Nghiên cứu biến tính bề mặt nano silica làm chất mang thuốc chống ung thư

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Võ Uyên Vy NGHIÊN CỨU BIẾN TÍNH BỀ MẶT NANO SILICA LÀM CHẤT MANG THUỐC CHỐNG UNG THƯ LUẬN ÁN TIẾN SỸ KHOA HỌC VẬT LIỆU Hà Nội – Năm 2022 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Võ Uyên Vy TÊN ĐỀ TÀI LUẬN ÁN NGHIÊN CỨU BIẾN TÍNH BỀ MẶT NANO SILICA LÀM CHẤT MANG THUỐC CHỐNG UNG THƯ Chuyên ngành: Vật liệu Cao phân tử Tổ hợp Mã số:9440125 LUẬN ÁN TIẾN SỸ KHOA HỌC VẬT LIỆU NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: GS TS NGUYỄN CỬU KHOA PGS TS NGUYỄN ĐẠI HẢI Hà Nội – Năm 2022 LỜI CAM ĐOAN Cơng trình thực phòng Vật liệu Y sinh - Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng - Viện Hàn Lâm Khoa học Cơng nghệ Việt Nam Thành phố Hồ Chí Minh Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu hướng dẫn khoa học GS.TS Nguyễn Cửu Khoa PGS.TS Nguyễn Đại Hải Các nội dung nghiên cứu, kết đề tài trung thực, hoàn thành dựa kết nghiên cứu kết nghiên cứu chưa dùng cho luận án cấp khác Tác giả luận án Võ Uyên Vy LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS.TS Nguyễn Cửu Khoa PGS.TS Nguyễn Đại Hải, người Thầy dành cho động viên giúp đỡ tận tình định hướng khoa học hiệu suốt q trình thực luận án Tơi xin cảm ơn giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi Viện Khoa học Vật liệu ứng dụng tơi q trình thực luận án Tơi xin cảm ơn giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi Học viện Khoa học công nghệ tơi q trình thực luận án Tôi xin cảm ơn giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi trường Đại học Công nghiệp TpHCM tơi q trình thực luận án Sau cùng, xin cảm ơn thực quên giúp đỡ tận tình thầy cô, bạn bè động viên, tạo điều kiện người thân gia đình suốt q trình tơi hồn thành luận án Tác giả luận án Võ Uyên Vy MỤC LỤC MỞ ĐẦU xiii Mục tiêu đề tài xiv SƠ ĐỒ MÔ TẢ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU xv CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN .1 1.1 Vật liệu nano silica 1.1.1 Giới thiệu tổng quát 1.1.2 Các tính chất vật liệu nano silica xốp 1.2 Các phương pháp tổng hợp vật liệu nano silica 1.2.1 Phương pháp sol-gel 1.2.2 Phương pháp kết tủa (precipitation) 1.2.3 Phương pháp ngưng tụ hóa học (chemical vapor condensation, CVC) 1.3 Các chất dùng để biến tính bề mặt nano silica 1.3.1 Hydrazine 1.3.2 Polyethylene glycol (PEG) 1.3.3 Chitosan (CS) 1.3.4 Dithiodipropionic acid (DTDP) 1.3.5 Gelatin 1.4 Thuốc trị bệnh ung thư 10 1.4.1 5-Fluorouracil (5-FU) 10 1.4.1.1 Giới thiệu chung 10 1.4.1.2 Cơ chế 5-FU 11 1.4.2 Thuốc Doxorubicin (DOX) 12 1.4.2.1 Giới thiệu 12 1.4.2.2 Cơ chế tác dụng .12 1.4.2.3 Chỉ định 13 1.4.3 Tác dụng phụ 13 1.5 Công nghệ nano phát triển chất dẫn truyền thuốc thông minh 13 1.5.1 Cơ chế mang thuốc hướng đích thụ động 14 1.5.2 Cơ chế mang thuốc hướng đích chủ động 15 1.6 Thành tựu nghiên cứu vật liệu nano silica dẫn truyền thuốc 15 1.6.1 Những nghiên cứu nước .15 1.6.2 Những nghiên