Xác định hàm lượng lactoferrin trong thực phẩm bổ sung bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TRẦN THÁI NGỌC XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG LACTOFERRIN TRONG THỰC PHẨM BỔ SUNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2021 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TRẦN THÁI NGỌC Mã sinh viên: 1601568 XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG LACTOFERRIN TRONG THỰC PHẨM BỔ SUNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: PGS.TS Phạm Thị Thanh Hà DS Vũ Thị Thanh An Nơi thực hiện: Bộ mơn Hố phân tích – độc chất Viện Kiểm nghiệm An toàn Vệ sinh Thực phẩm Quốc gia HÀ NỘI – 2021 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, em xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Phạm Thị Thanh Hà DS.Vũ Thị Thanh An – người thầy trực tiếp hướng dẫn bảo tận tình cho em suốt trình thực đề tài Em xin chân thành cảm ơn quan tâm giúp đỡ nhiệt tình anh chị Khoa Nghiên cứu phát triển Viện Kiểm nghiệm An toàn Vệ sinh Thực phẩm Quốc gia, đặc biệt chị ThS Nguyễn Thị Hồng Ngọc thầy cô giáo Bộ mơn Hóa Phân tích – Độc chất q trình em thực đề tài Em xin gửi lời cảm ơn đến ban lãnh đạo: Bộ mơn Hóa phân tích- Độc chất Khoa Nghiên cứu Phát triển – Viện Kiểm Nghiệm An toàn Vệ sinh thực phẩm Quốc gia Đã tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành khoá luận Và cuối em xin bày tỏ lịng u thương, biết ơn tới gia đình bạn bè người động viên, giúp đỡ em q trình học tập hồn thành khóa luận tốt nghiệp Hà Nội, ngày tháng năm 2021 Sinh viên Trần Thái Ngọc MỤC LỤC DANH MỤC KÍ HIỆU VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG BIỂU DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan lactoferrin Giới thiệu whey protein Giới thiệu Lactoferrin Phương pháp xác định hàm lượng 1.2 Sắc ký lỏng hiệu cao 10 Khái niệm 10 Nguyên tắc – cấu tạo hệ thống HPLC 10 1.3 Sắc ký lực 11 Khái niệm 11 Cơ chế 11 Các loại hình sắc ký lực 12 Sắc ký lực với heparin 13 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1 Đối tượng nghiên cứu 15 2.2 Thiết bị, dụng cụ, hoá chất 15 Thiết bị, dụng cụ 15 Hoá chất, chất chuẩn 15 2.3 Nội dung nghiên cứu 15 2.4 Phương pháp nghiên cứu 16 Phương pháp chuẩn bị dung dịch chuẩn 16 Phương pháp thẩm định 16 Áp dụng phương pháp để phân tích hàm lượng LF mẫu thực 18 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 19 3.1 Xây dựng phương pháp 19 Lựa chọn điều kiện sắc ký 19 Khảo sát điều kiện xử lý mẫu 19 C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Thẩm định phương pháp 25 3.2 Phân tích mẫu thực tế 34 3.3 Bàn luận 34 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 36 4.1 Kết luận 36 4.2 Kiến nghị 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an DANH MỤC KÍ HIỆU VIẾT TẮT Từ viết tắt Tiếng Anh Association of Official AOAC Analytical Commodities Tiếng Việt Hiệp hội cộng đồng phân tích thức Concentration Nồng độ Capillary Electropherosis Sắc ký điện động mao Chromatography quản D Dilution Độ pha loãng DAD Diod Array Detector Detector mảng diod Enzyme-Linked Immune- Kỹ thuật