhuộm soi vi khuẩn”, Tạp chí Kiểm nghiệm thuốc tập 1.(2) (số 2/2003), tr.6-8 Nguyễn Văn Liêm (2007), Ứng dụng kỹ thuật di truyền vào việc định danh số vi khuẩn thuộc chi Lacbacillus dùng làm probiotic, Luận văn Thạc sĩ Dược học, trường Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh Mai Đàm Linh, Đỗ Minh Phương, Phạm Thị Tuyết, Kiều Hữu Ảnh, Nguyễn Thị Giang (2008), “Đặc điểm sinh học chủng vi khuẩn lactic phân lập địa bàn thành phố Hà Nội”, Tạp chí Khoa học Đại học Quốc Gia Hà Nội, Khoa học Tự nhiên Công nghệ 24 tr.221-226 Đào Thị Lương, Nguyễn Thị Anh Đào, Nguyễn Thị Kim Quy, Trần Thị Lệ Quyên, Dương Văn Hợp (2010), “Phân lập tuyển chọn vi khuẩn lactic dùng chế biến bảo quản thức ăn thô xanh phụ phẩm nông nghiệp cho gia súc nhai lại”, Di truyền học ứng dụng – Chuyên san Công nghệ sinh học 6, tr.1-6 Nguyễn Thế Trang, Trần Đình Mẫn (2008), “Một số đặc điểm phân loại hai chủng vi khuẩn lactic HN11 HN34 sinh tổng hợp L(+)-lactic acid phân lập Việt Nam”, Tạp chí Cơng nghệ sinh học 6(4), tr.505-511 10 Phạm Thị Lan Thanh (2007), Phân lập, định danh nghiên cứu tiềm probiotic vi khuẩn Lactobacillus có nguồn gốc từ người, Luận văn Thạc sĩ sinh học, trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên TP Hồ Chí Minh 11 Nguyễn Thị Bích Thùy (2009), Phân lập vi khuẩn lactic có nguồn gốc từ thực phẩm dược phẩm mang hoạt tính probiotic, Đồ án tốt nghiệp chuyên ngành Công nghệ sinh học, trường Đại học Kỹ Thuật Cơng Nghệ TP Hồ Chí Minh 12 Nguyễn Thị Nghi Trung (2008), Định danh vi khuẩn Lactobacillus acidophilus phương pháp sinh học phân tử, Luận văn tốt nghiệp Dược sĩ Đại học, trường Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh 13 Trần Linh Thước (2010), Phương pháp phân tích vi sinh vật nước, thực phẩm mỹ phẩm, Nhà xuất giáo dục, tr.63-69, 101-160 14 Phạm Hùng Vân (2006), Kỹ thuật xét nghiệm vi sinh lâm sàng, Nhà xuất y học, tr.101-143 15 Tạ Thành Văn (2010), PCR số kỹ thuật y sinh học phân tử, Nhà xuất y học, tr.33-40 16 Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia (2010), Thẩm định phương pháp phân tích hóa học vi sinh vật, Nhà xuất khoa học kỹ thuật, tr 60-72 17 Viện vệ sinh dịch tể trung ương (2013), Các phương pháp chẩn đoán vi khuẩn gây bệnh, www.nihe.org.vn 18 Cao Thi Kim Yến (2010), Tổng quan thực phẩm probiotic, Khóa luận tốt nghiệp chuyên ngành Công nghệ sinh học, trường Đại học Kỹ Thuật Công Nghệ TP Hồ Chí Minh TÀI LIỆU TIẾNG ANH 19 A.A.Amara, A.Shibl (2013), “Role of probiotics in health improvement, infection control and disease treatment and management”, Saudi Pharmaceutical Journal 2013, p.1-6 20 Ankur Desai, B.Sc.M.Sc (2008), Strain identification, viability and probiotics properties of Lactobacillus casei, A thesis submitted for the degree of doctor of philosophy, School of Biomedical and Health Sciences Victoria University, Werribee campus Victoria, Australia, p.9-57 21 Anthimia Batrinon (2010), The use of lactic acid bacteria in probiotic products, TEI of Athens, p.20-22 22 A.Talwalkar, K.Kailasapathy (2004), “Comparison of selective and differential media for the accurate enumeration of strains of Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium spp and Lactobacillus casei complex from commercial yoghurts”, International Dairy Journal 14, p.143–149 23 Azadnia P and Khan Nazer A H (2009), “Identification of lactic acid bacteria isolated from traditional drinking yoghurt in tribes of fars province”, Iranian Journal of Veterinary Research, Shiraz University, Vol 10, p.235-240 24 B.J.B.Wood, W.H.Holzapfel (2010), The Lactic Acid Bacteria volume 2, Springer Science and Business Media Dordrecht, p.19-49 25 Cong Dai, Chang-Qing Zheng, Min Jiang, Xiao-Yu Ma, Li-Juan Jiang (2013), “Probiotics and irritable bowel syndrome”, World Journal of Gastroenterol 19(36), p.5973-5980 26 C.G.Vinderola, J.A.Reinheimer (1999), “Culture media for the enumeration of Bifidobacterium bifidum and Lactobacillus acidophilus in the presence of yoghurt bacteria”, International Dairy Journal 9, p 497-505 27 De Man J C., Rogosa