cứu nước 17 1.7 Nội dung phương pháp nghiên cứu 18 1.7.1 Điều chế nanosilica xốp (PNS) tạo liên kết cho biến tính 18 1.7.1.1 Phương pháp sol-gel điều chế nano silica xốp 18 1.7.1.2 Tạo liên kết biến tính 19 1.7.2 Biến tính vật liệu nano silica xốp (PNS) 21 1.7.2.2 Biến tính PNS Chitosan-mPEG (tổng hợp PNS-GPTMS-CS-mPEG chất mang thuốc 2) 21 1.7.2.3 Biến tính PNS Gelatin (tổng hợp PNS-APTES-COOH-GE chất mang 4) 23 1.7.2.4 Biến tính PNS Gelatin-mPEG (tổng hợp PNS-GEL-mPEG hay gọi PNS-APTES-GEL-mPEG chất mang 5) .24 1.7.2.5 Biến tính PNS SS-CS-PEG (tổng hợp PNS-SS-CS-PEG hay gọi PNS@CS-PEG chất mang 6) 27 1.8 Đo độ độc tính tế bào (cytotoxicity test) 28 CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 29 2.1 Hóa chất thiết bị 29 2.1.1 Hóa chất 29 2.1.2 Dụng cụ 30 2.2 Thực nghiệm .30 2.2.1 Tổng hợp nano silica xốp (PNS) tạo cầu nối biến tính 30 2.2.1.1 Tổng hợp PNS phương pháp sol-gel 30 2.2.1.2 Tổng hợp PNS phương pháp kết tủa 31 2.2.1.3 Tạo cầu nối biến tính .33 2.2.2 Biến tính vật liệu nano silica .35 2.2.2.1 Biến tính hydrazine (tổng hợp PNS-GPTMS-Hydrazine chất mang thuốc 1) 35 2.2.2.2 Biến tính PNS Chitosan-mPEG (tổng hợp PNS-GPTMS-CS-mPEG chất mang thuốc 2) 36 2.2.2.3 Biến tính gelatin (tổng hợp PNS-APTES-COOH-GE chất mang 4) 39 2.2.2.4 Biến tính PNS gelatin-mPEG (tổng hợp PNS-APTES-COOH-GELmPEG hay gọi PNS -GEL-mPEG chất mang thuốc 5) 40 2.2.2.5 6) Biến tính SS-CS-PEG (tổng hợp PNS-SS-CS-PEG (là chất mang thuốc 43 2.2.3 Khảo sát q trình mang giải phóng vật liệu 44 2.2.3.1 Khảo sát q trình mang thuốc 5-FU giải phóng thuốc 44 2.2.3.2 Khảo sát khả mang giải phóng DOX vật liệu .47 2.2.3 Thử nghiệm độc tính tế bào 48 2.2.4.1 Phương pháp nuôi cấy tế bào .49 2.2.4.2 Quy trình khảo sát hoạt tính gây độc phương pháp SRB 49 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 50 3.1 Đặc trưng vật liệunano silica xốp (PNS) 50 3.1.1 Khảo sát kích thước hạt PNS phương pháp sol-gel 50 3.1.2 Ảnh TEM vật liệu nano silica xốp (PNS) tổng hợp phương pháp sol-gel53 3.1.3 Kết phân tích ảnh SEM vật liệu nano silica xốp (PNS) tổng hợp phương pháp kết tủa 53 3.1.4 Kết phân tích giản đồ XRD vật liệu nano silica xốp (PNS) tổng hợp phương pháp sol-gel phương pháp kết tủa .54 3.1.5 Kết FT-IR vật liệu nano silica xốp (PNS) tổng hợp phương pháp solgel phương pháp kết tủa 55 3.1.6 Kết BET vật liệu nano silica xốp (PNS) tổng hợp phương pháp solgel phương pháp kết tủa 56 3.2 Biến tính nano silica xốp 57 3.2.1 Biến tính thơng qua cầu nối GPTMS 57 3.2.1.1 Biến tính Hydrazine (tổng hợp PNS-GPTMS-Hydrazin-chất mang thuốc 1) 57 3.2.1.2 Biến tính Chitosan-mPEG (tổng hợp PNS-GPTMS-Chitosan-mPEG viết tắt PNS-GPTMS-CS-mPEG chất mang thuốc 2) 59 3.2.2 Biến tính thơng qua cầu nối APTES 62 3.2.2.1 Biến tính gelatin (tổng hợp PNS-APTES-COOH-gelatin gọi PNS-APTESCOOH-GE (chất mang thuốc 4)) 62 3.2.2.2 Biến tính PNS GEL-mPEG (tổng hợp PNS-APTES-COOH-GEL-mPEG hay gọi tắt PNS-Gelatin-mPEG (chất mang thuốc 5) 64 3.2.2.3 Biến tính SS-CS-PEG (tổng hợp PNS@CS-PEG hay cịn gọi PNS-APTES-SSCOOH-CS-PEG (chất mang thuốc 6)) 68 3.2.3 Nhận xét chung hệ biến tính .69 3.3 Kết mang giải phóng thuốc 71 3.3.1 Kết mang giải phóng thuốc PNS 71 3.3.1.1 Xây dựng đường chuẩn 5-Fluorouracil (5-FU) 71 3.3.1.4 Kết mang thuốc 5-FU PNS (nano silica xốp) 73 3.3.1.6 Kết mang thuốc DOX PNS (nano silica xốp) 75 3.3.1.7 Kết giải phóng thuốc DOX PNS (nano silica xốp) 76 3.3.2 Kết mang giải phóng PNS-GPTMS-Hydrazine (chất mang thuốc 1) 77 3.3.2.1 Khảo sát mang giải phóng 5-FU PNS-GPTMS-Hydrazine 77 3.3.2.2 Khảo sát giải phóng 5-FU PNS-GPTMS-Hydrazine 78 3.3.2.3 Kết mang thuốc DOX PNS-GPTMS-Hydrazine 79 3.3.2.4 Khảo sát khả giải phóng DOX vật liệuPNS-GPTMS-Hydrazine 79 3.3.3 Kết mang giải phóng thuốc PNS-GPTMS-CS-mPEG (Chất mang thuốc 2) 82 3.3.3.1 Kết mang 5-FUcủa hệ PNS-GPTMS-CS-mPEG 82 3.3.3.3 Kết mang thuốc DOX PNS-GPTMS-CS-mPEG 83 3.3.3.4 Khảo sát khả giải phóng thuốc DOX hệ PNS-GPTMS-CS-mPEG 84 3.3.4 Kết mang giải phóng PNS-APTES (chất mang thuốc 3) .86 3.3.4.1 Kết mang 5-FU PNS-APTES .86 3.3.4.2 Kết giải phóng 5-FU PNS-APTES .86 3.3.4.3 Kết mang DOX PNS-APTES .87 3.3.4.4 Kết giải phóng DOX PNS-APTES 88 3.3.5 Kết mang giải phóng PNS-APTES-Anhydrid Succinic-Gelatin (PNSAPTES-COOH-GE chất mang thuốc 4) 89 3.3.5.1 Kết mang 5-FU PNS-APTES-COOH-GE 89 3.3.5.2 Kết giải phóng 5-FU PNS-APTES-COOH-GE 90 Hình 3.35 Phổ HPLC 5-FU (a) HPLC hệ PNS-APTES-COOH-GE 91 3.3.5.3 Kết mang DOX PNS-APTES-COOH-GE 91 3.3.5.4 Kết giải phóng DOX PNS-APTES-COOH-GE 91 3.3.6 Kết mang giải phóng PNS-APTES-Anhydrid Succinic- Gelatin-mPEG (gọi tắt PNS-GEL-mPEG chất mang thuốc 5) 93 3.3.6.1 Khảo sát khả mang 5-FU hệ PNS-GEL-mPEG 93 3.3.6.2 Khảo sát khả giải phóng 5-FU hệ PNS-GEL-mPEG 93 3.3.6.3 Kết mang thuốc DOX PNS-GEL-mPEG 94 3.3.6.4 Khảo sát khả giải phóng DOX hệ PNS-GEL-mPEG 94 3.3.7 Kết mang giải phóng hệ PNS@CS-PEG .98 3.3.7.1 Kết mang thuốc DOX PNS@CS-PEG 98 3.3.7.2 Kết giải phóng DOX PNS@CS-PEG 98 3.3.8 Nhận xét chung cho tất kết mang giải phóng thuốc 100 3.4 Kết thử độc tính tế bào 102 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 104 4.1 Kết luận 104 4.2 Kiến nghị 105 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN .106 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ 107 TÀI LIỆU THAM KHẢO .109 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Từ viết đầy đủ APTES CTAB (3-aminopropyl)triethoxysilane Cetyltrimethylamnonium bromide CS Chitosan GEL GE Gelatin Da DOX Dalton Doxorubicin 5-FU Fluorouracil DLS Dynamic light scattering EDC 1-3 Dimethylamino-5-ethyl carbodimide Et Ethyl EtOH Ethanol FT-IR Fourier transform infrared spectroscopy (phổ hồng ngoại) Gelatin GEL GE mPEG Methoxy ethyleneglycol MSN Nano silica mesoporous NPC p-nitrophenyl carbonate PEG Poly ethyleneglycol PNS Porous nano silicas PBS TEOS Phosphate buffered saline Tetraethyl orthosilicate THF Tetrahydrofuran TGA Thermogravimetric analysis TEM Transmission electron microscopy UV-Vis Ultraviolet-visible XRD X-ray powder diffraction DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Tên hóa chất nơi xuất xứ 27 Bảng 3.1 Số liệu tương quan diện tích bề mặt (BET) kích thước hạt (TEM) hệ PNS trước sau biến tính 66 Bảng 3.2 Số liệu đường chuẩn thuốc 5-FU 67 Bảng 3.3 Số liệu đường chuẩn thuốc DOX 68 Bảng 3.4 Số liệu khảo sát tỷ lệ thuốc DOX chất mang 68 Bảng 3.5 Kết giải phóng DOX hệ PNS 72 Bảng 3.6 Số liệu biểu thị khối lượng thuốc mang 60 mg hạt 73 Bảng 3.7 So sánh DLE DLC PNS PNS-GPTMS-Hydrazine mang thuốc 5FU 73 Bảng 3.8 Kết giải phóng DOX hệ PNS GPTMS-Hydrazine 76 Bảng 3.9 Lượng thuốc 5-FU tự hệ PNS-GPTMS-CS-mPEG 77 Bảng 3.10 Kết đo thuốc DOX tự hệ PNS-GPTMS-CS-mPEG .79 Bảng 3.11 So sánh số liệu DLE DLC PNS-GPTMS-CS-mPEG PNS 79 Bảng 3.12 Dữ liệu cho thấy khả giải phóng thuốc DOX hệ PNS-GPTMS-CSmPEG pH 7,4 pH 4,5 80 Bảng 3.13 Khối lượng thuốc tự mang 60 mg chất mang PNS-APTES 81 Bảng 3.14 Hiệu suất mang thuốc khả chứa thuốc 5-FU hạt nano silica xốp biến tính (PNS-APTES) so sánh với PNS chưa biến tính 82 Bảng 3.15 Số liệu giải phóng DOX PNS-APTES pH 7,4 4,5 83 Bảng 3.16 Kết đo dung dịch A B (trước sau mang thuốc 5-FU hệ PNSAPTES-Anhydrid Succinic-GE) 85 Bảng 3.17 Số liệu giải phóng DOX hệ PNS- APTES-COOH-GE pH 7,4 4,5 87 Bảng 3.18 Số liệu biểu thị khối lượng thuốc 5-FU mang 60 mg PNS-GELmPEG 88 Bảng 3.19 Khả giải phóng DOX hệ PNS-GEL-mPEG pH 7,4 pH 4,5 89 Bảng 3.20 So sánh giải phóng DOX hệ PNS PNS-GEL-mPEG pH 7,4 91 35 Sau đánh siêu âm, nhỏ từ từ, lúc 4mL ethanol 1mL APTES Khuấy hỗn hợp 20 30oC Sau đem mẫu siêu âm 30 phút Dung dịch thu đem thẩm tách màng cellulose (MW 6.000-8.000 Da) nước ngày, tiếp tục thẩm tách 250 mL hỗn hợp gồm acid acetic 2(M) ethanol (1:1) Quá trình thực lần Dung dịch thu đem đông khô, thu sản phẩm dạng bột màu trắng, mịn 2.2.2 Biến tính vật liệu nano silica 2.2.2.1 Biến tính hydrazine (tổng hợp PNS-GPTMS-Hydrazine chất mang thuốc 1) PNS-GPTMS hòa tan hồn tồn nước khử ion sau nhỏ từ từ hỗn hợp vào hydrazine phản ứng 12 điều kiện khuấy từ nhiệt độ phòng Sản phẩm đưa vào màng (MW 12kD-14kDa) thẩm tách nước cất khoảng ngày, sau đơng khơ thu sản phẩm 36 Hình 2.6 Quy trình tổng hợp PNS-GPTMS-Hydrazine 2.2.2.2 Biến tính PNS Chitosan-mPEG (tổng hợp PNS-GPTMS-CS-mPEG chất mang thuốc 2) Tổng hợp Chitosan-mPEG Hoạt hóa mPEG-NPC - Cân 0,25g mPEG (5000Da) cho vào bình cầu cổ sau gia nhiệt lên 65-70oC cho mPEG chảy Trong trình gia nhiệt cần hút chân không để tạo môi trường chân không cho phản ứng - Sau mPEG chảy hồn tồn cân 16,00mg NPC (201.56 Da) cho vào Khi cân NPC lưu ý NPC nhạy với nước nên thao tác cần nhanh để tránh trường hợp NPC bị thủy phân Để hệ phản ứng ổn định nhiệt độ từ 65-70˚C, môi trường chân khơng vịng giờ, tốc độ khuấy 300 vịng/phút - Sau phản ứng nhiệt độ 65-70oC, hạ nhiệt độ hệ phản ứng xuống 40˚C Cho tiếp vào mL THF vào tiếp tục khuấy tốc độ 300 (vòng/phút) khoảng 1giờ 37 Rửa hỗn hợp phản ứng diethyl ether lần (mỗi lần 10 mL) Bỏ phần nước phía thu lấy phần chất rắn trắng kết tủa phía Tiếp theo đem cô quay phần chất rắn trắng để loại bỏ hết dung môi hữu Thu mPEG hoạt hóa Hình 2.7 Hoạt hóa mPEG NPC Tổng hợp CS-mPEG - Dung dịch chitosan hòa tan nước pH 4,0 - Nhỏ giọt dung dịch mPEG hoạt hóa vào dung dịch chitosan theo tỉ lệ khối lượng 1:5, khuấy 300 rpm vòng 24 - Dung dịch CS-mPEG thu thẩm tách màng (MW 12-14.000 Da) nước cất ngày - Đông cô dung dịch mPEG-chitosan thu sản phẩm 38 Hình 2.8 Sơ đồ điều chế chitosan-mPEG(CS-mPEG) Tạo liên kết PNS-GPTMS CS-mPEG Phản ứng chitosan lên bề mặt nano silica vừa biến tính hồn tồn tạo nhờ khả hoạt động mạnh vòng epoxy pH cao lẫn pH thấp Tuy nhiên để chọn lựa pH để CS-mPEG giữ liên kết amide sau phản ứng vấn đề đáng ý Trong luận án này, pH khoảng đến lựa chọn, pH liên kết amide không bị thủy phân PNS-GPTMS phân tán 15 mL H2O, đánh siêu âm 30 phút, điều chỉnh pH 3,5 CS-mPEG hòa tan 20 mL H2O, điều chỉnh pH 3,5 sau khuấy từ khoảng 30 phút Cho từ từ dung dịch CS-mPEG vào PNS-GPTMS Phản ứng thực nhiệt độ phòng 36 Hỗn hợp ly tâm rửa lại lần với nước cất Đông khô, thu sản phẩm 39 Hình 2.9 Qui trình tổng hợp PNS-GPTMS-CS-mPEG 2.2.2.3 Biến tính gelatin (tổng hợp PNS-APTES-COOH-GE chất mang 4) Tổng hợp PNS-APTES-Succinic Anhydride (PNS-APTES-COOH) Đầu tiên, lấy 0,2 g PNS-APTES hòa tan 10 mL aceton (dung dịch A) g anhydrid succinic hòa tan acetone 20 mL (dung dịch B) Khuấy riêng lẻ dung dịch A, B 30 phút Cho từ từ dung dịch A vào B khuấy hỗn hợp nhiệt độ phòng 24 Sau đuổi dung mơi nhiệt độ 40oC để thu PNS-APTES-COOH Hình 2.10 Quy trình tổng hợp PNS-APTES-Succinic Anhydride (PNS-APTESCOOH) 40 Tổng hợp PNS-APTES-Succinic-Gelatin (PNS-APTES-COOH-GE) Cho 0,3 g gelatin phân tán mL nước giờ, điều chỉnh pH 7,4 Cân 0,2 g PNS-APTES-COOH vào 75 mL nước, khuấy khoảng 50 phút, điều chỉnh pH 3,5 Sau đó, cho 10 μL EDC vào, tiếp tục khuấy thêm khoảng 10 phút Cho từ từ dung dịch gelatin vào dung dịch PNS-APTES-COOH, cho phản ứng nhiệt độ phòng Hỗn hợp thẩm tách đông khô, thu sản phẩm cuối dạng bột, màu trắng, mịn hệ mang thuốc Hình 2.11 Qui trình tổng hợp PNS-APTES-COOH-GE 2.2.2.4 Biến tính PNS gelatin-mPEG (tổng hợp PNS-APTES-COOHGEL-mPEG hay gọi PNS -GEL-mPEG chất mang thuốc 5) Sau biến tính PNS với gelatin, nghiên cứu tiếp tục phát triển cách gắn thêm mPEG lên gelatin trước biến tính lên bề mặt nano silica xốp (PNS) nhằm mục đích tăng khả hịa tan thuốc nước tăng tính tương hợp sinh học trì thời gian thuốc lưu thơng hệ tuần hồn máu Tổng hợp gelatin-mPEG Qui trình tổng hợp gelatin-mPEG tiến hành bước: Hoạt hóa mPEG p- nitrophenyl carbonate (NPC) 41 Hình 2.12 Hoạt hóa mPEG NPC - Cân 0,25g mPEG (5.000 Da) cho vào bình cầu cổ sau gia nhiệt lên 65-70˚C cho mPEG chảy Trong trình gia nhiệt cần hút chân không để tạo môi trường chân không cho phản ứng - Sau mPEG chảy hồn tồn cân 16 mg NPC (201.56 Da) cho vào Khi cân NPC lưu ý NPC nhạy với nước nên thao tác cần nhanh để tránh trường hợp NPC bị thủy phân Để hệ phản ứng ổn định nhiệt độ từ 65-70˚C, môi trường chân không vòng giờ, tốc độ khuấy 300 vòng/phút - Sau phản ứng nhiệt độ 65-70˚C, hạ nhiệt độ hệ phản ứng xuống 40˚C Cho tiếp vào mL THF vào tiếp tục khuấy tốc độ 300 vòng/phút khoảng 1giờ - Rửa hỗn hợp phản ứng diethyl ether lần Gạn bỏ phần nước phía thu lấy phần chất rắn trắng kết tủa phía Tiếp theo đem quay phần chất rắn trắng để loại bỏ hết dung môi hữu Thu mPEG hoạt hóa 42 Biến tính Gelatin với mPEG Ban đầu mPEG hoạt hóa cách cho tác dụng với NPC để thu mPEG-NPC Tác chất sau phản ứng với Gelatin để thu sản phẩm Gelatin-mPEG Trong phản ứng này, gelatin có cấu trúc lớn phải pha lỗng gelatin Qui trình thực sau: - Dung dịch Gelatin hòa tan nước - Nhỏ giọt dung dịch mPEG hoạt hóa vào dung dịch Gelatin theo tỉ lệ khối lượng 1:5, khuấy 300 rpm vòng 24 - Dung dịch Gelatin-mPEG thu thẩm tách màng (MW 12.00014.000 Da) nước cất ngày - Đông cô dung dịch Gelatin-mPEG thu sản phẩm dạng bột, màu trắng Hình 2.13 Qui trình tổng hợp Gelatin-mPEG (GEL-mPEG) Tổng hợp PNS-APTES-COOH-GEL-mPEG (PNS-APTES-Succinic-Gelatin-mPEG) Cho 0,3 g Gelatin-mPEG phân tán mL nước giờ, điều chỉnh pH 7,4 Thu dung dịch A 43 Cân 0,2 g PNS-APTES-COOH vào 75 mL nước, khuấy khoảng 50 phút, điều chỉnh pH 3,5 Sau đó, cho 10 μL EDC vào, tiếp tục khuấy thêm khoảng 10 phút Thu dung dịch B Cho từ từ dung dịch A vào B, cho phản ứng nhiệt độ phòng Hỗn hợp thẩm tách đông khô, thu sản phẩm cuối dạng bột, màu trắng, mịn hệ mang thuốc Hình 2.14 Qui trình tổng hợp PNS-APTES-COOH-GEL-mPEG Sau trình tổng hợp hoàn thành, sản phẩm thu vật liệu có kích thước nano PNS-APTES-COOH-Ge-mPEG (có thể gọi tắt PNS-Ge-mPEG) Vật liệu tổng hợp với kích thước mong muốn 20 nm < d < 100 nm, d đường kính hạt Ngồi vật liệu tổng hợp có cấu trúc dạng tổ ong nên có nhiều lỗ xốp, nhờ thực trình mang thuốc hạt thuốc hấp phụ bề mặt vật liệu lỗ xốp 2.2.2.5 Biến tính SS-CS-PEG (tổng hợp PNS-SS-CS-PEG (là chất mang thuốc 6) Gắn cầu nối disulfide, hình thành PNS-SS-COOH Cho g PNS-APTES vào cốc 100 mL có chứa sẵn 20 mL nước deion, khuấy 30 phút, sau thêm vào 0,14mL EDC trước tiến hành phản ứng phút (cốc 1) 44 Cho 0,16g DTDP vào cốc 50mL có chứa sẵn 20mL DMF, khuấy đến tan (cốc 2) Cho cốc (2) vào (1) tiến hành phản ứng 24 Cho dung dịch vào màng – kDa thẩm tách ngày nước cất Đem dung dịch thu đông khô, ta thu PNS-SS-COOH Lưu ý: Tất trình thực nhiệt độ phịng, tốc độ khuấy trì 300 (vòng/phút) Tổng hợp PNS@CS-PEG Cho 150 mg PNS-SS-COOH hòa tan 20 mL nước deion, khuấy 30 phút tốc độ 300 rpm, nhiệt độ phòng Điều chỉnh pH dung dịch PNS-SSCOOH khoảng pH 4-5 dung dịch HCl NaOH Thêm 50µg/L EDC (1-3 Dimethylamino-5-ethyl carbodimide) vào để hoạt hóa nhóm COOH 15 phút Cho 10 mL dung dịch CS-PEG (108 mg) vào thực phản ứng 24 nhiệt độ phòng điều kiện N2 Thẩm tách màng 6–8 kDa môi trường nước ngày 2.2.3 Khảo sát q trình mang giải phóng vật liệu 2.2.3.1 Khảo sát q trình mang thuốc 5-FU giải phóng thuốc Tiến hành mang thuốc 5-FU Phương pháp 1: Hòa tan riêng lẻ thuốc chất mang thuốc vào nước khử ion thành hai dung dịch riêng Khuấy siêu âm tạo hai hỗn hợp cho đồng khoảng 30 phút [65] Cho từ từ hỗn hợp thuốc vào chất mang Duy trì khuấy từ khoảng thời gian cho thuốc vào Tiếp tục khuấy 24 [65] Tiến hành chia màng để thẩm tách loại thuốc tự 45 Đo HPLC để xác định thuốc chưa mang nhận thấy với phương pháp mang thuốc 5-FU vào vật liệu nano silica dù thử nhiều lần với tất chất mang biến tính, hút chân khơng cẩn thận chất mang trước mang thuốc… Với khó khăn trên, chúng tơi tìm cách mang thuốc 5-FU vào vật liệu cách bắt chước nguyên lý sắc ký cột, dùng áp lực nén thuốc vào chất mang Phương pháp xin tạm gọi phương pháp Phương pháp 2: Cân 60 mg chất mang cho vào ống nhỏ giọt, (dùng muỗng inox nhỏ lấy chất mang cho vào ống nhỏ giọt) Cho cẩn thận 12 mL nước cất hòa tan 15 mg thuốc becher, khuấy từ 1giờ, lấy mL để đo HPLC trước mang thuốc (dung dịch A), lại 11 mL dung dịch A Tiếp theo, cho dung dịch thuốc (dung dịch A) vào ống nhỏ giọt thủy tinh chứa sẵn chất mang, lấy mL nước đề ion tráng chai đựng thuốc, cho chảy qua cột (ống nhỏ giọt ) ngày (nên dùng thêm ống nhỏ giọt khác lấy thuốc để tránh thất thoát) Hứng dung dịch qua cột (ống nhỏ giọt ) nhiều lần, thực ngày (dung dịch hứng sau ngày gọi dung dịch B) Sau lấy tồn hỗn hợp chất mang thuốc ống nhỏ giọt cho vào becher, khuấy hỗn hợp 30 phút với 20 mL nước khử ion Tiến hành chia màng để thẩm tách loại thuốc tự Đo HPLC để xác định thuốc chưa mang từ tính hiệu suất mang thuốc khả chứa thuốc vật liệu dựa công thức sau [65, 66]: Hiệu suất mang thuốc (DLE) DLE (%) = Lượng thuốc chứa mẫu Tổng lượng thuốc ban đầu x 100% Khả chứa thuốc chất mang (DLC) DLC (%) = Lượng thuốc chứa mẫu Tổng lượng chất mang lượng thuốc mẫu x 100% 46 Khảo sát q trình giải phóng thuốc Mẫu nano silica biến tính mang thuốc sử dụng để khảo sát q trình giải phóng môi trường dung dịch đệm phosphat (pH 7,4) đệm acetat (pH 4,5) Cách thực sau: Mỗi túi thẩm tách chứa mL hệ nano silica mang thuốc trên, tiến hành thẩm tách với 18 mL dung dịch đệm PBS Acetat Lấy mẫu thời gian ngày theo thời gian 1giờ, giờ, giờ, giờ, 12 giờ, 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ, 72 giờ, 84 96 Nồng độ 5-FU giải phóng mơi trường xác định phương pháp HPLC Để đảm bảo kết tính xác mẫu đo lấy giá trị trung bình Sau đo HPLC dung dịch A, B, chai đựng mẫu giải phóng Hình 2.15 Sơ đồ quy trình mang 5-FU 47 2.2.3.2 Khảo sát khả mang giải phóng DOX vật liệu Khảo sát tỉ lệ thuốc DOX chất mang [67] Trước tiến hành mang thuốc, tiến hành khảo sát tỉ lệ thuốc chất mang sau chọn tỉ lệ tối ưu để thực mang thuốc cho mẫu Pha dung dịch bao gồm 10mg chất mang với 10 mL nước cất siêu âm hỗn hợp khoảng 30 phút Cho cẩn thận mL nước cất hòa tan thuốc theo tỉ lệ Trộn dung dịch khuấy từ 24 nhiệt độ phòng Sau khuấy, lấy dung dịch cho vào túi thẩm tách 3.000-5.000 Da nước cất Lấy dung dịch thẩm tách giờ, 12 24 để đo hàm lượng thuốc chưa mang Khảo sát trình mang thuốc DOX [33, 57, 67] Tiến hành chuẩn bị dung dịch cách pha dung dịch bao gồm 60 mg chất mang PNS biến tính với 10mL nước cất đánh siêu âm hỗn hợp khoảng 30 phút Cho cẩn thận 2mL nước cất hòa tan 15 mg thuốc, khuấy hỗn hợp khoảng 30 phút ta thu dung dịch Tiếp theo cho cẩn thận dung dịch vào dung dịch khuấy từ 24 nhiệt độ phòng Sau khuấy, lấy 2mL dung dịch để đo nồng độ ban đầu Sau cho mẫu cịn lại vào túi thẩm tách 3.000-5.000 Da, túi có mL hỗn hợp Trong 12 đầu, thẩm tách sản phẩm lần với 18 mL nước (1 lấy 18 mL nước cho vào 18 mL nước mới) Thẩm tách tương tự 12 tiếp Trích giữ nước thẩm tách để đo hàm lượng thuốc chưa mang 48 Khảo sát q trình giải phóng thuốc DOX Mẫu nano silica biến tính mang thuốc sử dụng để khảo sát q trình giải phóng mơi trường dung dịch đệm phosphat (PBS) đệm acetat Cách thực sau: Mỗi túi thẩm tách chứa mL hệ nano silica mang thuốc trên, tiến hành thẩm tách với 18 mL dung dịch đệm PBS (pH 7,4) Acetat (pH 4,5) Lấy mẫu thời gian ngày theo thời gian 1giờ, giờ, giờ, giờ, 12 giờ, 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ, 72 giờ, 84 96 Nồng độ DOX giải phóng môi trường xác định phương pháp UV-Vis Để đảm bảo kết tính xác mẫu đo lấy giá trị trung bình Hình 2.16 Sơ đồ quy trình mang DOX 2.2.3 Thử nghiệm độc tính tế bào Qui trình xác định hoạt tính gây độc tế bào thực phịng thí nghiệm Sinh học Phân tử, Bộ môn Di truyền, Khoa Sinh học Phân tử, Đại học Khoa học Tự nhiên 49 2.2.4.1 Phương pháp ni cấy tế bào Dịng tế bào ung thư vú (MCF-7), ung thư phổi (NCI H460), ung thư cổ tử cung (HeLa), ung thư gan (Hep G2) ung thư máu (Jurkat) ATCC (Hoa Kỳ) cung cấp, nuôi cấy môi trường E’MEM (MCF-7, NCI H460, HeLa HepG2) RPMI (Jurkat) có bổ sung L-glutamine (2 mM), HEPES (20 mM), amphotericin B (0,025μg/mL), penicillin G (100 UI/mL), streptomycin (100 μg/mL), 10% (v/v) huyết bào thai bò FBS ủ 37oC, 5% CO2 2.2.4.2 Quy trình khảo sát hoạt tính gây độc phương pháp SRB Tế bào đơn cấy đĩa nuôi cấy 96 giếng với mật độ 104 tế bào/giếng (đối với dòng tế bào HeLa, Hep G2 MCF-7); 7,5.103 tế bào/giếng (đối với dòng NCIH460) 5.104 tế bào/giếng dòng tế bào Jurkat Sau 24 nuôi cấy, quần thể tế bào ủ với chất khảo sát nồng độ 48 Sau đó, protein tổng từ tế bào thử nghiệm cố định dung dịch Trichloroacetic acid (Sigma) 50% lạnh (riêng Jurkat 70%) nhuộm với dung dịch Sulforhodamine B 0,2% (Sigma) Kết đọc máy ELISA reader hai bước sóng 492 nm 620 nm Các thí nghiệm lặp lại ba lần kết trình bày dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn Xử lý kết quả: Sau có giá trị mật độ quang bước sóng 492 nm 620 nm (ký hiệu OD492 OD620): - Tính giá trị OD = OD492 – OD620 (1) - Tính OD492 (hoặc OD620) = ODtb – ODblank (2) - Tính tỉ lệ (%) gây độc tế bào theo công thức: Với: %I = (I - ODTN / ODC ) x 100% - ODtb : giá trị OD giếng có chứa tế bào - ODblank : giá trị OD giếng (khơng có chứa tế bào) - ODTN : giá trị OD mẫu thử tính từ công thức (1) (2) - ODC : giá trị OD mẫu chứng (control) tính từ cơng thức (1) (2) IC50 xác định cách sử dụng phần mềm Prism với phương pháp hồi qui không tuyến tính đa thơng số R2 > 0,9