Nguyễn văn tuấn ứng dụng phương pháp tối ưu hóa đa đối tượng trong thiết kế hợp chất tiềm năng kháng hiv hướng ức chế enzym phiên mã ngược không phải nucleoside khóa luận tốt nghiệp dược sĩ

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN VĂN TUẤN ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP TỐI ƯU HÓA ĐA ĐỐI TƯỢNG TRONG THIẾT KẾ HỢP CHẤT TIỀM NĂNG KHÁNG HIV HƯỚNG ỨC CHẾ ENZYM PHIÊN MÃ NGƯỢC KHÔNG PHẢI NUCLEOSIDE KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI 2023 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN VĂN TUẤN 1801741 ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP TỐI ƯU HÓA ĐA ĐỐI TƯỢNG TRONG THIẾT KẾ HỢP CHẤT TIỀM NĂNG KHÁNG HIV HƯỚNG ỨC CHẾ ENZYM PHIÊN MÃ NGƯỢC KHÔNG PHẢI NUCLEOSIDE KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: PGS.TS Phạm Thế Hải Nơi thực hiện: Bộ mơn Hóa dược HÀ NỘI 2023 LỜI CẢM ƠN Để hồn thành khóa luận tốt nghiệp này, trước hết xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy cô trường Đại học Dược Hà Nội nói chung, thầy Bộ mơn Hóa dược nói riêng dạy dỗ cho kiến thức môn đại cương môn chuyên ngành, giúp tơi có sở lý thuyết vững vàng tạo điều kiện giúp đỡ tơi suốt q trình thực khóa luận tốt nghiệp Đặc biệt, tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành dạy, hướng dẫn tận tình PGS.TS Phạm Thế Hải, giảng viên Bộ mơn Hóa dược, Trường Đại học Dược Hà Nội suốt thời gian thực khóa luận Thầy người truyền cảm hứng khoa học cho tơi, mà thấy cịn dạy cho tơi kiến thức sâu rộng phương pháp làm việc đầy hiệu quả, đưa lời khuyên hữu ích với định hướng phát triển thân làm nghiên cứu khoa học Mặc dù trình làm khóa luận tơi cố gắng nhiên khơng tránh khỏi thiếu sót Tơi hy vọng nhận ý kiến nhận xét, góp ý thầy cô giáo vấn đề triển khai báo cáo khóa luận tốt nghiệp tơi hồn thiện giúp tơi có thêm kinh nghiệm q báu Cuối cùng, tơi xin kính chúc thầy cô giảng viên trường Đại học Dược Hà Nội nói chung, thầy Bộ mơn Hóa dược nói riêng ln ln dồi sức khỏe thành công nghiệp giảng dạy cao quý Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2023 Sinh viên thực Nguyễn Văn Tuấn MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN Tổng quan virus HIV .2 1.1 Sự phát virus HIV 1.2 Quá trình nhân lên virus HIV tế bào chủ 1.3 Tổng quan enzym phiên mã ngược (RT) 1.4 Các loại thuốc ức chế HIV-1 RT nucleoside (NNRTI) Tổng quan phương pháp tối ưu hóa đa đối tượng (MOOP) CHƯƠNG DỮ LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Dữ liệu Phương pháp nghiên cứu 10 2.1 Xây dựng mơ hình dự đốn 10 2.2 Lựa chọn hàm desirability 11 2.3 Thuật toán xếp hạng 13 2.4 Đánh giá thuật tốn xếp hạng tính số chất lượng xếp hạng (Ψ) 14 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 17 Kết xây dựng mô hình dự đốn 17 Kết tối ưu hóa đa đối tượng xếp hạng 22 Bàn luận .32 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .35 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT AIDS Acquired Immuno Deficiency Syndrom – Hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải CC50 Nồng độ gây chết 50% tế bào HIV Human Immunodeficiency Virus – Virus