xét nghiệm Sorbent Assay miễn dịch High Performance Liquid Sắc ký lỏng hiệu Chromatography cao LF Lactoferrin Lactoferrin LOD Limit Of Detection Giới hạn phát LOQ Limit Of Quantification Giới hạn định lượng M Mass Khối lượng SDS- Polyacrylamide - Sodium PAGE dodecyl sulphate V Volume C CEC ELISA HPLC Điện di gel Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn Thể tích C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1.1 Nồng độ LF dịch sinh học khác thể Bảng 1.2 Các phương pháp xác định hàm lượng Bảng 3.1 Hàm lượng LF thu sau chiết dung môi 22 Bảng 3.2 Kết khảo sát số lần chiết 24 Bảng 3.3 Đường chuẩn LF 27 Bảng 3.4 LOD, LOQ LF mẫu sữa bột Error! Bookmark not defined Bảng 3.5 Kết phân tích độ lặp lại sữa bột 28 Bảng 3.6 Kết độ tái lặp mẫu sữa bột 29 Bảng 3.7 Độ lặp lại độ tái lặp dựa vào thông số RSD% mẫu sữa bột mức nồng độ 30 Bảng 3.8 Kết phân tích độ thu hồi – sữa bột 32 Bảng 3.9 Độ thu hồi LF mẫu sữa bột 33 Bảng 3.10 Ứng dụng phân tích mẫu thực tế 34 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Hình minh hoạ tỷ lệ loại protein sữa Hình 1.2 Cấu trúc hố học LF Hình 1.3 Cơ chế kháng khuẩn LF Hình 1.4 Cơ chế chống lại virus LF Hình 1.5 Sơ đồ cấu trúc hệ thống HPLC 11 Hình 1.6 Cơ chế sắc ký lực 12 Hình 1.7 Tương tác protein heparin 13 Hình 3.1 Hình ảnh cảm quan dịch chiết loại dung mơi 21 Hình 3.2 Sơ đồ bước xử lý mẫu 25 Hình 3.3 Sắc ký đồ mẫu trắng, mẫu chuẩn, mẫu thử thêm chuẩn, mẫu thử 26 Hình 3.4 Sắc ký đồ độ lặp lại (1), độ tái lặp (2) độ tái lặp (3) 30 Hình 3.5 Sắc đồ thu hồi 33 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an ĐẶT VẤN ĐỀ Sữa mẹ nguồn dinh dưỡng tốt cho hầu hết trẻ sơ sinh Nhiều chứng sữa mẹ có chứa nhiều chất có hoạt tính sinh học giúp thay đổi chức đường tiêu hoá hệ thống miễn dịch phát triển trí não [9] Tuy khơng phải lúc trẻ sử dụng sữa mẹ, thị trường nhiều loại thực phẩm bổ sung dạng sữa, đời với mục đích thay sữa mẹ, có thành phần tương tự sữa mẹ Sữa mẹ bao gồm nhiều thành phần đường lactose, chất béo, protein khoáng chất [14].Trong thành phần khơng thể thiếu sữa mẹ phải kể đến nguồn protein dồi có nhóm whey protein đặc biệt, chiếm lượng nhỏ mặt tỷ lệ lactoferrin lại đóng vai trị quan trọng việc hoàn thiện hệ miễn dịch trẻ nhỏ [9,13].Các nghiên cứu gần tác dụng lactoferrin kháng khuẩn, điều hoà miễn dịch, giảm nguy ưng thư, kháng virus, chống oxi hố [29] Vì vây, lactoferrin ngày quan tâm phát triển, thực phẩm bổ sung có mặt lactoferrin mà ngày đa dạng Tuy nhiên việc kiểm soát chất lượng lactoferrin chưa đầy đủ hoàn chỉnh Hiện Việt Nam lại chưa có phương pháp phân tích xác định hàm lượng lactoferrin thực phẩm bổ sung Vì để góp phần vào tư liệu nghiên cứu tiến hành thực đề tài: “ Xây dựng thẩm định phương pháp xác định lactoferrin thực phẩm bổ sung phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao” với mục tiêu sau: Xây dựng thẩm định phương pháp định lượng lactoferrin thực phẩm bổ sung mẫu sữa bột có chứa lactoferrin Kiểm tra khả ứng dụng phương pháp để phân tích hàm lượng lacoferrin thực phẩm bổ sung thị