Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của nấm thượng hoàng (phellinus linteus) trong nuôi cấy thuần khiết

LỜI CẢM ƠN Được đồng ý trường Đại học Lâm Nghiệp, khoa Quản lý tài nguyên rừng môi trường, môn Bảo vệ thực vật giáo viên hướng dẫn tiến hành thực đề tài: "Nghiên cứu số đặc điểm sinh học nấm Thƣợng hồng (Phellinus linteus) ni cấy khiết" Để hồn thành luận văn tốt nghiệp, tơi nhận nhiều giúp đỡ, hướng dẫn cán Trung tâm nghiên cứu bảo vệ rừng, đặc biệt quan tâm, tận tình PGS TS Phạm Quang Thu Nhân dịp này, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS TS Phạm Quang Thu thầy giáo trực tiếp hướng dẫn khoa học tồn thể cán cơng tác Trung tâm nghiên cứu bảo vệ rừng - Viện khoa học Lâm Nghiệp Việt Nam nơi thực đề tài Mặc dù cố gắng để hoàn thiện đề tài tốt Tuy nhiên điều kiện thời gian khả thân hạn chế, nên khơng thể tránh khỏi thiếu sót Vì vậy, mong nhận ý kiến đóng góp, xây dựng Thầy giáo tồn thể bạn bè để đề tài hoàn thiện Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội ngày 13 tháng năm 2015 Sinh viên thực hiện: Trần Nhật Tân MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 Giới thiệu nấm Thượng hoàng 1.2 Nghiên cứu giới 1.3 Nghiên cứu Việt Nam Phần 2: MỤC TIÊU - ĐỐI TƢỢNG - ĐỊA ĐIỂM - THỜI GIAN - NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Mục tiêu, đối tượng, địa điểm thời gian nghiên cứu 2.1.1 Mục tiêu 2.1.2 Đối tượng 2.1.3 Địa điểm 2.1.4 Thời gian nghiên cứu 2.2 Nội dung nghiên cứu 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Nghiên cứu đặc điểm sinh học hệ sợi nấm điều kiện nuôi cấy khiết 2.3.1.1 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng môi trường dinh dưỡng đến sinh trưởng phát triển hệ sợi 2.3.1.2 Phương pháp nghiên cứư ảnh hưởng nhiệt độ khơng khí đến sinh trưởng phát triển hệ sợi 11 2.3.2 Bước đầu nghiên cứu hoạt tính sinh kháng sinh ức chế phát triển tế bào ung thư thông qua hai chủng nấm Phytophthora sp Ceratocystis sp 12 2.3.3 Nghiên cứu nhân sinh khối hệ sợi môi trường lỏng 13 2.3.3.1 Phương pháp xác định thời gian nhân sinh khối hệ sợi 14 2.3.3.2 Phương pháp sấy thu hoạch sản phẩm hệ sợi nuôi cấy 14 Phần 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 15 3.1 Nghiên cứu đặc điểm sinh học hệ sợi nấm điều kiện nuôi cấy khiết 15 3.1.1 Nghiên cứu ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến sinh trưởng phát triển nấm 15 3.1.2 Nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ đến sinh trưởng phát triển nấm 19 3.1.3 Nghiên cứu ảnh hưởng ẩm độ đến sinh trưởng phát triển nấm thượng hoàng 21 3.2 Bước đầu nghiên cứu hoạt tính sinh kháng sinh ức chế phát triển tế bào ung thư thông qua chủng nấm Phytophthora sp Ceratocystis sp 23 3.3 Nghiên cứu nhân sinh khối hệ sợi môi trường lỏng 24 3.3.1 Xác định thời gian nhân sinh khối hệ sợi 24 3.3.2 Xác định thời gian sấy sản phẩm hệ sợi nuôi cấy 27 Chƣơng 4: KẾT LUẬN - KIẾN NGHỊ - TỒN TẠI 29 Kết luận 29 4.2 Tồn 29 4.3 Kiến nghị 29 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC BIỂU Biểu 3.1: Sinh trưởng hệ sợi nấm môi trường dinh dưỡng khác 15 Biểu 3.2: Khối lượng hệ sợi nấm hai công thức môi trường dinh dưỡng khác 17 Biểu 3.3: Tốc độ sinh trưởng trung bình hệ sợi nấm thang nhiệt độ khác 19 Biểu 3.4: Ảnh hưởng độ ẩm khơng khí đến sinh trưởng phát triển đường kính hệ sợi 22 Biểu 3.5: Đánh giá hiệu lực kháng nấm bệnh nấm Thượng hoàng 24 Biểu 3.6: Sinh khối hệ sợi nấm sau khoảng thời gian nuôi khác 25 Biểu 3.7: Thời gian sấy khô hệ sợi với thang nhiệt độ 27 DANH MỤC HÌNH Hình 3.1: Biểu đồ tốc độ sinh trưởng hệ sợi nấm môi trường dinh dưỡng 16 Hình 3.2: Hệ sợi nấm hai mơi trường dinh dưỡng khác 16 Hình 3.3: Biểu đồ sinh trưởng hệ sợi nấm hai công thức môi trường dinh dưỡng khác 17 Hình 3.4: Hệ sợi nấm môi trường CT1 18 Hình 3.5: Hệ sợi nấm môi trường CT2 18 Hình 3.6: Biểu đồ sinh trưởng hệ sợi nấm thang nhiệt độ khơng khí khác 20 Hình 3.7: Hệ sợi nấm mơi trường dinh dưỡng thang nhiệt độ 21 Hình 3.8: Biểu đồ tốc độ mọc hệ sợi thang độ ẩm khác 22 Hình 3.9: Hệ sợi nấm mơi trường dinh dưỡng theo thang độ ẩm 23 Hình 3.10: Khả kháng nâm Phellinus linteus 24 Hình 3.12: Hệ sợi chưa đến thời gian thu hoạch 26 Hình 3.13: Hệ sợi đến thời gian thu hoạch 26 Hình 3.14: Hệ sợi thời gian thu hoạch 26 Hình 3.15: Biểu đồ thời gian sấy hệ sợi thang nhiệt độ 27 Hình 3.16: Hệ sợi nấm trước sấy 28 Hình 3.17: Hệ sợi nấm sau sấy 28 ĐẶT VẤN ĐỀ Cuộc sống phải đối mặt với nhiều vấn đề sức khỏe ảnh hưởng môi trường biến đổi khí hậu hay thực phẩm sử dụng hàng ngày có hóa chất độc hại Chính ngun nhân mà sức khỏe người suy giảm cách vơ nghiêm trọng Có nhiều bệnh dịch hay bệnh nan y chưa có phương pháp điều trị cách tối ưu Một bệnh thách thức áp lực tồn xã hội ung thư Hiện nhà khoa học chưa có phương pháp chữa trị cho có hiệu chi phí cho việc điều trị vơ cao Các phương pháp nhà khoa học áp dụng thường xạ trị, truyền hóa chất hay cắt bỏ khối u ung thu Các cách thường mang tính tình vào tỉ lệ thành công điều trị chiếm tí lệ nhỏ Ngồi việc chi phí đắt đỏ hiệu qủa khơng cao phương pháp cịn có nhiều tác dụng phụ sau chữa trị không mong muốn Đứng trước địi hỏi nhà khoa học cố gắng tìm kiếm sản phẩm có nguồn gốc từ thiên nhiên việc điều trị loại bỏ bệnh nan y mà đến khoa học đại gắp khó khăn Từ hàng ngàn năm phát triển loài người, biết sử dụng dược liệu có sẵn tự nhiên để chữa bệnh nâng cao thể lực cho thể Các loài cỏ hoa sung quanh có nhiều tác dụng y học đáng quý mà hàng ngày sử dụng tìm tịi nghiên cứu để tìm thêm công hiệu chúng Trong số dược liệu mà người thường sủ dụng đánh gía cao số lồi nấm Chúng dùng hàng trăm năm qua y học Đông Á Nấm Linh chi, Nấm lim, Đông trùng hạ thảo ý nhiều thời gian gần nấm Thượng hồng “ Phellinus linteus” điều trị phòng ngừa ung thu hiệu Được nhận định có đặc tính phịng chống khối u trên, tế bào ung thư phổi ung thư tuyến tiền liệt Khi tiến hành thí nghiệm với tế bao ung thư vú người, nhà nhà khoa học nhận thấy lồi nấm có khả hạn chế hiệu enzym AKT, loại enzym kích thích tế bào ung thư phát triển Với tác dụng tốt việc áp dụng vào ni trồng nhân tạo Việt Nam cịn hạn chế Chúng ta thường phải nhập nước Nhật Bản, Hàn Quốc, Trung Quốc chúng đa dạng khó kiểm sốt chất lượng Vì việc đưa vào nghiên cứu điều kiện sinh trưởng tối ưu để phục vụ nuôi trồng đại trà cần thiết vấn đề có ý nghĩa khơng mặt khoa học mà đáp ứng nhu cầu xã hội Xuất phát từ nhu cầu chọn đề tài: “Nghiên cứu số đặc điểm sinh học nấm Thƣợng hồng (Phellinus linteus) ni cấy khiết” Phần I TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 1.1 Giới thiệu nấm Thƣợng hồng Nấm Thượng hồng (hay cịn gọi Hoàng sơn) tên loài gần chi Phellinus, họ Hymenochaetaceae… sử dụng từ lâu y học cổ truyền với dạng dùng nấu nước uống Đây loài nấm mọc nhiều năm, lớp thụ tầng năm sau chồng lên lớp thụ tầng năm trước Nấm thường mọc dâu tằm vùng rừng sâu, núi cao hiểm trở, khu rừng nguyên sinh, tuổi nấm có đến vài chục năm Nấm Thượng hồng có tên khoa học Phellinus linteus, Ở Trung Quốc, gọi Song-gen, Sang-hwang Hàn Quốc Meshimakobu Nhật Bản, Việt Nam có tên Nấm Thượng hồng hay Hồng sơn Các loại nấm chi Phellinus nhà nấm học giới quan tâm, đặc tính hỗ trợ chống phát triển khối u mạnh, có tác dụng phịng chống ung thư, trẻ hóa thể Tuy nhiên, loại nấm thường mọc vùng rừng sâu, núi cao hiểm trở, đặc biệt khu rừng nguyên sinh Tuổi nấm có đến vài chục năm Nấm Thượng hồng mơ tả theo y học Phương Đơng có khả điều hịa miễn dịch mạnh tăng chức miễn dịch Nấm hiệu nhiều bệnh, bao gồm việc tăng lưu thông máu, ngăn ngừa điều trị bệnh tim, tăng khả giải độc bảo vệ gan, chống lại bệnh dị ứng tiểu đường, giảm căng thẳng Đặc biệt, Nấm Thượng hồng có cơng dụng chống ung thư mạnh ngăn ngừa phát triển khối u Nấm Thượng hoàng chứng minh có đặc tính chống khối u da, tế bào ung thư phổi ung thu tuyến tiền liệt Nấm Thượng hoàng quý hiếm, phù hợp với lứa tuổi, khơng có tác dụng phụ Thành phần nấm Thượng hồng: Chín hợp chất phân tách từ phần ethyl acetate hoạt động thân nấm xác định axit protocatechuic , protocatechualdehyde , axit caffeic , axit ellagic , hispidin , davallialactone , hypholomine B , interfungins A inoscavin Một số interfungins A chất ức chế mạnh protein glycation (một protein gây suy yếu mạch máu gây đột quỵ) Mặc dù việc nghiên cứu thành phần nấm thượng hoàng phức tạp nhiều chất chưa tìm hiểu phát hợp chất sinh học phức tạp Điểm khác nấm Linh chi nấm Thượng hoàng: Cả Nấm Thượng hoàng Linh chi hai loại dược thảo quý truyền thống phương Đông Trong Từ điển y dược Trung Quốc "Thần Nông Bản Thảo" xuất 2000 năm trước mô tả Nấm Linh chi Và Nấm Thượng hoàng loại thuốc thần tiên với tác dụng điều trị tiếp thêm sinh lực men sức sống, không độc hại, loại thảo mộc có giá trị cao, có tác dụng mang lại lợi ích thiết thực lượng quan trọng cho thể, tăng cường gân xương, ổn định huyết áp, giảm mỡ máu, phòng chữa bệnh tiểu đường, bệnh gan, đặc biệt hỗ trợ điều trị bệnh ung thư Nếu sử dụng thời gian dài trẻ hóa thể kéo dài tuổi thọ đặc biệt sau dùng thuốc kéo dài Tuy nhiên hoạt chất chống ung thư Nấm Thượng hồng cao 32% (hoạt chất chống ung thư Nấm Linh chi 64,9%, Nấm Thượng hoàng : 96,7% 1.2 Nghiên cứu giới Nấm Phellinus linteus, cịn có tên gọi Song gen Trung Quốc, Sanghwang Hàn Quốc Mesimakobu Nhật Bản coi nấm ''trường sinh bất lão'' dược liệu quý sử dụng thang thuốc đông y từ nhiều kỷ qua Theo nghiên cứu gần Hoạt động miễn dịch trị liệu việc cho uống thể Phellinus linteus tự nhiên (nPF) chống lại phát triển di tế bào khối u ác tính tiêm B16/BL6 kiểm tra Bào tử nấm (nPF) sử dụng dạng đường uống B16/BL6 thực chuột, mẫu cho di mạch phổi khối u ác tính, với liều dùng 83, 415 2075 mg/kg/ngày chế độ ăn chúng Chế độ dùng bào tử nấm nPF có ý nghĩa kéo dài thời gian sống chuột mang B16/BL6 Hơn việc sử dụng liều lượng nPF phụ thuộc vào tăng cường sản xuất NO đại thực bào chuẩn bị từ mang khối u, nPF điều trị cho loài động vật Đồng thời nPF không trực tiếp gây nhiễm độc cho tế bào chống lại B16/BL6 Những kết nghiên cứu khuyên việc cho uống bào tử nấm nPF hữu ích miễn dịch hóa trị liệu với ung thư kéo dài sống thơng qua việc ức chế cách hiệu phát triển di tế bào ung thư Ikekawa (1968) cộng báo cáo việc chọn lựa chiết xuất dung dịch loại nấm, bao gồm Coriolus versicolor, Lentinus edodes P linteus, có hiệu đáng ý ức chế tăng trưởng 180 tế bào khuẩn tròn bát điệp cấy da chuột [4, 6] Từ chiết xuất nấm đó, chiết xuất nấm P linteus trưng bày với hiệu vượt trội [4] Tuy nhiên, P linteus khó khăn phát triển mơi trường ni cấy dẫn đến phát triển tác nhân trị liệu từ loại nấm có thành cơng Cùng thời điểm Krestin Lentinan phát triển từ C versicolor L edodes [6,7] sử dụng chất kích thích miễn dịch điều trị lâm sàng ung thư Nhật Bản Tại Nhật Bản số loại nấm bao gồm P linteus bán lợi ích trì sức khỏe chúng phòng chống bệnh tật coi loại thuốc thay Nhiều bệnh nhân ung thư biểu mô Nhật Bản biết tiêu thụ loại nấm việc kết hợp với liệu pháp trị liệu ung thư tiêu chuẩn họ Hơn Kojima (2006) cộng [13] báo cáo trường hợp lấn áp tự phát ung thư biểu mô tế bào gan chiết xuất dung dịch từ P linteus Nhiều nhà nghiên cứu báo cáo polysaccharide axit phân lập từ việc nuôi cấy sợi nấm P linteus kích thích miễn dịch chống lại khối u, ức chế khối u phát triển di [9-12] Tuy nhiên 3.1.1.2 Mơi trường dinh dưỡng khơng có Agar Nghiên cứu mơi trường dinh dưỡng lỏng quan trọng nấm sinh trưởng môi trường lỏng thường nhanh so với môi trường thạch Và ni cấy thể nấm thường sử dụng để làm mơi trường giống, hay thường sử dụng để nuôi nấm phục vụ cho công việc tách chiết… Thí nghiệm mơi trường dinh dưỡng lỏng thực công thức kết thí nghiệm thể Biểu 3.2 Hình 3.3 Biểu 3.2: Khối lƣợng hệ sợi nấm hai công thức môi trƣờng dinh dƣỡng khác TT Môi trƣờng Khối lƣợng hệ sợi nấm (g/lọ) Độ dầy dinh dƣỡng Tươi Khô hệ sợi (mm) CT1 1,82 0,31 2,04 CT2 1,12 0,26 2,33 Qua kết bảng số liệu ta thấy khối lượng nấm ni cấy mơi trường dinh dưỡng CT1 có khối lượng cao 1,82g so với môi trường dinh dưỡng CT2 1,12g Tuy nhiên độ dày hệ sợi môi trường dinh dưỡng CT2 lại lớn 2,34g so với mơi trường dinh dưỡng thứ 2,04g Hình 3.3: Biểu đồ sinh trƣởng hệ sợi nấm hai công thức môi trƣờng dinh dƣỡng khác 17 Màu sắc hệ sợi hai môi trường dinh dưỡng khác Với mơi trường dinh dưỡng CT1 hệ sợi có màu vàng tươi, cịn mơi trường dinh dưỡng CT2 hệ sợi có màu vàng nâu hệ sợi bơng xốp Hình 3.4 Hình 3.5 Hình 3.4: Hệ sợi nấm mơi trƣờng CT1 Hình 3.5: Hệ sợi nấm mơi trƣờng CT2 18 3.1.2 Nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ đến sinh trưởng phát triển nấm Nhiệt độ khơng khí ảnh hưởng lớn đến nảy mầm bào tử Đặc biệt nhiệt độ định tốc độ sinh trưởng hệ sợi thời gian hình thành thể nấm Yếu tố nhiệt độ quan trọng q trình ni cấy nấm điều kiện khiết Trên sở tìm nhiệt độ thích hợp cho nấm sinh trưởng tốt Kết thí nghiệm thể Biểu 3.3 Hình 3.6 Biểu 3.3: Tốc độ sinh trƣởng trung bình hệ sợi nấm thang nhiệt độ khác Nhiệt độ Tốc độ sinh trƣởng hệ sợi nấm (oC) (mm/ngày) 10 0,92 15 1,74 20 2,25 25 2,34 30 2,24 35 0,41 TT Khi biểu diễn tốc độ phát triển hệ sợi nấm Biểu 3.3 cho thấy, thang nhiêt độ sinh trưởng nấm rộng, nhiệt độ 25 oC tốc độ sinh trưởng hệ sợi đạt mức cao với tốc độ 2,34mm/ngày nhiệt độ 35oC tốc độ sinh trưởng thấp với tốc độ 0,41mm/ngày Vì kết luận nhiệt độ thích hợp cho nấm sinh trưởng 25 oC 19 Hình 3.6: Biểu đồ sinh trƣởng hệ sợi nấm thang nhiệt độ khơng khí khác Qua hình 3.6 thấy điều kiện nhiệt độ quan trọng nuôi cấy nấm Ở thang nhiệt độ khác tốc độ sinh trưởng hệ sợi khác có chênh lệnh rõ rệt Bên cạnh khác tốc độ sinh trưởng yếu tố nhiệt độ thể qua độ dày màu sắc hệ sợi, thang nhiệt độ phù hợp cho nấm sinh trưởng nấm có độ dày lớn có màu vàng tươi, cịn điều kiện khơng phù hợp cho nấm sinh trưởng hệ sợi nấm mỏng màu sắc đậm điều thể qua Hình 3.7 với kết thí nghiệm cho thấy gặp điều kiện nhiệt độ khơng khí thích hợp vào mùa xuân, mùa thu năm nhiệt độ đạt ngưỡng từ 25oC đến 30oC tiến hành nuôi trồng nấm thu hiệu giá trị kinh tế cao 20 Hình 3.7: Hệ sợi nấm môi trƣờng dinh dƣỡng thang nhiệt độ 3.1.3 Nghiên cứu ảnh hưởng ẩm độ đến sinh trưởng phát triển nấm thượng hoàng Trong nhân tố khí tượng nhiệt độ, độ ẩm khơng khí yếu tố sinh thái quan trọng có ảnh hưởng trực tiếp đến sinh trưởng phát triển hệ sợi nấm Cùng với nhiệt độ khơng khí, độ ẩm tương đối nhân tố quan trọng quan trọng định đến hiệu việc ni cấy nấm Do nghiên cứu ảnh hưởng độ ẩm khơng khí đến sinh trưởng nấm có ý nghĩa quan trọng đến hiệu kinh tế việc nuôi trồng nấm Kết thí nghiệm thể Biểu 3.4 Hình 3.8 21 Biểu 3.4: Ảnh hƣởng độ ẩm khơng khí đến sinh trƣởng phát triển đƣờng kính hệ sợi TT Độ ẩm(%) 75 80 85 90 95 Tốc độ sinh trƣởng trung bình hệ sợi (mm/ngày) 2,17 2,45 2,34 2,26 2,18 Qua kết nghiên cứu Biểu 3.4 cho thấy nấm sinh trưởng phát triển biên độ độ ẩm từ 75% đến 95%, khơng có khác biệt lớn tốc độ phát triển khoảng độ ẩm nghiên cứu, độ ẩm khơng khí 80% sinh trưởng hệ sợi đạt mức cao 2,45mm/ngày cịn độ ẩm khơng khí 75% sinh trưởng mức thấp 2,17mm/ngày, hai giá trị khơng có khác biệt q lớn Độ ẩm khơng tối ưu để phát triển thích hợp từ 80% - 85% Hình 3.8: Biểu đồ tốc độ mọc hệ sợi thang độ ẩm khác 22 Do điều kiện môi trường ấm ẩm có nhiệt độ khơng khí khơng cao q thường vào mùa xuân, đầu mùa thu hay đầu mùa sinh trưởng môi trường thuận lợi cho nấm sinh trưởng phát triển mạnh Hình 3.9: Hệ sợi nấm môi trƣờng dinh dƣỡng theo thang độ ẩm 3.2 Bƣớc đầu nghiên cứu hoạt tính sinh kháng sinh ức chế phát triển tế bào ung thƣ thông qua chủng nấm Phytophthora sp Ceratocystis sp Mẫu sau quay hịa tan dung dịch Methanol (ME), tiến hành nhỏ vào hộp lồng chuẩn bị sẵn trình bày phần phương pháp, kết đánh giá hiệu lực kháng nấm bệnh trình bày Biểu 3.5 23 Biểu 3.5: Đánh giá hiệu lực kháng nấm bệnh nấm Thƣợng hoàng Tỷ lệ % TT Loài nấm bệnh Phytophthora sp 25,5 ++ Ceratocystis sp 35,3 ++ kháng nấm Khả kháng nấm Từ kết Biểu 3.5 cho ta thấy nấm Phellinus linteus có khả kháng nấm bệnh, mức độ kháng loài nấm bệnh kể khác rõ Trong loài nấm bệnh nấm Phellinus linteus kháng nấm Ceratocystis sp mạnh hẳn so với nấm Phytophthora sp gấp 1,38 lần Tuy nhiên khả kháng loài nấm bệnh kể mức độ trung bình Kết thấy rõ qua Hình 3.10 Phytophthora sp Ceratocystis sp Hình 3.10: Khả kháng nâm Phellinus linteus 3.3 Nghiên cứu nhân sinh khối hệ sợi môi trƣờng lỏng 3.3.1 Xác định thời gian nhân sinh khối hệ sợi Biết thời gian nuôi nấm dạng hệ sợi thời gian thu hoạch có ý nghĩa lớn, nấm nói riêng lồi sinh vật nói chung có tuổi định, chúng sinh trưởng đến chừng mực cho suất hay hiệu tốt chững lại theo quy luật tự nhiên Bởi nhân 24 sinh khối hệ sợi nấm thời gian thu hoạch xác giúp cho thu lại sinh khối nấm hiệu ích nấm lớn Nấm Phellinus linteus nuôi môi trường PD, sau kết trọng lượng khô hệ sợi sau thu hoạch khoảng thời gian nuôi cấy môi trường dịch thể hai công thức môi trường dinh dưỡng sau 14 ngày, 18 ngày, 22 ngày, 26 ngày ni cấy ngày trình bày Biểu 3.6 mơ qua Hình 3.11 Biểu 3.6: Sinh khối hệ sợi nấm sau khoảng thời gian nuôi khác Thời gian (ngày) Sinh khối hệ sợi (g/lọ) Khối lƣợng tƣơi Khối lƣợng khô 14 1,16 0,21 18 1,32 0,23 22 1,70 0,27 26 1,46 0,24 Kết bảng số liệu cho thấy với thời gian nuôi cấy 22 ngày khối lượng hệ sợi thu lớn với 1,70g sinh khối tươi 0,27g sinh khối khô Khối lượng hệ sợi tăng lên từ 14 ngày đến 22 ngày Tuy nhiên sau 22 ngày đến 26 ngày khối lượng hệ sợi bắt đầu giảm dần 1,46g sinh khối tươi 0,24g sinh khối khô, điều chứng tỏ khối lượng hệ sợi nấm Thượng hoàng cao thu hoạch vào thời gian 22 ngày để không làm giảm xuất chất lượng hệ sợi Nếu để lâu màu sắc hệ sợi thay đổi từ màu vàng tươi sang màu nâu sậm 25 Hình 3.11: Biểu đồ sinh khối hệ sợi thời gian thu hoạch khác Nghiên cứu xác định thời gian thu hoạch hệ sợi nấm vào thời gian phù hợp tốt cho suất cao điều quan trọng Vì sinh trưởng nấm nói riêng sinh vật nói chung có thời gian định Sợi nấm sinh trưởng đến chừng mực bị già yếu, sinh trưởng chậm, khả đề kháng để lâu làm thời gian mà suất hệ sợi không tăng, dẫn đến hiệu kinh tế thấp tăng thêm chi phí sản xuất Nếu lúc thu hoạch hệ sợi sử dụng hệ sợi làm giống sợi nấm khơng đạt u cầu cho sinh trưởng chậm, sợi nấm bị vàng nâu dễ bị thoái hoá giống Thời điểm thu hoạch hệ sợi làm giống tốt lúc hệ sợi nấm cịn vàng, bơng khoẻ Hình 3.12: Hệ sợi chƣa Hình 3.13: Hệ sợi đến Hình 3.14: Hệ sợi đến thời gian thu hoạch thời gian thu hoạch thời gian thu hoạch 26 3.3.2 Xác định thời gian sấy sản phẩm hệ sợi nuôi cấy Việc xác định thời gian sấy đánh giá hai môi trường dinh dưỡng Hệ sợi nấm sau thu hoạch sấy khô nhiệt độ thấp 35oC, 40oC, 45 oC có quạt gió đến độ ẩm tương đối sản phẩm sấy đạt 10 – 12%, thời gian sấy khô hệ sợi nấm chủng trình bày Biểu 3.7 Biểu 3.7: Thời gian sấy khô hệ sợi với thang nhiệt độ STT Nhiệt độ sấy Thời gian sấy khô hệ sợi (giờ) 35oC 14 40 oC 10 45 oC Từ kết Biểu 3.7 cho thấy thời gian để sấy nấm thang nhiệt độ sấy khác khác rõ rệt Kết cho thấy nhiệt độ 35oC thời gian làm khô hệ sợi lâu (14 giờ) so với sấy nhiệt độ 35oC (10giờ) 45oC (8giờ) Ở thang nhiệt độ 45oC sợi nấm khô nhanh so với nhiệt độ Thời gian (giờ) 35oC khơng đáng kể, điều thấy rõ Hình 3.15 14 12 10 35 40 45 Nhiệt độ oC Thời gian sấy khô hệ sợi (giờ) Hình 3.15: Biểu đồ thời gian sấy hệ sợi thang nhiệt độ 27 Để đảm bảo an toàn cho nấm khơng nên sấy nhiệt độ cao, sợi nấm cịn tươi mà đem sấy nhiệt độ cao không đảm bảo lượng nước bay hoàn toàn thường dẫn đến hệ sợi nấm giòn dễ vỡ vụn Mặt khác đối tượng sấy hệ sợi nấm, có chứa nhiều thành phần hố học q ví dụ vitamin, axit amin nhiều thành phần khác có cấu trúc cácbon… sấy nhiệt độ cao phá vỡ cấu trúc thành phần làm ảnh hưởng đến tính chất thành phần dễ dẫn đến làm hỏng tác dụng quý báu vốn có nấm Với kết thời gian sấy nấm hợp lý 40 oC - 45 oC tốt 40oC lý sau: thời gian sấy đảm bảo sợi nấm không bị nhiễm tạp, thời gian sấy không lâu nhiệt độ khơng q cao đảm bảo độ an tồn chất lượng sợi nấm Hình 3.16: Hệ sợi nấm trước sấy 28 Hình 3.17: Hệ sợi nấm sau sấy Chƣơng KẾT LUẬN - KIẾN NGHỊ - TỒN TẠI Kết luận Đã xác định đặc điểm sinh học hệ sợi nấm điều kiện nuôi cấy khiết - Môi trường dinh dưỡng tối ưu để hệ sợi nấm phát triển tốt mơi trường PDA (20g Glucoza/lít + 200g khoai tây/lít + 17g Agar) - Nấm phát triển tốt khoảng nhiệt độ từ 20 oC – 30oC, nhiệt độ thích hợp cho nấm phát triển 25oC với tốc độ mọc 2,34 (mm/ngày) Ở 10 oC 35oC nấm phát triển - Khoảng độ ẩm thích hợp cho nấm sinh trưởng phát triển từ 75% 95%, loài nấm ưa độ ẩm cao phát triển khoảng biên độ độ ẩm lớn Nhưng với độ ẩm 80% tối ưu cho nấm phát triển Bước đầu xác định khả kháng nấm dịch chiết nấm Thượng Hoàng với loại nấm bệnh Phytophthora sp Ceratocystis sp Nhận thấy khả kháng nấm dịch chiết nấm mức độ trung bình Đã xác định nhân sinh khối hệ sợi môi trường lỏng - Thời gian nhân sinh khối hệ sợi nấm tốt là 22 ngày, tương đương với khối lượng tươi 1,70 g/lọ khối lượng khô 0,27 g/lọ - Nhiệt độ để sấy khô hệ sợi nấm tốt 40oC – 45oC, tốt 40oC thời gian 10 4.2 Tồn Do thời gian nghiên cứu khóa luận cịn hạn chế, khóa luận chưa sử dụng nhiều dung mơi hữu để tiến hành tách chiết hợp chất hóa học 4.3 Kiến nghị Đối tượng nghiên cứu loài nấm dược liệu quý, có ý nghĩa y dược cao, nên tiếp tục sâu nghiên cứu để đáp ứng mục đích cuối tạo sản phẩm thể nấm nuôi trồng nhân tạo có giá trị cao ứng dụng cho ngành y học 29 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng việt Cổ Đức Trọng (2009), Kết trồng nấm Thượng hoàng (Phellinus linteus) mạt cưa cao su, Trung tâm nghiên cứu Linh chi dược liệu, Cổng thông tin điện tử Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn http://www.slideshare.net/hoanggiafood/nm-thng-hong http://samnamlinhchi.com/tin-tuc-suc-khoe/18/NAM-THUONGHOANG-CHUA-BENH-UNG-THU-VU.html Tiếng anh: Ikekawa T, Nakanishi M, Uehara N, Chihara G, Fukuoka F(1968) Antitumor action of some Basidiomycetes, especially Phellinus linteus Gann 59:155–157 Ikekawa T, Uehara N, Maeda Y, Nakanishi M, Fukuoka F (1969) Antitumor activity of aqueous extracts of edible mushrooms Cancer Res 29:734–735 Chihara G, Maeda Y, Hamuro J, Sasaki T, Fukuoka F (1969) Inhibition of mouse sarcoma 180 by polysaccharides from Lentinus edodes (Berk ) sing Nature 222:687–688 Miyazaki T, Yadomae T, Sugiura M, Ito H, Fujii K (1974) Chemical structure of antitumor polysaccharide, coriolan, produced by Coriolus versicolor Chem Pharm Bull 22:1739–1742 Han MW, Ko KS, Chung KS (1995) Korea Patent Open no 95–7860 Kim GY, Oh WK, Shin BC, Shin YI, Park YC, Ahn SC, Lee JD,Bae YS, Kwak JY, Park YM (2004) Proteoglycan isolated from Phellinus linteus inhibits tumor growth through mechanisms leading to an activation of CD11c+CD8+ DC and type I helper T cell-dominant immune state FEBS Lett 576:391–400 30 10 Kim GY, Park SK, Lee MK, Lee SH, Oh YH, Kwak JY, Yoon S,Lee JD, Park YM (2003) Proteoglycan isolated from Phellinus linteus activates murine B lymphocytes via protein kinase C andprotein tyrosine kinase Int Immunopharmacol 3:1281–1292 11 Kim GY, Oh YH, Park YM (2003) Acidic polysaccharide isolated from Phellinus linteus induces nitric oxide-mediatedtumoricidal activity of macrophages through protein tyrosinekinase and protein kinase C Biochem Biophys Res Commun 309:399–407 12 Han SB, Lee CW, Kang JS, Yoon YD, Lee KH, Lee K, Park SK, Kim HM (2006) Acidic polysaccharide from Phellinus linteus inhibits melanoma cell metastasis by blocking cell adhesion and invasion Int Immunopharmacol 6:697–702 13 Kojima H, Tanigawa N, Kariya S, Komemushi A, Shomura Y, Sawada S, Arai E, Yokota Y (2006) A case of spontaneous regression of hepatocellular carcinoma with multiple lung metastases Radiat Med 24:139–142 14 A, Itoh S, Tanaka R, Kato S, Haruna M, Kishimoto K, Hirayama H, Goda Y, Mizukami H, Ogihara Y (2004) Identification of novel substituted fused aromatic compounds, meshimakobnol A and B, from natural Phellinus linteus fruit body Tetrahedron Lett 45:5931–5933 15 Min BS, Yun BS, Lee HK, Jung HJ, Jung HA, Choi JS (2006) Two novel furan derivatives from Phellinus linteus with anticomplement activity Bioorg Med Chem Lett 16:3255–3257 16 Chen W, He FY, Li YQ (2006) The apoptosis effect of hispolon from Phellinus linteus (Berkeley & Curtis) Teng on human epidermoid KB cells Ethnopharmacol 105:280–285 31