M & Sharpe M E (1960), “A medium for the cultivation of Lactobacilli”, J oppl Bact 23 (l), p.130-135 28 G.Balakrish Nair, Yoshifumi Takeda (2011), “Probiotic foods in health and disease”, Science Publishers, P.O Box 699, Enfield, NH 03748, USA, p.5-7 29 Intan H.Ismail, Paul V.Licciardi and Mimi LK.Tang (2013), “Probiotic effects in allergic disease”, Journal of Paediatrics and Child Health vol 10, p.1-5 30 Irina A.Kirpich, PhD, Craig J.McClain, MD (2013), “Probiotics in the treatment of the liver diseases”, Journal of the American College of Nutrition vol 31, p.14-19 31 Jans D (2005), “Probiotics in Animal Nutrition”, www fefana.org, p 4-18 32 J.E.L.Corry, G.D.W.Curtis and R.M.Baird (2012), Handbook of Culture Media for Food and Water Microbiology 3rd edition, The Royal Society of Chemistry, p.174-186 33 J.Sarowska et al (2013), “The therapeutic effect of probiotic bacteria on gastrointestinal diseases”, Clinical and Experimental Medicine vol 22, p 759– 766 34 Jun Sik Yoon, Won Sohn, Oh Young Lee, Sang Pyo Lee, Kang Nyeong Lee, Dae Won Jun, Hang Lak Lee, Byung Chul Yoon, Ho Soon Choi, Won-Seok Chung, Jae-Gu Seo (2014), “Effect of Multispecies Probiotics on Irritable Bowel Syndrome”, Journal of Gastroenterol Hepatol, 29(1), p.52-59 35 Katia Gianni de Carvalho Lima, Monika Francisca Kruger, Jorge Behrens, Maria Teresa Destro, Mariza Landgraf, Bernadette Dora Gombossy de Melo Franco (2009), “Evaluation of culture media for enumeration of Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei and Bifidobacterium animalisin the presence of Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus and Streptococcus thermophilus”, LWT - Food Science and Technology (42), p.491-495 36 Kingsley C.Anukam (2007), “Probiotics: 100 years (1907-2007) after Elie Metchnikoff’s observation”, Communicating Current Research and Educational Topics and Trends in Applied Microbiology A Méndez-Vilas (Ed.), p.466-474 37 Lucia Pacifico et al (2014), “Probiotics for the treatment of Helicobacter pylori infection in children”, World Journal of Gastroenterol 20(3), p.673-683 38 Metchnikoff Elie and translation edited by P.Chalmers Mitchel (2004), The prolongation of life, Optimistic studies, Springer Publishing Company, p.4-5 39 Miriam Bermudez-Brito Julio Plaza-Díaz Sergio Moz-Quezada, Carolina Gómez-Llorente Angel Gil (2012), “Probiotic Mechanisms of Action”, Ann Nutr Metab 61, p.160-174 40 Muhammad Zeeshan Iqbal, Muhammad Imran Qadir, Tauqeer Hussain, Khalid Hussain Janbaz, Yusra Habib Khan and Bashir Ahmad (2014), “Probiotics and their beneficial effects against various diseases”, Pakistan Journal of Pharmaceutical Sciences vol 27, p.405-415 41 M.M.Locascio, R.Alesso, V.I.Morata and S.N.González (2012), “Medium for differential enumeration of Lactobacillus casei and Lactobacillus acidophilus from lyophilized mixed cultures”, Medium for Differential Enumeration, p.257-261 42 M.G.Redman, E.J.Ward and R.S.Phillips (2014), “The efficacy and safety of probiotics in people with cancer”, Annals of Oncology 00, p.1-11 43 Nalayini Tharmaraj, Nagendra P Shah (2004), “Survival of Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus paracasei ssp.paracasei, Lactobacillus rhamnosus, Bifidobacterium animalis and Propionibacteriumin cheese-based dips and the suitability of dips as effective carriers of probiotic bacteria”, International Dairy Journal 14, p.1055-1066 44 NordVal (2009), Protocol for the validation of alternative microbiological methods, p.5-16 45 N.Tharmaraj and N P.Shah (1999), “Selective enumeration and survival in dairy foods”, Symposium: PROBIOTIC BACTERIA 46 N.Tharmaraj and N P.Shah (2003), “Selective Enumeration of Lactobacillus delbrueckiissp.bulgaricus, Streptococcus thermophilus, Lactobacillus acidophilus, Bifidobacteria, Lactobacillus casei, Lactobacillus rhamnosus, and Propionibacteria”, Journal of Dairy Science (86), p.2288-2296 47 Parenteral Drug Association (2000), “Evaluation, Validation and Implementation of New Microbiological Testing