trường Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan lactoferrin Giới thiệu whey protein Protein sữa có loại bao gồm whey chiếm 20% casein chiếm 80% tổng hàm lượng, có tác dụng làm giảm triệu chứng mệt mỏi mãn tính, kháng virus, tăng khả miễn dịch,…[15] Whey protein phức hợp protein gồm nhiều chất có hoạt tính sinh học α-lactalbumin (LA), glycomacropeptid, βlactoglobulin, lactoferrin (LF),…, chất có nhiều lợi ích cho sức khoẻ, chống lại dị ứng, ung thư, nhiễm trùng viêm Trong đó, lactalbumin LF chiếm khoảng 12% 1% [6] Tỷ lệ thành phần protein nhóm whey thể hình 1.1 [24] Hình 1.1 Hình minh hoạ tỷ lệ loại protein sữa Đặc tính lý hố whey protein: Whey protein có độ hồ tan tốt khoảng pH rộng (từ 2-9), đun nóng 70ºC 1-10 phút hồ tan tốt tối thiểu pH 4,5 [32] Tuy nhiên chúng hoà tan nhiều điều kiện acid mạnh kiềm mạnh giảm đến gần điểm đẳng điện pKi~4,5 dù mức nhiệt độ [29] Dựa vào khả hồ tan whey, dung mơi thường dùng nước Khả hydrat hoá whey protein ~ 0,45 – 0,52 (g nước/g protein) [32] Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Bảng 3.8 Độ thu hồi LF mẫu sữa bột Mẫu Nền thêm mẫu chuẩn Sữa bột Kết Mức yêu cầu % Kết % Mức Hàm lượng 1% 97-103 98,9 Mức Hàm lượng 0,1% 95-105 99,8 Mức Hàm lượng 0,01% 90-107 98,1 - luận 101,5 Đạt 102,6 Đạt 102,1 Đạt Kết luận: kết đạt theo yêu cầu AOAC độ Một số sắc đồ thu hồi thể hình 3.5 2.00 7.099 - 381310 1.00 0.50 0.00 5.00 10.00 15.00 Minutes 0.15 0.10 7.068 - 35623 0.00 AU AU 1.50 0.05 0.00 0.00 5.00 10.00 15.00 Minutes Hình 3.5 Sắc đồ thu hồi Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn 33 C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 3.2 Phân tích mẫu thực tế Kết phân tích LF số mẫu thực phẩm bổ sung thị trường Hà Nội thể bảng 3.10 Bảng 3.9 Ứng dụng phân tích mẫu thực tế Nền mẫu Hàm lượng (mg/100g) Công bố (mg/100g) Hàm lượng so với công bố (%) SB_1 13,6 15 90,7 SB_2 83,9 113 74,3 SB_3 16,3 10 163 SB_4 15,3 20 76,5 SB_5 12,4 15 82,7 3.3 Bàn luận Sau tiến hành xây dựng thẩm định phương pháp xác định LF thực phẩm bổ sung sắc ký lỏng hiêụ cao sử dụng cột heparin detetor DAD, nhóm nghiên cứu có số nhận xét đề tài: - Việc lựa chọn phương pháp HPLC với detector DAD gặp khó khăn với mẫu phức tạp độ đặc hiệu ko cao LCMS Nên yêu cầu phải xử lý mẫu thật tốt Các nghiên cứu trước kết hợp việc sử dụng cột heparin với vai trò làm mẫu cột phân tách C4 cho thấy độ đặc hiệu cao, nhiên việc sử dung cột C4 ko cần thiết phân tách LF với cột heparin nên để tăng tính ứng dụng nghiên cứu, nhóm nghiên cứu lựa chọn việc sử dụng cột heparin với vai trò vừa làm phân tích LF đề tài - Dung mơi chiết: Các dung môi acid acetic, acid clohydric sử dụng rộng rãi để loại bỏ casein thực phẩm bổ sung dang sữa Trong nghiên cứu lựa chọn chiết acid acetic 1%, lắc ngang 1h ly tâm phút Dịch chiết sau ly tâm loại nhiều casein 34 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an giữ nhiều hoạt chất nên nhóm nghiên cứu lựa chọn acid acetic 1% làm dung môi chiết mẫu - Số lần chiết: Chiết lần, thu hàm lượng LF cao nhất, nhiên lượng LF cao không đáng kể, đồng thời làm tăng thời gian