gây suy giảm miễn dịch người HIV-1 Human Immunodeficiency Virus type – Virus gây suy giảm miễn dịch người type IC50 Nồng độ ức chế 50% (thường dùng với chất ức chế enzym) MLR Multiple linear regression – Hồi quy tuyến tính đa biến MOOP Multiobjective optimization – Tối ưu hóa đa đối tượng NF-kB Nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B - Yếu tố hạt nhân tăng cường chuỗi nhẹ kappa tế bào B hoạt hóa NFAT Nuclear factor of activated T-cells – Yếu tố hạt nhân tế bào T hoạt hóa NNRTI Non-nucleoside reverse transcriptase inhibitor – Chất ức chế enzym phiên mã ngược nucleoside NRTI Nucleoside reverse transcriptase inhibitor – Chất ức chế enzym phiên mã ngược nucleoside PI Protease inhibitor – Chất ức chế enzym protease PIC Pre-integration complex – Phức hợp tiền tích hợp RT Reverse transcriptase – Enzym phiên mã ngược DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1: Thứ hạng thực tế, thứ hạng theo thuật toán xếp hạng thứ hạng tệ .15 Bảng 2: Ý nghĩa phân loại tham số phân tử sử dụng để xây dựng mơ hình dự đốn 21 Bảng 3: Giá trị thực nghiệm giá trị dự đốn đặc tính giá trị mong muốn D tổng thể .23 Bảng 4: Giá trị tối ưu tham số phân tử 26 Bảng 5: Giá trị trọng số tối ưu cho tham số phân tử 27 Bảng 6: Khoảng cách euclid, khoảng cách euclid chuẩn hóa thứ hạng chuẩn hóa chất xếp hạng so với chất lý tưởng 27 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1: Cấu trúc “giống bàn tay” enzym reverse transcriptase (PDB ID: 1T05) .5 Hình 2: Các thuốc kháng HIV NNRTI FDA phê duyệt .6 Hình 3: Mục tiêu phương pháp tối ưu hóa đa mục tiêu: tìm chất có kết hợp tốt đặc tính quan trọng như: Hoạt lực, sinh khả dụng độc tính Hình 4: Cấu trúc nhóm chất ức chế HIV-1 RT chính: HEPT, DATA, DABO ATC Hình 5: Phạm vi ứng dụng mơ hình -LogIC50 .18 Hình 6: Phạm vi ứng dụng mơ hình -LogCC50 18 Hình 7: Kết kiểm định số giả thiết mơ hình hồi quy MLR 20 Hình 8: Xếp hạng thực tế (OT) xếp hạng theo thuật toán xếp hạng (OR) danh sách chất tham gia xếp hạng 31 Hình 9: Xếp hạng thực tế (OT) xếp hạng theo thuật toán xếp hạng (OR) chất tốt 31 Hình 10: chất xếp hạng tốt dựa liệu thực nghiệm 33 ĐẶT VẤN ĐỀ Theo số liệu UNAIDS tính đến cuối năm 2021, Thế giới có khoảng 38,4 triệu người nhiễm HIV Trong năm 2021, tồn giới có 1,5 triệu người nhiễm HIV 650 ngàn người tử vong liên quan đến AIDS Hiện việc điều trị HIV/AIDS điều trị triệu chứng kéo dài thời gian sống cho người bệnh Các thuốc chống HIV phân loại thành nhóm thuốc: thuốc ức chế enzym chép ngược nucleoside (NRTI), thuốc ức chế enzym chép ngược nucleoside (NNRTI), thuốc ức chế protease (PI), thuốc ức chế integrase thuốc ức chế xâm nhập [3] Trong đó, thuốc ức chế enzym chép ngược (RT) nucleoside lên nhóm thuốc tiềm ứng dụng điều trị có độc tính thấp so với nhóm thuốc khác Song nhóm thuốc có nhược điểm lớn điều trị dài ngày khả kháng thuốc virus Các đột biến nhỏ vị trí liên kết NNRTI khơng ảnh hưởng đến chức enzym, song làm giảm lực liên kết nhiều NNRTI với enzym, dẫn đến giảm tác dụng thuốc Kháng thuốc thường xuất nhanh chóng NNRTI dùng đơn trị liệu trường hợp ức chế virus không