Methods”, Technical report 33, p.15-39 48 Parvathy Seema Nair and Puthuvallil Kumaran Surendran (2005), “Biochemical characterization of lactic acid bacteria isolate from fish and prawn”, Journal of culture collections, Volume 4, p.48-52 49 Rabia Ashraf, Nagendra P Shah (2011), “Selective and differential enumerations of Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricus, Streptococcus thermophilus, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei and Bifidobacterium spp in yoghurt”, International Journal of Food Microbiology (149), p.194-208 50 Reza Karimi et al (2012), “Selective enumeration of probiotic microorganisms in cheese”, Food Microbiology 29, p.1-9 51 Ronald M.Atlas (2010), Handbook of Microbiological media Fourth Edition, Taylor and Francis Group, p.1231-1238 52 S.Charlton, R.Giroux, D.Hondred, C.Lipton, K.Worden (2005), “PCR validation and performance characteristics”, AEIC biotech concensus paper, p 1-6 53 S.Van de Casteele et al (2006), “Evaluation of culture media for selective enumeration of probiotic strains of lactobacilli and bifidobacteria in combination with yoghurt or cheese starters”, International Dairy Journal 16, p.1470–1476 54 Tobias A.Oelschlaeger (2010), “Mechanisms of probiotic actions”, International Journal of Medical Microbiology 300, p.57-62 55 T Iannitti, B Palmieri (2010), “Therapeutical use of probiotic formulations in clinical practice”, Clinical Nutrition 29, p.701-725 56 United States Pharmacopeia 34 (2011), Validation of alternative microbiological methods 57 V Sreeja, Jashbhai B.Prajapati (2013), “Probiotic Formulations: Application and Status as Pharmaceuticals”, Probiotics & Antimicro Prot 5, p.81–91 58 William P.Charteris et al (1997), “Selective detection, enumeration and identification of potentially probiotic Lactobacillus and Bifidobacterium species in mixed bacterial populations”, Inrernational Journal of Food Microbiology 35, p.1-27 59 William B.Whitman (2009), Bergey’s manual of Systematic Bacteriology Second Edition Volume Three, Springer Dordrecht Heidelberg London New York, p 465-511 PHỤ LỤC PHỤ LỤC Kết xây dựng qui trình định danh L.acidophilus, L.kefir, L.rhamnosus PL-1 PHỤ LỤC Kết xây dựng qui trình thử giới hạn vi sinh vật gây bệnh PL-5 PHỤ LỤC Đường tuyến tính qui trình định lượng L.acidophilus, L.kefir, L.rhamnosus PL-9 PHỤ LỤC Môi trường, thuốc thử PL-10 PHỤ LỤC Kỹ thuật cấy vi sinh vật, nguyên tắc, cách thực phương pháp nhuộm phản ứng sinh hóa PL-13 DANH MỤC HÌNH PHỤ LỤC Hình PL1.1 Kết nhuộm Gram, nhuộm bào tử, nhuộm kháng acid, phản ứng catalase, phản ứng indol, khả di động, sinh acid lactic, lên men glucose 45 0C L.acidophilus PL-1 Hình PL1.2 Kết nhuộm Gram, nhuộm bào tử, nhuộm kháng acid, phản ứng catalase, phản ứng indol, khả di động, sinh acid lactic, lên men glucose 450C L.kefir PL-2 Hình PL1.3 Kết nhuộm Gram, nhuộm bào tử, nhuộm kháng acid, phản ứng catalase, phản ứng indol, khả di động, sinh acid lactic, lên men glucose 45 0C L.rhamnosus PL-3 Hình PL1.4 Kết phản ứng lên men đường L.acidophilus PL-4 Hình PL1.4 Kết phản ứng lên men đường L.kefir PL-4 Hình PL1.4 Kết phản ứng lên men đường L.rhamnosus PL-4 Hình PL2.1 Khuẩn lạc Candida albicans mơi trường Sabouraud PL-5 Hình PL2.2 Kết nhuộm Gram nấm Candida albicans PL-5 Hình PL2.3 Kết phản ứng germ tube nấm Candida albicans PL-5 Hình PL2.4 Khuẩn lạc E.coli môi trường EMB PL-6 Hình PL2.5 Kết phản ứng sinh hóa E.coli PL-6 Hình PL2.6 Khuẩn lạc Salmonella Shigella môi trường EMB PL-7 Hình PL2.7 Kết định danh Salmonella Shigella mơi trường KIA PL-7 Hình PL2.8 Khuẩn lạc Staphylococcus aureus môi trường MSA PL-8 Hình PL2.9 Kết nhuộm Gram Staphylococcus aureus PL-8 Hình PL2.10 Kết phản ứng coagulase Staphylococcus aureus PL-8 Hình PL3.1 Đồ thị tương quan nồng độ vi khuẩn L.acidophilus số khuẩn lạc trung bình đếm đĩa thạch PL-9 Hình PL3.2 Đồ thị tương quan nồng độ vi khuẩn L.kefir số khuẩn lạc trung bình đếm đĩa thạch PL-9 Hình PL3.3 Đồ thị tương quan nồng độ vi khuẩn L.rhamnosus số khuẩn lạc trung bình đếm đĩa thạch PL-9