xử lý mẫu Do lựa chọn lần vừa tiết kiệm thời gian xử lý mẫu mà hiệu suất chiết cao - Kết xây dựng phương pháp thẩm định cho thấy quy trình xử lý mẫu đơn giản, rẻ tiền, phương pháp có độ tin cậy cao với thơng số thẩm định phù hợp với yêu cầu cuả AOAC đặc biêt khoảng xác định rộng LOD nhỏ Ngoài đề tài chứng minh khả làm phân tách đặc hiệu LF cột heparin - Tuy nhiên, đề tài dừng lại việc tiến hành phân tích mẫu sữa bột, mẫu khác sữa lỏng, sữa chua, phô mai,… chưa tiến hành Và cột heparin đặc hiệu với LF nên khơng thể áp dụng để phân tích đồng thời protein khác có thực phẩm bổ sung Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn 35 C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Đề tài “ Xác định lactoferrin thực phẩm bổ sung sắc ký lỏng hiệu cao” thực mục tiêu đề thu kết sau: - Đã khảo sát phương pháp xác định hàm lượng LF thực phẩm bổ sung HPLC cách trực tiếp với điều kiện xử lý mẫu sắc ký cụ thể: • Xử lý mẫu: Mẫu chiết lần acid acetic % • Cột làm phân tích cột heparin • Pha động đệm A: Na2HPO4 0,2M ( pH=8); B: Na2HPO4 0,05M NaCl 1M (pH=8) • Nhiệt độ cột: 25ºC • Th tớch tiờm: 10 àl ã Tc dũng: ml/phút • Detector DAD • Bước sóng làm việc: 220 nm • Thời gian phân tích: 15 phút - Phương pháp xây dựng thẩm định, kết tiêu đạt theo hướng dẫn AOAC 2016 - Đã áp dụng phương pháp xác định hàm lượng LF thực phẩm bổ sung thị trường, cho thấy phương pháp khả thi ứng dụng chế phẩm 4.2 Kiến nghị Hướng tiếp cận sử dụng cột heparin để xác định hàm lượng LF cho thấy tiềm việc làm mẫu sữa nhiều thành phần Tuy nhiên nghiên cứu dừng lại phân tích mẫu sữa bột Bên cạnh đó, cịn nhiều dạng khác mẫu sữa lỏng, sữa chua, thực phẩm bổ sung LF khác,… cần tiếp tục khảo sát hồn thiện, từ xây dựng phương pháp hoàn chỉnh để xác định đồng thời tất dạng bào chế, chế phẩm chứa LF thị trường Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn 36 C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Trần Tử An, Thái Nguyễn Hùng Thu (2012), Hoá phân tích tập II, NXB Y học, Hà Nội, tr.123-203 Phạm Luận (2014), Phương pháp phân tích sắc ký chiết tách, NXB Bách khoa Hà Nội, Hà Nội Viện kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia (2010), Thẩm định phương pháp phân tích hố học vi sinh vật, NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội Nước Ngoài Adlerova L., Bartoskova A., Faldyna M (2008), “Lactoferrin: A Review” Veterinarni Medicina, 53(9), pp.457-468 Antonio I., Valeria B., Luana L., Roberta C., Carmine F., Giuseppe N., Francesco C., Michele C., Vincenzo A., Giovanni T (2016), “Immunoexpression of lactoferrin in triple-negative breast cancer patients: A proposal to select a less aggressive subgroup”, Oncology letters, 13(5), pp.32053209 Arashdeep S., Rizaldy C.Z., Adel P.,Cameron G.K., Ursula I.T., Prasanth K.C (2019), “Whey Protein and Its Components Lactalbumin and Lactoferrin Affect Energy Balance and Protect against Stroke Onset and Renal Damage in SaltLoaded, High-Fat Fed Male Spontaneously Hypertensive Stroke-Prone Rats”, The journal of Nutrition, 150(4), pp.763-774 Association of Official Analytical Chemists (2002), AOAC Guidelines for Single Laboratory Validation of Chemical Methods for Dietary Supplements and Botanicals Association of Official Analytical Chemists (2016), Guidelines for Standard Method Performance Requirements, AOAC Official Methods of Analysis Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Camilia R.M., Pei-Ra L., George L.B (2016), “Review of Infant Feeding: Key Features of Breast Milk and Infant Formula”, Nutrients, 8(5), pp.279 10 Chang Y.Y., Li H., Sun H., Sun (2017), “Immobilized Metal Affinity Chromatography (IMAC) for Metalloproteomics and Phosphoproteomics”, The University of Hong Kong, pp.329-353 11 European medicines agency (2011), Guideline on bioanalytical method validation, Europe 12 Franck P., Sylvie R (2014), “Heparin protein interactions From affinity and kinetics to biological roles Application to an interaction network regulating angiogenesis”, Matrix Biology, 35, pp.73-81 13 Geoffrey W.K.P (2007), “Emerging health properties of Whey protein and their clinical implication”, Journal of the american college of nutrition, 26(6), pp.713-723 14 Hajirostamloo B (2010), “Bioactive Component In Milk And Dairy Product”, Engineering and Technology International Journal of Agricultural and Biosystems Engineering, 4(12), pp.162-166 15 Hermant H.G., Mayur A.C., Pooja S.P., Nayana S.B (2011), “Whey Protein”, Research Journal, 1(2), pp.69 16 Hitoshi S., Mitsunori T.,Yoshitaka T., Seiichi S., Mamoru T (1994), “Physicochemical And Anibacterial Properties Of Lactoferrin And Its Hydrolylase Produced By Heat Treatment At Acidic pH”,Experimental medicine and biology, 357, pp.219-226 17 Hodgkinson A.J., Ross K.M, Fahey S.N., Prosser C.G (2008), “Quantification of lactoferrin in milk from New Zealand dairy goats” Proceedings of the New Zealand Society of Animal Production, 68, pp.166-169 18 International Council for Harmonisation (1996), ICH Hamonised Tripartite Guideline Validation of Analytical Procedures: Text and methodology, European Medicines Agency 19 Ishan C.D., Robert J.L.P (2002), “Heparin–Protein Interactions”, Angewandte Chemie International Edition, 41(3), pp.390-412 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 20 Isui AG.M., Tania S.C., Sigifredo A.G., Quintin R.C (2011), “Lactoferrin a multiple bioactive protein: An Overview”, Biochimica et Biophysica Acta, 1820(3), pp.226-36 21 Jacques L.V.S., Pierre L.M., Joseph F.H (1974), “The Involment Of Lactoferrin In The Hyposideremia Of Acute Inflamation”, Journal of experimental medicine, 140(4), pp.1068-1084 22 Jeffrey S.W., Guoyan L.,Atul V., Karel P., Mark S., Daqing L., Julina O., Xiaoy Z., Rodney J.T., Scott E.S., Bert W O.J (2008), “Oral Lactoferrin Results in T Cell–Dependent Tumor Inhibition of Head and Neck Squamous Cell Carcinoma In vivo”, Clinical cancer research, 13(5), pp.1601–1610 23 Jia L., Xiaojing D., Yongyan C., Baohua S., Shan Z., Zhi W (2012), “Determination of bovine lactoferrin in infant formula by capillary electrophoresis with ultraviolet detection”, Journal