hoàn toàn, cho thấy kháng thuốc chọn lọc quần thể virus đột biến tồn từ trước cá thể [11] Thực trạng khiến cho việc nghiên cứu phát triển NNRTI gặp nhiều khó khan thách thức Các phương pháp sàng lọc, nghiên cứu phát triển thuốc truyền thống thường tối ưu đặc tính sinh học chất, dẫn đến chu kì thử sai tiêu tốn nhiều thời gian chi phí Thay vào đó, phương pháp sàng lọc cách tối ưu đồng thời nhiều đối tượng đem lại hiệu cao Vì tơi thực đề tài “Ứng dụng phương pháp tối ưu hóa đa đối tượng thiết kế hợp chất tiềm kháng HIV hướng ức chế enzym phiên mã ngược nucleoside” với mục tiêu sau: - Xây dựng mơ hình liên quan cấu trúc – tác dụng dự đoán khả ức chế enzym phiên mã ngược RT độc tính tế bào máu MT4 Xây dựng mơ hình tối ưu hóa đồng thời khả ức chế enzym phiên mã ngược RT độc tính tế bào máu MT4 Xếp hạng danh sách hợp chất NNRTI có tiềm phát triển thành thuốc kháng virus HIV CHƯƠNG TỔNG QUAN Tổng quan virus HIV 1.1 Sự phát virus HIV Hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải (AIDS) lần công nhận bệnh vào năm 1981 ngày có nhiều người mắc bệnh nhiễm trùng hội bất thường bệnh ác tính gặp Một loại retrovirus, gọi virus gây suy giảm miễn dịch người type (HIV-1), sau xác định tác nhân gây bệnh mà từ trở thành bệnh truyền nhiễm nguy hiểm xuất lịch sử gần Kể từ lần xác định cách gần ba thập kỷ, đại dịch HIV lây nhiễm cho 60 triệu người khiến 25 triệu người tử vong Các nước phát triển có tỷ lệ mắc bệnh tử vong HIV/AIDS lớn nhất, với tỷ lệ nhiễm cao ghi nhận người trưởng thành trẻ tuổi châu Phi cận Sahara (http://www.unaids.org/) Mặc dù điều trị thuốc kháng virus làm giảm số ca tử vong liên quan đến AIDS, việc tiếp cận với liệu pháp điều trị chưa phổ biến triển vọng phương pháp điều trị khỏi bệnh hoàn toàn hiệu vaccin khơng chắn Do đó, AIDS tiếp tục mối đe dọa nghiêm trọng sức khỏe cộng đồng nhiều thập kỷ tới [15] 1.2 Quá trình nhân lên virus HIV tế bào chủ Quá trình chép HIV-1 tương tự retrovirus khác, liên quan đến trình phiên mã ngược gen ARN virus để tạo thành sợi trung gian ADN sợi kép, tích hợp ổn định vào ADN nhiễm sắc thể, tạo tiền virus Trình tự gen HIV-1 diện suốt thời gian tồn tế bào Các bước chép ban đầu dẫn đến việc thiết lập lây nhiễm tế bào đích, virus khơng hoạt động số loại tế bào cần kích hoạt để biểu gen virus Giai đoạn cuối trình chép bao gồm phiên mã xử lý ARN virus, dịch mã biến đổi protein virus, đồng thời giải phóng virion hệ cách nảy chồi qua màng sinh chất tế bào chủ Gắn xâm nhập Sự xâm nhập HIV-1 vào tế bào đích thơng qua hợp vỏ virus với màng tế bào đích Bước xâm nhập liên quan đến gắn kết có lực cao glycoprotein gp120 vỏ bề mặt với thụ thể tế bào CD4 diện bề mặt phân nhóm tế bào lympho T hỗ trợ đại thực bào đơn nhân [19] Điều dẫn đến thay đổi hình dạng gp120 xuất yếu tố định kháng nguyên (epitope) cho phép tương tác với đồng thụ thể (co-recepter) Các đồng thụ thể CCR5 (trên tế bào lympho T) CXCR4 (trên đại thực bào) [1] Một loạt quy trình xảy sau đó, bao gồm việc chèn peptit dung hợp đầu tận N gp41 vào màng tế bào đích, đưa màng tế bào virus lại gần để xảy dung hợp Sau dung hợp với màng tế bào vật chủ, lõi capsid virus giải phóng vào tế bào chất tế bào chủ [5] Lõi capsid virus chứa thành phần thiết yếu virus, bao gồm enzym reverse transcriptase (RT), protease (PR) intergrase (IN) với sợi đơn ARN Phiên mã ngược Sau trình dung hợp hồn tất, thơng tin di truyền virus xâm nhập vào tế bào Bộ gen HIV bao gồm hai ARN mạch đơn bảo vệ nucleocapsid Sau dung hợp, ARN sợi đơn virus phiên mã thành ADN sợi kép trình gọi phiên mã ngược (reverse transcript) Nó gọi phiên mã ngược đảo ngược thứ tự trình diễn q trình phiên mã thơng thường, tức là, tạo ARN thơng tin từ ADN nhân, sau xuất vào tế bào chất tổng hợp protein Nó thực enzym gọi enzym phiên mã ngược (reverse transcriptase) [9] Tháo vỏ xâm nhập vào nhân Tháo vỏ trình tháo rời vỏ capsid virus trước xâm nhập gen virus vào nhân Các nghiên cứu ban đầu cho thấy tháo vỏ xảy sau vi-rút xâm nhập Tuy nhiên liệu gần gợi ý capsid nguyên vẹn vài ổn định quan trọng lây nhiễm HIV-1 Hơn nữa, dường việc tháo vỏ có liên quan chặt chẽ với chép ngược kèm với trình chuyển đổi phức hợp chép ngược (reverse transcription complex - RTC) thành phức hợp tiền tích hợp (pre-integration complex - PIC) có khả tích hợp vào gen tế bào chủ [18] Tuy nhiên, thời điểm xác việc loại bỏ lớp vỏ chưa hiểu rõ đối tượng cho nghiên cứu chuyên sâu Các PIC HIV-1 phải vận chuyển tích cực qua lỗ nhân chúng q lớn để vượt qua chúng cách khuếch tán thụ động Các nghiên cứu gần cho thấy protein capsid HIV-1 đóng vai trị quan trọng q trình này, chế chưa nghiên cứu rõ ràng Tích hợp vào nhân tế bào chủ Sau phiên mã ngược thành công ADN vận chuyển qua màng nhân, HIV phải chèn gen vào gen tế bào chủ để biểu gen sản xuất sản phẩm virus Sau ADN virus đưa vào ADN tế bào loại Quá trình nghiên cứu tiến hành máy tính nên tiết kiệm chi phí thời gian nguồn lực Chất số 19 Chất số 16 Chất số Chất số 11 Chất số 12 Chất số Chất số 13 Chất số 15 Hình 10: chất xếp hạng tốt dựa liệu thực nghiệm Nhược điểm phương pháp nghiên cứu Nghiên cứu có sử dụng nhiều phần mềm khác nên thuật toán thơng số khơng thống Dữ liệu thu thập từ nghiên cứu khác nhau, tác giả khác tiến hành theo phương pháp khác nên dễ dẫn đến sai lệch 33 Các tham số phân tử lựa chọn khó giải thích khó mơ tả cấu trúc, dẫn tới khó thiết kế cấu trúc chất tối ưu Có thể khắc phục cách sử dụng tham số phân tử mô tả cấu trúc 2D nhiên số lượng tham số phân tử nhỏ gây giảm độ xác mơ hình nên phương pháp không lựa chọn nghiên cứu 34 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Từ kết nghiên cứu trên, xin đưa kết luận sau: - Xây dựng thành cơng mơ hình liên quan cấu trúc – tác dụng dự đoán khả ức chế enzym phiên mã ngược RT độc tính tế bào máu MT4 Mơ hình dự đốn khả ức chế enzym phiên mã ngược RT: -LogIC50 = 10,1619 + 0,3790 x AlogP + 0,0915 x AATSC7m - 4,9407 x MATS5m - 4,3088 x MATS7v + 1,8189 x MATS8e - 4,9299 x SpMax7_Bhm + 7,3773 x SpMin7_Bhi - 2,5024 x SpMin4_Bhs + 1,4266 x MDEN-12 Mơ hình dự đốn độc tính tế bào máu MT4: -LogCC50 = - 4,4381 + 0,0002 x ATSC7m - 1,1633 x MATS5e + 0,8199 x GATS8v + 1,6232 x GATS4p - 0,6637 x SHBd + 0,0731 x StsC - 0,2280 x minsssN + 0,1591 x nAtomLAC + 0,6096 x MDEC-11 - Xây dựng thành cơng mơ hình tối ưu hóa đồng thời khả ức chế enzym phiên mã ngược RT độc tính tế bào máu MT4 - Xếp hạng thành cơng danh sách NNRTI có tiềm làm thuốc, xếp hạng 10% NNRTI có tiềm làm thuốc với độ xác cao KIẾN NGHỊ Để tiếp tục phát triển kết nghiên cứu khóa luận thiết kế, sàng lọc NNRTI, đề xuất thực phương pháp sau: - Nâng quy mô liệu sàng lọc - Tiến hành phương pháp thử hoạt tính in silico khác: Docking, MD… - Tiến hành thử nghiệm sinh học in vitro, in vivo với hoạt chất sàng lọc 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO Chan D.C., Kim P.S (1998), "HIV entry and its inhibition", Cell, 93(5), pp.6814 Cruz-Monteagudo M., Cordeiro M.N., Tejera E., Dominguez E.R., Borges F (2012), "Desirability-based multi-objective QSAR in drug discovery", Mini Rev Med Chem, 12(10), pp.920-35 De Clercq E., Li G (2016), "Approved Antiviral Drugs over the Past 50 Years", Clin Microbiol Rev, 29(3), pp.695-747 Derringer G., Suich R (1980), "Simultaneous Optimization of Several Response Variables", Journal of Quality Technology, 12(4), pp.214-219 Ferguson M.R., Rojo D.R., von Lindern J.J., O'Brien W.A (2002), "HIV-1 replication cycle", Clin Lab Med, 22(3), pp.611-35 Ji L., Chen F.E., De Clercq E., Balzarini J., Pannecouque C (2007), "Synthesis and anti-HIV-1 activity evaluation of 5-alkyl-2-alkylthio-6-(arylcarbonyl or alpha-cyanoarylmethyl)-3,4-dihydropyrimidin-4(3H)-ones as novel nonnucleoside HIV-1 reverse transcriptase inhibitors", J Med Chem, 50(8), pp.177886 Jorgensen W.L (2004), "The many roles of computation in drug discovery", Science, 303(5665), pp.1813-8 Karn J (1991), "Control of human immunodeficiency virus replication by the tat, rev, nef and protease genes", Curr Opin Immunol, 3(4), pp.526-36 10 11 12 13 Kirchhoff F (2021), "HIV Life Cycle: Overview", Encyclopedia of AIDS, Hope Thomas J., Stevenson Mario,Richman Douglas, Springer New York, New York, NY, pp.1-9 Le Grice S.F., Naas T., Wohlgensinger B., Schatz O (1991), "Subunit-selective mutagenesis indicates minimal polymerase activity in heterodimer-associated p51 HIV-1 reverse transcriptase", Embo j, 10(12), pp.3905-11 Mackie N (2006), "Resistance to non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors", Antiretroviral Resistance in Clinical Practice, Geretti A M., London, pp.102-109 Monforte A.M., Rao A., Logoteta P., Ferro S., De Luca L., Barreca M.L., Iraci N., Maga G., De Clercq E., Pannecouque C., Chimirri A (2008), "Novel N1substituted 1,3-dihydro-2H-benzimidazol-2-ones as potent non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors", Bioorg Med Chem, 16(15), pp.7429-35 Niazi A., Leardi R (2012), "Genetic algorithms in chemometrics", Journal of Chemometrics, 26(6), pp.345-351 14 Nicolaou C.A., Brown N., Pattichis C.S (2007), "Molecular optimization using computational multi-objective methods", Curr Opin Drug Discov Devel, 10(3), pp.316-24 15 16 Sharp P.M., Hahn B.H (2011), "Origins of HIV and the AIDS pandemic", Cold Spring Harb Perspect Med, 1(1), pp.a006841 Singh A.K., Das K (2022), "Insights into HIV-1 Reverse Transcriptase (RT) 17 Inhibition and Drug Resistance from Thirty Years of Structural Studies", Viruses, 14(5), pp.1027 Spallarossa A., Cesarini S., Ranise A., Schenone S., Bruno O., Borassi A., La Colla P., Pezzullo M., Sanna G., Collu G., Secci B., Loddo R (2009), "Parallel synthesis, molecular modelling and further structure-activity relationship studies 18 19 20 21 22 of new acylthiocarbamates as potent non-nucleoside HIV-1 reverse transcriptase inhibitors", Eur J Med Chem, 44(5), pp.2190-201 Trivedi J., Tripathi A., Chattopadhyay D., Mitra D (2019), "Chapter 11 - PlantDerived Molecules in Managing HIV Infection", New Look to Phytomedicine, Ahmad Khan Mohd Sajjad, Ahmad Iqbal,Chattopadhyay Debprasad, Academic Press, pp.273-298 Wang W.K., Chen M.Y., Chuang C.Y., Jeang K.T., Huang L.M (2000), "Molecular biology of human immunodeficiency virus type 1", J Microbiol Immunol Infect, 33(3), pp.131-40 Watson I., Marir F (1994), "Case-based reasoning: A review", The Knowledge Engineering Review, 9(4), pp.327-354 Wensing A.M., Calvez V., Ceccherini-Silberstein F., Charpentier C., Gunthard H.F., Paredes R., Shafer R.W., Richman D.D (2019), "2019 update of the drug resistance mutations in HIV-1", Top Antivir Med, 27(3), pp.111-121 Zhuang C., Pannecouque C., De Clercq E., Chen F (2020), "Development of non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors (NNRTIs): our past twenty years", Acta Pharm Sin B, 10(6), pp.961-978 PHỤ LỤC Bảng 1: Danh sách chất liệu thực nghiệm STT Công thức IC50 CC50 STT 5.06 405 5.37 Công thức IC50 CC50 0.06 237 529 0.26 250 0.02 60 10 0.09 42.23 0.19 30.33 11 0.16 74.4 0.11 39.07 12 1.07 41.54 2.70 29.46 13 0.28 193.9 0.09 196.9 14 0.01 143.2 15 0.01 133 23 4.50 40.4 16 0.11 187.9 24 4.20 91 17 0.02 92.83 25 4.00 43 18 0.01 170.6 26 4.30 102 19 0.03 32.15 27 7.70 66.6 20 0.08 243 28 10.30 133 21 0.06 256.3 29 11.60 43 22 58.00 111 30 8.80 43 31 8.40 82 37 0.01 41 32 8.60 125.2 38 0.01 18 33 1.40 122.4 39 0.01 18 34 6.00 63 40 0.01 168 35 1.20 53 41 0.66 53.19 36 0.38 100 42 0.80 49.39 43 2.70 46.09 49 1.17 122.3 44 0.09 163.86 50 0.18 51.88 45 4.71 148.32 51 4.85 47.99 46 0.00 10.81 52 1.25 24.52 47 6.34 58.95 53 0.64 58.02 48 7.28 53.81 54 1.33 34.19 55 2.22 23.46 60 27.84 196.5 56 1.34 7.32 61 6.79 178.9 57 3.53 26.79 62 0.46 39.6 58 37.58 241.6 63 0.5 38.78 59 2.05 263.1 64 0.21 28.73 65 0.057 33.2 69 1.86 37.11 66 0.65 35.58 70 0.83 32.57 67 0.38 32.75 71 2.96 32.57 68 0.063 35.3 72 0.092 30.96 73 12.53 171.92 78 22.02 210.0 74 0.11 32.82 79 3.37 42.19 75 0.067 30.23 80 0.65 154.5 76 2.77 31.4 81 2.65 36.3 77 0.23 77.07 82 0.83 187.3 83 0.47 50.13 88 22.66 192.9 84 0.065 34.19 89 0.73 207.7 85 25.99 180.48 90 1.63 181.6 86 7.06 195.23 91 0.26 134.4 87 8.78 155.47 92 0.02 244.0 93 6.00 103.00 99 4.69 60.37 94 8.00 122.00 100 10.87 24.69 95 7.60 80.00 101 0.18 52.50 96 4.00 70.70 102 0.15 38.40 97 1.30 51.50 103 0.48 34.28 98 16.94 210.37 104 0.51 38.40 105 0.25 29.60 108 4.69 59.58 106 7.37 36.12 109 0.10 43.89 107 0.21 31.47