of Chromatography A, 1244, pp.178–183 24 Korhonen H., Marnila P (2011), “Milk Protein”, Academic press, pp.801-806 25 Levay P.F., Viljoen M (1995), “Lactoferrin: a general review” Haematologica, 80(3), pp.252-67 26 Lucilla S., Assunta M.D.B., Magda M., Agostina , Pietrantoni, Antonella T., Fabiana S (2004), et al., “Antiviral activity of lactoferrin towards naked viruses”, Biometals, 17(3), pp.295-299 27 Ministere de l'enviroment et de la lutte contre les changement climatiques (2021), Programme d’accreditation des laboratories d’analyse, Votre gourvenement, Québec 28 National Center for Biotechnology information, “Lactoferrin”, PubChem Compound Summary for CID=126456119 29 Pelegrine D.H.G., Gasparetto C.A (2005), “Whey proteins solubility as function of temperature and pH”, LWT-Food Science and Technology, 38(1), pp.77-80 30 Sanchez L., Calvo M., Brock J.H (1992), “Biological role of lactoferrin”, Archives of disease in childhood, 67(5), pp.657-661 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 31 Sheng X., Ling Z., Qing.Y.H (2008), “Fractionation of Proteins by Heparin Chromatography”, Methods in Molecular Biology, 1, pp.213-221 32 Srinivasan D., Kirk L.P., Owen R.F (1996), Fennema's Food Chemistry, CRC Press 33 Susana A.G.C., Sigifredo A.G., Quintín R (2008), “Lactoferrin: structure, function nd applications”, Journal of Antimicrob Agent, 33(4), pp 301.e1-8 34 Weinberg E.D (1984), “Iron withholding: a defense against infection and Neoplasia”, Physiological Review, 64(1), pp.65-102 35 Yafei L., Xuewan W., Mianbin W., Wanping Z (2011), “Simultaneous Isolation of Lactoferrin and Lactoperoxidase from Bovine Colostrum by SPEC 70 SLS Cation Exchange Resin”, Enviromenal Research and Pblic Health, 8(9), pp.3764–3776 36 Yin Z., Fei L , Wei W., Xin D., Jia R., Qiuguang S (2017), “Determination of Bovine Lactoferrin in Food by HPLC with a Heparin Affinity Column for Sample Preparation”, Journal of AOAC International, 100(1), pp.133-138 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an PHỤ LỤC Phụ lục Sắc ký đồ khảo sát dung môi chiết Phụ lục Sắc ký đồ khảo sát số lần chiết Phụ lục Sắc ký đồ đường chuẩn Phụ lục Sắc ký đồ độ lặp lại Phụ lục Sắc ký đồ độ Phụ lục Sắc ký đồ khảo sát dung môi chiết Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Phụ lục Sắc ký đồ khảo sát số lần chiết Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Phụ lục Sắc ký đồ đường chuẩn Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Phụ lục 4.Sắc ký đồ độ lặp lại 1.50 7.100 - 389936 0.50 AU AU 7.104 - 387494 1.00 1.00 0.50 0.00 0.00 0.00 5.00 10.00 15.00 0.00 5.00 Minutes 10.00 15.00 10.00 15.00 Minutes p 1.50 1.20 1.00 7.088 - 141614 0.50 0.80 AU AU 7.095 - 379944 1.00 0.60 0.40 0.20 0.00 0.00 0.00 5.00 10.00 15.00 0.00 5.00 Minutes Minutes 1.20 2.00 1.00 1.50 0.40 7.092 - 148390 0.60 AU 7.092 - 143837 AU 0.80 1.00 0.50 0.20 0.00 0.00 0.00 5.00 10.00 15.00 0.00 5.00 Minutes 10.00 Minutes Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn 15.00 C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn